專利名稱：精子活力的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及精子的活力(motility)，更具體地涉及提高精子活力的方法。 背景4支術(shù)
精子活力不足是雄性哺乳動物(例如人)不育的常見原因。因而，提高精 子活力的簡單無毒的方法將提供令人高度期望的對不育中的精子活力不足 的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使來自人精子活力不足(asthenozoospermic)的受試者 的精子體外暴露于腺苷5'-三磷酸(ATP)提高了精子運(yùn)動的前進(jìn)速度 (progressive velocity)和直線性(linearity)。因此本發(fā)明的特征為通過使精子暴 露于細(xì)胞外的ATP來提高精子活力的方法以及使用ATP處理過的精子進(jìn)行 人工受精和體外受精(IVF)的方法。
更具體而言，本發(fā)明^是供了一種提高哺乳動物精子活力的方法。該方法 包括使來自哺乳動物受試者的精子與細(xì)胞外的腺苷5'-三磷酸(ATP)接觸。在 所述接觸之前，來自所述哺乳動物受試者的多個精子已經(jīng)被鑒定為具有降低 的活力。所述哺乳動物受試者可以是例如人受試者或馬科動物受試者。所述 精子可以得自精子活力不足的受試者。所述接觸可包括在其中溶有ATP的生 理培養(yǎng)基中培養(yǎng)精子。此外，所述接觸可以達(dá)約IO分鐘至約120分鐘，例 如達(dá)約60分鐘。在所述接觸初始時細(xì)胞外ATP的濃度可以為約100pM至約 5mM,例如約2.5mM。所述接觸可以在約18。C至約37°C,例如在約37。C。 在所述接觸之前，所述精子可以基本上已經(jīng)與精漿分離。在所述接觸之后， 可以評定精子的活力。此外，所述接觸可以在雌性哺乳動物的生殖道 (reproductive tract)中進(jìn)行，以及所述雌性哺乳動物可以是人或馬科動物受試 者。
本發(fā)明的特征還為 一種使哺乳動物卵子(egg)受精的方法。所述方法包括
4使哺乳動物卵子與已經(jīng)經(jīng)歷了上述提高哺乳動物精子活力的方法的哺乳動 物精子接觸。所述哺乳動物卵子的接觸可以在體外發(fā)生，以及在哺乳動物卵 子的接觸和經(jīng)接觸過的卵子已經(jīng)受精并成為胚胎之后，可以將所述哺乳動物 卵子置于哺乳動物子宮內(nèi)?？蛇x擇地，所述哺乳動物卵子的接觸可在體內(nèi)例 如在雌性生殖道中發(fā)生。所述哺乳動物精子可以是人的精子以及所述哺乳動 物卵子可以是人的卵子。此外，所述哺乳動物精子可以是馬科動物的精子以 及所述哺乳動物卵子可以是馬科動物的卵子。所述精子可以得自精子活力不 足的受試者。
本文所用術(shù)語"ATP"是指腺苷5'-三磷酸。它包括酸形式以及鹽，例如但 不限于腺苷5'-三磷酸二(三)鹽二水合物(5'-ATP-二(三)鹽)；腺苷5'-三磷酸二 鉀鹽二水合物(5'-ATP-K2);腺芬5'-三磷酸二鈉鹽(ATP二鈉鹽)；腺苷5'-三磷 酸二鈉鹽一水合物(ATP 二鈉鹽一水合物)；腺香5'-三磷酸鎂鹽(ATP鎂鹽)； 及耐水解的ATP類似物例如腺苦5'-(3-硫代三磷酸)四鋰鹽(ATPYS)和腺苷 5'-((3j-亞氨基)三磷酸四鋰鹽(AppNHp, AMP-PNP)。
應(yīng)理解的是，在本文所述的本發(fā)明所有方法中，ATP可被尿苷-5'-三磷 酸(UTP，包括與上面針對ATP列出的那些形式相對應(yīng)的化學(xué)形式)代替。
在本文中術(shù)語"精子(spermatozoon)"和"精子(spermatozoa)"與術(shù)語"精子 (sperm)"互換使用。
除非另外指出，本文中所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi) 的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。當(dāng)發(fā)生沖突時，以本文件(包
材料用于本發(fā)明的實(shí)施或試驗(yàn)中，但是下文描述了優(yōu)選的方法和材料。本文 提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)均整體并入本文作為參 考。本文披露的材料、方法和實(shí)例僅用于說明并不旨在受限于此。
基于下面的說明、附圖和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點(diǎn)(例如 提高精子活力)將是顯然的。


圖1是利用自動細(xì)胞運(yùn)動分析儀觀察到的活動精子所采取的軌跡的圖 示。圖中說明了術(shù)語VSL、 VCL、 ALH、 VAP、中位軌跡(median trajectory), 曲纟戔4九跡(curvilinear trajectory)和直纟戔運(yùn)動。圖2是一系列棒圖，顯示了在具有或不具有細(xì)胞外ATP的條件下已經(jīng) 培養(yǎng)1小時的精子(來自27位精子活力不足的男性受試者)的平均直線速度 (mean straight line velocity(VSL)， 見圖2A)、 平均曲線速度(mean curvilinear velocity(VCL)，見圖2B)、平均直線性(mean linearity即LIN,見圖2C)和外 側(cè)頭位移(lateralheaddisplacement(ALH),見圖2D)。所示的P值是通過斯氏 t試驗(yàn)由標(biāo)準(zhǔn)偏差確定的。
具體實(shí)施例方式
部分基于本發(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)，本文提供了提高哺乳動物精子活力的方 法和利用所述精子進(jìn)行哺乳動物授精的方法。 提高哺乳動物精子活力的方法
此處提供了提高哺乳動物精子活力的方法。所述方法包括使來自哺乳動 物受試者的精子與細(xì)胞外ATP源接觸。所述精子通過本領(lǐng)域已知的方法來源 于相關(guān)物種的雄性受試者，包括作為雄性受試者射出的精液的一種組分。作 為選擇，可通過從所述雄性受試者的輸精管、附睪或睪丸抽吸來取出精子。 所述精液優(yōu)選是在克制射精一段時間(例如，6小時、12小時、l天、2天、 3天，4天、5天、7天、10天、12天、14天或更長)后獲得的。在與ATP 接觸之前，可以任選地通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如實(shí)施例1中所述的一種方法)洗滌 精子，從而使精子與ATP的接觸在基本上不含精液(seminal fluid)的溶液(例 如培養(yǎng)基)中進(jìn)行。本文所用的"基本上不含精液"是指包含低于10%(例如低 于8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001%)源于精液的組分(例如蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)或者核酸)，所述源于精液的組分出現(xiàn)在用于獲得所述精子的精液中。
雄性哺乳動物受試者可以是任何哺乳動物，包括人(例如人類患者)，非 人類的靈長動物(例如猴、猩猩或猿)，馬科動物受試者(例如馬、驢或斑馬)， 豬，山羊，?？苿游?例如公牛)，綿羊，狗，貓，兔，豚鼠，倉鼠，沙鼠，
大鼠或者小鼠。
一般而言，所述哺乳動物受試者將是其精子具有低于正常直線速度(前 進(jìn)速度)并因此是相對不育的哺乳動物。本文所用的"正常直線速度"是該物種 能育雄性受試者(即，其精子不具有明顯喪失的使與所述精子相同物種的卵 子受精的能力的受試者)的精子所呈現(xiàn)的直線速度。然而，應(yīng)理解的是，所 述方法也可用于來自看上去上完全正常的受試者(例如其精子不具有明顯喪失的使合適的卵子受精的能力但希望提高其受孕可能性的受試者)的精子。
在所述4妄觸之前，可以任選地對來自所述受試者的多個(例如，5、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 70、 100、 200、 500、 800、 1000、 2000、 5000、 10000
或更多個)精子進(jìn)行活力(即，正常的、增高的或降低的活力)測試。以該方式 測試的精子可以從與用于獲得與ATP接觸的精子相同的精液樣品獲得或者 從與所述受試者的精液不同的樣品獲得。此外，在所述接觸之后，可以任選 地針對活力對所述精子的數(shù)目進(jìn)行測試，目的是測試所述接觸的效力。本文 所用的、應(yīng)用于精子的術(shù)語"活力"指的是直線速度或前進(jìn)速度，兩者均用縮 寫"VSL"進(jìn)行指定(參見實(shí)施例1)。與活力不同，可以在所述接觸之前和之后 測量直線性(即，精子軌跡的筆直程度)。
所述接觸可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)所述接觸在體外進(jìn)行時，將精子(通 常作為多個精子之一)培養(yǎng)在處于各種溫度中的任意溫度(例如，在約15。C至 約39。C，在約17。C至約38°C，在約18。C至約37°C，在約34。C,在約35。C, 在約36。C，在約37。C，或者在約38。C)的生理培養(yǎng)基(例如，組織培養(yǎng)基)中。 這些溫度的上下文中所用的術(shù)語"約"是指所述溫度可偏離所指出的溫度至 多2°C。所述生理培養(yǎng)基可以是其中哺乳動物精子可以保持活力并保持其4受 精能力的任意培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基的實(shí)例包括BWW培養(yǎng)基或Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)?？蓪⒏鞣N培養(yǎng)基增補(bǔ)劑(supplement)中的任意 一種增補(bǔ)劑加至所述培養(yǎng)基中。所述增補(bǔ)劑包括細(xì)菌抗生素和真菌抗生素 (例如，青霉素、鏈霉素、慶大霉素和/或兩性霉素B)以及來自相同物種但與 供精者不同個體的血清(即，同種異體的血清)，來自供精者的血清(即，自體 同源的血清)或者來自與供精者不同物種的一個或多個個體的血清(即，異種
的血清)。異種的血清可以是例如胎牛血清(FBS)、馬科動物血清(例如馬血 清)、山羊血清、綿羊血清或者豬血清。用于增補(bǔ)組織培養(yǎng)基的血清優(yōu)選是 同種異體的血清或自體同源的血清。因此，當(dāng)供精者是人時，所述血清優(yōu)選 是人血清；而當(dāng)供精者是馬時，所述血清優(yōu)選是馬血清。當(dāng)使用人血清時， 所述血清優(yōu)選來自一個或多個具有AB血型的個體。在使用之前，也可對用 作培養(yǎng)基增補(bǔ)劑的血清進(jìn)行篩選以確定是否存在抗精子抗體。含有可檢測水 平的所述抗體的那些血清將排除使用。其它培養(yǎng)基增補(bǔ)劑包括各種非必需氨 基酸或者必需氨基酸(例如谷氨酰胺)、蛋白質(zhì)(例如，人或牛的血清白蛋白、 胰島素和運(yùn)鐵蛋白)、碳水化合物(例如糖類如葡萄糖)、核酸、核苷酸、核苦和/或脂質(zhì)。
將精子的含精子樣品(優(yōu)選至少洗滌一次以基本上除去精液)與培養(yǎng)基
結(jié)合?？梢栽谂囵B(yǎng)基與精子混合之前已經(jīng)將ATP加至培養(yǎng)基中，或者可以在 培養(yǎng)基與精子混合之后將ATP加至培養(yǎng)基中。加入的ATP使得初始濃度(即， 在培育ATP/精子/生理溶液混合物之前的濃度)為約100 mM至約10mM,即， 約100 pM至約5mM，約500 pM至約5mM,約1 mM至約5mM，約1 mM 至約2.5mM,約1 mM，約2 mM，約2.5mM或者約3 mM。在這些ATP濃 度的上下文中，術(shù)語"約"說明所述濃度可以以所指出的值的至多約10%變化。 可用的ATP的化學(xué)形式包括所有上述的那些形式。
在將精子、ATP和生理培養(yǎng)基混合之后，將所得的混合物在上面列出的 溫度中的一個或多個溫度培育任意寬范圍的時間，例如，培育約5分鐘至約 180分鐘、約IO分鐘至約150分鐘、約IO分鐘至約120分4中、約20分鐘至 約120分鐘、約30分鐘至90分鐘、約30分鐘至約60分鐘、約120分鐘、 約90分鐘、約60分鐘或約30分鐘。在這些時間段的上下文中，術(shù)語"約" 說明所述時間可以以所指出的值的至多約20%變化。在培育之后，精子的含 并青子群(spermatozoon-containing population)可以用于各種4受津青方'法(參見下文) 中的任意一種中，任選地在用生理溶液(例如生理鹽水、磷酸緩沖鹽水(PBS) 或者組織培養(yǎng)基)洗滌之后。
精子與ATP在體內(nèi)的接觸可以通過將含ATP的組合物和精子的含精子 樣品遞送至雌性生殖道中來實(shí)現(xiàn)。因此，例如在相關(guān)物種的;^性受試者和雌 性受試者性交之前或者緊接其后將含ATP的組合物置入所述雌性受試者的 陰道中。可選擇地，將精液或者經(jīng)洗滌基本上不含精液的精子人工灌入或注 入到所述雌性受試者的陰道中。 一般而言，在將精子遞送至雌性生殖道之前 或之后不超過約60分鐘、約45分鐘、30分鐘、20分鐘、10分鐘、5分鐘、 2分鐘或1分鐘時將所述組合物置入。在這些時間段的上下文中，術(shù)語"約" 說明所述時間可以以所指出的值的至多約10%變化。在這些方法中，遞送至 雌性陰道中的精子與ATP接觸。自然地，雌性物種可以是上面作為精子來源 的供精者列出的物種中的任一物種。作為精子來源的^M生和向其生殖道中遞 送精子的雌性通常是同一物種，但這不是必須的。
遞送至雌性生殖道(例如，通過施力o(application)、灌入或注入)的ATP組 合物可以采用下面的形式，例如散劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑、錠劑(troche)、液體(例如洗劑)、凝膠劑、軟膏劑、乳膏劑或者乳劑。當(dāng)采用液體、凝膠劑、
軟膏劑、乳膏劑或者乳劑形式時，所述ATP可以是溶解的或在懸浮液中，并 且其在組合物中的濃度一般與上面針對精子和ATP體外接觸所列出的濃度 相同。所述組合物通常包含ATP和可藥用載體。本文所用的"可藥用載體" 包括與藥學(xué)給藥相容的溶劑、^:介質(zhì)、包衣(coating)、抗菌劑和抗真菌劑、 等滲劑和吸收延遲劑(absortion delaying agent),等等。也可將增補(bǔ)的活性化 合物結(jié)合到所述組合物中。
所述組合物優(yōu)選是無菌的。其在制造和存儲條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，且應(yīng) 防腐保存以防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。所述載體可以是含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)或者它們的合適混 合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，可以通過使用包衣例如卵磷脂、通過在^t 情形下保持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?可通過各種抗菌劑和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用，所述抗菌劑和抗真 菌劑為例如對羥基苯曱酸酯類(paraben)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酚 (phenol)、抗壞血酸(ascorbic acid)、硫柳汞(thimerosal)等。在許多情形時，常 常期望在所述組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨糖 醇)以及氯化鈉。在散劑情形下，制備方法可包括真空干燥或冷凍干燥，這 從其溶液中產(chǎn)生活性成分加上任何其它所期望的成分的散劑。
所述散劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑和錠劑包含1。/o至95。/o(w/w)的活性化 合物。在一些實(shí)施方案中，所述活性化合物的范圍為5。/。至70。/。(w/w)。合適 的載體是碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、糖、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、 黃蓍膠、曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、低熔蠟(lowmeltingwax)、可可油， 等等。術(shù)語"制劑"旨在包括以封裝材料作為載體的活性化合物的劑型，提供 如下膠嚢，在所述膠嚢中，具有或不具有其它載體的活性組分被載體包圍， 所述載體因此與所述活性組分結(jié)合。
可通過將ATP溶于水中并按需要加入合適的著色劑、穩(wěn)定劑和增稠劑 來制備水溶液。可用粘性物質(zhì)(例如天然膠或合成膠、樹脂、曱基纖維素、 羧曱基纖維素鈉和其它公知的懸浮劑)將微細(xì)粉碎的活性組分分散在水中來 制備水性混懸劑。
所述組合物也可以制備成栓劑形式(例如， -使用常規(guī)的栓劑基底 (suppository base)如可可油和其它的甘油酯)或者制備成用于陰道遞送的持留灌腸劑(retention enemas)形式。
在一個實(shí)施方案中，將ATP與載體一起制備，所述載體將保護(hù)所述化 合物免于從身體快速消去，例如控制釋放制劑，包括植入物和微嚢遞送系統(tǒng)。 可使用可生物降解性、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚 酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備上述制劑的方法對本領(lǐng)域的 4支術(shù)人員來i兌是顯而易見的。材料也可從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc商購。脂質(zhì)體混懸液也可用作可藥用載體。這些可才艮據(jù) 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如在美國專利4,522,811中所述的方法)制備。
為了易于給藥和使劑量一致，有利的是可以劑量單位形式配制組合物。 本文所用的劑量單位形式指的是對于治療的受試者適于作為單元劑量的物 理上離散的單位；各單位包含預(yù)定量的ATP,對所述預(yù)定量進(jìn)^f亍計(jì)算以與所 需的藥用載體結(jié)合產(chǎn)生所期望的活力提高效果。劑量單位還可附有用法說明 書。
本文還提供了制品，其包含含有ATP和包裝材料的容器和/或遞送媒介 物(例如瓶、小瓶(vial)、膠嚢或藥片)和/或包裝嵌入物(insert),所述包裝嵌入 物含有如何實(shí)施上述提高精子活力的方法中任一種方法的說明書。
授精方法
如上所指出，已經(jīng)體外與ATP接觸的精子群中的精子可用于本領(lǐng)域已 知的各種IVF和人工受精方法中的任種一方法中。這樣的方法的實(shí)例詳細(xì)描 述于Hall等人的(1997) Sa/〃&my C7/w. (7;/""eco/. 11:711-24; Van
Steirteghem的(1994) CWr. Op/w. 06"". G^weco/. 6:173-177;以及Van Voorhis 的(2007)W.人iV/ed 356:379-386中，將它們公開內(nèi)容整體并入本文作為
參考。 '
在用于這些方法—之前，可任選地(但不是必須地)清洗精子從而使其不含 或者基本上不含含有ATP的生理培養(yǎng)基。本文所用的"基本上不含含有ATP 的生理培養(yǎng)基"是指包含少于10%(例如，少于8%; 6%; 4%; 2%; 1%; 0.1%或0.001°/。)用于使精子與ATP接觸的含ATP的生理培養(yǎng)基。
實(shí)質(zhì)上，IVF方法牽涉培育來自任一上面所列物種的雌性受試者的卯子 與來自相同物種的任一雄性受試者的、并且已經(jīng)經(jīng)歷上述活力提高方法的精 子。在培育之后，將在精子穿入一個或多個卵子后發(fā)育成的一個或多個胚胎 置入雌性受試者的子宮中，所述受試者是(通常但非必須)最初從其獲得卵子的受試者。同樣，精子的雄性供體和卵子的雌性供體可以是上面所列物種中 的任一種。通常但不是總是，所述雄性和雌性是同一物種。
一般而言，在卵
子被精子穿入的16-24小時后，出現(xiàn)精子和卵核的熔合(即，形成受精卵)。 在精子穿入卵子的約48小時后，形成胚胎即通常含有兩個細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。在 該階段或者在胚胎成熟的稍后階段(精子穿入卵子后的至多5天)，將胚胎移 至雌性受試者的子宮中。在轉(zhuǎn)移之前，可通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟悉的方法 對卵子的受精和隨后胚胎的形成進(jìn)行測試。
人工受精方法包括，例如，將已經(jīng)經(jīng)歷上述活力提高方法的精子遞送至 雌性受試者的生殖道(例如，陰道和/或子宮)。在這種情形下，希望所述精子 會與由雌性受試者所產(chǎn)生的卵子接觸并使之受精。同樣，精子的雄性供體和 雌性受試者可以是上面列出物種中的任一種。通常但不是總是，所述雄性和 雌性是同一物種。
下面的實(shí)施例用于說明而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例
實(shí)施例1:材并+和方法 精子活力
根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)實(shí)驗(yàn)室手冊[用于檢查人的精液和精子-子宮 頸粘液相互作用的世界衛(wèi)生組織(1999) WHO實(shí)驗(yàn)室手冊，第128頁。劍橋 大學(xué)出版社，劍橋，其公開內(nèi)容整體并入本文作為參考]標(biāo)準(zhǔn)對精子活力按a 至d的等級進(jìn)行評級，如下所述
等級a(快速前進(jìn))精子以直線形式快i4向前游動；
等級b(緩慢前進(jìn))精子向前游動，但是以曲線形式或歪斜形式游動， 或緩慢游動(緩慢的線性或者非線性的活動(motility));
等級c(不前進(jìn))精子移動其尾部，但不向前移動(只是原地活動)；以及
等級d(不游動的)精子根本不動。
"快速"和"緩慢"是精子運(yùn)動的定性特征，其是由觀察樣品的操作者基于 他或她^r查精子的經(jīng)^r來確定。
認(rèn)為低百分率的等級a和b活力和高百分率的等級c和d表明了弱的精 子授精能力。
患者選擇分析了因不育而求助于男科中心(帕多瓦大學(xué)，內(nèi)^"與外科科學(xué)系，內(nèi)
分泌學(xué)部分)的27位精子活力不足而其它方面健康的男性的精子。本文所用 術(shù)語"精子活力不足的"指的是其具有活力等級a的精子的百分?jǐn)?shù)加上具有等 級b的精子的百分?jǐn)?shù)低于50%的雄性受試者。來自所有受試者的精液樣品的 等分試樣的培養(yǎng)物都顯示樣品沒有細(xì)菌污染，并且在上述任一受試者的精液 中均未檢測到抗精子抗體。 精子特征如下
精子活力等級a的百分?jǐn)?shù)+等級b的百分?jǐn)?shù)(用光學(xué)顯微鏡評價)< 50%。
精液中的精子濃度220 x 106/ml
具有正常形態(tài)學(xué)的精子2 30%
精子存活率(viability): 2 50%
實(shí)驗(yàn)方案
節(jié)欲3天后，將精液樣品收集在無菌的容器中。在室溫時液化30分鐘 之后，根據(jù)WHO實(shí)驗(yàn)室手冊[同上]檢查標(biāo)準(zhǔn)精液參數(shù)。
對于精子移動分析，將精液等分試樣(IO pl)置于Makler室，隨機(jī)檢查每 室的10個不同區(qū)域(field)，并且就所述室的每個區(qū)域而言對至少100個精子 進(jìn)行評分。利用自動分析儀(37°C) (CellTrack VP1 10，美國加州Palo Alto的 Motion Analysis Corporation)對能游動的精子的百分凄t和移動特性進(jìn)行分析。 僅對能游動的精子進(jìn)行精子速度和動態(tài)參數(shù)的評價，并表達(dá)為平均值。計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)偏差并通過斯氏t檢驗(yàn)(Stuents，s West)確定顯著性P值。
確定下面的精子參數(shù)
曲線速度(VCL)，也稱為軌跡速度，并且是精子沿各軌道的速度(單位為 (j_m/s);
直線前進(jìn)速度(VSL),是從軌道的起點(diǎn)到終點(diǎn)以直線測量的平均速度(單 位nm/s);
外側(cè)頭位移(ALH)的幅度，是精子頭部擺動的平均寬度(單位拜)；以及
直線性系數(shù)(linearity coefficient)(LIN = VSL/VCL x 100)，是精子軌跡的 筆直程度(單位％)。
這些參數(shù)圖表形式顯示于圖1中。在圖1中，VAP指的是平滑精子路線 的平均速度(lim/s)。
為了分析細(xì)胞外ATP對來自精子活力不足的受試者的精子活力參數(shù)的作用，通過如下方式將來自該受試者的精子樣品進(jìn)行一次洗滌添加BWW 培養(yǎng)基(Biggers-Whitten-Whittingham培養(yǎng)基；95mMNaCl， 4.8mMKCl， 1.7 mM CaCl2, 1.2 mM KH2P04, 1.2 MgS04， 25 NaHC03, 5.6 mM果糖，0.25 mM 丙酮酸鈉，3.7 ml/1的60%乳酸鈉糖漿，104 IU/ml青霉素，以及10 mg/ml 鏈霉素)，并以800xg離心10分鐘。離心后棄去上清液，將精子沉淀小5求 以濃度10x 1(^個精子/毫升懸浮于BWW培養(yǎng)基中，分成兩等分，并^f吏它們 恢復(fù)15分鐘。然后將一等分試樣用ATP(2.5mM的最終濃度，由100mM母 液通過用生理溶液(0.9%的NaCl蒸餾水溶液)稀釋ATP而制備)在37。C培育， 而另一等分試樣僅用相同量的生理溶液在37。C培育(作為陰性對照)。在培育 60分鐘之后，如上所述確定精子活力參數(shù)。
實(shí)施例2:用細(xì)胞外ATP處理來自精子活力不足的受試者的精子 檢查了細(xì)胞外ATP對如下精子的精子活力參數(shù)的作用，所述精子來自 患有精子活力不足癥受試者，洗去精液后懸浮于BWW培養(yǎng)基(10x 106個精 子/毫升)。
精子活力不足的受試者的精子在2.5mM的ATP存在下培育60分鐘改 進(jìn)了精子的活力參數(shù)，包括前進(jìn)速度(對照23.81±6.04 pM/s， ATP: 28.85±7.27 pm/s; pi.0024)以及直線性(對照29.59±6.25， ATP: 37.7士7.9; p-0.0004)(參 見圖2)。在ATP處理(2.5mM)后未觀察到ATP處理對曲線速度和精子外側(cè)頭 位移的顯著影響。
因此看來，來自精子活力不足的受試者的精子的ATP處理提高了精子 活力特性。這些發(fā)現(xiàn)對ATP如何提高人IVF成功率提供了機(jī)械學(xué)支持，并 說明使精子培育暴露于細(xì)胞外ATP對于不育可以是一種有用且無毒的治療。
已經(jīng)描述了多個本發(fā)明的實(shí)施方案。但是，應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明的精 神和范圍的條件下可進(jìn)行各種修改。因此，其它實(shí)施方案在所附的權(quán)利要求 書的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提高哺乳動物精子活力的方法，該方法包括使來自哺乳動物受試者的精子與細(xì)胞外腺苷5′-三磷酸(ATP)接觸。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中，在所述接觸之前，來自所述哺乳動物受 試者的多個精子經(jīng)鑒定為具有降低的活力。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述哺乳動物受試者是人受試者。
4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述哺乳動物受試者是馬科動物受試者。
5. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸包括在其中溶有ATP 的生理培養(yǎng)基中培養(yǎng)精子。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸達(dá)約IO分鐘至約120 分鐘。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸達(dá)約60分鐘。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中在所述接觸初始時細(xì)胞外ATP 的濃度為約lOOpM至約5mM。
9. 權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中在所述接觸初始時細(xì)胞外ATP 的濃度為約2.5mM。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸在約18。C至約37 'C進(jìn)行。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸在約37。C進(jìn)行。
12. 權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的方法，其中在所述接觸之前，所述精 子基本上與精漿分離。
13. 權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中在所述接觸之后，對精子 活力進(jìn)行評定。
14. 權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述接觸發(fā)生在雌性哺乳動 物的生殖道中。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述雌性哺乳動物為人。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述雌性哺乳動物為馬科動物受試者。
17. —種使哺乳動物卵子受精的方法，該方法包括使哺乳動物卵子與已 經(jīng)經(jīng)歷權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法的哺乳動物精子接觸。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在體外發(fā)生。
19. 權(quán)利要求17的方法，其中在哺乳動物卵子的接觸和接觸過的卵子 已經(jīng)受精并成為胚胎之后，將所述哺乳動物卵子置于哺乳動物子宮內(nèi)。
20. 權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在體內(nèi)發(fā)生。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動物卵子的接觸在雌性生殖道 內(nèi)發(fā)生。
22. 權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動物精子是人的 精子，所述哺乳動物卵子是人的卵子。
23. 權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動物精子是馬科 動物的精子，所述哺乳動物印子是馬科動物的卵子。
24. 權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受試者。
25. 權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)的方法，其中所述精子得自精子活力不 足的受試者。
全文摘要
本發(fā)明披露了提高哺乳動物精子授精能力的方法，包括使所述精子與腺苷5′-三磷酸接觸，以及披露了使用所述方式處理過的精子進(jìn)行授精的方法。
文檔編號G01N33/483GK101688859SQ200880013833
公開日2010年3月31日 申請日期2008年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日
發(fā)明者古列爾莫·伯納尼, 弗朗西斯科·蒂弗吉里奧, 馬科·羅薩托 申請人:達(dá)斯卡科技公司