專利名稱：：用于定量糖組學(xué)的體內(nèi)同位素標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記聚糖和促進(jìn)生物細(xì)胞的糖組學(xué)(glycomic)組合物的高通量定量/比較分析的方法。優(yōu)先權(quán)要求和資金支持本申請(qǐng)要求2007年10月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)流水號(hào)61/000，920的優(yōu)先權(quán)，其名稱為“IDAWGAnovelquantitativemethodforglycomics-IDAWG”，其整個(gè)內(nèi)容以其整體在此引入作為參考。本發(fā)明得到政府的支持，其資金號(hào)為NIH/NCRR5P41RR018502和NIH/NIDDK1R01DK075069,由NIH授予。因而，美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
：已開(kāi)發(fā)了一系列策略以用于大規(guī)模體系的高通量(throughput)定量/比較分析，以使得可比較不同生物狀態(tài)之間各種分子的表達(dá)水平。在_組學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域使用的技術(shù)可能是最成熟的，且可廣泛細(xì)分為兩個(gè)一般流程-涉及使用標(biāo)記的方法和不使用標(biāo)記的方法。在不使用標(biāo)記的方法中，肽/蛋白質(zhì)的不同方面，如標(biāo)準(zhǔn)化的離子強(qiáng)度、光譜計(jì)數(shù)、質(zhì)量、掃描數(shù)和信號(hào)強(qiáng)度，以及精確質(zhì)量加保留時(shí)間已成功用于指定蛋白質(zhì)表達(dá)水平以進(jìn)行對(duì)比研究H。然而，各分析物的離子化效率取決于以下因素，如其分子量、質(zhì)子/陽(yáng)離子親和力、表面活性、與分析物的離子化競(jìng)爭(zhēng)或干擾分析物的離子化的其它化合物的存在等，因此離子的強(qiáng)度不直接與濃度相關(guān)。此外，儀器的響應(yīng)可隨時(shí)間改變，因此源自兩項(xiàng)或更多項(xiàng)分析的數(shù)據(jù)的直接比較可產(chǎn)生顯著不同的結(jié)果。相對(duì)定量的備選策略通過(guò)同時(shí)分析幾對(duì)同位素標(biāo)記的群體克服了這些問(wèn)題，其提供了以下優(yōu)點(diǎn)，即重和輕標(biāo)記的肽對(duì)在完全相同的條件下分析，使得可直接比較該肽的相對(duì)豐度。同位素標(biāo)記的群體之間的相對(duì)定量通過(guò)計(jì)算輕和重單同位素峰的面積或強(qiáng)度的比例而進(jìn)行。已開(kāi)發(fā)了眾多策略用于將穩(wěn)定的同位素引入蛋白質(zhì)群體5_12。例如，同位素-編碼的親和標(biāo)簽(ICAT)化學(xué)靶向肽序列中的特定氨基酸，通常為半胱氨酸，用于差別標(biāo)記5。其它體外方法也靶向多肽的官能團(tuán)6’8—12。也可通過(guò)代謝標(biāo)記將穩(wěn)定的同位素引入生物體系。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)物中用氨基酸進(jìn)行的穩(wěn)定同位素比較(SILAC)提供了簡(jiǎn)單且直接的方法以在基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)之前向蛋白質(zhì)體內(nèi)引入同位素標(biāo)記物7。在SILAC實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)細(xì)胞群在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基相同除了其中之一包含“輕”而另一個(gè)包含“重”形式的特定氨基酸(例如12C和13C標(biāo)記的賴氨酸和精氨酸)。將該標(biāo)記的氨基酸類似物代替天然氨基酸供給培養(yǎng)中的細(xì)胞，且其實(shí)現(xiàn)摻入所有新合成的蛋白質(zhì)。在大量細(xì)胞分裂后，特定氨基酸的各實(shí)例由其同位素標(biāo)記的類似物替換。該方法優(yōu)于體外方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為，在細(xì)胞裂解后細(xì)胞立即混合在一起。因此，來(lái)自兩種類型細(xì)胞的蛋白質(zhì)在樣品處理、消化、純化等過(guò)程中都經(jīng)受完全相同的實(shí)驗(yàn)條件，其消除了當(dāng)樣品以平行方式分開(kāi)處理時(shí)會(huì)發(fā)生的差別損耗。因此，SILAC通常被認(rèn)為是定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”13。比較糖組學(xué)的領(lǐng)域不像蛋白質(zhì)組學(xué)一樣成熟；然而多種定量的蛋白質(zhì)組學(xué)工具已適用于糖組學(xué)分析。例如，總離子作圖(totalionmapping)(TIM)為不使用標(biāo)記的方法，其基于碎片離子強(qiáng)度的總和確定聚糖個(gè)體相對(duì)樣品中所有聚糖總量的流行率和百分?jǐn)?shù)，且有些方面類似于蛋白質(zhì)組學(xué)使用的不使用標(biāo)記的方法14。體外同位素標(biāo)記也已通過(guò)眾多團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了開(kāi)發(fā)。對(duì)于N-連接的聚糖和游離寡糖，已得到多種含同位素的標(biāo)簽以標(biāo)記還原端15_18。0-連接的聚糖通常通過(guò)β-消除從蛋白質(zhì)主鏈釋放，因此不適合這些方法。然而，已開(kāi)發(fā)了依賴β-消除以將質(zhì)量標(biāo)記引入聚糖的定量方法19。比較同位素標(biāo)記寡糖的另一種建議的方法依賴于標(biāo)準(zhǔn)全甲基化過(guò)程中的重碘甲烷(13CH3,12⑶H2,12CHD2，和/或12CD3)相對(duì)輕碘甲烷(12CH3)的標(biāo)記，其為MS分析N-連接的和0-連接的聚糖之前常用的衍生化步驟(14’2°’21。此外，已為N-和0-連接的聚糖開(kāi)發(fā)了同量異位(isobaric)標(biāo)記策略，其使用用13CH3和12⑶H2進(jìn)行的全甲基化，且對(duì)于異構(gòu)混合物中存在的聚糖個(gè)體的定量特別有用22’23。所有這些體外方法對(duì)于糖組學(xué)是有用的工具。附圖簡(jiǎn)述圖IA圖示了己糖胺生物合成途徑，其將糖酵解中間體果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為UDP-GlcNAc。圖IB顯示用于在有或沒(méi)有重Gln的情況下標(biāo)記鼠ES細(xì)胞，然后從蛋白質(zhì)分離N-和0-連接的聚糖用于質(zhì)譜分析的分離和分析步驟的流程圖。圖2顯示從在14Gln或15NGln中生長(zhǎng)的mESCs釋放的全甲基化的N-連接的聚糖的全光譜。圖3顯示對(duì)由GlcNAcsMar^聚糖產(chǎn)生的雙電荷分子離子(M+2Na)2+的更密切的檢查，其出現(xiàn)在距14N和15NGln培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的聚糖的1005.5和1006.5m/z單位處。圖4A和4B顯示重和輕標(biāo)記的核心巖藻糖基化的、完全唾液酸化的(fullysialyated)、雙觸角N-連接的聚糖的碎裂顯示的碎片與15N-摻入Neu5Ac以及核心和觸角GIcNAC殘基一致。圖5A-F說(shuō)明將15N摻入到0-聚糖中包含的所有氨基糖中，對(duì)于包含GIcNAC和Neu5Ac的O-Man引發(fā)的聚糖、包含GlcNAc的O-GalNAc引發(fā)的結(jié)構(gòu)和含兩個(gè)Neu5Ac殘基的O-GalNAc引發(fā)的結(jié)構(gòu)顯示碎裂后重和輕分離的樣品的MS/MS光譜。圖6顯示表1，其表明按照本文所述的本發(fā)明15N標(biāo)記N-聚糖的高標(biāo)記效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記聚糖的方法。該方法用于促進(jìn)生物物質(zhì)(尤其包括細(xì)胞和組織)的糖組學(xué)組合物(glycomiccompositions)的高通量定量/比較分析。本發(fā)明涉及利用對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物中聚糖進(jìn)行穩(wěn)定的同位素(15N)標(biāo)記以進(jìn)行相對(duì)定量的糖組學(xué)的方法。該方法稱為用谷氨酰胺同位素檢測(cè)氨基糖(IDAWG)，其依賴于己糖胺的生物合成途徑，該合成途徑使用谷氨酰胺的側(cè)鏈作為其在糖核苷酸的產(chǎn)生中氨基糖的氮的唯一供體源。因此，例如，向其它無(wú)Gln的培養(yǎng)基引入重谷氨酰胺(15N)(作為單體、二聚或多聚的谷氨酰胺和它們藥學(xué)可接受的鹽)可使得所有氨基糖被標(biāo)記且質(zhì)量位移+1道爾頓。本發(fā)明涉及用于重(同位素)標(biāo)記細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的復(fù)合糖的體系以促進(jìn)定量的糖組學(xué)。該方法依賴于以下事實(shí)，即眾多細(xì)胞或組織培養(yǎng)物體系需要添加內(nèi)源性Gln，且Gln是己糖胺生物合成途徑中氨基糖的唯一氮供體。因此，假設(shè)且顯示，如果在培養(yǎng)基中使用在側(cè)鏈(酰胺基)具有15N的重Gln，則包含GlcNAC、GalNAC和唾液酸的復(fù)合糖快速將重氮摻入這些單糖的每一種中。然后將重谷氨酰胺中生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織和其它生物物質(zhì)分離、提取等以得到包含聚糖的肽和脂質(zhì)，將它們定量和定性分析。該方法可用于評(píng)判聚糖半衰期，在兩份細(xì)胞或組織培養(yǎng)物樣品之間進(jìn)行相對(duì)定量，并輔助聚糖檢測(cè)、表征(聚糖的類型以及任選的聚糖綴合的肽或脂質(zhì)的類型)和驗(yàn)證。因此，使用本方法，可測(cè)定分化、疾病或病癥、藥物、激素或環(huán)境因素對(duì)聚糖的數(shù)量和質(zhì)量的影響并診斷性和治療性使用以辨別分化過(guò)程中聚糖的變化，診斷疾病狀態(tài)，監(jiān)測(cè)治療和測(cè)定藥物、激素和環(huán)境對(duì)生物物質(zhì)尤其是培養(yǎng)的細(xì)胞和組織的活性。因此，本發(fā)明涉及用15Gln精確比較在生物物質(zhì)尤其是細(xì)胞和組織中的聚糖水平的方法，其使用對(duì)生物物質(zhì)，尤其是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上的糖基(聚糖)的質(zhì)譜分析和同位素標(biāo)記以及任選的核磁共振(15N為順磁的)。在一方面，本發(fā)明允許快速地和幾乎完全地將15N摻入各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物體系中N-連接的和0-連接的聚糖的GlcNAc、GalNAc和唾液酸。除了通過(guò)LC-MSn和任選的NMR方法輔助指定結(jié)構(gòu)(肽或脂質(zhì)上局部的和聚糖的結(jié)構(gòu))，該方法還可確定從樣品分離的聚糖是從細(xì)胞過(guò)程還是血清糖蛋白獲得的。重要地是，該方法還可以定量方式在兩個(gè)細(xì)胞群之間比較聚糖。而且，可通過(guò)將細(xì)胞群從重標(biāo)記條件轉(zhuǎn)換為輕標(biāo)記條件且隨后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲且通過(guò)LC-MSn方法分析聚糖而對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行半衰期研究。因此，本發(fā)明是糖組學(xué)工具箱中易于使用且強(qiáng)大的新穎工具。注意到因?yàn)?5N為順磁的原子，使用質(zhì)譜分析的分析可以用聚焦于15N的NMR研究來(lái)補(bǔ)充。因?yàn)樘腔诙喾N生理和病理生理過(guò)程中起主要作用，本發(fā)明的使用非常寬且尤其包括以下方法1.在胚胎/成人干細(xì)胞分化或任何其它類型的分化(前脂肪細(xì)胞(preadipocytes)至脂肪細(xì)胞，神經(jīng)元先祖(progenitor)分化，等)后定義和定量糖組/糖蛋白組(glycoproteome)中的變化。該方法在分化過(guò)程中具有具體的適用性且可用于促進(jìn)各種多能干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及各種前體細(xì)胞的產(chǎn)生和方法，包括使用和包含特定類型和濃度的分化劑；2.在疾病進(jìn)展(誘導(dǎo)胰島素耐受性(II型糖尿病)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移潛力(癌癥)，等)時(shí)定義、定量和/或定性糖組/糖蛋白組中的變化。該方面可具體用于診斷疾病或監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)的進(jìn)展，包括代謝綜合征，I和II型糖尿病，肥胖癥，心血管疾病和損傷，神經(jīng)發(fā)育疾病，神經(jīng)病(包括阿爾茨海默病和帕金森病)，等；3.在藥物/小分子處理時(shí)定義和定量糖組/糖蛋白組的變化。該方面可具體用于測(cè)試藥物作為細(xì)胞活性和生物功能的抑制劑/激動(dòng)劑/調(diào)節(jié)劑的效能，且該活性和功能涉及聚糖產(chǎn)生；4.定義和定量蛋白質(zhì)(Ο-GlcNAc)的細(xì)胞內(nèi)糖基化的變化，已顯示該蛋白質(zhì)(Ο-GlcNAc)在II型糖尿病、τ病如阿爾茨海默病和帕金森疾病、心血管損傷等中涉及。該方面可具體用于確定治療干預(yù)在多種疾病狀態(tài)/癥狀中的適合性；5.在培養(yǎng)基或條件變化(為單克隆抗體或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生和相關(guān)的生物產(chǎn)物和細(xì)胞樣品按比例放大)時(shí)定義和定量糖組/糖蛋白組的變化。因此本發(fā)明提供以下的一項(xiàng)或多項(xiàng)1.在細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中穩(wěn)定的同位素標(biāo)記以進(jìn)行相對(duì)定量的糖組學(xué)/糖蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)(A對(duì)B)(類似于蛋白質(zhì)組學(xué)的SILAC)。2.使得細(xì)胞/組織中合成的糖組學(xué)結(jié)構(gòu)與來(lái)自培養(yǎng)基污染的聚糖/復(fù)合糖區(qū)別。3.使得進(jìn)行“脈沖追蹤”實(shí)驗(yàn)以研究聚糖結(jié)構(gòu)的半衰期。這也可用于確定在許多條件下聚糖結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化，以提供對(duì)于可影響聚糖結(jié)構(gòu)的半衰期的條件的深入了解。4.在聚糖序列測(cè)定過(guò)程中輔助指定結(jié)構(gòu)。5.通過(guò)快速檢測(cè)2份樣品之間的差異(簡(jiǎn)單的全MS光譜)減少糖組學(xué)工作，以使可進(jìn)行僅表征變化的結(jié)構(gòu)的工作。6.將穩(wěn)定的同位素差異用于MSn分析，使得對(duì)某結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多對(duì)峰，這有助于指定結(jié)構(gòu)和允許以MSn方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)相對(duì)定量。本發(fā)明涉及用于糖組學(xué)研究的體內(nèi)標(biāo)記策略。更具體地，本發(fā)明考慮用谷氨酰胺同位素檢測(cè)氨基糖，且其依賴于己糖胺生物合成途徑，該合成途徑使用谷氨酰胺的側(cè)鏈作為其在糖核苷酸的產(chǎn)生中氨基糖的氮的唯一供體源。因此，將具有15N標(biāo)記的側(cè)鏈(酰胺-15N-Gln)的谷氨酰胺引入無(wú)Gln的培養(yǎng)基可使得所有氨基糖，包括GlcNAC、GalNAC和唾液酸，變成用15N標(biāo)記的。通過(guò)以此方式摻入15N,N-和0-連接的聚糖、糖脂和細(xì)胞外基質(zhì)多糖的質(zhì)量(其都應(yīng)每氨基糖增加+1道爾頓單位)，可進(jìn)行測(cè)量和分析。因?yàn)?5N為順磁的且可適應(yīng)NMR研究，質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)可用NMR數(shù)據(jù)補(bǔ)充。本發(fā)明人通過(guò)分析輕和酰胺-15N-Gln中生長(zhǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞的蛋白質(zhì)釋放的N-連接的和0-連接的聚糖闡述了該方法的功用。本文提供的這些實(shí)驗(yàn)的成功清楚表明本方法可在細(xì)胞培養(yǎng)物中用于多種比較糖組學(xué)研究。本發(fā)明為細(xì)胞培養(yǎng)物體系中聚糖提供了易于實(shí)施且強(qiáng)大的同位素標(biāo)記策略。本方法依賴于以下事實(shí)，即Gln的酰胺側(cè)鏈?zhǔn)羌禾前飞锖铣赏緩街蠻DP-GlcNAc的唯一氮供體且UDP-GlcNAc為UDP-GalNAc和CMP_Neu5Ac(Ge)的生物合成底物。因此，本發(fā)明人使用小鼠ES細(xì)胞證實(shí)了，用酰胺-15N-Gln代替正常Gln補(bǔ)充物可使得在72小時(shí)標(biāo)記策略內(nèi)對(duì)N-連接的和0-連接的聚糖的GlcNAc、GalNAc和NeuAc殘基進(jìn)行幾乎完全的同位素標(biāo)記。本發(fā)明提供了兩份樣品間的從蛋白質(zhì)和脂質(zhì)釋放的聚糖的穩(wěn)固的定量。而且，該技術(shù)提供適用于直接檢測(cè)和定量糖肽的標(biāo)記策略。該策略在檢查對(duì)于從輕和重Gln-標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)物體系分離的蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)O-GIcNAC修飾3°中得到證實(shí)。15N-Gln也摻入蛋白質(zhì)，但如預(yù)期一樣沒(méi)有觀察到其它重氨基酸，該觀察結(jié)果提供了一種標(biāo)記策略，其可單獨(dú)使用或與重Arg/LysSILAC7分析組合使用以定量均來(lái)自相同樣品集的聚糖、蛋白質(zhì)和糖蛋白/糖肽。本方法也可用于定性(qualify)糖基化和確定蛋白質(zhì)和脂質(zhì)上的糖基的結(jié)合位點(diǎn)。最后，本方法可以計(jì)算樣品中所有含氨基糖的聚糖的半衰期，其通過(guò)首先完全標(biāo)記樣品，然后以一個(gè)或多個(gè)間隔用輕Gln代替重Gln并按時(shí)間過(guò)程分離和分析樣品。因此，本方法提供了強(qiáng)大的新的定量和定性的工具，以研究細(xì)胞培養(yǎng)物體系中聚糖、糖蛋白和糖脂的生物作用。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，公開(kāi)了用于比較一份或多份生物物質(zhì)，優(yōu)選細(xì)胞或組織(包括活細(xì)胞)樣品中聚糖的相對(duì)豐度的方法，其中樣品之一已經(jīng)通過(guò)暴露于處理進(jìn)行了調(diào)節(jié)，該處理如分化，藥物，激素，細(xì)菌或病毒，或刺激，如化學(xué)刺激或環(huán)境刺激。在本發(fā)明該方面，生物物質(zhì)(尤其是，細(xì)胞或組織)的第一樣品在含重谷氨酰胺C5N谷氨酰胺)的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)且生物物質(zhì)的第二樣品在含輕谷氨酰胺(14N谷氨酰胺)的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將該樣品之一(優(yōu)選暴露于重谷氨酰胺的樣品，進(jìn)行調(diào)節(jié))，然后將該樣品裂解、提取以取出蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)，且剩余的(未提取的)蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)任選進(jìn)一步分離為包含聚糖的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)，然后暴露于PNGaseF處理和β-消除以從樣品中包含的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)中釋放聚糖?？墒褂帽绢I(lǐng)域可用的標(biāo)準(zhǔn)方法從聚糖中去除蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)，包括液相色譜法(例如反相HPLC)，然后將聚糖樣品通過(guò)質(zhì)譜分析和任選的NMR進(jìn)行分析，以確定樣品中發(fā)現(xiàn)的聚糖的數(shù)量和類型。對(duì)于對(duì)照樣品進(jìn)行相同的過(guò)程和實(shí)施相應(yīng)分析(如果使用重谷氨酰胺而非輕谷氨酰胺在生長(zhǎng)過(guò)程中接觸對(duì)照樣品，則主要為MS，但任選NMR)，且對(duì)聚糖進(jìn)行定量和定性。將調(diào)節(jié)樣品所得的結(jié)果與對(duì)照樣品所得的結(jié)果進(jìn)行比較以確定該調(diào)節(jié)對(duì)聚糖數(shù)量和質(zhì)量具有的影響。如所指示的，調(diào)節(jié)可采取前體細(xì)胞分化為更成熟的細(xì)胞的形式以確定分化對(duì)聚糖含量和類型的影響、疾病狀態(tài)或異常狀況對(duì)細(xì)胞或組織的作用(診斷)，藥物或其它小分子對(duì)細(xì)胞(正常的、患病的或顯示癥狀的)的影響，以確定藥物或小分子的活性，相對(duì)于正常的對(duì)照細(xì)胞監(jiān)測(cè)患病或異常細(xì)胞(顯示待治療的癥狀)的治療，和確定按照制備過(guò)程的培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響。如所指示的，也可以在重谷氨酰胺中培養(yǎng)各樣品以不僅提供用于對(duì)聚糖殘基進(jìn)行質(zhì)譜分析的便利，而且提供受調(diào)節(jié)的生物物質(zhì)和對(duì)照物的聚糖結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步的相關(guān)信息。聚糖的分析可對(duì)分離的聚糖或聚糖結(jié)合的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)進(jìn)行。因此，在該方面，受調(diào)節(jié)的生物物質(zhì)和/或?qū)φ詹牧系妮^小的樣品可從剩余樣品分離，且包含聚糖的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)可直接通過(guò)MSn和任選的NMR分析以提供與結(jié)合至蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的聚糖和聚糖結(jié)合的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的類型和量相關(guān)的信息。本發(fā)明另一方面包括在MSn分析和任選的NMR分析之前使用例如，蛋白酶或脂酶將蛋白質(zhì)或脂質(zhì)暴露于消化，以確定聚糖-蛋白質(zhì)或聚糖-脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。如所討論的，聚糖從蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)釋放，其任選使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)消化(例如，對(duì)N-和0-連接的聚糖分別為PNGaseF處理和β-消除)。該釋放的聚糖然后使用MSn(例如，線離子阱質(zhì)譜儀或兼性(hybrid)線離子阱質(zhì)譜儀)和任選的NMR分析進(jìn)行分析。確定聚糖的總含量和/或使用本領(lǐng)域可用的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如碎裂規(guī)則和glycoworkbench(參見(jiàn)dkfz-heidelberg.de/spec/EUROCarbDB/GlycoWorkbench/以及NMR分析)作出聚糖結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)確定。此外，發(fā)生糖基化的蛋白質(zhì)和/或多肽和脂質(zhì)也可使用此技術(shù)(從質(zhì)譜分析確定結(jié)合至糖基的多肽和/或脂質(zhì))和類似技術(shù)(例如，從不具有糖苷連接的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分離出所有具有糖苷連接的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，然后在該群中辨別蛋白質(zhì)、多肽和脂質(zhì))確定。然后將所得結(jié)果與對(duì)照群獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)分析的目的，其可表示其它方面與含輕谷氨酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的分析的細(xì)胞群相同的對(duì)照細(xì)胞群，或者，該對(duì)照群可為前體群、正常細(xì)胞群(如果要檢查疾病狀態(tài))或有或沒(méi)有重谷氨酰胺的情況下生長(zhǎng)的其它群中的一種或多種。根據(jù)使用的對(duì)照群和細(xì)胞生長(zhǎng)條件，也獲得對(duì)照群的糖苷含量，然后與調(diào)節(jié)群比較。或者，且優(yōu)選地，可將樣品(調(diào)節(jié)樣品和對(duì)照)合并且可將相同步驟用于合并的樣品，使得糖基化的蛋白質(zhì)和/或糖基化的脂質(zhì)被收獲/分離，任選消化，并暴露于MSn和任選的NMR，以提供與蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)上的聚糖的程度、類型和結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的信息。在本發(fā)明該方面，調(diào)節(jié)樣品或?qū)φ諛悠?優(yōu)選地，調(diào)節(jié)樣品)在重谷氨酰胺的存在下生長(zhǎng)且另一樣品在輕谷氨酰胺的存在下生長(zhǎng)，將樣品合并且如上所述進(jìn)行合并的樣品的分析。使用該方法，實(shí)驗(yàn)處理量明顯增加且產(chǎn)生的MS數(shù)據(jù)可提供同位素比例，其可使得在單一合并的(匯聚的)和分析的樣品中在調(diào)節(jié)樣品和對(duì)照樣品之間進(jìn)行直接比較。在本發(fā)明某些方面，將該分離的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)(其可進(jìn)行或不進(jìn)行消化)進(jìn)行質(zhì)譜分析以得到質(zhì)譜。細(xì)胞群中同位素質(zhì)量的不同對(duì)于質(zhì)譜中各蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)和/或聚糖導(dǎo)致兩種獨(dú)特的、緊密間隔的峰(取決于樣品如何被加工)。質(zhì)譜中的一個(gè)峰相應(yīng)于來(lái)自具有正常同位素(輕谷氨酰胺)的合并的樣品的蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或聚糖。另一峰相應(yīng)于來(lái)自富含重谷氨酰胺的樣品的蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)和/或聚糖。在質(zhì)譜中的至少一對(duì)峰的峰強(qiáng)度之間計(jì)算比例。各樣品中聚糖(結(jié)合至蛋白質(zhì)、肽或脂質(zhì)的或自蛋白質(zhì)、肽或脂質(zhì)釋放的)的相對(duì)豐度可基于計(jì)算的比例確定。聚糖可通過(guò)質(zhì)譜中峰的質(zhì)荷比，以及本領(lǐng)域已知的其它手段，尤其包括NMR分析而鑒別。因此，兩份樣品的效果可通過(guò)用含重谷氨酰胺的培養(yǎng)基制備另外的樣品，且調(diào)節(jié)并分析該另外的樣品而同時(shí)分析。到質(zhì)譜分析時(shí)，該方法步驟中沒(méi)有一步將包含重谷氨酰胺的聚糖與包含輕谷氨酰胺的聚糖區(qū)分。因此，保持了來(lái)自兩份樣品的聚糖的原始量的比例，對(duì)樣品中蛋白質(zhì)的提取和分離之間的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。盡管已良好建立了對(duì)于釋放的、全甲基化的聚糖的結(jié)構(gòu)的鑒別，但本發(fā)明允許鑒別中增加的置信度，因?yàn)橛^察到的輕和重碎片之間m/z的位移必須相應(yīng)于提出的結(jié)構(gòu)中氮的數(shù)目。而且，置信度在碰撞誘導(dǎo)的解離后的串聯(lián)MS/MS光譜中獲得，因?yàn)閬?lái)自輕和重樣品的指定的碎片離子也必須包含確切數(shù)目的氮，其基于校正的m/z位移。最后，將重和輕的光譜進(jìn)行比較可使人們由那些包含氨基糖的聚糖或聚糖碎片的噪聲在全MS光譜和碎裂光譜中描繪完整的聚糖。發(fā)明詳述以下術(shù)語(yǔ)用于限定本發(fā)明。在術(shù)語(yǔ)在本文中沒(méi)有具體限定的情況下，該術(shù)語(yǔ)應(yīng)與本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)使用的、本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)方面所使用的語(yǔ)境中的意思一致。除非另有所述，本文使用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法。除了下文提供的術(shù)語(yǔ)的定義，也可使用分子生物學(xué)和生物化學(xué)中的常用術(shù)語(yǔ)的定義，例如參見(jiàn)Rieger等人，1991Glossaryofgenetics:classicalandmolecular,5thEd.,Berlin:Springer-Verlag；^CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人’Eds.,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.，(1998增刊)。應(yīng)理解如在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所使用的，根據(jù)其使用的環(huán)境，“一個(gè)"或"一種"可理解為一個(gè)/種或多個(gè)/種。因此，例如，關(guān)于"一個(gè)/種細(xì)胞"可理解為可使用至少一個(gè)/種細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”是指動(dòng)物，包括人，對(duì)于該動(dòng)物可提供本發(fā)明的治療、診斷或其它特征，或本發(fā)明的治療、診斷或其它特征與該動(dòng)物相關(guān)。所用的術(shù)語(yǔ)“生物物質(zhì)”、“細(xì)胞”和“組織”是指培養(yǎng)的生物細(xì)胞或組織，包括特別是，培養(yǎng)的人細(xì)胞、微生物細(xì)胞，組織，器官，且可包括為了診斷從整體動(dòng)物獲得的組織。在優(yōu)選方面，生物物質(zhì)主要為在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”用于描述非對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)該非對(duì)照實(shí)驗(yàn)條件使用本發(fā)明確定對(duì)生物物質(zhì)的影響和分析。調(diào)節(jié)條件與對(duì)照條件相對(duì)比。調(diào)節(jié)條件可包括將細(xì)胞暴露于分化條件、藥物、激素、環(huán)境條件、疾病狀態(tài)和異常條件以評(píng)估相比于正常細(xì)胞該調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞的糖組學(xué)的影響?！笆苷{(diào)節(jié)的”生物樣品或“受調(diào)節(jié)的細(xì)胞或組織”是那些暴露于實(shí)驗(yàn)(非對(duì)照)條件以評(píng)估相比于對(duì)照樣品那些條件對(duì)細(xì)胞的影響的細(xì)胞或組織?！罢{(diào)節(jié)劑”是一種試劑，其通常添加至培養(yǎng)基以按本文別處所述調(diào)節(jié)所述細(xì)胞。該調(diào)節(jié)劑可為分化劑、藥物、激素、另一化學(xué)品(包括嫌疑毒素(suspectedtoxin))、環(huán)境條件、制造條件、或引起疾病狀態(tài)的因子如微生物。術(shù)語(yǔ)“糖基化”用于描述一種過(guò)程，其中與糖基的連接的形成發(fā)生在蛋白質(zhì)(多肽)和脂質(zhì)上?！癗-連接的糖基化”基于寡糖，通常(但不唯一)在長(zhǎng)醇_脂質(zhì)平臺(tái)上合成，通過(guò)與多肽序列中的蘇氨酸或絲氨酸間隔靠近的氨基酸天冬酰胺連接至蛋白質(zhì)。相反，0-連接的糖基化基于寡糖基團(tuán)通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸的羥基直連接至蛋白質(zhì)。糖基化是將糖添加至蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過(guò)程或結(jié)果。該過(guò)程為在膜和分泌的蛋白質(zhì)的合成中4個(gè)主要的共翻譯和翻譯后修飾步驟中的一個(gè)，且粗ER中合成的大多數(shù)蛋白質(zhì)經(jīng)歷糖基化。其為酶-定向的位點(diǎn)特異的過(guò)程，與糖化的非酶促化學(xué)反應(yīng)相對(duì)。如上所述，存在兩種類型的糖基化至天冬酰胺側(cè)鏈的酰胺氮的N-連接的糖基化和至絲氨酸和蘇氨酸側(cè)鏈的羥基氧的0-連接的糖基化。附著至靶蛋白的多糖鏈有多種功能。例如，一些蛋白質(zhì)只有在首先將它們糖基化后才正確折疊。而且，在蛋白質(zhì)中連接在天冬酰胺的酰胺氮上的多糖對(duì)一些分泌的糖蛋白賦予穩(wěn)定性。一些實(shí)驗(yàn)顯示該情況下糖基化不是適當(dāng)折疊所嚴(yán)格要求的，但未糖基化的蛋白質(zhì)快速降解。糖基化可在細(xì)胞-細(xì)胞粘附中(免疫系統(tǒng)的細(xì)胞使用的機(jī)理)，以及分化過(guò)程中起作用。對(duì)于糖基化有多種機(jī)理，盡管它們都具有一些共同的特征。糖基化為酶促的過(guò)程，供體分子為活化的核苷酸糖且該過(guò)程為位點(diǎn)_特異的。N-連接的糖基化對(duì)一些真核蛋白質(zhì)的折疊是重要的。N-連接的糖基化過(guò)程在所有真核生物中發(fā)生。對(duì)于N-連接的寡糖，14-糖前體(長(zhǎng)醇)首先添加至靶蛋白的多肽鏈中的天冬酰胺。該前體的結(jié)構(gòu)是大多數(shù)真核生物共有的，且包含3個(gè)葡萄糖，9個(gè)甘露糖，和2個(gè)N-乙?；咸前贩肿印Ｒ唤M復(fù)雜的反應(yīng)將該分支的鏈附著至稱為長(zhǎng)醇的載體分子，且然后隨著其移位至ER內(nèi)腔中，其被轉(zhuǎn)移至多肽鏈上合適的點(diǎn)。存在兩種主要類型的N-連接的糖高-甘露糖寡糖和復(fù)合寡糖。高-甘露糖實(shí)質(zhì)上僅為兩個(gè)N-乙?；咸前?，其具有許多甘露糖殘基，通常幾乎與其連接至蛋白質(zhì)之前在前體寡糖中觀察到的一樣多。復(fù)合寡糖如此命名是因?yàn)樗鼈兛砂瑤缀跞魏螖?shù)目的其它類型的糖，包括多于初始的兩個(gè)N-乙?；咸前贰５鞍踪|(zhì)可通過(guò)這兩種類型的寡聚物(oligos)在蛋白質(zhì)的不同部分糖基化。認(rèn)為寡糖是高-甘露糖還是復(fù)合物取決于其對(duì)高爾基體中的糖修飾蛋白質(zhì)的可及性(accessibility)。如果糖相對(duì)難接近，其最有可能保持其原始高-甘露糖形式。如果其是易接近的，則很可能許多甘露糖殘基將會(huì)切割掉，且糖將會(huì)如上述討論的通過(guò)添加其它類型的基團(tuán)而進(jìn)一步修飾。寡糖鏈通過(guò)寡糖基轉(zhuǎn)移酶附著至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中出現(xiàn)的天冬酰胺，其中X可為任何氨基酸，除了脯氨酸。該序列已知為糖基化sequon。附著后，一旦蛋白質(zhì)正確折疊，三個(gè)葡萄糖殘基從鏈去除，且可使得蛋白質(zhì)從ER輸出。然后將如此形成的糖蛋白運(yùn)送至高爾基體，在那里可發(fā)生進(jìn)一步的甘露糖殘基的去除。然而，糖基化本身似乎對(duì)于蛋白質(zhì)的正確運(yùn)送靶向不像人們想的那樣是必需的。涉及阻斷某些糖基化中步驟的藥物或糖基化酶缺陷的突變體細(xì)胞的研究，仍然產(chǎn)生正確靶向的其它方面結(jié)構(gòu)上_正常的蛋白質(zhì)，且這種干涉似乎不嚴(yán)重干擾細(xì)胞的活力。成熟的糖蛋白可包含許多含5至9個(gè)甘露糖殘基的寡甘露糖N-連接的寡糖。進(jìn)一步去除甘露糖殘基導(dǎo)致包含3個(gè)甘露糖和2個(gè)N-乙?；咸前窔埢?核心'結(jié)構(gòu)，然后可將其用許多不同的單糖伸長(zhǎng)，該單糖包括半乳糖、N-乙?；咸前?、N-乙酰基半乳糖胺、巖藻糖和唾液酸。0-連接的糖基化在蛋白質(zhì)加工的后期發(fā)生，很可能在高爾基體中。這是通過(guò)酶UDP-N-乙?；?D-半乳糖胺多肽N-乙?；被肴樘腔D(zhuǎn)移酶(EC2.4.1.41)向絲氨酸或蘇氨酸殘基添加N-乙?；?半乳糖胺，然后是其它碳水化合物(如半乳糖和唾液酸)。該過(guò)程對(duì)于某些類型的蛋白質(zhì)如蛋白聚糖是重要的，其涉及向初始未糖基化的"蛋白聚糖核心蛋白質(zhì)"添加糖胺聚糖鏈。這些加成物通常為絲氨酸0-連接的糖蛋白，其看起來(lái)具有兩項(xiàng)主要功能中的至少一項(xiàng)。一項(xiàng)功能包括分泌以形成細(xì)胞外基質(zhì)的成分，通過(guò)蛋白聚糖的大的糖復(fù)合物之間的相互作用將一個(gè)細(xì)胞粘附至另一個(gè)。另一項(xiàng)主要功能為作為粘膜分泌物的成分，且正是高濃度的碳水化合物傾向于給予粘液其"粘質(zhì)的"感覺(jué)。血液中循環(huán)的蛋白質(zhì)在正常情況中不是0-糖基化的，除了某些類型的抗體(IgAl和IgD)和Cl-抑制劑。0-巖藻糖在Notch蛋白質(zhì)中的EGF樣重復(fù)的第二和第三保守半胱氨酸之間添加，且可能通過(guò)GDP-巖藻糖蛋白質(zhì)0-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1為其它底物，且通過(guò)GDP-巖藻糖蛋白質(zhì)0-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2添加至血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)。在EGF樣重復(fù)的情況下，0-巖藻糖可通過(guò)按序添加N-乙?；咸前?GlcNAc)、半乳糖和唾液酸進(jìn)一步伸長(zhǎng)為四糖，而對(duì)于血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)，可通過(guò)添加葡萄糖伸長(zhǎng)為二糖。這些巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶都已定位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這對(duì)于糖基轉(zhuǎn)移酶是不尋常的，大多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶在高爾基體中起作用。0-葡萄糖在Notch蛋白質(zhì)中的EGF樣重復(fù)的第一和第二保守半胱氨酸之間添加，且可能通過(guò)未鑒別的0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為其它底物。將O-N-乙?；咸前?Ο-GlcNAc)通過(guò)O-GIcNAC轉(zhuǎn)移酶添加至絲氨酸或蘇氨酸。O-GlcNAc似乎出現(xiàn)在其它情況中可通過(guò)絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸上。因此，如果發(fā)生磷酸化，則Ο-GlcNAc不會(huì)出現(xiàn)，且反之亦然。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榱姿峄?或脫磷酸已成為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要指示。糖基化的另一形式為GPI錨。這種形式的糖基化發(fā)揮將蛋白質(zhì)通過(guò)聚糖鏈附著至疏水脂質(zhì)錨的功能(也可參見(jiàn)異戊烯化)，在細(xì)胞表面上很常見(jiàn)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“氨基糖”廣泛地指任何包含氨基以代替羥基的糖。含胺的糖的衍生物，如N-乙酰基葡糖胺和唾液酸，盡管不明確地包含胺，也可認(rèn)為是氨基糖。本文使用的術(shù)語(yǔ)“氨基糖”可特別指具有氨基或取代的氨基以代替非糖苷羥基的單糖。氨基糖包括，葡萄糖-N-乙?；?GlcNAc)，半乳糖-N-乙?；?GalNAc)和唾液酸，其為本發(fā)明的代表性氨基糖。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚糖”或“糖基”表示多糖或寡糖。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚糖”或“糖基”也是指復(fù)合糖(glycoconjugate)，如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的碳水化合物部分。聚糖可為單糖殘基的均聚物或雜聚物且可為線性或分支的。本文使用的術(shù)語(yǔ)“復(fù)合糖”是指與其它化學(xué)物質(zhì)共價(jià)連接的碳水化合物。在糖蛋白或蛋白聚糖中，聚糖連接至蛋白質(zhì)或多肽。在糖脂或脂多糖中，聚糖連接至脂質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“糖組學(xué)”是指對(duì)給定細(xì)胞類型或有機(jī)體的所有聚糖結(jié)構(gòu)或糖組(有機(jī)體的整個(gè)糖補(bǔ)集(complement)，無(wú)論是游離的還是在更復(fù)雜的分子中存在)的系統(tǒng)研究，包括遺傳、生理、病理以及其它方面。糖組學(xué)，類似于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的術(shù)語(yǔ)，是“糖組”(有機(jī)體的整個(gè)糖的補(bǔ)充(complement)，無(wú)論是游離的還是在更復(fù)雜的分子中存在)的綜合研究，包括遺傳、生理、病理以及其它方面。糖組學(xué)"是給定細(xì)胞類型或有機(jī)體的所有聚糖結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)研究"。因此有機(jī)體中碳水化合物的整體性的身份統(tǒng)稱為糖組。在本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)"有效量"是描述在本發(fā)明中使用以產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的成分的濃度或量。成分的有效量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常知道且在本發(fā)明的方法中通常使用的那些。在本發(fā)明一個(gè)方面，同位素標(biāo)記的谷氨酰胺的有效量表示待分析的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中包括的谷氨酰胺的量(約0.1至約IOmM或更多，優(yōu)選約0.5至5mM，約1至約3mM，約2mM)能為分析目的有效地同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的糖基上的氨基糖。通常，細(xì)胞培養(yǎng)約18-24小時(shí)(少于1天)至約1天)至約14天或更多，約24小時(shí)至約5天(120小時(shí))，約36小時(shí)至約96小時(shí)，約48小時(shí)至約84小時(shí)，約60小時(shí)至約72小時(shí)。在優(yōu)選方面，優(yōu)選15N-谷氨酰胺的高同位素富集。優(yōu)選富集15N達(dá)到約90-100%水平的培養(yǎng)基，最優(yōu)選100%富集。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”用于描述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中根據(jù)本發(fā)明待分析的細(xì)胞被制備、穩(wěn)定(生長(zhǎng))，或者，從多潛能細(xì)胞或其它前體細(xì)胞，例如，干細(xì)胞(如人胚胎干細(xì)胞，成人干細(xì)胞或其它細(xì)胞)、祖細(xì)胞或其它細(xì)胞或分化細(xì)胞分化為一種或多種中間的或成熟的細(xì)胞。可在本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的且優(yōu)選包含至少一種極限必需培養(yǎng)基加任選成分如生長(zhǎng)因子、視黃酸、葡萄糖、非必需氨基酸、鹽(包括痕量元素)、谷氨酰胺(“輕”或“重”)、胰島素(在指明和不排除的情況中)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β巰基乙醇和本領(lǐng)域熟知的和本文另外描述的其它試劑。可使用的細(xì)胞培養(yǎng)基包括含2%至20%(優(yōu)選地，約10%)胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，或?qū)τ谙薅ǖ呐囵B(yǎng)基不含胎牛血清和KSR，但包括例如，牛血清清蛋白)?？墒褂萌魏螖?shù)目的細(xì)胞培養(yǎng)基，且其是本領(lǐng)域熟知的。根據(jù)待生長(zhǎng)、穩(wěn)定和/或分化的細(xì)胞類型，改變成分以最大化所需結(jié)果。DMEM/F12為優(yōu)選的細(xì)胞培養(yǎng)基，其經(jīng)常用于干細(xì)胞和/或多潛能細(xì)胞的分化和或生長(zhǎng)。其包含10%FCS。多種其它細(xì)胞培養(yǎng)基也可用于本發(fā)明。本發(fā)明可用的細(xì)胞培養(yǎng)基是可商購(gòu)的且可補(bǔ)充可商購(gòu)的成分，該可商購(gòu)的成分可獲自InvitrogenCorp.(GIBCO),CellApplications,Inc.禾口BiologicalIndustries,BethHaEmek,Israel,以及眾多其它商業(yè)來(lái)源。在其中前體細(xì)胞分化的優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種分化劑如一種或多種生長(zhǎng)因子、視黃酸、合成劑如LY294002等多種其它試劑添加至干細(xì)胞、祖細(xì)胞或其它前體細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，以促進(jìn)干細(xì)胞分化為祖細(xì)胞，和祖細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞或肝細(xì)胞，或干細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞或肝細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本發(fā)明將能夠易于改變細(xì)胞培養(yǎng)基以生成祖細(xì)胞或胰腺/肝細(xì)胞。細(xì)胞分化培養(yǎng)基基本與細(xì)胞培養(yǎng)基同義且涵蓋在細(xì)胞培養(yǎng)基之下，但在分化過(guò)程時(shí)使用，且包含細(xì)胞分化劑以將細(xì)胞分化為其它細(xì)胞。穩(wěn)定培養(yǎng)基是一類細(xì)胞培養(yǎng)基，其在分化步驟之前或之后使用，以穩(wěn)定細(xì)胞系以進(jìn)一步使用，且有時(shí)，但不總是，與細(xì)胞通常生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基相同。通常，如本文所述，細(xì)胞分化培養(yǎng)基和穩(wěn)定培養(yǎng)基可包括與細(xì)胞培養(yǎng)基基本類似的成分，但在不同環(huán)境下使用且可包含不同成分以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基用途的預(yù)期結(jié)果。細(xì)胞，尤其在分化時(shí)，可生長(zhǎng)在細(xì)胞支持物上，包括，例如，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，如層粘連蛋白、生腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白及其混合物，以及其它本發(fā)明可使用的分化蛋白質(zhì)，包括例如，膠原、纖連蛋白、vibronectin、聚賴氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸及其混合物。此外，也可使用包含有效濃度的這些分化蛋白質(zhì)的一種或多種的凝膠和其它材料。示例性胚胎干細(xì)胞分化蛋白質(zhì)或包含這@分化蛋白質(zhì)的材料包括,例如,BDCell-Tak"細(xì)胞和組織粘合劑，BDaFIBR0GEN人重組膠原I,BDaFIBR0GEN人重組膠原III,BDMatrigel1"基底膜基體,皿Matrigeln高濃度(HC)基底膜基體,BPPuraMatrix1"多肽水凝膠,膠原I,高濃度(HC)膠原I,膠原11(牛),膠原III,膠原IV,膠原V,和膠原VI,等。如本文所述，當(dāng)涉及細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離”是指從細(xì)胞源基本分離，使得特定類型的細(xì)胞、細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群被純化。此外，術(shù)語(yǔ)“分離”用于描述從兩種或更多種細(xì)胞的組物理選擇出一種或多種細(xì)胞，其中該細(xì)胞基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和/或各種標(biāo)記的表達(dá)選擇。如本文所述，術(shù)語(yǔ)"接觸"或“暴露”(即，將細(xì)胞與化合物，且特別是細(xì)胞培養(yǎng)物中的同位素或非同位素標(biāo)記的谷氨酰胺接觸或暴露)是指包括將化合物和細(xì)胞一起在體外溫育(例如，將化合物添加至培養(yǎng)的細(xì)胞，如貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng))。術(shù)語(yǔ)“同位素標(biāo)記的谷氨酰胺”或“重谷氨酰胺”是指谷氨酰胺或其藥學(xué)可接受的鹽，其在酰胺位置用15N標(biāo)記(參見(jiàn)下文)。非同位素標(biāo)記的谷氨酰胺或“輕谷氨酰胺”是指天然或非同位素標(biāo)記的谷氨酰胺。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)重谷氨酰胺應(yīng)指一群谷氨酰胺分子，其基本上(即，至少約85-90%，至少約92%，至少約95%，至少約96%，至少約98%，至少約99%和接近100%重量)為重谷氨酰胺。在優(yōu)選方面，輕谷氨酰胺在重谷氨酰胺樣品中的量不大于微小的百分比重量_通常少于約2%重量-基本上無(wú)輕谷氨酰胺。在輕谷氨酰胺的情況下，該術(shù)語(yǔ)是指一群谷氨酰胺分子，其包含不大于天然存在量的重谷氨酰胺，且通常少于5%，少于4%，少于2%重谷氨酰胺。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即將生物物質(zhì)(包括細(xì)胞和/或組織)在包含有效量的同位素標(biāo)記的谷氨酰胺的培養(yǎng)基中溫育至少約18小時(shí)(約24小時(shí)，約36小時(shí)，約48，約60小時(shí)，約72小時(shí)，約84小時(shí)，約96小時(shí)，約108小時(shí)，約120小時(shí)或更多，優(yōu)選約48小時(shí)至96小時(shí)，約72小時(shí))將導(dǎo)致代謝標(biāo)記，以將穩(wěn)定的同位素或氮15N摻入培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞的聚糖中。因此本發(fā)明涉及利用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)物中的聚糖以進(jìn)行相對(duì)定量的糖組學(xué)的方法。本發(fā)明依賴于己糖胺生物合成途徑，該合成途徑使用谷氨酰胺的側(cè)鏈作為其在糖核苷酸的制備中氨基糖的氮的唯一供體源。因此，例如，向其它方面無(wú)Gln的培養(yǎng)基引入重谷氨酰胺(15N)(作為單體、二聚或聚合的谷氨酰胺和它們藥學(xué)可接受的鹽)可使得所有氨基糖變?yōu)闃?biāo)記的且質(zhì)量位移+1道爾頓。本發(fā)明涉及用于重(同位素)標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)物中的復(fù)合糖的方法以促進(jìn)定量的糖組學(xué)一用于復(fù)合糖。該方法依賴于以下事實(shí)，即眾多細(xì)胞培養(yǎng)物體系需要添加內(nèi)源性谷氨酰胺(Gln)，且Gln是己糖胺生物合成途徑中氨基糖的唯一氮供體。因此，已確定當(dāng)在培養(yǎng)基中使用在側(cè)鏈(酰胺)具有15N的重Gln時(shí)，包含GlcNAC、GalNAC和唾液酸的復(fù)合糖快速將重氮摻入這些單糖的每一種中。該方法可用于評(píng)判聚糖半衰期，在兩份細(xì)胞培養(yǎng)物樣品之間進(jìn)行相對(duì)定量，并輔助聚糖檢測(cè)、表征和驗(yàn)證，尤其因?yàn)槠渖婕胺只^(guò)程細(xì)胞中的聚糖變化的影響，包括隨著細(xì)胞成熟聚糖組成的變化的影響。該方法還用于分析細(xì)胞糖基化對(duì)疾病狀態(tài)和疾病進(jìn)展的影響。在一方面，本發(fā)明可使得快速和接近完全地將15N摻入各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物體系中的N-連接的和0-連接的聚糖的GlcNAC、GalNAC和唾液酸中。除了通過(guò)液相色譜法/質(zhì)譜分析(LC-MSn)方法輔助指定結(jié)構(gòu)，該方法還可使我們確定從樣品分離的聚糖是從細(xì)胞過(guò)程還是血清糖蛋白獲得的。重要地是，該方法可以定量方式在兩個(gè)細(xì)胞群之間比較聚糖。而且，可通過(guò)將細(xì)胞群從重標(biāo)記條件轉(zhuǎn)換為輕標(biāo)記條件且隨后在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲且通過(guò)LC-MSn方法分析聚糖而對(duì)聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行半衰期研究。因此，本方法是糖組學(xué)工具箱中易于使用且極其強(qiáng)大的新穎工具。因?yàn)樘腔诙喾N生理和病理生理過(guò)程中起主要作用，該技術(shù)的使用非常寬且尤其包括以下方法1.在胚胎/成人干細(xì)胞分化或任何其它類型的分化(例如，祖細(xì)胞至產(chǎn)生自祖細(xì)胞的更成熟的細(xì)胞，前脂肪細(xì)胞至脂肪細(xì)胞，神經(jīng)元先祖分化，等)后定義和定量糖組/糖蛋白組(glycoproteome)中的變化。該方法在分化過(guò)程中具有具體的適用性且可用于促進(jìn)各種多能干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及各種前體細(xì)胞的產(chǎn)生和方法；2.疾病進(jìn)展(例如，誘導(dǎo)胰島素耐受性(II型糖尿病)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移潛力(癌癥)，等)以及多種其它疾病狀態(tài)如阿爾茨海默病和帕金森病和心血管損傷時(shí)定義、定量糖組/糖蛋白組中的變化。本發(fā)明該方面可具體用于診斷疾病或監(jiān)測(cè)糖基化受影響的實(shí)際上任何疾病狀態(tài)的進(jìn)展；3.在藥物/小分子處理時(shí)定義和定量糖組/糖蛋白組的變化。該方面可具體用于測(cè)試藥物作為細(xì)胞活性和生物功能的抑制劑/激動(dòng)劑/調(diào)節(jié)劑的效能；4.定義和定量蛋白質(zhì)(Ο-GlcNAc)的細(xì)胞內(nèi)糖基化的變化，已顯示該蛋白質(zhì)(Ο-GlcNAc)在II型糖尿病、τ病如阿爾茨海默病和帕金森疾病、心血管損傷等中涉及。該方面可具體用于確定治療干預(yù)在多種疾病狀態(tài)/癥狀中的適合性；5.在培養(yǎng)基或條件變化(為單克隆抗體或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生和相關(guān)的生物產(chǎn)物和細(xì)胞樣品按比例放大)時(shí)定義和定量糖組/糖蛋白組的變化。該方面涉及增強(qiáng)細(xì)胞環(huán)境內(nèi)出現(xiàn)的生物產(chǎn)品的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的方法提供以下的一項(xiàng)或多項(xiàng)1.在細(xì)胞培養(yǎng)物中穩(wěn)定的同位素標(biāo)記以在體內(nèi)進(jìn)行相對(duì)定量的糖組學(xué)/糖蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)(Α對(duì)B)(類似于蛋白質(zhì)組學(xué)的SILAC)。2.使得細(xì)胞中合成的糖組學(xué)結(jié)構(gòu)與來(lái)自培養(yǎng)基污染的聚糖/復(fù)合糖區(qū)別。3.使得進(jìn)行“脈沖追蹤”實(shí)驗(yàn)以研究聚糖結(jié)構(gòu)的半衰期。4.在聚糖序列測(cè)定過(guò)程中輔助指定結(jié)構(gòu)。5.通過(guò)快速檢測(cè)2份樣品之間的差異(簡(jiǎn)單的全MS光譜)減少糖組學(xué)工作，以使可進(jìn)行僅表征變化的結(jié)構(gòu)的工作。6.將穩(wěn)定的同位素差異用于MSn*析，使得對(duì)某結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多對(duì)峰，這有助于指定結(jié)構(gòu)和允許以MSn方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)相對(duì)定量。有多種使用本方法的途徑。例如，一個(gè)途徑為將待分析的細(xì)胞群在重谷氨酰胺細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。一段時(shí)間后，收集細(xì)胞，提取，收集蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)且進(jìn)行肽或脂質(zhì)消化。使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將聚糖從消化的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)釋放(例如，對(duì)于N-和0-連接的聚糖分別為PNGaseF處理和β-消除)。然后將聚糖使用MSn(例如，線離子阱質(zhì)譜儀或兼性線離子阱質(zhì)譜儀)和任選的NMR進(jìn)行分析。確定聚糖的總含量和/或使用本領(lǐng)域可用的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如碎裂規(guī)則和glyco工作臺(tái)(參見(jiàn)dkfz-heidelberg.de/spec/EUROCarbDB/GlycoWorkbench/)作出聚糖結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)確定。此外，發(fā)生糖基化的蛋白質(zhì)和/或多肽和脂質(zhì)也可使用此技術(shù)(從質(zhì)譜分析確定結(jié)合至糖基的多肽和/或脂質(zhì))和類似技術(shù)(例如，從不具有糖苷連接的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分離出所有具有糖苷連接的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，然后在該群中辨別蛋白質(zhì)、多肽和脂質(zhì))確定。然后將所得結(jié)果與對(duì)照群獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)分析的目的，其可表示其它方面與含輕谷氨酰胺的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的分析的細(xì)胞群相同的對(duì)照細(xì)胞群，或者，該對(duì)照群可為前體群、正常細(xì)胞群(如果要檢查疾病狀態(tài))或有或沒(méi)有重谷氨酰胺的情況下生長(zhǎng)的其它群中的一種或多種。根據(jù)使用的對(duì)照群和細(xì)胞生長(zhǎng)條件，也獲得對(duì)照群的糖苷含量，然后與分析的群比較。盡管從釋放的、全甲基化的聚糖鑒別結(jié)構(gòu)是已良好建立的，但本發(fā)明允許鑒別中增加的置信度，因?yàn)橛^察到的輕和重峰之間m/z的位移必須相應(yīng)于提出的結(jié)構(gòu)中氮的數(shù)目。而且，置信度在碰撞誘導(dǎo)的解離后的串聯(lián)MS/MS光譜中獲得，因?yàn)閬?lái)自輕和重樣品的指定的碎片離子也必須包含確切數(shù)目的氮，其基于校正的m/z位移。最后，將重和輕的光譜進(jìn)行比較可使人們由那些包含氨基糖的聚糖或聚糖碎片的噪聲在全MS光譜和碎裂光譜中描繪完整的聚糖。在本發(fā)明優(yōu)選方面，將調(diào)節(jié)樣品和對(duì)照樣品合并，處理且之后使用MS和任選的NMR分析進(jìn)行分析。上述各步驟是相同的，除了在處理之前將對(duì)照樣品和調(diào)節(jié)樣品合并。用MS分析得到一種光譜，其提供重同位素標(biāo)記的碎片與輕同位素標(biāo)記的碎片的比例，且根據(jù)這些比例，可確定有關(guān)糖基化的量，存在的聚糖類型(結(jié)構(gòu))和糖基化的位點(diǎn)(在蛋白質(zhì)、肽或脂質(zhì)上)。任選使用的NMR數(shù)據(jù)可向糖組學(xué)分析提供進(jìn)一步的輸入資料。分化作為實(shí)例且不是用來(lái)限制，在為確定從前體細(xì)胞至成熟的細(xì)胞的分化過(guò)程中對(duì)糖苷含量和糖基化的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)的類型和糖基化的程度的影響而進(jìn)行的研究中，前體細(xì)胞在含同位素標(biāo)記的谷氨酰胺的以及分化劑的細(xì)胞培養(yǎng)基的存在下分化(調(diào)節(jié))為成熟的細(xì)胞。在包含輕谷氨酰胺且不含分化因子的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以制備對(duì)照細(xì)胞。然后將所得分化的細(xì)胞按上述分析以確定糖基化的程度和類型以及任選的分化過(guò)程中發(fā)生糖基化的蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)。將分化的細(xì)胞所得的結(jié)果與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較，該對(duì)照細(xì)胞可在同位素標(biāo)記的谷氨酰胺的存在或不存在下生長(zhǎng)，且所得糖基化分析與分化細(xì)胞所得的分析進(jìn)行比較，從而建立糖基化的程度和類型和分化過(guò)程糖基化的蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)。優(yōu)選地，將對(duì)照細(xì)胞和分化細(xì)胞合并，一起處理和分析。所得MSn和任選的NMR分析提供的數(shù)據(jù)足以按分化細(xì)胞和前體(未分化的對(duì)照細(xì)胞)相比確定增加的/減少的糖基化的程度和類型，差別糖基化的蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)，以及糖基化在蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)上的位點(diǎn)。上述糖組學(xué)分析也可用于辨別會(huì)增加(例如，細(xì)胞純度和數(shù)目)前體細(xì)胞分化至更成熟細(xì)胞的分化因子和/或細(xì)胞培養(yǎng)基條件。疾病進(jìn)展/診斷本方法可用于通過(guò)分析發(fā)展為疾病狀態(tài)或異常條件的細(xì)胞中糖組學(xué)變化確定疾病或異常條件對(duì)生物物質(zhì)(細(xì)胞和/或組織)的影響。處于疾病狀態(tài)或顯示異常癥狀的細(xì)胞或組織在重谷氨酰胺的存在下在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。對(duì)照細(xì)胞(正常狀態(tài)，不存在疾病或癥狀)也在輕谷氨酰胺的存在下在相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。足夠時(shí)間后(如本文別處公開(kāi)的，優(yōu)選約72小時(shí)或更多)，各細(xì)胞樣品分開(kāi)處理，或優(yōu)選地，如上文進(jìn)行合并并分析^3"和任選的NMR)以確定疾病狀態(tài)或癥狀對(duì)聚糖的量、類型/結(jié)構(gòu)和它們與蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)的結(jié)合(包括結(jié)合位點(diǎn))的影響。所得結(jié)果提供了標(biāo)記，其可用于診斷患者中疾病或異常條件的存在。該方法可用于診斷疾病，其通過(guò)使用本方法比較嫌疑具有疾病或異常癥狀的細(xì)胞樣品與正常細(xì)胞以提供對(duì)各樣品的糖組學(xué)分析并比較該結(jié)果而進(jìn)行。該樣品可分開(kāi)分析，或如本文別處所述進(jìn)行合并并分析。藥物活性或毒性本方法也可用于確定細(xì)胞或組織暴露的藥物或小分子可具有的對(duì)于細(xì)胞或組織樣品的糖組學(xué)的影響。在本發(fā)明該方面，一種或多種細(xì)胞樣品在含有效量的重谷氨酰胺的培養(yǎng)基的存在下暴露于單一濃度或不同濃度的藥物或小分子。對(duì)照樣品在不存在藥物且包含輕谷氨酰胺的相同細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。足夠時(shí)間后(例如，約72小時(shí)或如本文別處所述)，收集樣品且按別處所述進(jìn)行處理。各樣品(包括對(duì)照樣品)可進(jìn)行分析以分析測(cè)試濃度的藥物可對(duì)細(xì)胞或組織的糖組學(xué)產(chǎn)生的影響?；蛘撸苷{(diào)節(jié)的細(xì)胞樣品(以單一藥物濃度)可與對(duì)照樣品合并且按本文別處所述進(jìn)行處理以提供藥物濃度對(duì)測(cè)試的細(xì)胞的糖組學(xué)的影響的指示。該方法可用于測(cè)試藥物和其它小分子對(duì)于細(xì)胞的活性以及潛在毒性。制備/生產(chǎn)效率本方法也可用于辨別成分或條件以確定制備方法或增強(qiáng)細(xì)胞或組織的制備效率，尤其包括將以顯著數(shù)目分化和產(chǎn)生的細(xì)胞或組織。在該方法中，待制備/分化的細(xì)胞樣品在包含重谷氨酰胺的培養(yǎng)基的存在下暴露于不同培養(yǎng)條件(時(shí)間，溫度，培養(yǎng)基組分，分化劑)，保持與制備一致的時(shí)間(約18小時(shí)至幾周或更多，通常約2-5天，取決于狀況)，且與對(duì)照樣品制備比較，例如，最終細(xì)胞群，包括例如，從在標(biāo)準(zhǔn)分化情況下(已知時(shí)間，已知成分，已知生成的最終細(xì)胞/組織的純度)但沒(méi)有待測(cè)分化劑或其它成分且在重谷氨酰胺的存在下生長(zhǎng)的前體細(xì)胞產(chǎn)生的分化的細(xì)胞群。將調(diào)節(jié)樣品生長(zhǎng)不同的時(shí)間(包括生成對(duì)照細(xì)胞的時(shí)間)，且調(diào)節(jié)樣品(具有測(cè)試成分和條件)使用本發(fā)明的方法在不同時(shí)間間隔分析以確定與對(duì)照樣品相比分化的產(chǎn)物的相對(duì)效率、純度和制備的效率?？芍苽涠喾菡{(diào)節(jié)樣品以確定細(xì)胞/組織產(chǎn)物的最佳制備條件。聚糖半衰期本發(fā)明的另一應(yīng)用為計(jì)算聚糖個(gè)體的半衰期。在該實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞用酰胺-15N-Gln標(biāo)記完全(持續(xù)時(shí)間范圍約24小時(shí)至約120小時(shí)，優(yōu)選約60-72小時(shí))，在該點(diǎn)時(shí)使用本文別處所述的方法分析細(xì)胞以提供了數(shù)量和質(zhì)量的指示，包括該點(diǎn)時(shí)細(xì)胞的聚糖內(nèi)容的結(jié)構(gòu)特征。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至僅包含14-NGln的培養(yǎng)基。在不同時(shí)間點(diǎn)獲取部分14N標(biāo)記的細(xì)胞且與全標(biāo)記的15N細(xì)胞混合以計(jì)算各聚糖結(jié)構(gòu)的摻入比例對(duì)于時(shí)間的函數(shù)。通過(guò)將此在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，且繪制相對(duì)時(shí)間的％摻入，可計(jì)算細(xì)胞中各聚糖的半衰期。也可將該實(shí)驗(yàn)組合以計(jì)算在對(duì)于細(xì)胞的任何干擾，如轉(zhuǎn)化、分化、藥物處理或供給條件的任何變化時(shí)聚糖的半衰期。通常，用于與對(duì)照細(xì)胞比較分析糖苷含量變化的細(xì)胞在用15N標(biāo)記的重谷氨酰胺中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間后，通常至少約18小時(shí)，但更具體約為60-72小時(shí)或更多，將細(xì)胞收集、溶解，將蛋白質(zhì)提取、分離/收集，然后使用MSn分析以確定蛋白質(zhì)個(gè)體(其可另外被消化以提供糖基化的肽，其可被測(cè)量)的總糖苷含量?？蓽y(cè)定細(xì)胞的總糖苷含量且與不含重標(biāo)記的谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)照細(xì)胞群比較。優(yōu)選將生長(zhǎng)的樣品合并以提供一批中各碎片的比例以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)處理量。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選方法中，受調(diào)節(jié)的細(xì)胞/組織樣品生長(zhǎng)在含重谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，且對(duì)照樣品生長(zhǎng)在與調(diào)節(jié)樣品實(shí)質(zhì)上相同的培養(yǎng)基中，不同地是在該培養(yǎng)基中使用輕谷氨酰胺而不是重谷氨酰胺，且其它成分(例如分化劑，等，其為所進(jìn)行的調(diào)節(jié)的基礎(chǔ))也可添加至調(diào)節(jié)培養(yǎng)基。如所討論的，優(yōu)選細(xì)胞群生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是相同的，除了存在重/輕谷氨酰胺和調(diào)節(jié)樣品中包含的調(diào)節(jié)劑。商業(yè)供應(yīng)商可提供含重谷氨酰胺的培養(yǎng)基(CambridgeIsotopeLaboratories，Inc.)。或者，該細(xì)胞可在相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)且可將標(biāo)記同位素(和調(diào)節(jié)劑)直接添加至細(xì)胞的一個(gè)培養(yǎng)物中。受調(diào)節(jié)的細(xì)胞樣品通過(guò)以下方式調(diào)節(jié)，例如，分化劑、微生物(細(xì)菌/病毒)、化學(xué)品、藥物、激素或環(huán)境變化，如溫度/濃度/時(shí)間變化。也可提供其它處理或刺激。待測(cè)量的另一樣品作為對(duì)照。處理生物物質(zhì)(樣品)后，質(zhì)譜分析所得的糖苷比例(同位素比例)會(huì)是待分析的細(xì)胞(受調(diào)節(jié)的細(xì)胞)和對(duì)照細(xì)胞群之間糖基化的變化的指示。MS分析，單獨(dú)或與NMR分析組合，可提供有關(guān)聚糖結(jié)構(gòu)、結(jié)合至聚糖的蛋白質(zhì)、肽(在消化樣品中蛋白質(zhì)后)和/或脂質(zhì)以及聚糖結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的進(jìn)一步的信息。在一個(gè)優(yōu)選方法中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)足夠時(shí)間后，將生物物質(zhì)的調(diào)節(jié)樣品和對(duì)照樣品合并。按本領(lǐng)域已知的方式將蛋白質(zhì)從合并的細(xì)胞群提取。例如，該細(xì)胞膜可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，如去污劑或在等滲的蔗糖溶液中均勻化而消化或破裂。然后將蛋白質(zhì)和/或通過(guò)超速離心或其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)從合并的細(xì)胞樣品提取。例如，可使用抗體以使某些蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫沉淀。使用的具體方法可取決于感興趣的具體蛋白質(zhì)，如本領(lǐng)域所知的?？蓪⒅|(zhì)提取出。然后將蛋白質(zhì)/脂質(zhì)的混合物分離為蛋白質(zhì)或脂質(zhì)個(gè)體或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)小集團(tuán)，其也通過(guò)已知的技術(shù)，如一維和/或二維電泳，超速離心，液相色譜法或親和結(jié)合。例如對(duì)于蛋白質(zhì)可使用二維十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(“SDS-PAGE“)。如果蛋白質(zhì)或脂質(zhì)個(gè)體從合并的細(xì)胞樣品提取的話，如通過(guò)使用抗體、提取技術(shù)或其它方法，可不需要單獨(dú)的分離步驟。可進(jìn)一步加工該分離的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)以提供肽或裂解的脂質(zhì)。在分離的蛋白質(zhì)的情況下，這些優(yōu)選消化為肽。優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)通過(guò)蛋白水解酶消化。優(yōu)選胰蛋白酶，因?yàn)槠湓谫嚢彼岷途彼岬奈稽c(diǎn)精確裂解，產(chǎn)生雙電荷的肽，其通常具有約5至50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度和約700-5,000的分子量。這種肽尤其適用于通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行分析，尤其通過(guò)電噴射離子化質(zhì)譜分析。其它可使用的位點(diǎn)特異性蛋白水解酶包括例如Ly-C，Asp-N和Glu_C。胃蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和蛋白酶Ic是低特異性酶，其也可使用?；瘜W(xué)試劑也可用于消化蛋白質(zhì)或脂質(zhì)。例如，可使用溴化氰以在甲硫氨酸的位點(diǎn)將蛋白質(zhì)切成肽。BNPS-類臭素可用于在色氨酸的位點(diǎn)裂解。也可使用酸水解。也可通過(guò)分離蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)且之后使用本領(lǐng)域已知的方法裂解聚糖(例如，對(duì)于N-和0-連接的聚糖分別為PNGaseF處理和β-消除)而處理蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)。聚糖也可使用標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)，包括液相色譜法(例如，反相HPLC)而進(jìn)一步分離。然后將該各自包含聚糖的蛋白質(zhì)、消化的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或處理的脂質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析?？墒褂萌魏钨|(zhì)譜儀以分析肽或蛋白質(zhì)。例如，該質(zhì)譜儀可為基質(zhì)-輔助激光解吸/離子化(〃MALDI“)飛行時(shí)間(“T0F")質(zhì)譜儀，獲自PerS印tiveBiosystems,Framingham,Massachusetts；電噴射離子化(“ESI")離子阱質(zhì)譜儀，獲自FinniganMAT,SanJose,Calif.；或ESI四極質(zhì)譜儀，獲自FinniganMAT或Perkin-ElmerCorporation,FosterCity，Calif。也可使用線離子阱質(zhì)譜儀(LTQ，ThermoFisher)或兼性線離子阱傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(LTQ-FT，ThermoFisher)。1至約5種消化的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚糖的簡(jiǎn)單混合物可用上述任何質(zhì)譜儀通過(guò)單級(jí)質(zhì)譜法而分析。多于6種消化的蛋白質(zhì)的混合物優(yōu)選通過(guò)涉及碰撞產(chǎn)生的解離(“CID")的二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析程序分析，如本領(lǐng)域所知的。同時(shí)優(yōu)選地是，不需要蛋白質(zhì)的消化。也可將一種或多種包含聚糖的全蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，不需要將蛋白質(zhì)消化為肽，如本領(lǐng)域所知的。單級(jí)質(zhì)譜分析可用于同時(shí)分析大量包含聚糖的全蛋白的混合物。進(jìn)行質(zhì)譜分析的聚糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽也優(yōu)選鑒別。鑒別步驟可在分離或提取單一蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或聚糖后的任何時(shí)間進(jìn)行。使用將該質(zhì)譜與蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)和聚糖的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的算法的蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)和聚糖鑒別軟件是可以獲得的。一種該算法，ProFoimd，使用Bayesian算法檢索蛋白質(zhì)或DNA數(shù)據(jù)庫(kù)以辨別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)的最佳匹配。ProFound可通過(guò)prowl,rockefeller,edu禾口proteometrics.com訪問(wèn)。Profound使用非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(NR)。蛋白質(zhì)鑒別的備選算法包括=MassSearchcbrg.inf.ethz.ch/subsection3.sub.—3.html)；MOWSEwww.seqnet.dl.ac.uk//mows.html)；MSFITprospector.ucsf.edu/ucsfhtml/msfit.htm)；PeptideMassSearchwww.mdc-berlin.de/.about.emu/Peptide_mass.html)；禾口PieptideSearchwww.mann.embl—heidelberg·de/services/peptidesearch/fr—Peptidesearchform.html)0也可參見(jiàn)，James,Peter,“Proteinidentificationinthepost-genomeera:therapidriseofproteomics〃，Q.Rev.Biophysics，Vol.30，No.4，pp.279—331(1997)。月旨質(zhì)也可特別使用脂質(zhì)定性/定量分析(LipidQA)軟件平臺(tái)和相關(guān)軟件從質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)(尤其是串聯(lián)質(zhì)譜分析)鑒別。參見(jiàn)，例如Song，等人，JournaloftheAmericanSocietyforMassSpectrography，2007年10月，1848-1858頁(yè)；Yetukuri，等人，BMCSystBiol.2007；1:12.，在線公開(kāi)于2007年2月15日。蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)也可在分離后通過(guò)電泳，抗體Edman序列測(cè)定，生物測(cè)定，脂質(zhì)提取，液相色譜法(反相HPLC)和分析，NMR或本領(lǐng)域已知和使用的其它方法鑒別。聚糖可通過(guò)本文別處討論的液相色譜法(HPLC)，NMR和質(zhì)譜分析鑒別。然后計(jì)算各對(duì)峰的峰強(qiáng)度的比例。該比例提供各樣品中聚糖的相對(duì)量的測(cè)量，如下文進(jìn)一步討論的。峰強(qiáng)度以常規(guī)方式計(jì)算。確定聚糖的總含量和/或然后使用本領(lǐng)域可用的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如碎裂規(guī)則和glycoworkbench(參見(jiàn)dkfz-heidelberg.de/spec/EUROCarbDB/GlycoWorkbench/以及NMR分析)作出聚糖結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)確定。因?yàn)檩p谷氨酰胺中生長(zhǎng)的對(duì)照樣品和重谷氨酰胺中生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)樣品的聚糖質(zhì)量之間的差異，質(zhì)譜分析的結(jié)果通常為多對(duì)緊密間隔的峰(closelyspacedpeaks)，各峰具有稍不同的m/z比(+1，+2，等，取決于聚糖基上氨基糖的數(shù)目)。因?yàn)楦患耐凰赝ǔ１茸钬S富的天然存在的同位素要重(例如，15N相對(duì)14N),所以較高m/z比的峰通常是在富含重谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的標(biāo)記的聚糖的聚糖相對(duì)豐度的指示。較低m/z比的峰通常是含輕谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非標(biāo)記的聚糖的聚糖相對(duì)豐度的指示。因?yàn)樵谡{(diào)節(jié)樣品中的細(xì)胞數(shù)可與對(duì)照樣品中的細(xì)胞數(shù)不同，對(duì)于任何給定的對(duì)峰(pairofpeaks)，相應(yīng)于調(diào)節(jié)樣品的聚糖的峰強(qiáng)度可與相應(yīng)于來(lái)自對(duì)照樣品的相同聚糖的峰強(qiáng)度不同。許多對(duì)峰之間的比例(其為蛋白質(zhì)、肽和脂質(zhì)碎片和未標(biāo)記的聚糖的指示)通常相同。定期觀察的比例的偏差表明兩份細(xì)胞樣品之間聚糖相對(duì)數(shù)量的差異，這可由于細(xì)胞樣品之一經(jīng)受的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生。該差異可根據(jù)本發(fā)明定量。在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，在加工和分析前合并對(duì)照樣品和調(diào)節(jié)樣品。因?yàn)樵摷?xì)胞樣品被合并，峰強(qiáng)度差異的其它來(lái)源，如具體蛋白質(zhì)或脂質(zhì)從細(xì)胞樣品的提取效率的變化，隨后的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)從凝膠或其它吸收介質(zhì)的提取效率的變化，使用的酶(若有的話)的消化效率的變化，質(zhì)譜儀對(duì)于具體蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)或聚糖的離子化效率的變化，以及其它該類因素，都均等地影響兩種細(xì)胞群。因此，這些因素不應(yīng)影響觀察到的比例。分析該峰對(duì)的比例彌補(bǔ)由質(zhì)譜儀對(duì)于具體聚糖的離子化效率的差異導(dǎo)致的質(zhì)量強(qiáng)度差異。同位素標(biāo)記兩種細(xì)胞樣品中的一種且觀察同位素標(biāo)記的和非同位素標(biāo)記的聚糖的峰之間的比例也彌補(bǔ)細(xì)胞樣品本身之間的差別效果(differentialeffects)，如在各樣品中存在不同數(shù)目的細(xì)胞，在細(xì)胞樣品之間提供了內(nèi)標(biāo)歸一化(internalnormalization).本發(fā)明的方法也可延伸以通過(guò)制備三種或更多種細(xì)胞樣品且相應(yīng)分析該樣品來(lái)比較兩種或更多種調(diào)節(jié)的作用，優(yōu)選在各情況下合并調(diào)節(jié)樣品和對(duì)照樣品，然后對(duì)于總體聚糖含量、具體聚糖含量和與樣品中聚糖的存在相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行處理和分析。因此本發(fā)明為細(xì)胞培養(yǎng)物體系中聚糖提供了易于實(shí)施且強(qiáng)大的同位素標(biāo)記策略。本發(fā)明依賴于以下事實(shí)，即Gln的酰胺側(cè)鏈?zhǔn)羌禾前飞锖铣赏緩街蠻DP-GlcNAc的唯一氮供體且UDP-GlcNAc為UDP-GalNAc和CMP_Neu5Ac(Ge)的生物合成底物。因此，本發(fā)明人在此使用小鼠ES細(xì)胞證實(shí)了，用酰胺-15N-Gln代替正常Gln補(bǔ)充物可使得用72小時(shí)標(biāo)記策略對(duì)N-連接的和0-連接的聚糖的GlcNAC、GalNAC和NeuAc殘基進(jìn)行幾乎完全的同位素標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)鼠胚胎干細(xì)胞(ES)基本如先前所述進(jìn)行培養(yǎng)24。該ES細(xì)胞培養(yǎng)基由以下構(gòu)成Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)，補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS，CommonwealthSerumLaboratories)、2mML-谷氨酰胺(14N或酰胺-15N)、0.ImM2-巰基乙醇和1000U/ml重組鼠白血病抑制因子(LIF)(ESGR0,ChemiconInternational)。酰胺-15N-Gln(98%純度)購(gòu)自CambridgeIsotopesInc(Andover，MA)。該ES細(xì)胞在37°C在10%CO2下培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基保持3天，之后通過(guò)解離緩沖液和刮削收集ESCs(IXIO7)，置于15ml圓錐管中，以1，OOOg使其沉淀。該細(xì)胞用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，然后在每次洗滌后以IOOOg離心。將所有上清液從管中去除且將細(xì)胞沉淀儲(chǔ)存在-80°C直到進(jìn)行分析。ES細(xì)胞裂解、去脂、聚糖釋放和全甲基化全甲基化的N-和0-連接的全甲基化的聚糖的分離基本上如先前所述14’22’23’25。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞重懸浮于水且通過(guò)超聲處理裂解。使用有機(jī)提取在氯仿甲醇水中進(jìn)行去脂。將所得蛋白質(zhì)進(jìn)行胰蛋白酶消化，且對(duì)于N-和0-連接的聚糖分別通過(guò)PNGaseF處理和β-消除釋放聚糖。反相富集的聚糖用碘甲烷全甲基化且通過(guò)反相富集再次純化并干燥。全甲基化的聚糖的MS分析將聚糖如先前所述14’22’23’25用線離子阱質(zhì)譜儀(LTQJhermoFisher)或兼性線離子阱傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(LTQ-FT，ThermoFisher)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，將全甲基化的聚糖溶于總共50μL樣品15μL100%甲醇，然后添加35μLlmMNaOH在50%甲醇中的溶液，且使用納米噴霧(nanospray)離子源直接輸入質(zhì)譜儀，該納米噴霧(nanospray)離子源具有熔融石英發(fā)射器(360X75X30ym，SilicaTip，NewObjective)，2.OkV毛細(xì)管電壓，200°C毛細(xì)管溫度，且注射流速為0.4μ7πη。正離子和圖形方式(profilemode)的全I(xiàn)TMS(離子阱質(zhì)譜分析)光譜在400-2000m/z收集30秒，顯微掃描(microscan)為5和最大注射時(shí)間(ms)為150。碰撞-誘導(dǎo)的解離(CID)后的形心(centroid)MS/MS光譜在400至2000m/z獲得，對(duì)于N-和0-連接的聚糖分別為34%和28%標(biāo)準(zhǔn)化的碰撞能，通過(guò)總離子作圖(TIM)為0.25活化Q，和30.Oms活化時(shí)間。對(duì)于用TIM掃描獲得的自動(dòng)化MS/MS光譜，母體質(zhì)量步長(zhǎng)和分離寬度分別設(shè)定為2.Om/ζ和2.8m/z。MSn實(shí)驗(yàn)以圖形方式手動(dòng)進(jìn)行。使用2.5m/z的分離寬度將聚糖前體離子分離用于MSn。對(duì)于FTICR分析，使用在100，000分辨率(resolution)的lOm/ζ的分離寬度。所有聚糖結(jié)構(gòu)的人工解釋根據(jù)碎裂規(guī)則和glyco工作臺(tái)(workbench)(網(wǎng)址dkfz-heidelberg·de/spec/EUROCarbDB/Glycofforkbench/)進(jìn)行。結(jié)果同位素?fù)饺霃?fù)合糖的機(jī)理己糖胺生物合成途徑將糖酵解中間體果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為UDP-GlcNAcf6，圖1A)。該途徑中的第一個(gè)和限速的步驟將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為葡糖胺-6-磷酸，且伴隨Gln轉(zhuǎn)化為Glu27。因此，Gln的側(cè)鏈酰胺為UDP-GlcNAc的制備中的氮源。其它主要的含氨基糖的糖核苷酸，UDP-GalNAc和CMP-唾液酸，自UDP-GlcNAc生物合成28’29。因此，理論上所有含GlcNAc,GalNAc和唾液酸的分子可通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充酰胺-15N-Gln而進(jìn)行同位素標(biāo)記(圖1)。進(jìn)行初始實(shí)驗(yàn)以評(píng)估使用代謝標(biāo)記作為將穩(wěn)定的同位素?fù)饺肱囵B(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)22胞的聚糖中的方法的可能性。在這些實(shí)驗(yàn)中，Rl鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)使用標(biāo)準(zhǔn)條件生長(zhǎng)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基通常不含谷氨酰胺，因?yàn)樵摪被嵩谒詶l件下分解為谷氨酸和氨。這簡(jiǎn)化了IDAWG標(biāo)記方法，因?yàn)闊o(wú)需特別自培養(yǎng)基排除Gin。使用酰胺-15N-Gln代替14N-形式以用推薦的濃度補(bǔ)充培養(yǎng)基，其在該情況下為2mM。這種直接的替換是IDAWG所需的正常細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的唯一變更。因此，本發(fā)明人用或不用重Gln標(biāo)記鼠ES細(xì)胞三天，然后從蛋白質(zhì)分離N-和0-連接的聚糖，用于基于質(zhì)譜法的分析(圖1B)。將15N摻入N-連接的聚糖15N向mESCs的N-連接的聚糖的摻入通過(guò)比較在14N-Gln或酰胺-15N-Gln中生長(zhǎng)的細(xì)胞釋放的全甲基化的N-連接的聚糖的全光譜而進(jìn)行研究(圖2)。將兩種樣品按需要進(jìn)行總離子作圖分析和MSn以證實(shí)結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些光譜觀察到的富含的離子主要為高甘露糖聚糖(GlcNAc2Man5_9)，其為帶單電荷或帶雙電荷的(圖2的結(jié)構(gòu)1-3，6，13-14和16)。比較這兩個(gè)光譜顯示在包含酰胺-15N-Gln的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞所得的高甘露糖聚糖離子對(duì)于帶雙電荷的離子增加lm/z單位，且對(duì)于帶單電荷的離子增加2m/z單位。這是預(yù)期的結(jié)果，條件是15N已被摻入這些聚糖包含的兩個(gè)核心GlcNAcs，其為高甘露糖聚糖中存在的唯一的氮。在全光譜中還包含的為代表包含GIcNAC(圖2的結(jié)構(gòu)4，5，7，8，10，11，12和15)和Neu5Ac(圖2的結(jié)構(gòu)12)殘基的復(fù)合聚糖的離子，觀察到其對(duì)于15N-摻入GIcNAC和Neu5Ac在酰胺-15N-Gln樣品中位移合適的質(zhì)量。為計(jì)算標(biāo)記效率，該樣品通過(guò)兼性LTQ-FT儀器分析。對(duì)出現(xiàn)在距14N和I-15NGln培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的聚糖的1005.5和1006.5m/z單位處的GlcNAcsMar^聚糖產(chǎn)生的雙電荷分子離子(M+2Na)2+的更密切的檢查，示于圖3。在這些光譜中，最強(qiáng)的離子出現(xiàn)在用14N或兩個(gè)15N計(jì)算的單同位素質(zhì)量處，表明大多數(shù)該聚糖在其兩個(gè)可能的位點(diǎn)摻入了15n。存在相應(yīng)于標(biāo)記不足的離子，即，摻入0和1個(gè)15N,然而優(yōu)勢(shì)種類是完全標(biāo)記的。對(duì)理論上包含2-5個(gè)15N-殘基的多個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了縮放掃描。對(duì)15N光譜中不同同位素的強(qiáng)度比例進(jìn)行的計(jì)算表明15N向N-連接的聚糖平均摻入96.2%(表1，圖6)，其非常類似于該實(shí)驗(yàn)使用的谷氨酰胺中15N的程度(98%)。因此，來(lái)自酰胺-15N-Gln的15N變得廣泛摻入N-連接的聚糖的氨基糖。而且，N-連接的聚糖的碎裂產(chǎn)生的MS/MS光譜顯示與標(biāo)記一致的樣式。例如，重和輕標(biāo)記的核心巖藻糖基化的、充分唾液酸化的(sialyated)、雙觸角N-連接的聚糖的碎裂顯示的碎片與15N-摻入Neu5Ac以及核心和觸角GIcNAC殘基一致(圖4)。該標(biāo)記可基于碎裂大大有助于指定結(jié)構(gòu)，且提供了基于MS/MS光譜中的多對(duì)峰進(jìn)行定量的可能性。15N摻入0-連接的聚糖為研究15N向mESCs的0_連接的聚糖的摻入，將在14N-Gln或酰胺-15N-Gln中生長(zhǎng)的細(xì)胞釋放的全甲基化的0-連接的聚糖的全光譜進(jìn)行比較。當(dāng)需要時(shí)兩種樣品都進(jìn)行總離子作圖分析和MSn以證實(shí)結(jié)構(gòu)。為說(shuō)明15N向0-聚糖中包含的所有3種氨基糖的摻入，對(duì)于包含GlcNAc和Neu5Ac的O-Man引發(fā)的聚糖，包含GlcNAc的O-GalNAc引發(fā)的結(jié)構(gòu)，和包含兩個(gè)Neu5Ac殘基的O-GalNAc引發(fā)的結(jié)構(gòu)顯示碎裂后重和輕分離的樣品的MS/MS光譜(圖5)。所有3種0-連接的結(jié)構(gòu)的分離m/z和碎裂圖(profile)與向所有GlcNAc、GalNAc和NeuAc單糖的15N-摻入一致。從碎裂圖可以看出，還原端GalNAc在重樣品中被同位素標(biāo)記，如在延長(zhǎng)的鏈中的GIcNAC和NeuAc。這些結(jié)果重點(diǎn)說(shuō)明了15N被摻入所有3種氨基糖，且輕和重結(jié)構(gòu)的碎裂將對(duì)聚糖指定和定量有巨大幫助。15N摻入蛋白質(zhì)對(duì)自14N/15N標(biāo)記的樣品獲得的肽進(jìn)行的散彈槍(Shotgun)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒別包含摻入的酰胺-15N-Gln的肽(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，沒(méi)有觀察到向其它氨基酸摻入15N。這是預(yù)期的結(jié)果，因?yàn)镚ln向其它氨基酸的轉(zhuǎn)化中的第一步產(chǎn)生谷氨酸(Glu)，其導(dǎo)致失去酰胺-15n。這是重要的，因?yàn)槠浜?jiǎn)化了數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，但保留了以蛋白質(zhì)水平進(jìn)行相對(duì)定量，以及使用鑒別的含Gln的肽的能力。如果需要同位素標(biāo)記肽(超過(guò)含Gln的肽的范圍)和聚糖兩者，上述代謝標(biāo)記方法可與SILAC或其它基于蛋白質(zhì)組學(xué)的同位素標(biāo)記策略組合。本技術(shù)為從兩種樣品的蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)已顯示)和脂質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示)釋放的聚糖提供了堅(jiān)穩(wěn)的定量。而且，該技術(shù)提供了可直接檢測(cè)和定量糖肽的標(biāo)記策略。該策略在對(duì)于從輕和重Gln-標(biāo)記的細(xì)胞培養(yǎng)物體系分離的蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)Ο-GlcNAc修飾3(1的檢測(cè)中證實(shí)。觀察到15N-Gln也摻入蛋白質(zhì)，但依照預(yù)期沒(méi)有觀察到其它重氨基酸，這提供了SILAC樣標(biāo)記策略，其可單獨(dú)使用或與重Arg/LysSILAC7組合使用以在理論上定量均來(lái)自相同組的樣品的聚糖、蛋白質(zhì)和糖蛋白/糖肽。最后，該IDAWG策略提供了一種選項(xiàng)，其可通過(guò)首先完全標(biāo)記樣品然后用輕Gln替換重Gln，且隨時(shí)間過(guò)程分離和分析樣品，以計(jì)算樣品中所有含氨基糖的聚糖的半衰期。因此，IDAffG形成了用于探索細(xì)胞培養(yǎng)物體系中聚糖、糖蛋白和糖脂的生物作用的強(qiáng)大的新定量工具。參考文獻(xiàn)1.Liu,H.；Sadygov,R.G.；Yates,J.R.,3rd,Amodelforrandomsamplingandestimationofrelativeproteinabundanceinshotgunproteomics.AnalChem2004,76，(14),4193-201.2.Radulovic,D.；Jelveh,S.；Ryu,S.；Hamilton,T.G.；Foss,Ε.；Mao,Y；Emili,Α.,Informaticsplatformforglobalproteomicprofilingandbiomarkerdiscoveryusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry.MolCellProteomics2004,3，(10)，984-97.3.Silva,J.C.；Denny,R.；Dorschel,C.Α.；Gorenstein,Μ.；Kass,I.J.；Li,G.Ζ.；McKenna,Τ.；Nold,Μ.J.；Richardson,K.；Young,P.；Geromanos,S.,Quantitativeproteomicanalysisbyaccuratemassretentiontimepairs.AnalChem2005,77,(7),2187-200.4.Wang,W.；Zhou,H.；Lin,H.；Roy,S.；Shaler,Τ.Α.；Hill,L.R.；Norton,S.；Kumar,P.；Anderle,M.；Becker,C.H.,Quantificationofproteinsandmetabolitesbymassspectrometrywithoutisotopiclabelingorspikedstandards.AnalChem2003,75，(18)，4818-26.5.Gygi,S.P.；Rist,B.；Gerber,S.Α.；Turecek,F.；Gelb,Μ.H.；Aebersold,R.,Quantitativeanalysisofcomplexproteinmixturesusingisotope-codedaffinitytags.NatBiotechnol1999,17，(10)，994—9.6.Liu,P.；Regnier,F.Ε.,Anisotopecodingstrategyforproteomicsinvolvingbothamineandcarboxylgrouplabeling.JProteomeRes2002,1,(5),443-50.7.Ong,S.E.；Blagoev,B.；Kratchmarova,I.；Kristensen,D.B.；Steen,H.；Pandey,A.；Mann,Μ.，Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture，SILAC，asasimpleandaccurateapproachtoexpressionproteomics.MolCellProteomics2002，1，(5)，376-86.8.Rao,K.C.；Carruth,R.Τ.；Miyagi，Μ.，Proteolytic180labelingbypeptidyl-Lysmetalloendopeptidaseforcomparativeproteomics.JProteomeRes2005，4，(2)，507-14.9.Schnolzer,M.；Jedrzejewski,P.；Lehmann,W.D.，Protease-catalyzedincorporationof180intopeptidefragmentsanditsapplicationforproteinsequencingbyelectrosprayandmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometry.Electrophoresis1996，17，(5)，945-53·10.Vosseller,K.；Hansen，K.C.；Chalkley，R.J.；Trinidad，J.C.；Wells,L；Hart，G.W.；Burlingame，A.L.，Quantitativeanalysisofbothproteinexpressionandserine/threoninepost-translationalmodificationsthroughstableisotopelabelingwithdithiothreitol.Proteomics2005，5，(2)，388-98.11.Wells,L.；Vosseller,K.；Cole,R.N.；Cronshaw,J.M.；Matunis,Μ.J.；Hart，G.W.，MappingsitesofO-GlcNAcmodificationusingaffinitytagsforserineandthreoninepost-translationalmodifications.MolCellProteomics2002，1，(10)，791-804.12.Yao,X.；Freas，Α.；Ramirez,J.；Demirev，P.A.；Fenselau，C.，Proteolytic180labelingforcomparativeproteomics:modelstudieswithtwoserotypesofadenovirus.AnalChem2001，73，(13)，2836-42.13.Ong,S.E.；Foster，LJ.；Mann,M.，Massspectrometric-basedapproachesinquantitativeproteomics.Methods2003，29，(2)，124-30·14.Aoki,K.；Perlman，M.；Lim,J.M.；Cantu,R.；Wells,L.；Tiemeyer,M.，DynamicdevelopmentalelaborationofN-IinkedglycancomplexityintheDrosophilamelanogasterembryo.JBiolChem2007，282，(12)，9127-42.15.Bowman,M.J.；Zaia，J.，Tagsforthestableisotopiclabelingofcarbohydratesandquantitativeanalysisbymassspectrometry.AnalChem2007，79，(15)，5777-84.16.Hitchcock,A.M.；Costello，C.E.；Zaia,J.，Glycoformquantificationofchondroitin/dermatansulfateusingaliquidchromatography-tandemmassspectrometryplatform.Biochemistry2006，45，(7),2350-61.17.Xia，B.；Kawar,Ζ.S.；Ju,Τ.；Alvarez,R.Α.；Sachdev，G.P.；Cummings，R.D.，Versatilefluorescentderivatizationofglycansforglycomicanalysis.NatMethods2005,2,(11),845-50.18.Yuan,J.；Hashii，N.；Kawasaki,N.；Itoh，S.；Kawanishi,Τ.；Hayakawa,Τ.，Isotopetagmethodforquantitativeanalysisofcarbohydratesbyliquidchromatography-massspectrometry.JChromatogrA2005，1067，(1-2),145-52.19.X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iào)節(jié)劑為至少一種分化劑，藥物，激素，另一化學(xué)品、環(huán)境條件，制造條件，或在所述細(xì)胞中引起疾病狀態(tài)的試劑。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為藥物。26.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為至少一種分化劑。27.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為環(huán)境條件。28.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為制造條件。29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑為微生物。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述微生物為細(xì)菌、病毒或真菌。31.根據(jù)權(quán)利要求21-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生長(zhǎng)步驟a進(jìn)行約60-72小時(shí)的一段時(shí)間。32.與對(duì)照樣品相比，確定未知活性的化合物對(duì)調(diào)節(jié)樣品和中一種或多種感興趣的聚糖的豐度的活性的方法，其包括在進(jìn)一步包含15N-谷氨酰胺的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)待調(diào)節(jié)的第一細(xì)胞樣品；將對(duì)照樣品在與所述第一培養(yǎng)基相同且進(jìn)一步包含14N-谷氨酰胺的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)；在培養(yǎng)過(guò)程中用所述化合物接觸所述第一細(xì)胞樣品；加工所述第一細(xì)胞樣品和所述對(duì)照樣品以從它們提取蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)；在所述加工步驟后從所述樣品分離所述蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)；任選將所述蛋白質(zhì)消化為多個(gè)肽；任選從所述蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)釋放聚糖且從所述蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)分離所述釋放聚糖；將所述蛋白質(zhì)、所述肽、所述脂質(zhì)和/或所述聚糖進(jìn)行質(zhì)譜分析以得到質(zhì)譜；通過(guò)基于所述質(zhì)譜確定各樣品的感興趣的所述聚糖的相對(duì)豐度確定所述化合物的活性。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物為分化劑或多種分化劑的混合物。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物為藥物。35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述化合物為嫌疑毒素。36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)步驟包括將所述細(xì)胞暴露于感興趣的微生物以確定所述微生物對(duì)所述調(diào)節(jié)樣品中聚糖的影響。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述微生物為細(xì)菌、病毒或真菌。38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)步驟包括將所述細(xì)胞暴露于一種或多種調(diào)節(jié)的培養(yǎng)條件以評(píng)估調(diào)節(jié)的培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的產(chǎn)生的影響。39.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在所述分離步驟后，所述蛋白質(zhì)消化為多個(gè)肽。40.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中將所述蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)進(jìn)一步分離為結(jié)合至聚糖的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)和無(wú)聚糖的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。41.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述聚糖從所述蛋白質(zhì)釋放和分離。42.根據(jù)權(quán)利要求32-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述聚糖除了進(jìn)行質(zhì)譜分析還進(jìn)行NMR分析。43.根據(jù)權(quán)利要求32-42中任一項(xiàng)所述的方法，還包括從所述質(zhì)譜確定感興趣的所述聚糖的結(jié)構(gòu)的步驟。44.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述肽進(jìn)一步分離為包含聚糖的肽和不含聚糖的肽。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述包含聚糖的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定所述聚糖的肽結(jié)合位點(diǎn)。46.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中將所述分離的脂質(zhì)進(jìn)一步分離為包含聚糖的脂質(zhì)和不含聚糖的脂質(zhì)。47.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)用蛋白水解酶消化。48.與對(duì)照樣品相比，確定制備條件對(duì)調(diào)節(jié)樣品中一種或多種感興趣的聚糖的豐度的影響的方法，其包括在進(jìn)一步包含15N-谷氨酰胺的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)待調(diào)節(jié)的第一生物樣品；將對(duì)照樣品在與所述第一培養(yǎng)基相同且進(jìn)一步包含14N-谷氨酰胺的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)；在調(diào)節(jié)條件下培養(yǎng)所述第一樣品；加工所述第一樣品和所述對(duì)照樣品以從它們提取蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)；在所述加工步驟后從所述樣品分離所述蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)；任選將所述蛋白質(zhì)消化為多個(gè)肽；任選從所述蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)釋放聚糖且從所述蛋白質(zhì)、肽和/或脂質(zhì)分離所述釋放聚糖；將所述蛋白質(zhì)、所述肽、所述脂質(zhì)和/或所述聚糖進(jìn)行質(zhì)譜分析以得到質(zhì)譜；基于所述質(zhì)譜確定所述樣品中感興趣的所述聚糖的相對(duì)豐度以確定所述調(diào)節(jié)條件的影響。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)條件為不用于對(duì)照樣品的分化劑或分化劑的混合物的濃度的變化。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)條件為不用來(lái)培養(yǎng)對(duì)照樣品的一段時(shí)間或溫度。51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)條件為不用于培養(yǎng)對(duì)照樣品的所述培養(yǎng)基成分或添加劑，或所述培養(yǎng)基成分的濃度。52.根據(jù)權(quán)利要求48-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述分離步驟后，所述蛋白質(zhì)消化為多個(gè)肽。53.根據(jù)權(quán)利要求48-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)進(jìn)一步分離為結(jié)合至聚糖的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)和無(wú)聚糖的蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。54.根據(jù)權(quán)利要求48-51和53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚糖從所述蛋白質(zhì)釋放和分離。55.根據(jù)權(quán)利要求48-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述聚糖除了進(jìn)行質(zhì)譜分析還進(jìn)行NMR分析。56.根據(jù)權(quán)利要求48-55中任一項(xiàng)所述的方法，還包括從所述質(zhì)譜確定感興趣的所述聚糖的結(jié)構(gòu)的步驟。57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述肽進(jìn)一步分離為包含聚糖的肽和不含聚糖的肽。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述包含聚糖的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析以確定所述聚糖的肽結(jié)合位點(diǎn)。59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中將所述分離的脂質(zhì)進(jìn)一步分離為包含聚糖的脂質(zhì)和不含聚糖的脂質(zhì)。60.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述聚糖從所述包含聚糖的脂質(zhì)釋放和分離。61.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)用蛋白水解酶消化。全文摘要本發(fā)明涉及同位素標(biāo)記聚糖和促進(jìn)生物細(xì)胞的糖組學(xué)組合物的高通量定量/比較分析的方法。該方法尤其適用于辨別分化細(xì)胞和它們的糖組學(xué)特征、分化情況、疾病和/或治療進(jìn)展，診斷疾病狀態(tài)，確定藥物活性，建立制造效率和確定細(xì)胞中聚糖的半衰期。文檔編號(hào)G01N33/534GK101910841SQ200880123401公開(kāi)日2010年12月8日申請(qǐng)日期2008年10月29日優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日發(fā)明者J·邁克爾·皮爾斯,凱利·W·莫雷曼,威廉·S·約克,斯蒂芬·達(dá)爾頓,羅伯特·L·韋爾斯,羅納德·C·奧蘭多,詹姆斯·A·阿特伍德,邁克爾·蒂邁耶申請(qǐng)人:佐治亞大學(xué)研究基金會(huì)