專利名稱：：一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥復(fù)方的生物效應(yīng)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，特別是涉及一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
背景技術(shù)：
：降脂寧始載于《千金方》，現(xiàn)載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(中藥)第十三冊(cè)，由山楂、制首烏、決明子、荷葉4味中藥組成，具有溫通經(jīng)脈、扶正疏風(fēng)、通經(jīng)活絡(luò)的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明降脂寧具有降血脂、軟化血管作用，臨床使用廣泛，療效顯著。但目前有關(guān)降脂寧的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法，非常簡單，僅有鑒別項(xiàng)(采用化學(xué)反應(yīng)鑒別生物堿、蒽醌和黃酮)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(中藥)第十三冊(cè)降脂寧項(xiàng)下，水平很低，導(dǎo)致臨床療效不穩(wěn)定，安全性存在隱患。因此，迫切需要建立降脂寧合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，以改進(jìn)藥品生產(chǎn)工藝、提升藥品質(zhì)量、促進(jìn)藥品二次開發(fā)、實(shí)現(xiàn)藥品的現(xiàn)代化，最終保證臨床用藥的安全有效。目前亦未見有關(guān)降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的相關(guān)專利。技術(shù)方案本發(fā)明的目的在于提供一種中藥復(fù)方的生物效應(yīng)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種基于調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)的中藥復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)方法；本發(fā)明的目的還在于提供一種基于調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明基于調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法建立的基本程序如下(1)降脂寧組方藥材(山楂、荷葉、何首烏、決明子)一制備工藝一降脂寧提取物一分離純化，活性篩選一降脂寧有效部位一成分分析，活性評(píng)價(jià)一降脂寧藥效組分。(2)待檢樣品一分離純化一供試品。(3)降脂寧藥效組分生物效應(yīng)測(cè)定、供試品生物效應(yīng)測(cè)定(平行操作)。(4)降脂寧藥效組分生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定藥效組分效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)生物效應(yīng)。(5)供試品效應(yīng)與藥效組分標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)比較，供試品生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(生物效價(jià)比=供試品效應(yīng)/藥效組分標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)X100%)。(6)供試品質(zhì)量評(píng)價(jià)。質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)生物效價(jià)比在80%120%之間，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為合格品；生物效價(jià)比<80%，或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)有顯著性差異，為不合格品；生物效價(jià)比>120%,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為優(yōu)質(zhì)品。本發(fā)明基于調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括(1)抗氧化指標(biāo)氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)細(xì)胞活力；Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-l(ET-l)含量；Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力。(2)代謝物含量指標(biāo)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)外總膽汁酸(TBA)含量。本發(fā)明基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法為1.藥效組分制備精密稱取2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-l3-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、牡荊素、大黃素甲醚、槲皮素，按質(zhì)量比7~8:2~3:0.5~1:0.2~0.5:0.5~1:0.5~1.5的比例混勻，用蒸餾水溶解(可加入少量二甲基亞砜助溶)，配成相應(yīng)濃度的儲(chǔ)備液，用0.22pm微孔濾膜過濾，4'C冰箱保存，備用。2.供試品制備取待檢樣品，加水溶解分散，通過AB-8型或D-101型或HPD-300型大孔吸附樹脂柱(樹脂柱徑高比為1:610)，樹脂體積(mL)與藥量(g)之比為1:0.51.5。待吸附完成，水液全部通過樹脂柱后，樹脂柱先用36倍樹脂體積水洗脫，水洗脫液棄去，樹脂柱再用36倍樹脂體積的4070%乙醇洗脫。收集4070%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，5(TC減壓干燥，得供試品。取供試品用蒸餾水溶解后，配成相應(yīng)濃度儲(chǔ)備液，用0.22拜微孔濾膜過濾，4'C冰箱保存，備用。3.細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EAHY926置37'C水浴中復(fù)蘇，接種至培養(yǎng)皿中，置37'C、5。/。C02飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長成致密單層后，傳代培養(yǎng)，傳代時(shí)棄去原培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，加入胰酶-EDTA消化液(0.125%/0.02%，1:1)消化5min左右，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞回縮或細(xì)胞間隙增大，且有少量細(xì)胞懸浮時(shí)，立即棄去消化液，加入2倍于胰酶的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使成均勻的細(xì)胞懸液，吸入離心管中離心(1000rpm，5min)，上清液棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以12xl(^個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。每23d換液一次，長滿后即可再次傳代。將凍存的人肝細(xì)胞株Bel-7402置37。C水浴中復(fù)蘇，按2xl()S/mL接種于25ci^培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為RPMI-1640完全培養(yǎng)基，其中含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100ng/mL鏈霉素。置37"C、5%002飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每23d換液一次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，用胰酶-EDTA(0.125%/0.02%，1:1)消化傳代。選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。4.調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)測(cè)定分別取藥效組分及供試品儲(chǔ)備液配成相應(yīng)劑量，按照下列測(cè)定指標(biāo)平行進(jìn)行調(diào)脂抗氧化效應(yīng)測(cè)定。4.1抗氧化指標(biāo)4丄1細(xì)胞模型制備用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)制備HUVEC細(xì)胞損傷模型。Ox-LDL原始濃度為l1.5mg/mL，4'C冰箱保存，備用。臨用時(shí)稀釋至80100pg/mL。4丄2分組空白對(duì)照組僅加入無血清培養(yǎng)基；模型對(duì)照組僅加入Ox-LDL100[ig/mL于無血清培養(yǎng)基；阿托伐他汀對(duì)照組無血清培養(yǎng)基中含阿托伐他汀lxl(^mg/mL;供試品低、中、高劑量組無血清培養(yǎng)基分別含供試品2xl0"4，2xl0'3，lxl(y2mg/mL;藥效組分低、中、高劑量組無血清培養(yǎng)基中分別含藥效組分lx104，lxl(T3，lxl(T2mg/mL。4.1.3Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用Ox-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，用供試品及藥效組分進(jìn)行干預(yù)后，噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活力。具體方法為取培養(yǎng)后細(xì)胞，按100nL/孔(約lx104)接種于96孔培養(yǎng)板中，按"4丄2分組"項(xiàng)下方法分為9組，每組6個(gè)平行孔。藥物作用于細(xì)胞24h后，加入5mg/mLMTT50^iL繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清液，各孔加二甲基亞砜(DMSO)150nL，室溫避光微振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值。由下列公式計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞活力內(nèi)皮細(xì)胞活力％=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值xl00%。4丄4Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用Ox-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，用供試品及藥效組分進(jìn)行干預(yù)后，取培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書檢測(cè)NO、ET-1含量。具體方法為取培養(yǎng)后細(xì)胞，按lxlO"mL接種于6孔板，置37'C、5%<302培養(yǎng)箱培養(yǎng)2411，棄去原培養(yǎng)基，按"4丄2分組"項(xiàng)下方法分為9組，每組3個(gè)平行孔，加入各藥液，再置37'C、5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2000rpm離心10min，取上清液分裝于EP管中，4'C冰箱保存，備用。分別按試劑盒說明書用分光光度法檢測(cè)NO含量、用放射免疫分析法檢測(cè)ET-1含量。4丄5Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用Ox-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，用供試品及藥效組分進(jìn)行干預(yù)后，移除培養(yǎng)液，按試劑盒說明書檢測(cè)MDA含量、SOD活力。具體方法為將移去培養(yǎng)基的細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，用PBS洗下細(xì)胞，1000rpm離心5min收集細(xì)胞。每孔收集的細(xì)胞，加入0.5mL雙蒸水，用超聲波粉碎儀粉碎細(xì)胞，3000rpm離心10min，取上清液分裝于EP管中，4'C冰箱保存，備用。按試劑盒說明書用分光光度法分別測(cè)定MDA含量、SOD活力。4.2代謝物含量指標(biāo)4.2.1分組空白對(duì)照組含2g/L牛血清白蛋白(BSA)的1640培養(yǎng)液；阿托伐他汀組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液加10々mg/mL阿托伐他??；供試品高、中、低劑量組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為1xlO'2mg/mL、2xlO'3mg/mL、2xl(^mg/mL的供試品；藥效組分高、中、低劑量組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為lxl(^mg/mL、lxlO-3mg/mL、lxl0^mg/mL的藥效組分。每組做3個(gè)平行孔。4.2.2Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量測(cè)定Bel-7402細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24h，將每孔加入lmL含有各組藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗2次，每孔加入正己垸-異丙醇(3:2，V/V)lmL，室溫下放置30min，分取有機(jī)溶劑，重復(fù)操作一次。合并2次收集的有機(jī)溶劑，置玻璃管內(nèi)吹干，用200pL甲醇復(fù)溶，測(cè)定膽固醇含量。提取了脂質(zhì)的細(xì)胞加入0.1mol/LNaOH裂解后，用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。膽固醇含量采用HPLC法測(cè)定，色譜條件為色譜柱HypersilAPS2C18(150mmx4.6mm，5拜);流動(dòng)相乙腈-異丙醇(90:10)，流速l.OmL.min"，柱溫25°C，檢測(cè)波長216nm;峰面積外標(biāo)法定量，以mg/g細(xì)胞蛋白為單位。4.2.3Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)外TBA含量測(cè)定采用酶法TBA試劑盒測(cè)定。Bel-7402細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24h后，每孔加入lmL含有各組藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)基，分裝于EP管中，測(cè)定培養(yǎng)基中TBA;將移除培養(yǎng)基的細(xì)胞，用PBS洗2次，每孔加入30(HiL含P/。Triton-X100的雙蒸水裂解后，收集液體，離心(3000rpm,10min)，分裝于EP管中，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TBA，并用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi)TBA含量用每克細(xì)胞蛋白所含TBA的pmol數(shù)表示。5供試品生物效價(jià)比計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將供試品經(jīng)過與藥效組分所確立的標(biāo)準(zhǔn)生物效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)后，計(jì)算該供試品的生物效價(jià)比并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。6供試品質(zhì)量評(píng)價(jià)根據(jù)生物效價(jià)比及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行供試品的質(zhì)量評(píng)價(jià)。生物效價(jià)比范圍及標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)比<80%，或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)有顯著性差異，為不合格品；效價(jià)比在80%120%之間，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為合格品；效價(jià)比>120%,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為優(yōu)質(zhì)品。實(shí)施例l1.藥效組分制備精密稱取2,3,5,4，-四羥基二苯乙烯-2-0-l3-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、牡荊素、大黃素甲醚、槲皮素，按質(zhì)量比7~8:2~3:0.51:0.2~0.5:0.5~1:0.5~1.5的比例混勻，用蒸餾水溶解(可加入少量DMSO助溶)，配成相應(yīng)濃度的儲(chǔ)備液，用0，22nm微孔濾膜過濾，4'C冰箱保存，備用。2.供試品制備取待檢樣品，加水溶解分散，通過AB-8型或D-101型或HPD-300型大孔吸附樹脂柱(樹脂柱徑高比為1:610)，樹脂體積(mL)與藥量(g)之比為1:0.51.5。待吸附完成，水液全部通過樹脂柱后，樹脂柱先用36倍樹脂體積水洗脫，水洗脫液棄去，樹脂柱再用36倍樹脂體積的4070%乙醇洗脫。收集4070%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，50'C減壓干燥，得供試品。取供試品用蒸餾水溶解(可加入少量DMSO助溶)，配成相應(yīng)濃度儲(chǔ)備液，用0.22pm微孔濾膜過濾，4'C冰箱保存，備用。3.細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備常規(guī)培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞和Bel-7402細(xì)胞。用Ox-LDL制備HUVEC細(xì)胞損傷模型，Ox-LDL原始濃度為lmg/mL，4'C冰箱保存，備用。臨用時(shí)稀釋至80jig/mL。4.分組4.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞影響細(xì)胞共分為9組?？瞻讓?duì)照組僅加入無血清培養(yǎng)基；模型對(duì)照組僅加入Ox-LDL100嗎/mL于無血清培養(yǎng)基；阿托伐他汀對(duì)照組無血清培養(yǎng)基中含阿托伐他汀lxlO々mg/mL;供試品低、中、高劑量組無血清培養(yǎng)基分別含供試品2xl0"4，2xl(T3，lxlO-2mg/mL;藥效組分低、中、高劑量組無血清培養(yǎng)基中分別含藥效組分lxl(T4，lxi(T3，lxl(T2mg/mL。4.2對(duì)Bel-7402細(xì)胞膽固醇代謝影響細(xì)胞共分為8組?？瞻讓?duì)照組含2g/L牛血清白蛋白(BSA)的1640培養(yǎng)液；阿托伐他汀組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液加10^mg/mL阿托伐他?。还┰嚻犯?、中、低劑量組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為lxlO'2mg/mL、2xl(T3mg/mL、2xl(^mg/mL的供試品；藥效組分高、中、低劑量組含2g/LBSA的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為lxl(^mg/mL、lxl(T3mg/mL、lxl(^mg/mL的藥效組分。5.實(shí)驗(yàn)方法5.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響MTT比色法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞活力取培養(yǎng)后細(xì)胞，按100pL/孔(約lx104)接種于96孔培養(yǎng)板中，按"4.分組"項(xiàng)下方法分為9組，每組4個(gè)平行孔。藥物作用于細(xì)胞24h后，加入5mg/mL的MTT50^iL繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清液，各孔加DMSO150pL，室溫避光微振蕩10min,使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度(OD)值。由下列公式計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞活力內(nèi)皮細(xì)胞活力％=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值xl00。/。。5.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC的NO及ET-1含量的影響取培養(yǎng)后細(xì)胞，按lxl06/mL接種于6孔板，置37°C、5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h,棄去原培養(yǎng)基，按"4.分組"項(xiàng)下方法分為9組，每組3個(gè)平行孔，加入各藥液，再置37。C、5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心(2000rpm，10min)，取上清液分裝于EP管中，4'C冰箱保存，備用。按試劑盒說明書用分光光度法檢測(cè)NO含量，用放射免疫分析法檢測(cè)ET-1含量。5.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC的MDA含量、SOD活力的影響將移去培養(yǎng)基的細(xì)胞用胰酶-EDTA消化液消化，用PBS洗下細(xì)胞，1000rpm離心5min,收集細(xì)胞。每孔收集的細(xì)胞，加入0.5mL雙蒸水，用超聲波粉碎儀粉碎細(xì)胞，3000rpm離心10min，取上清液分裝于EP管中，4'C冰箱保存，備用。按試劑盒說明書用分光光度法分別測(cè)定MDA含量和SOD活力。5.4對(duì)Bel-7402細(xì)胞內(nèi)膽固醇(CHO)含量的影響B(tài)d-7402細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24h，將每孔加入lmL含有各組藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗2次，每孔加入正己烷-異丙醇(3:2,V/V)lmL，室溫下放置30min，分取有機(jī)溶劑，重復(fù)操作一次。合并2次收集的有機(jī)溶劑，置玻璃管內(nèi)吹干，用200nL甲醇復(fù)溶，測(cè)定膽固醇含量。提取了脂質(zhì)的細(xì)胞加入0.1mol/LNaOH裂解后，用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。膽固醇含量采用HPLC法測(cè)定，色譜條件為色譜柱HypersilAPS2C18(150mmx4.6mm，5—;流動(dòng)相乙腈-異丙醇(90:10)，流速1.0mL'min,柱溫25°C，檢測(cè)波長216nm;峰面積外標(biāo)法定量，以mg/g細(xì)胞蛋白為單位。5.5對(duì)Bel-7402細(xì)胞內(nèi)TBA含量的影響采用酶法TBA試劑盒測(cè)定。Bel-7402細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24h后，每孔加入lmL含有各組藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)基，分裝于EP管中，測(cè)定培養(yǎng)基中TBA;將移除培養(yǎng)基的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，每孔加入300pL含l%Triton-X100的雙蒸水裂解后，收集液體，3000rpm離心10min，分裝于EP管中，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TBA，并用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。細(xì)胞內(nèi)TBA含量用每克細(xì)胞蛋白所含TBA的nmol數(shù)表示。5.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及生物效價(jià)比計(jì)算所有藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間比較用g檢驗(yàn)，以^<0.05表示差異有顯著性。供試品的生物效價(jià)比(簡稱效價(jià)比)=供試品效應(yīng)/藥效組分效應(yīng)xlOO。/。；其中效價(jià)比l、2、3分別代表低、中、高三個(gè)劑量組的效價(jià)比；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用單因素方差分析，以尸>0.05表示無顯著性差異。6.結(jié)果6.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響表l供試品l對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響(5±s，n=4)組別OD值細(xì)胞活力(％)空白對(duì)照組0.638±0.03-Ox-LDL組0.281±0.02**44.04%阿托伐他汀組0.435±0.02，68.18%藥效組分低劑量組0.415±0.02,#65.05%藥效組分中劑量組0.472±0.04*，73.98%藥效組分高劑量組0.513±0.06*##80.41%供試品l低劑量組0.375±0.06**58.77%供試品l中劑量組0.475±0.03*，74.45%供試品l高劑量組0.522±0.04*##**81.82%注ra^/,帶邀,*P<0.ft5,**尸<0力/,.raO;ixLD丄遂,*P<0.O5,**P<19.0/,^拜汾汰游^邀,Af<0.O5,AA/><rftW;f^爍;^著邀.'*尸<0.05，**/><0.W，-KS屮;^著邀,A尸"CW.仍，AA尸"CO.W。下表同。6.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞NO、ET-1含量的影響表2供試品l對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO、ET-l含量的影響±s，n=3)組別NO(nmol/L)ET陽l(pg/mL)空白對(duì)照組4.08±0.328.22±1.19Ox-LDL組2.41±0.26"14.80±1.68"阿托伐他汀組5.00±0.45##7.21士0.88絲藥效組分低劑量組4.63±0.26##10.99±1.78藥效組分中劑量組4.82±0.26##7.87±0.84##藥效組分高劑量組5.93±0.26**##*"5.20±1.07##"供試品l低劑量組3.52±0.26#AA12.34±0.85A供試品l中劑量組4.26±0.26##10.67±1.37供試品l高劑量組5.19±0.26*##**7.75±1.12##*6.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響表3供試品1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響±s，n=3)組別MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)空白對(duì)照組1.46±0.0724.21±0.47Ox-LDL組2.49±0.15"15.69±1.53**阿托伐他汀組1.15±0.04##21.53±0.35##藥效組分低劑量組1.85士0.24豐18.9±0.47**#藥效組分中劑量組1.64±0.07##AA22.12±0.21##*藥效組分高劑量組1.37±0.08歸*23.07±0.9##"供試品l低劑量組1.73士0.07纖厶18.68±0.48**#A供試品l中劑量組1.55±0.07##A21.58士0.92飾供試品l高劑量組1.34士0.05歸23.45±0.69##"6.4對(duì)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO、TBA含量的影響表4供試品1對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TBA、CHO含量的影響(5±s，n=3)組別TBA(nmol/g.pr)CHO(mg/g.pr)空白對(duì)照組5.58±0.23683.1±29.54阿托伐他汀組6.6±0.26"479.U45.59**藥效組分低劑量組5.81±0.1AA255.6±4.65**AA藥效組分中劑量組6.41±0.13*"228.7±24**AA藥效組分高劑量組6.86±0.04**"178.2±3.65**AA供試品l低劑量組6.01±0.23A460.9±50.35**供試品l中劑量組6.24±0.03**供試品1高劑量組6.82±0.03"A_278.2±25AA*"6.5統(tǒng)計(jì)分析及生物效價(jià)比計(jì)算(1)抗氧化指標(biāo)①Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品l均可以提高損傷的HUVEC細(xì)胞活力。三個(gè)劑量組的細(xì)胞活力A值分別與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=0.375/0.415x100%=90.36%、效價(jià)比2=0.475/0.472x100%=100.64%、效價(jià)比3=0.522/0.513x100%=101.75%。②Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定中、高劑量組的供試品1可以增加損傷的HUVEC的N0的分泌，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=4.26/4.82x100%=88.38%、效價(jià)比3=5.19/5.93x100%=87.52%。高劑量組的供試品1可以降低損傷的HUVEC的ET-1含量，與降脂寧藥效組分中劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比3=7.75/7.87x100%=98.48%。③Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品1均可以減少損傷的HUVEC的MDA含量，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=1.73/1.85x100%=93.51%、效價(jià)比2=1.55/1,64x100%-94.51%、效價(jià)比3=1.34/1.37x100%=97.81%。三個(gè)劑量組的供試品l均可以提高損傷的HUVEC的SOD活力，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=18.68/18.9x100%=98.84°/。、效價(jià)比2=21.58/22.12x100%=97.56%、效價(jià)比3=23.45/23.07x100%=織.65%。(2)代謝物含量指標(biāo)①Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品l均可以降低細(xì)胞內(nèi)CHO含量，其中高劑量組與降脂寧藥效組分低劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比3=278.2/255.6x100%=108.84%。②Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)TBA含量測(cè)定中、高劑量組的供試品l可以升高細(xì)胞內(nèi)TBC含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=6.24/6.41x100%=97.35%、效價(jià)比3=6.82/6.86x100%=99.42%。實(shí)施例21.藥效組分制備同實(shí)施例1。2.供試品制備同實(shí)施例l。3.細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備同實(shí)施例l。4.實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例l。5.實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例l。6.結(jié)果6.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響表5供試品2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響(5±s，n=4)組別OD值細(xì)胞活力(％)空白對(duì)照組0.638±0.03-Ox-LDL組0.281±0.02**44.04%阿托伐他汀組0.435±0.02，68.18%藥效組分低劑量組0.415±0.02*，65.05%藥效組分中劑量組0.472±0.04*，73.98%藥效組分高劑量組0.513±0.06*，*80.41%供試品2低劑量組0.463±0.02,#72.57%供試品2中劑量組0.492±0.02*，77.12%供試品2高劑量組0.512±0.04"##80.25%注ra對(duì)^f資,*尸<0.05,*<0.(W;FSOx-丄Z)i遂.'鄉(xiāng)汰逸爐.'<隨，KS鮮爐邀，V<tt05,**尸<亂.KS^;^M"遂.'*/"<%仍，AAf^9.W。下表同。6.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞NO、ET-1含量的影響表6供試品2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO、ET-1含量的影響(5±s，n=3)組別NO(nmol/L)ET隱1(pg/mL)空白對(duì)照組4.08±0.328.22±U9Ox-LDL組2.41士0.26"14.80±1.68**阿托伐他汀組5.00±0.45##7.21±0.88##藥效組分低劑量組4.63±0.26##10.99±1.78藥效組分中劑量組4.82±0.26##7.87±0.84##藥效組分高劑量組5.93±0.26，*"5.20±1.07##"供試品2低劑量組10.15±0.56#供試品2中劑量組4.08±0.26##8.42±0.86##供試品2高劑量組4.63±0.26##6.17±0.30##*6.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響表7供試品2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響(5±s，n=3)組別MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)空白對(duì)照組1.46±0.0724.21±0.47Ox-LDL組2.49±0.15**15.69士1.53"阿托伐他汀組1.15±0.04##21.53±0.35##藥效組分低劑量組1.85±0.24#MA18.9±0.47**#藥效組分中劑量組1.64±0.07##A22.12士0.21飾藥效組分高劑量組1.37±0.08,23.07±0.9##"供試品2低劑量組1.76±0.08##AA19.04±0.76**##供試品2中劑量組1.49±0.04##20.9±0.5，供試品2高劑量組1.48±0.15##22.65±0.85##"6.4對(duì)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO、TBA含量的影響表8供試品2對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TBA、CHO含量的影響(5±s，n=3)組別TBA((xmol/g.pr)CHO(mg/g.pr)空白對(duì)照組5.58±0.23683.1±29.54阿托伐他汀組6.6±0.26**479.1士45.59"藥效組分低劑量組5.81±0.1M255.6±4.65**AA藥效組分中劑量組6.41±0.13**228.7±24**AA藥效組分高劑量組6.86士0.04""178.2±3.65**AA供試品2低劑量組6.12±0.46463.9士25.35"供試品2中劑量組6.55±0.03*364.2±15.廣臉供試品2高劑量組6.63±0.46"**A180.7±23.65**AA**"6.5統(tǒng)計(jì)分析及生物效價(jià)比計(jì)算(1)抗氧化指標(biāo)①Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品2均可以提高損傷的HUVEC細(xì)胞活力。三個(gè)劑量組的細(xì)胞活力A值分別與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=0.463/0.415x100%=111.57%、效價(jià)比2=0.492/0.472x100%=104.24%、效價(jià)比3=0.512/0.513x100%=99.81%。②Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品2均可以增加損傷的HUVEC細(xì)胞NO的分泌，其中低、中劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=3.71/4.63x100%=80.13%、效價(jià)比2=4.08/4.82x100%=84.65%。低、中、高劑量組的供試品2可以降低損傷的HUVEC細(xì)胞ET-1含量，其中中、高劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=8.42〃.87x100%=106.99%、效價(jià)比3=6.17/5.2x100%=118.65%。③Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品2均可以減少損傷的HUVEC的MDA含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=1.76/1.85x100%=95.14%、效價(jià)比2=1.49/1.64x100%=90.85%、效價(jià)比3=1.48/1.37x100%=108.03%。三個(gè)劑量組的供試品2均可以提高損傷的HUVEC的SOD活力，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=19.04/18.9x100%=100.74%、效價(jià)比2=20.9/22.12x100%=94.48%、效價(jià)比3=22.65/23.07x100%=98.18%。(2)代謝物含量指標(biāo)①Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品2均可以降低細(xì)胞內(nèi)CHO含量，其中高劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比3=180.7/178.2x100%=101.4%。②Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)TBA含量測(cè)定中、高劑量組的供試品2可以升高細(xì)胞內(nèi)TBC含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=6.55/6.41x100%=102.18%、效價(jià)比3=6.63/6.86x100%=96.65%。實(shí)施例31.藥效組分制備同實(shí)施例l。2.供試品制備同實(shí)施例l。3.細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備同實(shí)施例l。194.實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例l。5.實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例l。6.結(jié)果6.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響表9供試品3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響(又±s，n=4)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>/^7范汰逸/7遂.-^<"0.05,^尸<0.0/;KS戀^/f邀*尸<0.05,**尸<(9.0/;ra<.05,▲<0.07。下表同。6.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞NO、ET-1含量的影響表10供試品3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO、ET-1含量的影響(元±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>6.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響表ll供試品3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響(i±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>空白對(duì)照組1.46±0.0724.21±0.47Ox-LDL組2.49士0.15"15.69±1.53**阿托伐他汀組1.15±0.04##21.53±0.35##藥效組分低劑量組1.85±0.24##AA*承18.9±0.47藥效組分中劑量組1.64±0.07##A22.12±0.21##藥效組分高劑量組1.37±0.08#"23.07±0.9##"供試品3低劑量組1.70士0.15艦承承18.77±1.14供試品3中劑量組1.67士0.11脆21.13±0.86##供試品3高劑量組1.52±0.08##23.94±1.59##"6.4對(duì)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO、TBA含量:的影響表12供試品3對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TBA、CHO含量的影響(又±s，n=3)組別TBA((imol/g.pr)CHO(mg/g.pr)空白對(duì)照組5.58±0.23683.1±29.54阿托伐他汀組6.6±0.26**479.1士45.59"藥效組分低劑量組5.81±0.1AA255.6±4.65**AA藥效組分中劑量組6.41±0.13***228.7±24**AA藥效組分高劑量組6.86士0.04""178.2±3.65**AA*供試品3低劑量組6.16±0.02*269.6±4.25,供試品3中劑量組6.43±0.07**196.1±26.85**AA供試品3高劑量組7.89±0.21**M**"135.8±1.8**AA"6.5統(tǒng)計(jì)分析及生物效價(jià)比計(jì)算(1)抗氧化指標(biāo)①Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品3均可以提高損傷的HUVEC細(xì)胞活力。三個(gè)劑量組的細(xì)胞活力A值分別與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=0.441/0.415x100%=106.27%、效價(jià)比2=0.468/0.472x100%=99.15%、效價(jià)比3=0.535/0.513x100%=104.29%。②Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品3均可以增加損傷的HUVEC細(xì)胞NO的分泌，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=4.08/4.63x100%=88.12%、效價(jià)比2=4.63/4.82x100%=96.06%、效價(jià)比3=5.00/5.93x100%=84.32%。中、高劑量組的供試品3可以降低損傷的HUVEC細(xì)胞ET-1含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=9.21〃.87x100%=117.03%、效價(jià)比3=5.45/5》100%=104.81%。③Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品3均可以減少損傷的HUVEC的MDA含量，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=1.7/1.85x100%=91.89%、效價(jià)比2=1.67/1.64x100%=101.83%、效價(jià)比3=1.52/1.37x100%=110.95%。中、高劑量組的供試品3可以提高損傷的HUVEC的SOD活力，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=21.13/22.12x100%=95.52%、效價(jià)比3=23.94/23.07x100%=103.77%。(2)代謝物含量指標(biāo)①Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品3均可以降低細(xì)胞內(nèi)CHO含量，其中低、中劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=269.6/255.6x100%=105.48%、效價(jià)比2=196.1/228.7x100%=85.75%。②Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)TBA含量測(cè)定中、高劑量組的供試品3可以升高細(xì)胞內(nèi)TBC含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=6.43/6.41x100%=100.31%、效價(jià)比3=7.89/6.86x100%=115.01%。實(shí)施例41.藥效組分制備同實(shí)施例l。2.供試品制備同實(shí)施例1。3.細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備同實(shí)施例l。4.實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例l。5.實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例l。6.結(jié)果6.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響表13供試品4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響(滅±s，n=4)22組別OD值細(xì)胞活力(％)空白對(duì)照組0.638±0.03-Ox-LDL組0.281±0.02**44.04%阿托伐他汀組0,435±0.02，68.18%藥效組分低劑量組0.415±0.02*，65.05%藥效組分中劑量組0.472±0.04"##73.98%藥效組分高劑量組0.513±0.06，80.41%供試品4低劑量組0.413±0.05**##64.73%供試品4中劑量組0.447±0.05，70.06%供試品4高劑量組0.544±0.04#"85.27%注ra對(duì)^f邀..*尸<0.05,*V<ft(W;*P<0.05,**尸<0.0/,-KS河矩汰逖;7"邀，AP<0.05,MP<0.OhKS爍淑量遂，a尸0.仍，"尸<0.^。下表同。6.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞N0、ET-1含量的影響表14供試品4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞N0、ET-1含量的影響(5±s，n=3)組別NO(,1/L)ET-1(pg/mL)空白對(duì)照組4豫0.328.22±1.19Ox-LDL組2.41士0.26"14.80±1.68**阿托伐他汀組5.00±0.45##7.21±0.88##藥效組分低劑量組4.63±0.26##10.99±1.78藥效組分中劑量組4.82士0.26絲7.87±0.84##藥效組分高劑量組5.93士0.26，"520±1.07##*供試品4低劑量組3.71±0.26#A12.51±2.56A供試品4中劑量組4.45±0.45##9.29±1.21#供試品4高劑量組5.19±0.26*##**5.83±0.86##**6.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響表15供試品4對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響(5±s，n=3)組別MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)空白對(duì)照組1.46±0.0724.21±0.47Ox-LDL組2.49±0.15**15.69±1.53**阿托伐他汀組1.15±0.04##21.53±0.35，藥效組分低劑量組1.85±0.24艦18.9±0.47*，藥效組分中劑量組1.64±0.07##AA22.12±0.21##*藥效組分高劑量組1.37±0.08##**23.07±0.9##"供試品4低劑量組1.73±0.07觀19.76±0.38"##供試品4中劑量組1.37±0.08##21.56±0.73，23供試品4高劑量組1.30±0.05##*23.12士0.34'6.4對(duì)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO、TBA含量的影響表16供試品4對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TBA、CHO含量的影響(5±s，n=3)組別TBA((miol/g.pr)CHO(mg/g.pr)空白對(duì)照組5.58±0.23683.1±29.54阿托伐他汀組6.6±0.26*479.1士45.59"藥效組分低劑量組5.81±0.1255.6±4.65"AA藥效組分中劑量組6.41±0.13*228.7±24**M藥效組分高劑量組6.86±0.04*"178.2±3.65,供試品4低劑量組6.22±0.53271.8±6.55**AA供試品4中劑量組6.26±0.18192.9土32.廣厶"供試品4高劑量組6.66±0.58*120.8±8.1**M"6.5統(tǒng)計(jì)分析及生物效價(jià)比計(jì)算(1)抗氧化指標(biāo)①Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品4均可以提高損傷的HUVEC細(xì)胞活力。三個(gè)劑量組的細(xì)胞活力A值分別與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=0.413/0.415x100%=99.52%、效價(jià)比2=0.447/0.472x100%=94.7%、效價(jià)比3=0.544/0.513x100%=106.04%。②Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品4均可以增加損傷的HUVEC細(xì)胞NO的分泌，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=3.71/4.63x100%=80.13%、效價(jià)比2=4.45/4.82x100%=92.32%、效價(jià)比3=5.19/5.93x100%=87.52%。中、高劑量組的供試品4可以降低損傷的HUVEC細(xì)胞ET-1含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=9.29〃.87x100%=118.04%、效價(jià)比3=5.83/5.2x100%=112.12%。③Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品4均可以減少損傷的HUVEC的MDA含量，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=1.73/1.85x100%=93.51%、效價(jià)比2=1.37/1.64x100%=83.54%、效價(jià)比3=1.39/1.37x100%=101.46%。三個(gè)劑量組的供試品4均可以提高損傷的HUVEC的S0D活力，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=19.76/18.9x100%=104.55%、效價(jià)比2=21.56/22.12x100%=97.47%、效價(jià)比3=23.12/23.07x100%=100.22%。(2)代謝物含量指標(biāo)①Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品4均可以降低細(xì)胞內(nèi)CHO含量，其中低、中劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=271.8/255.6x100%=106.34%、效價(jià)比2=192.9/228.7x100%=84.35%。②Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)TBA含量測(cè)定中、高劑量組的供試品4可以升高細(xì)胞內(nèi)TBC含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=6.26/6.41x100%=97.66%、效價(jià)比3=6.66/6.86x100%=97.08%。實(shí)施例51.藥效組分制備同實(shí)施例l。2.供試品制備同實(shí)施例1。3.細(xì)胞培養(yǎng)及模型制備同實(shí)施例l。4.實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)施例1。5.實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例l。6.結(jié)果6.1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力的影響表17供試品5對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響(5±s,n=4)組另!J"~55S細(xì)胞活力(％)4楊％68.18%65.05%73.98%80.41%空白對(duì)照組0.638±0.03Ox-LDL組0.281士0.02:阿托伐他汀組0.435±0.02'藥效組分低劑量組0.415±0.02'藥效組分中劑量組0.472±0.04:藥效組分高劑量組0.513±0.06:供試品5低劑量組0.409±0.02##64.1%供試品5中劑量組0.466±0.03"##73.04%供試品5高劑量組0.527±0.02**##A"82.52%注KS對(duì)厲邀,*尸<0.05,"P〈ftW,KS0;c-iZU^.'*P<"0.05,#*P<0.0/,KS/^7趙汰/逸;7邀.-A/><0.05,AAP<a0hKS爍,量邀,*尸<0.仍，*V<0.(W,ra^^/^l"蘊(yùn)，"^<0.仍，*1尸<15.^。下表同。6.2對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞NO、ET-1含量的影響表18供試品5對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO、ET-1含量的影響(S±s，n=3)組別NO(,ol/L)ET-1(pg/mL)空白對(duì)照組4.08±0.328.22±1.19Ox-LDL組2.41士0.26"14.80士1.68"阿托伐他汀組5.00±0.45##7.21±0.88##藥效組分低劑量組4.63±0.26##10.99±1.78藥效組分中劑量組4.82±0.26##7.87±0.84##藥效組分高劑量組5.93士0.26,"5.20±1.07##**供試品5低劑量組3.77±0.26#厶10.99±1.46供試品5中劑量組4.08±0.26##9.03±1.36##供試品5高劑量組5.09±0.45#"5.75±0.66#"6.3對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響表19供試品5對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力的影響(X±s，n=3)組別MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)空白對(duì)照組1.46±0.0724.21±0.47Ox-LDL組2.49士0.15"15.69士1.53"阿托伐他汀組1.15±0.04##21.53±0.35*##藥效組分低劑量組1.85±0.24##M18.9±0.47**勵(lì)藥效組分中劑量組1.64±0.07##A22.12士0.21糾"藥效組分高劑量組1.37士0.08歸23.07±0.9##"供試品5低劑量組1.85±0.24##AA19.67±0.3，供試品5中劑量組1.58±0.04##22.55±0.34##*供試品5高劑量組1.37士0.08崇24.24士0.6麵"6.4對(duì)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO、TBA含量的影響表20供試品5對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TBA、CHO含量的影響(X±s，n=3)組另i)"~~~一~TBA(,1/g.pr)CHO(mg/g.pr)'空白對(duì)照組5.58±0.23683.1±29.54阿托伐他汀組6.6±0.26**479.1士45.59"藥效組分低劑量組5.81±0,1A255.6±4.65**AA藥效組分中劑量組6.41±0.13**228.7±24**AA藥效組分高劑量組6.86±0.04**"178.2±3.65"AA供試品5低劑量組6.23±0.07262.9±1.1**AA供試品5中劑量組7.17±0.2廣*143±3.55**綠供試品5高劑量組7.27士0.57""120.3±1.85**厶厶"6.5統(tǒng)計(jì)分析及生物效價(jià)比計(jì)算(1)抗氧化指標(biāo)①Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品5均可以提高損傷的HUVEC細(xì)胞活力。三個(gè)劑量組的細(xì)胞活力A值分別與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=0.409/0.415x100%=98.55%、效價(jià)比2=0.466/0.472x100%=98.73%、效價(jià)比3=0.527/0,513x100%=102.73%。②Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量測(cè)定低、中、高劑量組的供試品5均可以增加損傷的HUVEC細(xì)胞NO的分泌，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=3.77/4.63x100%=81.43%、效價(jià)比2=4.08/4.82x100%=84.65%、效價(jià)比3=5.09/5.93x100%=85.83%。中、高劑量組的供試品5可以降低損傷的HUVEC細(xì)胞ET-1含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2-9.03〃.87x100%=114.74%、效價(jià)比3=5.75/5.2x100%=110.58%。③Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力測(cè)定低、中、高劑量組的供試品5均可以減少損傷的HUVEC的MDA含量，三個(gè)劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=1.85/1.85x100%=100%、效價(jià)比2=1.58/1.64x100%=96.34%、效價(jià)比3=1.37/1.37x100%=100%。三個(gè)劑量組的供試品5均可以提高損傷的HUVEC的SOD活力，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=19.67/18.9x100%=104.07%、效價(jià)比2=22.55/22.12x100%=101.94%、效價(jià)比3=24.24/23.07x100%=27(2)代謝物含量指標(biāo)①Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)CHO含量測(cè)定低、中、高三個(gè)劑量組的供試品5均可以降低細(xì)胞內(nèi)CHO含量，其中低劑量組與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比l=262.9/228.7x100%=114.95%。②Bd-7402肝細(xì)胞內(nèi)TBA含量測(cè)定中、高劑量組的供試品5可以升高細(xì)胞內(nèi)TBC含量，與降脂寧藥效組分相應(yīng)劑量組的生物效應(yīng)值相比無顯著性差異，效價(jià)比2=7.17/6.41x100%=111.86%、效價(jià)比3=7.27/6.86x100%=105.98%。權(quán)利要求1、一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于該評(píng)價(jià)方法建立的基本程序?yàn)?1)降脂寧組方藥材(山楂、荷葉、何首烏、決明子)→制備工藝→降脂寧提取物→分離純化，活性篩選→降脂寧有效部位→成分分析，活性評(píng)價(jià)→降脂寧藥效組分；(2)待檢樣品→分離純化→供試品；(3)降脂寧藥效組分生物效應(yīng)測(cè)定、供試品生物效應(yīng)測(cè)定(平行操作)；(4)降脂寧藥效組分生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定藥效組分效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)生物效應(yīng)；(5)供試品效應(yīng)與藥效組分標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)比較，供試品生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(生物效價(jià)比＝供試品效應(yīng)/藥效組分標(biāo)準(zhǔn)效應(yīng)×100％)；(6)供試品質(zhì)量評(píng)價(jià)。2、一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于該方法包括藥效組分制備、供試品制備、調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)測(cè)定、供試品生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、供試品質(zhì)量評(píng)價(jià)等。3、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于藥效組分制備的方法為精密稱取2,3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、牡荊素、大黃素甲醚、槲皮素，按質(zhì)量比78:23:0.51:0.20.5:0.51:0.51.5的比例混勻，用蒸餾水溶解(可加入少量二甲基亞砜助溶)，配成相應(yīng)濃度的儲(chǔ)備液，用0.22um微孔濾膜過濾，4"C冰箱保存。4、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于供試品制備的方法為取待檢樣品，加水溶解分散，通過AB-8型或D-101型或HPD-300型大孔吸附樹脂柱(樹脂柱徑高比為l:610)，樹脂體積(mL)與藥量(g)之比為1:0.51.5。待吸附完成，水液全部通過樹脂柱后，樹脂柱先用36倍樹脂體積水洗脫，水洗脫液棄去，樹脂柱再用36倍樹脂體積的4070%乙醇洗脫。收集4070%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，50'C減壓干燥，得供試品。取供試品用蒸餾水溶解后，配成相應(yīng)濃度儲(chǔ)備液，用0.22ym微孔濾膜過濾，4'C冰箱保存。5、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于抗氧化生物效應(yīng)測(cè)定的方法為(1)細(xì)胞模型制備選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)EAHY926，用氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)制備HUVEC細(xì)胞損傷模型，Ox-LDL原始濃度為11.5mg/mL，臨用時(shí)稀釋至80100ug/mL;(2)分組包括空白對(duì)照組(僅加入無血清培養(yǎng)基)，模型對(duì)照組(僅加入Ox-LDL100ug/mL于無血清培養(yǎng)基)，阿托伐他汀對(duì)照組(無血清培養(yǎng)基中含阿托伐他汀1X10—7mg/mL)，供試品低、中、高劑量組(無血清培養(yǎng)基分別含供試品2Xl(Tmg/mL、2X10—3mg/mL、1XlCTmg/mL),藥效組分低、中、高劑量組(無血清培養(yǎng)基中分別含藥效組分lX10-4mg/mL、1X10—3mg/mL、1X10-2mg/mL);(3)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用Ox-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，經(jīng)供試品及藥效組分干預(yù)后，噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活力；(4)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)含量測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用Ox-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，經(jīng)供試品及藥效組分干預(yù)后，取培養(yǎng)上清液，依法處理，分光光度法檢測(cè)NO含量、放射免疫分析法檢測(cè)ET-1含量；(5)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用0x-LDL進(jìn)行氧化損傷造模，經(jīng)供試品及藥效組分干預(yù)后，移除培養(yǎng)液，依法處理，分光光度法測(cè)定MDA含量、S0D活力。6、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于代謝物含量測(cè)定的方法為(1)分組空白對(duì)照組(含2g/L牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)液)，阿托伐他汀組(含2g/L牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)液加10-7mg/mL阿托伐他汀)，供試品高、中、低劑量組(含2g/L牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為lX10-2mg/mL、2Xl(T3mg/mL、2X10—4mg/mL的供試品)，藥效組分高、中、低劑量組(含2g/L牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)液分別加入終濃度為1X10—2mg/mL、lX10—3mg/mL、1X1(r4mg/mL的藥效組分)；(2)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量測(cè)定Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)24h，每孔加入lmL含有藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，移除培養(yǎng)基，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每孔加入正己烷-異丙醇(3:2，V/V)lmL，室溫下放置30min，分取有機(jī)溶劑，重復(fù)操作一次，合并2次收集的有機(jī)溶劑，置玻璃管內(nèi)吹干，用200iiL甲醇復(fù)溶，依法測(cè)定膽固醇含量，提取了脂質(zhì)的細(xì)胞加入O.lmol/LNaOH裂解，用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度；膽固醇含量采用HPLC法測(cè)定，色譜條件為色譜柱HypersilAPS2C18(150mmX4.6mm，5iim);流動(dòng)相乙腈-異丙醇(90:10)，流速1.0mL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長216nm;峰面積外標(biāo)法定量，以nig/g細(xì)胞蛋白為單位；(3)Be卜7402肝細(xì)胞內(nèi)外總膽汁酸(TBA)含量測(cè)定Bel-7402細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24h，每孔加入lmL含有藥物的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)基，分裝于EP管中，采用酶法TBA試劑盒測(cè)定TBA含量；將移除培養(yǎng)基的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，每孔加入300uL含iy。Triton-X100的雙蒸水裂解后，收集液體，離心(3000rpm，10min)，分裝于EP管中，采用酶法TBA試劑盒測(cè)定TBA含量，并用蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，細(xì)胞內(nèi)TBA含量用每克細(xì)胞蛋白所含TBA的umol數(shù)表示。7、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括(1)抗氧化指標(biāo)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力，Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-l含量，Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力；(2)代謝物含量指標(biāo)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)外TBA含量。8、如權(quán)利要求2所述的一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為生物效價(jià)比在80%120%之間，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為合格品；生物效價(jià)比<80%，或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)有顯著性差異，為不合格品；生物效價(jià)比>120%，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為優(yōu)質(zhì)品。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于調(diào)脂抗氧化效應(yīng)的降脂寧質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。該評(píng)價(jià)方法主要包括藥效組分制備、供試品制備、調(diào)脂抗氧化生物效應(yīng)測(cè)定、供試品生物效價(jià)比計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、供試品質(zhì)量評(píng)價(jià)等。藥效組分包括2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、荷葉堿、牡荊素、大黃素甲醚和槲皮素，其質(zhì)量比為7～8∶2～3∶0.5～1∶0.2～0.5∶0.5～1∶0.5～1.5。質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括(1)抗氧化指標(biāo)Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC細(xì)胞活力，Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC培養(yǎng)液NO、ET-1含量，Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量、SOD活力；(2)代謝物含量指標(biāo)Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，Bel-7402肝細(xì)胞內(nèi)外TBA含量。質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為生物效價(jià)比在80％～120％之間，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為合格品；生物效價(jià)比＜80％，或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)有顯著性差異，為不合格品；生物效價(jià)比＞120％，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)與效應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)無顯著性差異，為優(yōu)質(zhì)品。文檔編號(hào)G01N1/28GK101590128SQ200910141969公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月12日優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日發(fā)明者斌劉,英楊,偉王,石任兵申請(qǐng)人:斌劉