專利名稱：高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)傳感器、生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
三聚氰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工中間產(chǎn)物，最主要的用途是作為
生產(chǎn)三聚氰胺/甲醛樹(shù)脂(MF)的原料。由于其含氮量達(dá)66%左右， 一些不 法企業(yè)在飼料中大量添加三聚氰胺，造成飼料中粗蛋白質(zhì)虛高的假相，不僅 對(duì)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生不利影響，對(duì)人類健康也存在著嚴(yán)重威脅。2007年3月中旬以 來(lái)，美國(guó)發(fā)生多起貓、狗寵物中毒死亡事件，經(jīng)調(diào)査是由于寵物食品中含有 三聚氰胺所引起的。2008年，三鹿奶粉事件，弓l發(fā)全國(guó)震驚。9月16日國(guó) 務(wù)院有關(guān)部門(mén)負(fù)責(zé)人公布的國(guó)家質(zhì)檢總局組織的專項(xiàng)檢査結(jié)果，更讓人瞠目 結(jié)舌。對(duì)109家生產(chǎn)嬰兒奶粉產(chǎn)品企業(yè)的491批次嬰幼兒奶粉進(jìn)行了檢驗(yàn)， 其中22家企業(yè)69批次檢出含量不同的三聚氰胺，其中石家莊三鹿牌嬰幼兒 奶粉三聚氰胺含量很高，最高的達(dá)2563毫克/公斤。其他品牌的嬰幼兒奶 粉也陸續(xù)有相關(guān)事件。三聚氰胺， 一時(shí)間讓"食品安全"再次推倒了風(fēng)口浪 尖，因此亟需建立方便靈敏的方法對(duì)奶粉中三聚氰胺含量進(jìn)行測(cè)定。
傳統(tǒng)的檢測(cè)三聚氰胺的方法有升華法、重量法等。GB 9567 -1988中采 用重量法測(cè)定三聚氰胺的含量。該方法的缺點(diǎn)是操作繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)(約 為8h)，測(cè)定低含量三聚氰胺時(shí)誤差大。現(xiàn)在常用的檢測(cè)三聚氰胺的方法多 為色譜法與其他技術(shù)聯(lián)用，如HPLC-MS等，但這些方法往往需要比較復(fù)雜 的儀器，而且過(guò)程繁瑣，靈敏度受樣品凈化、濃縮等步驟的影響?；诳贵w 抗原免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是最近發(fā)展的另外一種新方法，但是這種方法的靈敏度不高，同時(shí)受生物分子穩(wěn)定性的影響，操作要求比較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于發(fā)明一種簡(jiǎn)便方便、比較靈敏的方法對(duì)奶制品中的三聚 氰胺進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明采用電化學(xué)方法對(duì)檢測(cè)樣品奶粉溶液進(jìn)行電解，將電解后的電極 先后經(jīng)戊二醛溶液和辣根過(guò)氧化物酶溶液浸泡，然后通過(guò)顯色液顯色，定性、 定量分析檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。
本發(fā)明通過(guò)電化學(xué)方法將奶粉中的三聚氰胺富集到電極表面，利用戊二 醛和胺的交聯(lián)作用，將辣根過(guò)氧化物酶固定到電極的表面。在過(guò)氧化氫存在 的情況下，利用辣根過(guò)氧化物酶催化愈創(chuàng)木酚氧化，形成有色產(chǎn)物，顯色終 止后，測(cè)定樣品的吸光度。該值與電極表面組裝的辣根過(guò)氧化物酶的量成正 比關(guān)系，而電極表面組裝的辣根過(guò)氧化物酶的量又與溶液中三聚氰胺的濃度 成正比關(guān)系，通過(guò)觀察顯色顏色可以定性、定量檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。
本發(fā)明專利的有益效果是本發(fā)明將電化學(xué)富集技術(shù)與顯色反應(yīng)相結(jié) 合，方法簡(jiǎn)便、快捷，檢測(cè)靈敏，成本低廉。
為了獲得電解液，檢測(cè)前先采用體積濃度為45 55%的乙腈溶液與奶粉 混合，經(jīng)超聲溶解后，過(guò)濾，取上清液，調(diào)節(jié)上清液pH值至0 1，作為電 化學(xué)方法的電解液。
另外，采用直徑為0.22pm的濾膜過(guò)濾。
將電化學(xué)方法處理后的電極取出后，依次于戊二醛溶液和辣根過(guò)氧化物 酶溶液中分別浸泡1 2小時(shí)，取出電極，浸入顯色液5 60min，終止顯色。
上述顯色液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺或2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并 噻吡咯啉-6磺酸)或愈創(chuàng)木酚任選其一與過(guò)氧化氫溶液的混合物。 上述戊二醛溶液的濃度為1% 2.5 %。上述辣根過(guò)氧化物酶溶液的濃度為l 10mg/ml 。 另，為了快速、靈敏地分析測(cè)定，本發(fā)明電化學(xué)方法中，掃描速度 100mv/s，掃描30圈。或在電位大于0.6V的條件下處理300秒。


圖1為顯色效果圖片。
圖2為三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
1、 樣品前處理
溶液制備將乙腈溶解在等體積的二次水溶液中，形成乙腈溶液，待用。 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量奶粉樣品，往樣品中加入乙腈溶液，超聲溶解后，
4000rpm離心10分鐘，用0.22pm的濾膜過(guò)濾，取上清液，用鹽酸調(diào)節(jié)
pH=0 l，即為實(shí)驗(yàn)用電解液。
2、 采用電化學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行富集
可以采用循環(huán)伏安法或者恒電位法將電極置于以上電解液中，為了快速 靈敏的分析測(cè)定，選擇掃描速度100mv/s，掃描30圈。如奶粉中含有三聚 氰胺，則在電極表面可見(jiàn)三聚氰胺富集在電極表面形成的一層薄膜。
3、 浸泡、顯色
顯色液準(zhǔn)備可以由鄰苯二胺和過(guò)氧化氫組成的混合物，也可以由四甲 基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫組成的混合物，也可以由2， 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻 吡咯啉-6磺酸)和過(guò)氧化氫組成的混合物，也可以由愈創(chuàng)木酚和過(guò)氧化氫溶 液的混合物。
為了使顯色液不影響辣根過(guò)氧化物酶的活性，還可采用磷酸-磷酸鹽緩 沖溶液與上述任一種顯色液混合。
本例中，將2.9 ml 0.1 M磷酸-磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)和30 jil 8.8 mM 愈創(chuàng)木酚(水溶液)、100ixl0.04M的H202 (水溶液)均勻混合形成顯色液，待用。
將電化學(xué)方法處理后的電極依次在濃度為1% 2.5 %的戊二醛和濃度 為1 10mg/ml的辣根過(guò)氧化物酶溶液中分別浸泡1 2小時(shí)后，取出電極， 浸入顯色液中5 60min，終止顯色。
4、 目測(cè)或者用光度計(jì)測(cè)定吸光度值
分別稱取一定質(zhì)量的含三聚氰胺和不含三聚氰胺的奶粉樣品，往樣品中 加入乙腈溶液，超聲溶解后，4000rpm離心10分鐘，用0.22jum的濾膜過(guò) 濾，取上清液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=0.5，作為實(shí)驗(yàn)用電解液。將電極置于以上 電解液中，采用循環(huán)伏安法富集三聚氰胺，選擇掃描速度100mv/s，掃描30 圈(或電位大于0.6V的條件下富集300秒)。將電化學(xué)方法處理后的電極依 次在濃度為1% 2.5 %的戊二醛和濃度為1 10mg/ml的辣根過(guò)氧化物酶 溶液中分別浸泡1 2小時(shí)后，取出電極，浸入顯色液中5 60min，終止顯 色。現(xiàn)象如附圖1所示。
可見(jiàn)，不含三聚氰胺的奶粉樣品A瓶?jī)?nèi)液體呈無(wú)色透明狀，含三聚氰 胺的奶粉樣品B瓶?jī)?nèi)液體呈橙紅色透明狀。
經(jīng)試驗(yàn)，如奶粉中含三聚氰胺，經(jīng)由鄰苯二胺和過(guò)氧化氫組成的混合物， 或由四甲基聯(lián)苯胺和過(guò)氧化氫組成的混合物，或由2，2'-邊氮基-雙(3-乙基苯 并噻吡咯啉-6磺酸)和過(guò)氧化氫組成的混合物形成的顯色液顯色，則呈現(xiàn)有 色；如奶粉中不含三聚氰胺，經(jīng)顯色液顯色，還是為無(wú)色。
結(jié)論可依據(jù)顯色效果直接、快速判斷奶粉中是否含有三聚氰胺。
5、 分析樣品中三聚氰胺的濃度
分別配置10-"， l(T10， 5xl(T10， 10-9, 5x10-9， 10-8M的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶 液，采用循環(huán)伏安法富集三聚氰胺，選擇掃描速度100mv/s，掃描30圈(或 電位大于0.6V，富集300s)。將電化學(xué)方法處理后的電極依次在濃度為1% 2.5 %的戊二醛和濃度為1 10mg/ml的辣根過(guò)氧化物酶溶液中分別浸泡l 2小時(shí)后，取出電極，浸入顯色液中5 60min，光度計(jì)讀數(shù)。
根據(jù)濃度和吸光度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)于每一個(gè)樣品的濃度可 以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出樣品中三聚氰胺的含量。 利用專業(yè)電腦軟件更便于大量樣本的快速分析。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān) 系如圖2所示。
結(jié)論采用本發(fā)明方法，可快速定量分析奶粉中三聚氰胺的含量。
權(quán)利要求
1、一種高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于采用電化學(xué)方法對(duì)檢測(cè)樣品奶粉溶液進(jìn)行電解，將電解后的電極先后經(jīng)戊二醛溶液和辣根過(guò)氧化物酶溶液浸泡，然后通過(guò)顯色液顯色，定性、定量分析檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于檢測(cè)前先采用體積濃度為45 55%的乙腈溶液與奶粉混合，經(jīng)超聲溶解后，過(guò)濾，取上清液，調(diào)節(jié)pH值至0 1,作為電化學(xué)方法的電解液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于采用直徑為0.22pm的濾膜過(guò)濾。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于將電化學(xué)方法處理后的電極取出后，依次于戊二醛溶液和辣根過(guò)氧化物酶溶液中分別浸泡1 2小時(shí)，取出電極，浸入顯色液5 60min，終止顯色。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于所述顯色液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺或2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)或愈創(chuàng)木酚任選其一與過(guò)氧化氫溶液的混合物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于所述戊二醛溶液的體積濃度為1% 2.5%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于所述辣根過(guò)氧化物酶溶液的濃度為1 10mg/ml。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于電化學(xué)方法中，掃描速度100mv/s，掃描30圈。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，其特征在于電化學(xué)方法中，電位大于0.6V，處理時(shí)間為300s。
全文摘要
高靈敏的檢測(cè)奶粉中三聚氰胺的方法，涉及化學(xué)傳感器、生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。采用電化學(xué)方法對(duì)檢測(cè)樣品奶粉溶液進(jìn)行電解，將電解后的電極先后經(jīng)戊二醛溶液和辣根過(guò)氧化物酶溶液浸泡，然后通過(guò)顯色液顯色，定性、定量分析檢測(cè)樣品中三聚氰胺的濃度。本發(fā)明將電化學(xué)富集技術(shù)與顯色反應(yīng)相結(jié)合，方法簡(jiǎn)便、快捷，檢測(cè)靈敏，成本低廉。
文檔編號(hào)G01N27/42GK101520431SQ20091002957
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者琴 徐, 胡效亞, 袁愛(ài)菊 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)