專利名稱：基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測方法及系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種雙波長或多波長表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測方法及其系統(tǒng)， 屬于細胞生物學檢測技術領域。
背景技術：
人類基因組計劃的完成和后基因組時代的到來，為藥物發(fā)現與開發(fā)提供了豐富的信息庫 和先進的技術，可以在分子層次上開展研究，包括基因組學和蛋白質組學。用高通量掃描方 法進行分子水平的藥物篩選，可以獲得親合力、特異性以及動力學參數等特征數據，發(fā)現新 藥。生物體是復雜的系統(tǒng)，疾病的發(fā)生是由于外界對生物體作用的結果，最早在分子水平表 現出來。細胞是生物體的基本生命單元，生物分子處在細胞中，受到細胞內部環(huán)境的影響和 制約。當細胞中的有關分子發(fā)生變化時，往往通過網絡發(fā)生作用，不僅影響其它生物分子， 而且還會引起該細胞對周圍的其它細胞的影響，直至影響到組織與個體。因此，只從分子水 平進行體外研究是不完全和不充分的，要真正理解藥物的作用位點及其機制，除在分子水平 進行外，還必須在更高層次開展研究，包括細胞和組織，甚至是個體。在一定條件下，細胞 水平的研究能基本反映生物體的真實情況，有助于闡明疾病發(fā)生和發(fā)展的機制，也有利于藥
物作用點的確定和藥革E的篩選。基于細胞的生物傳感，不僅便于營造類似其所處的生物體內 的環(huán)境，檢測時可獲取更可信的信息，而且有利于實時觀察和分析分子水平的變化與細胞狀 態(tài)的關系。不僅如此，還可以監(jiān)測細胞受病原體和污染物作用的狀況，以及細胞受到其它生 物分子或藥物刺激后的生理變化。這些變化，或者可以通過熒光、發(fā)光或色度上差異來顯示， 或者由阻抗或電位來顯現，還可以以其它物理或化學的特征來表現。可見，在分子和細胞結 合的層面進行研究，尋找新的檢測方法，開發(fā)新的檢測儀器，檢測細胞的分子特征以及發(fā)生 在其中的生物分子相互作用，獲得細胞的特異表型差異，即獲得細胞分子表型信息，對于腫 瘤細胞的診斷以及藥物的篩選都具有重要科學意義。
目前，在細胞層次研究生物分子相互作用，主要是采用熒光蛋白標記，通過顯微鏡能實 時觀察到有關變化。這種方法直觀，可是無法量化，尤其是無法獲得特異性、親和力以及動 力學常數，這些參數對藥物研究卻是至關重要的，因而難以滿足要求。表面等離子體共振
(surface plasmon resonance,簡稱SPR)傳感是一種高靈敏度的光學檢測方法，可以對分 子間的相互作用進行無標記的實時檢測，已廣泛應用于DNA-DNA， DNA-蛋白質，蛋白質-蛋白 質等之間的相互作用。近來，已有研究人員嘗試將SPR應用于細胞及細胞層次的分子相互作 用研究。有的是研究細胞外表面與傳感表面的接觸情況，從而分析細胞的遷移，顯然這僅僅 涉及細胞行為。有的采用紅外光來激發(fā)SPR，增大了探測深度，可以檢測到細胞內一定深度的變化，然而紅外光的波長一定，對應的探測到的細胞深度也是一定的，且檢測到的是這一深度內的綜合效應，即平均效應，無法實現如同CT斷層掃描那樣分層檢測。很明顯，這些方法都不能滿足在細胞層次上進行生物分子相互作用研究的要求，迫切需要發(fā)明一種新的方法。

發(fā)明內容
針對這一問題，本發(fā)明提出了一種基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測的系統(tǒng)和檢測方法，利用兩種或更多不同波長的光同時激發(fā)固定有細胞的傳感芯片上的表面等離子體共振，獲得在同一生物反應過程的兩個或多個表面等離子體共振信號，并提出一種數據解析方法，實時解析信號，得到細胞近膜區(qū)域分子間相互作用的信息以及細胞其他層面內的信息，提供給細胞生物學研究。需要強調的是，細胞膜及膜上蛋白的相互作用機制在細胞的生命和功能上占有很重要的地位，這種方法尤其適合對這些細胞近膜區(qū)域內的反應進行檢測。
本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明提出了一種基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)由混合光源、入射臂、生物傳感單元、反射臂和計算機組成，所述的混合光源包括至少兩種不同波長的穩(wěn)頻激光器和光開關，所述的入射臂包括起偏器、準直器、掃描反射鏡和第一成像透鏡，所述的生物傳感單元由柱面或球面棱鏡、折射率匹配層、細胞芯片及樣本池構成，所述的細胞芯片由玻璃基片、金膜、以及用作探針的細胞構成，所述的反射臂包括第二成像透鏡和光電接收器，不同激光器發(fā)出的光分別經耦合器耦合后進入光纖中，通過由計算機控制的光開關選通，某一時刻只有一種波長的光出射，出射光依次經過起偏器和準直器，照射到由計算機控制的繞中心軸擺動的掃描反射鏡上，再透過第一成像透鏡、柱面或球面棱鏡和折射率匹配層，射到細胞芯片的玻璃基底與金膜的界面上。光由此反射，經過第二成像透鏡，射在光電接收器上，進行光電轉換，并輸入計算機處理。
本發(fā)明所述的細胞芯片的玻璃基片材料與所述的柱面或球面棱鏡材料一致，均為BK7光
學玻璃，所述的折射率匹配層的折射率與BK7光學玻璃的折射率一致。本發(fā)明所述的的光電接收器的光譜響應范圍為500 1800nm。
本發(fā)明提出的基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測方法，其特征在于該方法包
括以下步驟
1) 采用至少兩種不同波長的穩(wěn)頻激光器組成混合光源，使不同光源發(fā)出的光束分別耦合到各自對應的光纖中，然后分別與光開關的輸入端連接，由計算機控制光開關的選通，使某
一時刻只有某一波長的光通過；
2) 混合光源發(fā)出的光束經過準直器和起偏器，成為一束線偏振的平行光，調整起偏器，使所述的平行光成為P光；
3) 使所述的p光入射到掃描反射鏡的旋轉中心上；
4) 所述的掃描反射鏡在計算機的控制下，以10 1000Hz的頻率繞中心軸擺動，擺動的角度范圍為±16° ;
5) 所述的入射到掃描反射鏡上的p光從鏡面上反射，透過成像透鏡后射到柱面或球面棱 鏡的表面，并保證不同角度的入射光均能會聚在柱面棱鏡的中心線上；
6) 所述的細胞芯片置于柱面棱鏡或球面的平面上，中間放置一層折射率匹配層，所述的 柱面或球面棱鏡的中心線正好位于細胞芯片的玻璃基片與金膜之間的界面上；
7) 所述的不同角度的入射光發(fā)生反射，經過第二成像透鏡，投射在光電接收器件上，由 所述的光電接受器將接收到的光強信號轉換成電信號，并經A/D轉換后輸入計算機；
8) 所述的不同波長的光在不同的角度下，在細胞芯片的金膜和細胞的界面上激發(fā)表面等 離子體共振，反射光的光強最小的點的位置各不同，并且同一波長的光在細胞芯片表面分子 相互作用過程中的光強最小的點的位置每時每刻也不同；
9) 實時記錄所述的反射光的光強最小的點的位置變化，同時得到至少兩個不同的表面等 離子體共振信號A《，其中7 = 1,2,...肌，用來表征同一生物反應過程；
10) 獲得的至少兩個表面等離子體共振信號，利用數據解析方法進行解析，從中獲得到 細胞的不同層次內的折射率變化A",，其中z、l,2,…附.，實現細胞的分層檢測。
本發(fā)明所述的數據解析方法基于以下數值模型
A《=+A +…+ L A"ffl A(92 = Sw A + S2畫2A"2 +…+ Sm—2AMm
△《,=+ S2_m A"2 + +
所述的模型中，A《(X2,…,".)為測得的不同波長的SPR信號值；一 (hl,2,…肌) 為不同層區(qū)域的折射率變化量；(f,j、l,2,…附.)為不同波長在不同區(qū)域中的靈敏度，通 過實驗標定得到。
利用本發(fā)明所述的系統(tǒng)和檢測方法，可以對細胞不同層區(qū)域內的生命過程進行檢測，有 效獲取細胞近膜區(qū)域的分子之間相互作用的信息，提供給分子生物學家、細胞生物學家以及 藥學家解析，闡明有關生命機理和發(fā)現新藥。


圖1為本發(fā)明所述的雙波長SPR傳感系統(tǒng)示意圖。
圖2為本發(fā)明所述的多波長SPR系統(tǒng)中的混合光源示意圖。
圖3為本發(fā)明所述的細胞芯片結構示意圖。
圖4為本發(fā)明所述的表征同一生物反應過程的兩種SPR信號示意圖。 圖5為本發(fā)明所述的雙波長SPR系統(tǒng)可檢測的細胞兩層區(qū)域示意圖。 圖6為本發(fā)明所述的雙波長SPR系統(tǒng)數據解析流程圖。 圖7為本發(fā)明所述的多波長SPR系統(tǒng)可檢測的細胞多層區(qū)域示意圖。
61-l一第一穩(wěn)頻激光器；1-2 —第二穩(wěn)頻激光器；1-m—第m穩(wěn)頻激光器；2-l—第一耦合器；2-2—第二耦合器；2-m—第m耦合器；3 —光開關；4一輸出光纖；5—起偏器；6 —準直器；7 —掃描反射鏡；8 —第一成像透鏡；9一柱面棱鏡；IO —折射率匹配層；ll一細胞芯片；12 —樣本池；13 —第二成像透鏡；14一光電接收器；15 —計算機；16 —玻璃基片；17 —金膜；
18_細胞樣本；18-a—細胞近膜區(qū)域；18-b —細胞內部區(qū)域；18-l —細胞區(qū)域一；18-2 —細胞區(qū)域二； 18-m—細胞區(qū)域m。
具體實施例方式
下面根據附圖，對本發(fā)明所述的基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測方法及其系統(tǒng)進行詳細的說明。
先以雙波長SPR傳感系統(tǒng)為例。本發(fā)明所述的雙波長SPR傳感系統(tǒng)，由混合光源系統(tǒng)、入射臂、生物傳感單元、反射臂及計算機等幾部分組成，如圖1所示。
混合光源系統(tǒng)由兩種不同波長的穩(wěn)頻激光光源l-l、 1-2，光纖耦合器2-l、 2-2，光開關3及傳導光纖4組成。各個光源發(fā)出的光分別經過耦合器耦合后進入光纖，2根光纖再通過接頭與光開關3的輸入端連接，光纖4與光開關3的輸出端相連。光開關3由計算機15控制選通，保證某一時刻只有一種波長的光通過。
所述的入射臂由起偏器5、準直器6、掃描反射鏡7以及第一成像透鏡8構成。混合光源系統(tǒng)發(fā)出的光經過起偏器5后成為p方向偏振的線偏振光，再通過準直器6成為平行光，射在掃描反射鏡7的旋轉中心上；掃描反射鏡7在計算機15的控制下以10 1000Hz的頻率繞中心軸擺動，擺動的角度范圍為±16° ,將所述的p光反射，經過第一成像透鏡8照射到生物傳感單元表面，激發(fā)SPR。
生物傳感單元自下而上，分別由柱面或球面棱鏡9，折射率匹配層IO,細胞芯片ll以及樣本池12構成。掃描反射鏡7中心與柱面或球面棱鏡9的中心線關于第一成像透鏡共軛，當掃描反射鏡在一定角度范圍內擺動時，不同角度的入射光均可照射在細胞芯片11的同一位置上。細胞芯片ll自下而上，分別由玻璃基片16、金膜17及細胞樣本18構成，不同角度的入射光的焦點剛好位于細胞芯片的玻璃基片與金膜之間的界面上，也即柱面或球面棱鏡9的中心線上，如圖3所示，其中玻璃基片16的材料與柱面或球面棱鏡9的材料一致，均為BK7光學玻璃，其折射率與折射率匹配層10的折射率一致。SPR現象發(fā)生在金膜17與細胞樣本層18的界面。某種蛋白質或藥物溶液注入樣本池12中，當其與細胞發(fā)生相互作用時，引起細胞芯片11上的折射率發(fā)生變化；不同波長的光，在不同的入射角下激發(fā)SPR現象，使反射光的光強幾乎接近0，即產生光強最小點；相互作用不斷發(fā)生，折射率隨之不斷變化，每種波長的共振角(產生光強最小點的入射角位置)也對應改變。
所述的反射臂由第二成像透鏡13和光電接收器14構成。每種波長探測一定深度內折射率的變化所引起的反射光強變化，經由第二成像透鏡13，被光電接收器14接收，將光強信號轉換成電信號，并經過A/D轉換后輸入計算機15處理。光電接收器14具有500 1800nm 的光譜響應范圍，可實時接收每種波長的反射光的強度。
不同波長的光，對應激發(fā)表面等離子體共振的入射角不同，即分別在不同的入射角下可 檢測到反射光強最暗點，即SPR共振峰。掃描反射鏡7擺動一個周期，每種波長即可得到表 征生物反應過程中某一時刻的一個SPR共振峰。生物反應不斷進行，傳感層(SPR探測深度 內的細胞樣本層)內的折射率不斷改變，共振角的位置也會發(fā)生A6l的移動，即所述的SPR 信號。不同波長對應不同的SPR信號。
計算機15控制光開關3，在掃描反射鏡7擺動到某個角度時切換一次光源波長，則可分 別得到兩種波長的SPR信號。所述的光開關3的轉換頻率和掃描反射鏡7的掃描頻率較快， 盡管得到的兩種波長的SPR信號之間有時間差，掃描反射鏡7擺動一個周期也需時間，但是 生物反應速度較慢，所以此時間差可忽略不計。因此，可以認為在生物反應的任一時刻，都 可同時得到兩種SPR信號A《和A&，如圖4所示。
利用這2種SPR信號，可以實現兩層區(qū)域的細胞信號提取，如圖5所示，分別為細胞近 膜區(qū)域18-a和細胞內部區(qū)域18-b。細胞的重要生命活動很大部分都發(fā)生在細胞膜附近。在 細胞近膜區(qū)域18-a發(fā)生蛋白質相互作用等生物過程時，引起該區(qū)域的折射率變化為A^。由 于細胞本身的復雜性，細胞內部的物質運動也會引起細胞內部區(qū)域18-b的折射率變化A 。 這兩部分變化都會包含在每一種波長所測得的SPR信號中。將獲得的兩種SPR信號A《與 A&用數據解析方法進行解析，即可得到兩部分區(qū)域的折射率變化A 和A ，實現兩部分信 息的區(qū)分和提取。
數據解析方法基于數據解析模型，最佳近似模型的選擇流程圖如圖6所示。 首先選擇如下的線性近似模型
+5^A"C △《/ =&, c_" A"c
其中&—,、 &』和&_,,分別為兩種不同波長的光在細胞近膜區(qū)域18-3和細胞內
部區(qū)域18-b的靈敏度，這4個靈敏度均可以通過標定實驗獲得。
標定4個線性靈敏度后，用確定折射率變化量的反應過程進行驗證實驗，得到兩種SPR 信號，將兩層的折射率變化量和4個靈敏度代入到該線性模型中，并將結果與這兩種SPR信 號進行對比，如果誤差較小，則證明該線性模型可用來對實際情況進行近似，選擇該線性模 型進行數據解析。如果存在較大誤差時，則對該模型進行修訂，增加相關項，采用以下非線 性近似模型
A《=S^A +&一々￡相關項《A^A^或^A A 中的2個相關靈敏度《、《,的數值，可以通過進一步標定實驗獲得。
確定最佳近似模型后，將兩種SPR信號代入，即可求得兩部分區(qū)域的折射率變化量，實現細胞的分層檢測，為細胞生物學的研究提供信息。
本發(fā)明所述的多波長SPR傳感系統(tǒng)，可在雙波長SPR傳感系統(tǒng)上進行擴展，換用耦合有更多種波長的光的混合光源，以及相應響應范圍的光電接收器件，并對計算機中相應的控制程序進行修改即可。適合多波長SPR傳感系統(tǒng)的混合光源如圖2所示，多個具有不同中心波長的激光器l-l， 1-2，……1-m發(fā)出的光，分別通過耦合器2-1， 2-2，……2-m進入光纖中，并分別與多選一光開關3的輸入端連接，經輸出光纖4輸出。
多波長SPR傳感系統(tǒng)可實現對細胞內多層區(qū)域的檢測，如圖7所示。同時得到多個SPR信號A《(y、l,2,…m.)后，通過標定實驗，獲得不同波長在所需要的不同區(qū)域如18-1，18-2，…，18-m中的靈敏度S,力(/，y、l,2,…m.)，代入到如下數值模型中
A《=+ &_,"2 +…+ A"m△《=S卜2A", + S2—2A"2 +…+ 5^A
A(9m = S,—+ +…+ D m
求得細胞不同厚度的區(qū)域內的折射率變化量A^ (z、l,2，…附.)，實現細胞的多層信息提取。
權利要求
1. 一種基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)由混合光源、入射臂、生物傳感單元、反射臂和計算機組成，所述的混合光源含有至少兩種不同波長的穩(wěn)頻激光器(1-1、1-2、……1-m)和光開關(3)；所述的入射臂包括起偏器(5)、準直器(6)、掃描反射鏡(7)和第一成像透鏡(8)，所述的生物傳感單元由柱面或球面棱鏡(9)、折射率匹配層(10)、細胞芯片(11)及樣本池(12)構成，所述的細胞芯片由玻璃基片(16)、金膜(17)以及用作探針的細胞(18)構成，所述的反射臂包括第二成像透鏡(13)和光電接收器(14)；不同激光器發(fā)出的光分別通過耦合器耦合后進入光纖(4)中，通過由計算機控制的光開關(3)選通，某一時刻只有一種波長的光出射，出射光依次經過起偏器和準直器，照射到由計算機控制的繞中心軸擺動的掃描反射鏡(7)上，再依次透過第一成像透鏡(8)、柱面或球面棱鏡(9)和折射率匹配層(10)，射到細胞芯片(11)的玻璃基底與金膜的界面上，光由此反射，經過第二成像透鏡(13)，射在光電接收器(14)上進行光電轉換，并輸入計算機(15)處理。
2. 根據權利要求1所述的基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測系統(tǒng)，其特征在于 細胞芯片的玻璃基片材料與所述的柱面或球面棱鏡材料一致，均為BK7光學玻璃，所述的折 射率匹配層的折射率與BK7光學玻璃的折射率一致。
3. 根據權利要求1所述的基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測系統(tǒng)，其特征在于 所述的光電接收器的光譜響應范圍為500 1800nm。
4. 基于如權利要求1所述的系統(tǒng)的細胞分層檢測方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1) 采用至少兩種不同波長的穩(wěn)頻激光器組成混合光源，使不同光源發(fā)出的光束分別耦合 到各自對應的光纖中，然后分別與光開關的輸入端連接，由計算機控制光開關的選通，使某一時刻只有某一波長的光通過；2) 混合光源發(fā)出的光束經過準直器和起偏器，成為一束線偏振的平行光，調整起偏器， 使所述的平行光成為P光；3) 使所述的p光入射到掃描反射鏡的旋轉中心上；4) 所述的掃描反射鏡在計算機的控制下，以10 1000Hz的頻率繞中心軸擺動，擺動的 角度范圍為±16° ;5) 所述的入射到掃描反射鏡上的p光從鏡面上反射，透過成像透鏡后射到柱面或球面棱 鏡的表面，并保證不同角度的入射光均能會聚在柱面棱鏡的中心線上；6) 所述的細胞芯片置于柱面棱鏡或球面的平面上，中間放置一層折射率匹配層，所述的 柱面或球面棱鏡的中心線正好位于細胞芯片的玻璃基片與金膜之間的界面上；7) 所述的不同角度的入射光發(fā)生反射，經過第二成像透鏡，投射在光電接收器件上，由 所述的光電接受器將接收到的光強信號轉換成電信號，并經A/D轉換后輸入計算機；8) 所述的不同波長的光在不同的角度下，在細胞芯片的金膜和細胞的界面上激發(fā)表面等 離子體共振，反射光的光強最小的點的位置各不同，并且同一波長的光在細胞芯片表面分子 相互作用過程中的光強最小的點的位置每時每刻也不同；9) 實時記錄所述的反射光的光強最小的點的位置變化，同時得到至少兩個不同的表面等 離子體共振信號A《.，其中j、l,2,…附.，用來表征同一生物反應過程；10) 獲得的至少兩個表面等離子體共振信號，利用數據解析方法進行解析，從中獲得到 細胞的不同層次內的折射率變化A",，其中；=1,2,...附.，實現細胞的分層檢測。
5.根據權利要求4所述的細胞分層檢測方法，其特征在于所述的數據解析方法基于以 下數值模型<formula>formula see original document page 3</formula>所述的模型中，A《.為測得的不同波長的SPR信號值，其中/ = 1，2，一??；An,為不同層區(qū) 域的折射率變化量，其中z、l,2,…m.; ;為不同波長在不同區(qū)域中的靈敏度，其中 i,乂二l,2，…m.，通過實驗標定得到。
全文摘要
基于表面等離子體共振傳感的細胞分層檢測方法及系統(tǒng)，屬于細胞生物學檢測技術領域。本發(fā)明利用兩種或更多不同波長的光同時激發(fā)固定有細胞的傳感芯片上的表面等離子體共振，獲得在同一生物反應過程的兩個或多個表面等離子體共振信號，并提出一種數據解析方法，實時解析信號，有效獲取細胞近膜區(qū)域的分子之間相互作用的信息，提供給分子生物學家、細胞生物學家以及藥學家解析，闡明有關生命機理和發(fā)現新藥。
文檔編號G01N21/55GK101477046SQ20091007628
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權日2009年1月9日
發(fā)明者丁麗麗, 余興龍, 劉芳芳, 耿俊清 申請人:清華大學