專利名稱：：使用外切糖苷酶對(duì)n-聚糖進(jìn)行表征的制作方法使用外切糖苷酶對(duì)N-聚糖進(jìn)行表征相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2007年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/923,688的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過引用結(jié)合在此。背景糖蛋白的糖基化作用模式經(jīng)常在該糖蛋白的功能中發(fā)揮重要的作用。僅給出一些實(shí)例糖蛋白的糖基化作用模式會(huì)影響其正確地折疊的能力，其穩(wěn)定性(例如，對(duì)蛋白質(zhì)水解和/或其他的降解的耐受性)，催化活性、藥效學(xué)和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，和/或糖蛋白與其他的分子適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行相互作用的能力。可替代地或額外地，糖蛋白的糖基化作用模式可以影響這種糖蛋白的傳送和靶向。例如，糖蛋白的糖基化作用模式會(huì)影響該糖蛋白是否仍然是細(xì)胞內(nèi)(包括，例如該糖蛋白正確地靶向適當(dāng)?shù)膩喖?xì)胞區(qū)室或多個(gè)區(qū)室)，該糖蛋白是否會(huì)是膜結(jié)合的和/或該糖蛋白是否會(huì)從細(xì)胞中分泌出來。目前的方法經(jīng)常不能檢測(cè)到在多種聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的幾種聚糖。主要的幾種聚糖會(huì)阻止以低水平存在的幾種聚糖的檢測(cè)和識(shí)別。此外，目前的方法通常不能對(duì)多種聚糖的一個(gè)群體中的幾種單個(gè)的聚糖的相對(duì)水平進(jìn)行精確地定量。目前的方法可能不能檢測(cè)多種聚糖的一個(gè)群體中的非標(biāo)準(zhǔn)化的連接。因此，需要對(duì)在多種聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的幾種聚糖進(jìn)行檢測(cè)的方法。需要對(duì)多種聚糖的一個(gè)群體中的幾種單個(gè)的聚糖的相對(duì)水平進(jìn)行定量的方法。概述本披露提供了對(duì)N-聚糖的組成和/或結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的方法。在此所說明的方法可以用來分析N-聚糖制品(例如，多種N-聚糖的一個(gè)混合物)，并且用來測(cè)定在制品中特定的結(jié)構(gòu)基團(tuán)和/或不常見的修飾作用(例如，核心或觸角海藻糖、乳糖胺擴(kuò)展物、高甘露糖以及雜合的聚糖，硫酸化作用以及磷酸化作用)的相對(duì)水平。在此所說明的方法總體上可以涉及以下步驟獲得一種N-聚糖制品；用外切糖苷酶的酶類對(duì)N-連接的聚糖進(jìn)行消化以便特異性地從非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割；并且分析這些切割產(chǎn)物。將使用外切糖苷酶的酶類的多種處理(例如同時(shí)的以及不同的順序處理)的結(jié)果進(jìn)行比較可以提供有關(guān)聚糖結(jié)構(gòu)的出人意料的信息，例如可以鑒別出在一種N-聚糖制品中以非常低的水平而存在的幾種聚糖。聚糖制品可以通過本領(lǐng)域內(nèi)任何一種可供使用的方法而獲得。總體而言，獲得一種N-聚糖制品包括以下步驟(1)獲得一種糖蛋白或其他的結(jié)合糖(glycoconjiigate)制品；并且(2)從該結(jié)合糖制品中獲得一種N-聚糖制品。結(jié)合糖(例如糖蛋白)制品可以從任何一種來源中獲得，包括但不限于，治療性配制品、商業(yè)性生物產(chǎn)品、以及生物樣品。在一些實(shí)施方案中，通過提供一種糖蛋白群體并且從該糖蛋白群體的這些糖蛋白中移出N-聚糖而獲得一種N-聚糖制品。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖可以與一種可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如，熒光的和/或放射性的部分(moiety))相締合。在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種外切糖苷酶對(duì)多種N-聚糖群體進(jìn)行消化，并且對(duì)消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和/或組成進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露所使用的外切糖苷酶僅識(shí)別并且切割了一種具體類型的糖苷連接(glycosidiclinkage)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露所使用的外切糖苷酶識(shí)別并且切割了多于一種具體類型的糖苷連接。根據(jù)本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、巖藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。根據(jù)本披露，N-聚糖群體可以使用任何外切糖苷酶進(jìn)行消化。在一些實(shí)施方案中，通過將多種N-聚糖的一個(gè)群體經(jīng)受多種外切糖苷酶的處理而對(duì)N-聚糖進(jìn)行消化。例如，多種N-聚糖的一個(gè)群體中可以經(jīng)受2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多種外切糖苷酶的處22理。在一些實(shí)施方案中，同時(shí)給予多種外切糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，順序地給予多種外切糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，改變所給予的外切糖苷酶的身份揭示了有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。在一些實(shí)施方案中，改變所給予的多種外切糖苷酶的順序揭示了有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。在一些實(shí)施方案中，使用多種外切糖苷酶進(jìn)行順序消化揭示了有關(guān)N-聚糖結(jié)構(gòu)和/或組成的信息，該信息不同于用同一組外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行消化所揭示的信息。在一些實(shí)施方案中，使用多種外切糖苷酶進(jìn)行順序消化揭示了有關(guān)N-聚糖結(jié)構(gòu)和/或組成的信息，該信息與用同一組外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行消化所揭示的信息相同。在一些實(shí)施方案中，一旦一種外切糖苷酶的處理已經(jīng)執(zhí)行完成，就對(duì)所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或身份進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，至少一種樣品可以在外切糖苷酶的處理過程中(例如，在完成該外切糖苷酶處理之前的任何時(shí)間點(diǎn))從該聚糖制品中被移出。在一些實(shí)施方案中，在至少所移出的樣品之一中對(duì)所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或類別進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，該分析步驟包括將在所移出的樣品中的一種或多種中所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能與在至少一種其他的所移出的樣品中所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，該分析步驟包括將在所移出的樣品中的一種或多種中所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能與在一種參比樣品中所切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能進(jìn)行比較。已消化的N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過任何一種可供使用的方法進(jìn)行分析(例如色譜方法、質(zhì)譜法、核磁共振、毛細(xì)管電泳法、等等)。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的幾種N-聚糖。例如，根據(jù)本披露，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在的幾種N-聚糖小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1°/。、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、或小于0.1%。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的具體的連接(linkage)。例如，23根據(jù)本披露，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在的具體的連接小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5°/。、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25°/0、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)多種N-聚糖的一個(gè)群體中的幾種單個(gè)的N-聚糖的相對(duì)水平。例如，可對(duì)液相色譜法中每個(gè)峰之下的面積進(jìn)行測(cè)量并且將其表達(dá)為總數(shù)的一個(gè)百分?jǐn)?shù)。這種分析提供了在多種N-聚糖的一個(gè)群體中每個(gè)N-聚糖種類的相對(duì)百分比的量。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法可以用來分析作為治療劑(例如，干擾素、集落刺激因子、血液凝固因子、等等)而使用的糖蛋白的糖基化作用模式。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些治療性糖蛋白試劑的糖基化作用模式可以潛在地影響其治療特性。這樣，對(duì)所感興趣的一種已表達(dá)的糖蛋白的糖基化作用模式進(jìn)行精確表征是重要的。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的方法在此類治療性糖蛋白的糖基化作用模式的精確表征方面是有用的。在一些實(shí)施方案中，所感興趣的治療性糖蛋白產(chǎn)生于細(xì)胞中并且在產(chǎn)生之后從該細(xì)胞中分泌出來。根據(jù)本披露的方法可以用于預(yù)測(cè)此類經(jīng)分泌的治療性糖蛋白的糖基化作用模式。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的方法可以用于監(jiān)測(cè)糖蛋白在其通過細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的過程中的糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生產(chǎn)(例如，商業(yè)性生產(chǎn))可以涉及以下步驟(1)培養(yǎng)產(chǎn)生這種糖蛋白的細(xì)胞，(2)在整個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的過程中以規(guī)則或不規(guī)則的間隔獲得樣品，并且(3)分析在每個(gè)所獲得的樣品中產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化作用模式。在一些實(shí)施方案中，此類方法可以進(jìn)一步包括將在每個(gè)所獲得的樣品中產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化作用模式彼此進(jìn)行比較的一個(gè)步驟。在一些實(shí)施方案中，此類方法可以進(jìn)一步包括將在每個(gè)所獲得的樣品中產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化作用模式與一個(gè)參比樣品的糖基化作用模式進(jìn)行比較的一個(gè)步驟。在一些實(shí)施方案中，所感興趣的治療性糖蛋白是一種可商購(gòu)的糖蛋白(例如，抗體、多肽、白細(xì)胞介素、受體類似物、受體拮抗劑類，等等，和/或其用于治療一種疾病、病況、或紊亂的特征性部分)。根據(jù)本披露的方法可以用于確定此類可商購(gòu)的糖蛋白的糖基化作用模式。附圖簡(jiǎn)要說明圖l:示例性的N-聚糖結(jié)構(gòu)。圖2:將經(jīng)2AB-標(biāo)記的N-聚糖的混合物經(jīng)受用唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶的酶類的處理。將樣品施用至酰胺柱上并且用正相色譜法進(jìn)行洗脫。(A)在酰胺柱上分離開的N-聚糖混合物。(B)用酶逐步處理之后的N-聚糖類。如色譜圖中所示，通過這種處理乳糖胺-擴(kuò)展的聚糖沒有被完全地切割成M3N2。這些峰的身份通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)得到確認(rèn)。圖3:N-聚糖混合物在該混合物用唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶的酶類同時(shí)進(jìn)行處理而徹底消化之后的色譜圖。將這些樣品施用至酰胺柱上并且用正相色譜法進(jìn)行洗脫。插圖從大約30至大約70分鐘的柱色譜圖的特寫，放大至可看見較小的峰。圖4:使用廣泛特異性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶(Rx05-C處理)順序地進(jìn)行消化的示例性的N-聚糖群體中。示出了不同的消化產(chǎn)物的全體。圖5:消化產(chǎn)物的比較，這些消化產(chǎn)物在使用a-2/3，6,8，9-唾液酸酶、P-l/3,4，6-半乳糖苷酶、以及|3-1，4-己糖胺酶對(duì)一種聚糖群體(由頂部所示的兩種聚糖表示)順序地(左)以及同時(shí)地(右)進(jìn)行消化之后而獲得。針對(duì)該聚糖群體的兩種聚糖，同時(shí)的消化產(chǎn)生了同樣的反應(yīng)產(chǎn)物(甘露糖核心)。順序的消化產(chǎn)生了兩種不同的消化產(chǎn)物。該實(shí)例示出了順序消化如何能夠揭示不能從一種同時(shí)的消化中獲得的信息。圖6:glcNAc(正方形)的巖藻糖基化作用(由三角形表示)阻止己糖胺酶能夠切割一個(gè)末端的glcNAc。這里示出的是兩種25聚糖，一種具有觸角巖藻糖化的glcNAc(右)，而另一種沒有(左)。用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶消化之后，左邊的這類被切去成為其甘露糖的核心。相比之下，巖藻糖化的glcNAc不能通過一個(gè)相同的外切糖苷酶的處理而被切割掉。圖7:同時(shí)的以及順序的外切糖苷酶的處理以揭示雜合的以及聚乳糖胺的結(jié)構(gòu)。使用外切糖苷酶對(duì)聚糖混合物進(jìn)行處理并且對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。通過HPLC(A)展示了保留在同時(shí)對(duì)比順序的切割中的聚糖結(jié)構(gòu)的對(duì)比。使用唾液酸酶、半乳糖苷酶(頂部格子)、唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶(中部格子)或唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶(底部格子)對(duì)聚糖制品同時(shí)地或順序地進(jìn)行處理。通過質(zhì)譜(MS)(B)展示了保留在針對(duì)唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶的反應(yīng)的同時(shí)對(duì)比順序的切割中的聚糖結(jié)構(gòu)的比較。用HPLC以及相應(yīng)的MS對(duì)保留在順序的切割之后的聚乳糖胺結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)定。圖8:通過對(duì)同樣的聚糖樣品的順序的以及同時(shí)的酶處理所產(chǎn)生的色譜圖進(jìn)行頭對(duì)頭的比較(head-to-headcomparison)來快速鑒別包含聚乳糖胺的聚糖。將唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶用于酶促反應(yīng)。用箭頭指示順序的以及同時(shí)的處理。圖9:通過對(duì)同樣的聚糖樣品的順序的(頂部格子)以及同時(shí)的(底部格子)酶處理所產(chǎn)生的MALDI-MS譜圖進(jìn)行頭對(duì)頭的比較來快速鑒別包含聚乳糖胺的聚糖。將唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶用于酶促反應(yīng)。定義大約、約、約略如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"大約"、"約"或"約略"當(dāng)施用至一個(gè)或多個(gè)所感興趣的值時(shí)，是指與一個(gè)所指出的參考值相類似的一個(gè)值。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"大約"、"約"或"約略"是指落在所指出的參考值的以下比例之內(nèi)的數(shù)值的范圍25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或更小。生物樣本如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指由任何活細(xì)胞或生物體排泄或分泌而獲得的任何固體或液體的樣品，包括但不限于組織培養(yǎng)物、生物反應(yīng)器樣品、人或動(dòng)物的組織、植物、水果、蔬菜、單細(xì)胞的微生物(如，細(xì)菌以及酵母)以及多細(xì)胞的生物體。例如，生物樣本可以是一種生物液體，該生物液體獲自例如，血液、血漿、血清、尿液、膽汁、精液、腦脊液、房水或玻璃體液、或任何一種身體的分泌物、一種滲出液、一種溢泌物(例如，獲自膿腫或任何其他的感染或炎癥點(diǎn)的液體)、或者獲自關(guān)節(jié)的液體(例如，正常的關(guān)節(jié)或受疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎)影響的關(guān)節(jié))。生物樣板還可以是例如，獲自任何器官或組織(包括活組織檢查或尸體解剖樣本)的一種樣品，可以包括細(xì)胞(不論是原代細(xì)胞或是培養(yǎng)的細(xì)胞)，受任何細(xì)胞、組織或器官、組織培養(yǎng)物限制的培養(yǎng)介質(zhì)。細(xì)胞表面糖蛋白如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞表面糖蛋白"是指一種糖蛋白，它的至少一部分存在于細(xì)胞的外表面上。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面糖蛋白是一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞表面上，這樣聚糖結(jié)構(gòu)中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞的外表面上。細(xì)胞表面聚糖"細(xì)胞表面聚糖"是存在于細(xì)胞的外表面上的一種聚糖。在本披露的多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表面聚糖被共價(jià)地連接到作為一種細(xì)胞表面糖蛋白的部分的一個(gè)多肽上。細(xì)胞表面聚糖還可以被連接到細(xì)胞膜的類脂上。聚糖如本領(lǐng)域內(nèi)己知并且在此所使用，"聚糖"是多種糖。聚糖可以是糖殘基的單體或聚合物，但典型地包含至少三個(gè)糖，并且可以是直鏈的或分支的。聚糖可以包括天然的糖殘基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙?；窠?jīng)氨糖酸、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、己糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、等等)和/或經(jīng)修飾的糖(例如，2，-氟代核糖、2，-脫氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺基N-乙酰葡糖胺、等等)。術(shù)語(yǔ)"聚糖"包括糖殘基的均聚物以及雜聚物。術(shù)語(yǔ)"聚糖"還涵蓋了結(jié)合糖的一個(gè)聚糖組分(例如，一種糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等的一個(gè)聚糖組分)。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋游離的聚糖，包括從一種結(jié)合糖中己經(jīng)被切割的或由其他方式所釋放的聚糖。聚糖制品如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"聚糖制品"是指根據(jù)一個(gè)具體的生產(chǎn)方法而獲得的一組聚糖。在一些實(shí)施方案中，聚糖制品是指從一種糖蛋白制品(見以下糖蛋白制品的定義)中獲得的一組聚糖。結(jié)合糖如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"結(jié)合糖"涵蓋了以下所有分子，其中至少一個(gè)糖部分被共價(jià)地連接到至少一個(gè)其他部分上。0該術(shù)語(yǔ)確切地涵蓋了所有具有共價(jià)附連的糖部分的生物分子，包括例如N-連接的糖蛋白、O-連接的糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等等。糖形在此所使用的術(shù)語(yǔ)"糖形"是指結(jié)合糖的一種具體形式。S卩，當(dāng)相同的主鏈部分(它作為一種結(jié)合糖的部分)(例如多肽、類脂、等等)具有被連接到不同的聚糖或聚糖的不同組上的潛在性時(shí)，于是結(jié)合糖(即，其中該主鏈被連接到具體的一組聚糖上)的每一種不同形式即被稱為一種"糖形"。糖脂如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"糖脂"是指包含一個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接的糖部分(即，聚糖)的一種類脂。一個(gè)或多個(gè)糖部分可以是處于單糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。這種或這些糖部分可以包括糖殘基的一個(gè)單一的無分支的鏈或者可以由一個(gè)或多個(gè)分支的鏈所組成。在一些實(shí)施方案中，這些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，這些糖蛋白包含O-連接的糖部分；在一些實(shí)施方案中，這些糖蛋白包含N-連接的糖部分。糖蛋白如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"糖蛋白"是指一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含了共價(jià)連接至一個(gè)或多個(gè)糖部分(即，聚糖)上的一個(gè)肽主鏈。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解，這種肽主鏈典型地包括具有多種氨基酸殘基的一個(gè)直鏈的鏈。在一些實(shí)施方案中，這種肽主鏈跨越了細(xì)胞膜，這樣它包括一個(gè)跨膜部分以及一個(gè)細(xì)胞外部分。在一些實(shí)施方案中，跨過了細(xì)胞膜的糖蛋白的肽主鏈包括了細(xì)胞內(nèi)部分，跨膜部分、以及細(xì)胞外部分。在一些實(shí)施方案中，本披露的方法包括使用一種蛋白酶來切割一種細(xì)胞表面糖蛋白以釋放該糖蛋白的細(xì)胞外部分，或它的一部分，其中這種暴露基本上不會(huì)使細(xì)胞膜破裂。這個(gè)或這些糖部分可以是處于單糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。這個(gè)或這些糖部分可以包括糖殘基的一個(gè)單一的無分支的鏈或者可以包括一個(gè)或多個(gè)分支的鏈。在一些實(shí)施方案中，這些糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基團(tuán)。可替代地或額外地，這些糖部分可以包括乙?；?、羥乙?；?、丙基或其他烷基的修飾。在一些實(shí)施方案中，這些糖蛋白包含O-連接的糖部分；在一些實(shí)施方案中，這些糖蛋白包含N-連接的糖部分。在一些實(shí)施方案中，在此所披露的方法包括分析以下項(xiàng)中任何一項(xiàng)或全部的一個(gè)步驟細(xì)胞表面糖蛋白、已釋放的細(xì)胞表面糖蛋白的碎片(例如，糖肽)、附連到細(xì)胞表面糖肽上的細(xì)胞表面聚糖、細(xì)胞表面糖肽的肽主鏈、此類糖肽的碎片、聚糖和/或肽主鏈，以及它們的組合。糖苷酶如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"糖苷酶"是指一種試劑，該試劑切割了在聚糖中的多種順序的糖之間的或在糖與主鏈部分之間(例如，在糖蛋白的糖與肽主鏈之間)的一個(gè)共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，糖苷酶是一種酶。在一些實(shí)施方案中，糖苷酶是含有一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的一種蛋白(例如，一種蛋白質(zhì)酶(proteinenzyme))。在一些實(shí)施方案中，糖苷酶是一種化學(xué)切割試劑。糖基化作用模式如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"糖基化作用模式"是指在一個(gè)具體的樣品中存在的一組聚糖結(jié)構(gòu)。例如，一個(gè)具體的結(jié)合糖(例如，糖蛋白)或一組結(jié)合糖(例如，糖蛋白的組合)將具有一種糖基化作用模式。在一些實(shí)施方案中，提及的是細(xì)胞表面聚糖的糖基化作用模式。糖基化作用模式的特征可以是，例如聚糖的身份、單個(gè)的聚糖或具體類型的聚糖的量(絕對(duì)的或相對(duì)的)、糖基化位點(diǎn)的占用度、等等，或這些參數(shù)的組合。糖蛋白制品如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"糖蛋白制品"是指一組單個(gè)的糖蛋白分子，該組中的每一個(gè)包括具有一個(gè)特定的氨基酸序列(該氨基酸序列包括至少一個(gè)糖基化位點(diǎn))的一個(gè)多肽以及被共價(jià)地附連到該至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)上的至少一種聚糖。在糖蛋白制品中的一種具體糖蛋白的單個(gè)的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可能在至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)的占用方面有所不同和/或在被連接到至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)上的聚糖的身份方面所有不同。即，一種糖蛋白制品可以僅包括一種具體的糖蛋白的一種單一的糖形，但是更典型地包括多種糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在所存在的糖形的身份方29面(例如，在一種制品中存在的糖形可能是另一種制品所缺少的)和/或在不同糖形的相對(duì)量方面有所不同。N-聚糖如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"N-聚糖"是指多種糖的一個(gè)聚合物，該聚合物已經(jīng)從一種結(jié)合糖中釋放出來，但是之前通過一個(gè)氮連接(參見以下N-連接的聚糖的定義)被連接到該結(jié)合糖上。N-連接的聚糖N-連接的聚糖是以下聚糖，它們通過一個(gè)氮連接而被連接到一種結(jié)合糖上。存在著不同分類的N-連接的聚糖，但是它典型地基于共同的核心戊糖(Man)3(GlcNAc)(GlcNAc)。O-聚糖如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"O-聚糖"是指多種糖的一個(gè)聚合物，該聚合物已經(jīng)從一種結(jié)合糖中釋放出來，但是之前通過一個(gè)氧連接(參見以下O-連接的聚糖的定義)被連接到該結(jié)合糖上。O-連接的聚糖O-連接的聚糖是以下聚糖，它們通過一個(gè)氧連接而被連接到一種結(jié)合糖上。O-連接的聚糖典型地通過N-乙?；?D"半乳糖胺(GalNAc)而被連接到糖蛋白上或者通過N-乙?；?D-葡糖胺(GlcNAc)而被連接到L-絲氨酸(Ser)或L-蘇氨酸(Thr)的羥基基團(tuán)上。一些O-連接的聚糖還具有諸如乙?；饔靡约傲蛩峄饔玫男揎椬饔谩Ｔ谝恍├又?，O-連接的聚糖附連到糖蛋白，通過巖藻糖或甘露糖到L-絲氨酸(Ser)或L-蘇氨酸(Thr)的羥基基團(tuán)上。磷酸化作用如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"磷酸化作用"是指將一個(gè)或多個(gè)磷酸根基團(tuán)共價(jià)地加至一個(gè)分子(例如，一種聚糖)中的過程。蛋白酶如在此所使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白酶"是指一種試劑，該試劑切割了在一個(gè)多肽鏈中的多個(gè)順序的氨基酸之間的一個(gè)肽鍵。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是一種酶(即，一種蛋白水解酶)。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是一種蛋白質(zhì)(例如，一種蛋白質(zhì)酶)，該蛋白質(zhì)包括一個(gè)或多個(gè)多肽鏈。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是一種化學(xué)切割試劑。蛋白質(zhì)總體而言，"蛋白質(zhì)"是一種多肽(即，通過肽鍵彼此相連的一串至少兩個(gè)的氨基酸)。蛋白質(zhì)可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或還可以另行處理或修飾。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，"蛋白質(zhì)"可以是由細(xì)胞(具有或沒有一種信號(hào)序列)所產(chǎn)生的一種完整的多肽鏈，或者可以是它的一個(gè)功能性部分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步地理解，有時(shí)蛋白質(zhì)可包括多于一種的多肽鏈，例如通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵相連接或通過其他方式相締合。唾液酸在此所使用，術(shù)語(yǔ)"唾液酸"是針對(duì)神經(jīng)氨糖酸的N-或O-取代的衍生物的一個(gè)統(tǒng)稱，是一種九碳單糖。神經(jīng)氨糖酸的氨基基團(tuán)典型地帶有唾液酸中的乙?；蛄u乙?；幕鶊F(tuán)。唾液酸中存在的羥基取代基可以通過乙?；饔谩⒓谆饔?、硫酸化作用、以及磷酸化作用進(jìn)行修飾。主導(dǎo)性唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨糖酸(Neu5Ac)。唾液酸向聚糖傳遞一個(gè)負(fù)電荷，這是因?yàn)轸驶鶊F(tuán)在生理pH下易于解離出一個(gè)質(zhì)子。示例性的去質(zhì)子的唾液酸顯示如下基本上如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"基本上"是指展示出一個(gè)所感興趣的特征或特性的總體的或接近總體的范圍或程度的定性的狀態(tài)。生物領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，生物以及化學(xué)現(xiàn)象很少(如果存有的話)會(huì)達(dá)到完全和/或進(jìn)行到完全或?qū)崿F(xiàn)或避免一個(gè)絕對(duì)的結(jié)果。因此，術(shù)語(yǔ)"基本上"在此進(jìn)行使用以涵蓋在許多生物以及化學(xué)現(xiàn)象中固有的潛在的完全性的缺失。僅給出一個(gè)具體的實(shí)例，當(dāng)一種處理被說成"基本上"不會(huì)使細(xì)胞膜破裂時(shí)，它意指在處理的過程中以及在處理之后所有的或大部分細(xì)胞膜仍然是完整的，例如這樣細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白或糖肽因此不會(huì)從細(xì)胞中釋放出來。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"基本上"當(dāng)被施用至未破裂的細(xì)胞膜中時(shí)是指一種狀態(tài)，其中經(jīng)受了一種具體的處理的細(xì)胞的15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或更少展示出了可測(cè)量的已破裂的細(xì)胞膜。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"基本上"當(dāng)被施用于未破裂的細(xì)胞膜中是N-乙酰神經(jīng)氨糖酸(Neu5Ac)神經(jīng)氨糖酸(Neu)31指一種狀態(tài)，其中經(jīng)受了一種具體的處理的多個(gè)細(xì)胞都沒有展示出可測(cè)量的已破裂的細(xì)胞膜。某些實(shí)施方案的詳細(xì)說明本披露提供了分析N-連接的聚糖的組成的方法。根據(jù)本披露，在此所說明的方法可以用于分析一種N-聚糖的混合物，并且用于測(cè)量在這種混合物中特定的基團(tuán)以及不常見的修飾(例如，核心或觸角巖藻糖、乳糖胺擴(kuò)展物、高甘露糖以及雜合聚糖、硫酸化作用、磷酸化作用，等等)的相對(duì)水平。例如，圖6證實(shí)了觸角的巖藻糖基化作用如何通過己糖胺酶阻止了glcNAc的消化。在多個(gè)實(shí)施方案中，本披露提供了多種方法，涉及以下步驟獲得一種N-聚糖制品；使用一種外切糖苷酶的酶來消化N-連接的聚糖以特異性地從非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割；并且分析這些切割產(chǎn)物。N-連接的聚糖類總體而言，聚糖是指一個(gè)碳水化合物部分，在一些實(shí)施方案中該碳水化合物部分被共價(jià)地附連到一種糖蛋白上。碳水化合物部分(例如，寡糖鏈)通過N-連接或O-連接被連接到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體中的糖蛋白上。典型地，N-連接的寡糖鏈被加到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中的糖蛋白上(參見Albertsetal.，MolecularBiologyoftheCell,1994，通過引用結(jié)合在此)。碳水化合物部分被加到包含于Asn-X-Ser/Thr的目標(biāo)共有序列內(nèi)的天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的氨基基團(tuán)上，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。最初的寡糖鏈通常通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的特異性的糖苷酶的酶類進(jìn)行修剪，產(chǎn)生由兩個(gè)N-乙酰葡糖胺以及三個(gè)甘露糖殘基組成的一個(gè)短的、分支的核心寡糖。N-聚糖可以再分成三個(gè)獨(dú)特的組，稱為"高甘露糖類型"、"雜合類型"、以及"復(fù)合類型"，其中在所有三個(gè)組中均發(fā)生一個(gè)常見的戊糖核心(Manp(al，6)-(Manp(al，3))-Manp(|31，4)-GlcpNAc(卩1，4)-GlcpNAc(pi，N)-Asn)。對(duì)核心的修飾作用包括例如，額外的糖基化作用，提供一個(gè)二等分的GlcNAc，將一個(gè)巖藻糖基殘基附接至最里面的GlcNAc上，以及使用唾液酸(Neu)殘基進(jìn)行加帽。示例性的N-聚糖描繪于圖1中。正如所見，N-聚糖的結(jié)構(gòu)變化多數(shù)發(fā)生于(相對(duì)于(高達(dá))4個(gè)觸角)在圖1中所述的N-聚糖的左手側(cè)。N-連接的聚糖通常被發(fā)現(xiàn)作為肽(即，糖肽)以及蛋白(即，糖蛋白)的成分。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行最初的處理之后，糖蛋白接著被傳送至高爾基體，在高爾基體中可發(fā)生另外的處理。經(jīng)修剪的N-連接的寡糖鏈可以通過加入幾種甘露糖殘基進(jìn)行修飾，產(chǎn)生一個(gè)"高甘露糖的寡糖"。可替代地或額外地，一個(gè)或多個(gè)N-乙酰葡糖胺的單糖單元可以被加到核心甘露糖的亞單元中以便形成"復(fù)合的寡糖"。半乳糖可以被加到N-乙酰葡糖胺的亞單元中，并且唾液酸的亞單元可以被加到半乳糖的亞單元中，產(chǎn)生用唾液酸、半乳糖、或N-乙酰葡糖胺的殘基中的任何一個(gè)進(jìn)行終止的鏈。巖藻糖殘基可以被加到核心寡糖的一個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基中。這些加入物各自通過特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行催化。N-連接的聚糖涉及多種細(xì)胞的處理。例如，N-聚糖有助于真核細(xì)胞中適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶蛋白(例如，鈣聯(lián)接蛋白以及鈣網(wǎng)蛋白)結(jié)合到在N-聚糖核心上存在的三個(gè)葡萄糖殘基上。分子伴侶蛋白典型地輔助聚糖所附連的蛋白質(zhì)的折疊。在適當(dāng)?shù)恼郫B之后，這三個(gè)葡萄糖殘基被移出，并且該聚糖可以繼續(xù)進(jìn)行另外的處理反應(yīng)。如果該蛋白未能進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣郫B，則這三個(gè)葡萄糖殘基被再附連，允許該蛋白與分子伴侶蛋白進(jìn)行再締合。這種循環(huán)可以重復(fù)若干次，直至蛋白質(zhì)達(dá)到其合適的構(gòu)象。如果蛋白質(zhì)未能重復(fù)地進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣郫B，則通常它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分泌出來并且被細(xì)胞質(zhì)蛋白酶降解?？商娲鼗蝾~外地，N-聚糖有助于通過空間效應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊。例如，由于附近聚糖的大小，可以暫時(shí)地阻止肽中的半胱氨酸殘基與其他半胱氨酸殘基形成二硫鍵。因此，N-連接的聚糖的存在可以允許細(xì)胞來控制哪個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)形成二硫鍵。N-聚糖可參與細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用。例如，腫瘤細(xì)胞時(shí)常產(chǎn)生異常的N-聚糖結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以被自然殺傷細(xì)胞上的CD337受體識(shí)別成表示相關(guān)的細(xì)胞為癌性的一種信號(hào)。N-聚糖可以參與將降解的溶酶體的酶類靶向至溶酶體。具體而言，使用甘露糖-6-磷酸殘基來修飾N-聚糖可以作為表示這種聚糖所附連的蛋白應(yīng)當(dāng)被靶向至該溶酶體的一個(gè)信號(hào)。因此，本披露涵蓋了以下識(shí)別，該識(shí)別對(duì)確定N-聚糖(例如，結(jié)合到糖蛋白上的N-聚糖)的糖基化作用模式而言是重要的。在此所說明的方法可以用來分析任何N-聚糖的特征(例如，組成和/或結(jié)構(gòu))。N-聚糖制品本披露提供了分析聚糖制品中的單個(gè)的N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的方法。聚糖制品可以通過本領(lǐng)域內(nèi)的任何一種可供使用的方法而獲得?？傮w而言，獲得一種N-聚糖制品包括以下步驟(1)獲得一種糖蛋白制品；并且(2)從該糖蛋白制品中獲得一種N-聚糖制品。在一些實(shí)施方案中，獲得一種N-聚糖制品可任選地包括用一種可檢測(cè)的標(biāo)記物對(duì)該N-聚糖制品進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。糖蛋白制品糖蛋白制品可以從任何一種來源中獲得，包括但不限于，治療性配制品(例如，促紅細(xì)胞生成素、胰島素、人生長(zhǎng)激素、等等)、商業(yè)性生物產(chǎn)品(例如，在表3中所呈現(xiàn)的那些生物產(chǎn)品)、以及生物樣品。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指通過任何活細(xì)胞或生物體排泄或分泌而獲得的任何一種固體或液體的樣品，包括但不限于組織培養(yǎng)物、人或動(dòng)物的組織、植物、水果、蔬菜、單細(xì)胞的微生物(如，細(xì)菌以及酵母)以及多細(xì)胞的生物體。例如，生物樣本可以是一種生物液體，該生物液體獲自例如，血液、血漿、血清、尿液、膽汁、精液、腦脊液、房水或玻璃體液、或任何一種身體分泌物、一種滲出液、一種溢泌物(例如，獲自膿腫或任何其他感染或炎癥點(diǎn)的液體)，或者獲自關(guān)節(jié)的液體(例如，正常的關(guān)節(jié)或受疾病(如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎)影響的關(guān)節(jié))。生物樣品還可以是例如一種樣品，該樣品獲自任何一種器官或組織(包括活組織檢查或尸體解剖樣本)，可以包括細(xì)胞(不論是原代細(xì)胞或是培養(yǎng)的細(xì)胞)，受任何細(xì)胞、組織或器官、組織培養(yǎng)物限制的培養(yǎng)介質(zhì)。糖蛋白制品可以被任何機(jī)器、人、或?qū)嶓w所接受。在一些實(shí)施方案中，糖蛋白制品可以被機(jī)器所接受，然后它可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)糖蛋白制品的測(cè)定、處理、或精制。在一些實(shí)施方案中，糖蛋白制品可以被人接受。在一些實(shí)施方案中，糖蛋白制品可以被一個(gè)外界的實(shí)體所接受。在一些實(shí)施方案中，糖蛋白制品可以被一個(gè)人或業(yè)務(wù)單位(為第二個(gè)人或業(yè)務(wù)單位進(jìn)行表征服務(wù))所接受。例如，一個(gè)業(yè)務(wù)單位可以得到運(yùn)行，其中該業(yè)務(wù)單位接受了將從其他業(yè)務(wù)單位或?qū)嶒?yàn)室中得到表征的糖蛋白制品。糖蛋白制品能以任何方式進(jìn)行處理。例如，可以對(duì)糖蛋白制品進(jìn)行處理以便分離出一種或多種糖形。N-聚糖制品在一些實(shí)施方案中，N-聚糖制品通過提供一種糖蛋白群體并且從該糖蛋白群體的這些糖蛋白中移出N-聚糖而獲得。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖通過消化從糖蛋白中被移出?？傮w而言，根據(jù)本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc-GlcNAc或Man-GlcNAc殘基之間進(jìn)行切割?？捎脕韽奶堑鞍字幸瞥鯪-聚糖的示例性的酶類包括但不限于，N-聚糖酶F禾tV或N-聚糖酶-A、0-聚糖酶和/或EndoH。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖通過化學(xué)切割從糖蛋白中被移出。僅給出一些實(shí)例，肼、硼氫化鈉、和/或三氟甲磺酸(TFMS)可以用來從糖蛋白中移出聚糖。標(biāo)記N-聚糖在一些實(shí)施方案中，N-聚糖(例如，己經(jīng)從一種糖蛋白群體中移出的N-聚糖)可以與其他一種或多種可檢測(cè)的標(biāo)記物相締合。可檢測(cè)的標(biāo)記物典型地與N-聚糖的還原性末端相締合。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光的部分。根據(jù)本披露可以使用的示例性的熒光團(tuán)包括但不限于2-氨基苯甲酸(2AA)、2-氨基苯甲酰胺(2AB)、和/或2-氨基嘌呤(2AP)?？傮w而言，根據(jù)本披露而使用的熒光團(tuán)的特征在于在不損害和/或破壞聚糖的條件下具有與一種寡糖和/或單糖的還原性末端的反應(yīng)性。在一些實(shí)施方案中，熒光的部分被直接地附連到還原性末端。例如，直接附連可以通過還原性氨基化作用的直接結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，熒光的部分被間接地附連到還原性末端。例如，間接連接可以通過一個(gè)反應(yīng)性的連接臂而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)的標(biāo)記物包括放射性的部分或經(jīng)同位素標(biāo)記的分子。根據(jù)本披露可以使用的示例性的放射的部分包括但不限于氣(3H)、氘(2H)、和/或"S。典型地，這些部分被直接35附連到該熒光團(tuán)上或者以其他方式與該熒光團(tuán)相締合。僅給出一個(gè)放射性的熒光團(tuán)的實(shí)例，可以對(duì)2AP進(jìn)行修飾這樣將所有的氫都被氖化。N-連接的聚糖的消化本披露提供了確定糖蛋白的糖基化作用模式的方法。此類方法總體上涉及將一種N-聚糖群體經(jīng)受一種或多種外切糖苷酶處理并且分析這些消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和/或組成。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露所使用的外切糖苷酶僅識(shí)別并且切割了一種具體類型的糖苷連接。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露所使用的外切糖苷酶識(shí)別并且切割了多于一種具體類型的糖苷連接。外切糖苷酶外切糖苷酶是從聚糖的非還原性末端切割末端的糖苷鍵的酶。它們對(duì)于具體的單糖連接以及異頭性(anomericity)(a/卩)是典型地高度特異的。在一些實(shí)施方案中，相鄰的分枝模式可以影響外切糖苷酶的特異性。外切糖苷酶的處理通常導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)的觸角連接的聚糖被切割成戊糖核心(M3N2)(包含3個(gè)甘露糖以及2個(gè)glcNAc殘基)。然而，不常見的修飾的種類(例如，巖藻糖化的觸角或核心巖藻糖化的種類、高甘露糖以及雜合聚糖、乳糖胺擴(kuò)展的聚糖、硫酸化的聚糖、磷酸化的聚糖，等等)對(duì)外切糖苷酶處理具有耐受性，并且可以用色譜方式分辨出并且相對(duì)于M3N2戊糖進(jìn)行定量。根據(jù)本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶，包括但不限于，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、巖藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。外切糖苷酶可以獲自任何一種來源，包括商業(yè)來源(例如，來自QA-Bio、ProZyme、Roche、Sigma、NEB、EMD、Glyko、等等)?？商娲鼗蝾~外地，外切糖苷酶可以從一種細(xì)胞的來源(例如細(xì)菌、酵母、植物、等等)中被分離和/或純化。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶(例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、巖藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶)可以被分成多個(gè)分類或"亞組"。在一些實(shí)施方案中，不同的亞組對(duì)切割不同類型的連接顯示出不同的能力。表1呈現(xiàn)出了一些示例性的外切糖苷酶，它們的連接特異性、以及從中得出每一種的生物體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)36人員應(yīng)當(dāng)理解這僅是一個(gè)示例性的，而非綜合性的外切糖苷酶列表，并且具有任何連接特異性的外切糖苷酶都可以根據(jù)本披露進(jìn)行使用。表l.外切糖苷酶<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>oc-甘露糖苷酶3.2.1.24a-l/2,3，6陽(yáng)人刀豆oc-l/2,3-人木薯萎蔫病黃單胞菌a-l,6-人(典型地一種核心甘露糖苷酶)黃單胞菌屬的菌種a-l,2-人齋藤曲霉|3-甘露糖苷酶3.2.1.25a-l，4-人蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)*"EC#"是指酶學(xué)委員會(huì)登記號(hào)根據(jù)本披露，N-聚糖群體可以使用任何一種外切糖苷酶或任何一組外切糖苷酶進(jìn)行消化?？傮w而言，外切糖苷酶反應(yīng)在與酶活性相容的條件下發(fā)生。例如，pH、溫度、反應(yīng)溶液成分以及濃度(例如，鹽、洗滌劑、等等)，以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)度可以得到最佳化以便獲得所希望的外切糖苷酶活性水平。總體而言，外切糖苷酶反應(yīng)在中性或酸性條件下發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)在基本上中性的條件下發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH在大約6與大約8之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH為大約7。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH為大約6.5。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH為大約7.5。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH為大約6。在一些實(shí)施方案中，中性條件是指pH為大約8。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)在酸性的條件下發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH小于約7。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約1與大約7之間的范圍。在一些些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約2與大約7之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約3與大約7之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約4與大約7之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約5與大約7之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH是在大約6與大約7之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約2與大約6之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約3與大約6之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約4與大約6之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約5與大約6之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約1與大約2之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約2與大約3之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH在大約4與大約5之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約6.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約6。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約5.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約4.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約4。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約3.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約3。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約2.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約2。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約1.5。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約1。在一些實(shí)施方案中，酸性條件是指pH為大約0.5。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)pH在從大約5至大約6的范圍時(shí)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)pH在大約5.5時(shí)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)pH在從大約6至大約8的范圍時(shí)發(fā)生?？傮w而言，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)溫度在大約20。C與大約45。C之間的范圍時(shí)(例如從大約30。C至大約40。C)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)溫度在大約25。C與大約40。C之間的范圍時(shí)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)在大約20°C、大約25。C、大約30°C、大約35°C、大約36°C、大約37°C、大約38°C、大約39。C、大約40。C、大約42。C、或大約45。C發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)溫度在大約35°C與大約40°C之間的范圍時(shí)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)溫度在大約36°C與大約38。C之間的范圍時(shí)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)當(dāng)溫度在大約37。C時(shí)發(fā)生?？傮w而言，外切糖苷酶反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間長(zhǎng)度在大約10分鐘與大約20小時(shí)之間的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)進(jìn)行大約10分鐘、大約30分鐘、大約1小時(shí)、大約2小時(shí)、大約5小時(shí)、大約10小時(shí)、大約12小時(shí)、大約15小時(shí)、大約18小時(shí)、大約20小時(shí)、大約24小時(shí)、大約36小時(shí)、或大約48小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)過夜進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)在一種洗滌劑的存在下(例如高達(dá)25%的洗滌劑)進(jìn)行。根據(jù)本披露可在外切糖苷酶反應(yīng)中利用的示例性的洗滌劑包括十二垸基硫酸鈉(SDS)，月桂基硫酸鈉(SLS)，山梨聚糖脂肪酸酯類(例如，吐溫、斯盤、賣澤、等等)、聚乙二醇脂肪酸酯類(例如，克列莫佛)、布里杰、Triton、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在大約0.1%、大約0.5%、大約1%、大約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、或大約25%的洗滌劑存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在不存在任何一種洗滌劑時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在鹽的存在下進(jìn)行。根據(jù)本披露可在外切糖苷酶反應(yīng)中利用的示例性的洗滌劑包括但不限于氯化鈉、氯化鈣、磷酸鈉、醋酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鎂、氯化錳、和/或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)在大約1mM至大約500mM的鹽的存在下進(jìn)行。例如，在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在大約1mM、大約2mM、大約5mM、大約10mM、大約25mM、大約50mM、大約100mM、大約150mM、大約200mM、大約250mM、大約300mM、大約400mM、大約口mM、大約500mM的鹽的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在大約100mM的鹽的存在下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶反應(yīng)是在不存在任何一種鹽時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖可以通過將一種N-聚糖群體經(jīng)受多種外切糖苷酶的處理而被消化。例如，多種N-聚糖的一個(gè)群體可以經(jīng)受2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或更多種外切糖苷酶的處理。在一些實(shí)施方案中，多種N-聚糖的一個(gè)群體使用全部以基本上切糖苷酶進(jìn)行消化。在一些實(shí)施方案中，多種N-聚糖的一個(gè)群體使用并非全部以基本上相等的量而存在的兩種或多種外切糖苷酶進(jìn)行消化。僅給出一個(gè)實(shí)例，多種N-聚糖的一個(gè)群體可以使用外切糖苷酶A、B以及C(比例為1:2:1)進(jìn)行消化。在一些實(shí)施方案中，同時(shí)給予多種外切糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，順序地給予多種外切糖苷酶。使用多種外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行消化在一些實(shí)施方案中，使用多種外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行的消化可以用來分析聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能。在一些實(shí)例中，可以進(jìn)行同時(shí)消化以便確定具體類型的連接和/或聚糖修飾作用的存在。僅給出一個(gè)實(shí)例，用于以下所示的假設(shè)的聚糖結(jié)構(gòu)對(duì)使用半乳糖苷酶以及己糖胺酶的同時(shí)處理進(jìn)行預(yù)測(cè)，僅留下最初包含于末端的唾液酸殘基中的觸角。然后這些唾液酸殘基可以可任選地被移出，并且通過HPLC對(duì)得到的聚糖混合物進(jìn)行分析，以便揭示在起始的混合物中存在的單、二、三以及四唾液酸化的觸角種類的特性。同時(shí)消化的方法的實(shí)例以及此類方法的分析說明于實(shí)例2中。使用多種外切糖苷酶進(jìn)行順序的消化作為另一個(gè)非限制性的實(shí)例，N-聚糖可以通過以下步驟而被消化將多種N-聚糖的一個(gè)群體經(jīng)受一個(gè)第一外切糖苷酶的處理，持續(xù)一個(gè)第一段時(shí)間，在這之后這種多種N-聚糖的一個(gè)群體經(jīng)受了一個(gè)第二外切糖苷酶的處理，持續(xù)一個(gè)第二段時(shí)間。使用第二外切糖苷酶處理之前，該第一外切糖苷酶可以可任選地被移出和/或被滅活。作為舉例，該第一外切糖苷酶，在一個(gè)溫度下孵育該外切糖苷酶足以將其滅活的時(shí)間，可以被滅活。額外地或可替代地，該第一外切糖苷酶可以通過用對(duì)該外切糖苷酶特異的一種抑制劑(例如，一種抗體或其他分子，它特異性地連接至該第一外切糖苷酶上并抑制其催化活性)進(jìn)行孵育而被滅活。其他將該第一外切糖苷酶滅活的方法對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言應(yīng)當(dāng)是已知的。當(dāng)該第一外切糖苷酶通過用一種特異的抑制劑對(duì)其進(jìn)行孵育而被滅活的情況下，應(yīng)當(dāng)理解的是抑制劑的存在不應(yīng)該基本上抑制該第二外切糖苷酶的活性。在一些實(shí)施方案中，在加入一種第二外切糖苷酶之前用于滅活或移出一種第一外切糖苷酶的方法包括將反應(yīng)混合物加熱、將反應(yīng)混合物冷卻、加入有機(jī)溶劑、加入蛋白酶，和/或它們的組合。在一些實(shí)施方案中，該第一外切糖苷酶在加入一種第二外切糖苷酶之前從該反應(yīng)中被移出，例如通過色譜法、固相萃取柱柱體、分子量過濾器、離心作用、沉淀作用、和/或它們的組合。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到這些相同的原則適用于第三、四、五、六、等等外切糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，使用多種外切糖苷酶進(jìn)行順序消化揭示了有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息，該信息不同于用同一組外切糖苷酶同時(shí)消化所揭示的信息。在一些實(shí)施方案中，使用多種外切糖苷酶進(jìn)行順序消化揭示了有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息，該信息與用同一組外切糖苷酶同時(shí)消化所揭示的信息相同。在一些實(shí)施方案中，改變給予多種外切糖苷酶的順序揭示了有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。僅給出一個(gè)實(shí)例，將一種具體的N-聚糖按照以下具體順序經(jīng)受(1)唾液酸酶、(2)半乳糖苷酶、(3)己糖胺酶、(4)巖藻糖苷酶，以及(5)甘露糖苷酶的處理，會(huì)產(chǎn)生一組消化產(chǎn)物，該組消化產(chǎn)物不同于將同樣的N-聚糖按照以下順序經(jīng)受(1)己糖胺酶、(2)甘露糖苷酶、(3)唾液酸酶、(4)巖藻糖苷酶以及(5)唾液酸酶的處理所獲得的消化產(chǎn)物。進(jìn)行這兩種系列的順序消42化，分析通過兩種順序消化所獲得的不同組的消化產(chǎn)物，并且比較不同組的消化產(chǎn)物(例如，相對(duì)于彼此和/或相對(duì)于一個(gè)參比樣品)可以提供有關(guān)N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息，該信息將不會(huì)通過僅進(jìn)行這些系列的順序消化之一并且分析僅從這些系列的順序消化之一所獲得的消化產(chǎn)物而獲得。順序消化方法的實(shí)例以及此類方法的分析說明于實(shí)例3中。在一些實(shí)施方案中，對(duì)構(gòu)成有待用于順序和/或同時(shí)消化的一組酶的單個(gè)的酶進(jìn)行挑選以便將可通過進(jìn)行消化而獲得的信息最大化。表2中所示的處理例證了酶處理的選擇以鑒定唾液酸化的聚糖上特異的聚糖修飾作用。表2.用于鑒定唾液酸化的聚糖上的修飾作用的示例性的酶處理<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>連接GlcNAc的唾液酸將使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶而沒有唾液酸酶、以及N-乙酰己糖胺酶的順序反應(yīng)與同時(shí)反應(yīng)進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，用于鑒定非唾液酸化的聚糖上的修飾作用的酶處理可以如表2中所說明而進(jìn)行，除了將唾液酸酶從表2中所例證的反應(yīng)中省略之外。聚糖結(jié)構(gòu)的分析總體而言，根據(jù)本披露的方法包括將一種聚糖制品經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶處理。在一些實(shí)施方案中，一旦一種外切糖苷酶的處理已經(jīng)執(zhí)行完成，就對(duì)已切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或身份進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，樣品可以在外切糖苷酶處理的過程中從聚糖制品中移出。在一些實(shí)施方案中，在時(shí)間上分離開(例如，以規(guī)則的或是不規(guī)則的間隔)的多個(gè)樣品可以在外切糖苷酶處理的過程中(例如，在完成外切糖苷酶處理之前的任何一個(gè)時(shí)間點(diǎn))從聚糖制品中被移出。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶處理包括給予至少一種外切糖苷酶，以及包括在給予至少一種外切糖苷酶的過程中將至少一種樣品移出的移出步驟(例如，在將外切糖苷酶加到該聚糖制品之后，但在該外切糖苷酶已經(jīng)被滅活和/或從該聚糖制品中被移出之前)。在一些實(shí)施方案中，外切糖苷酶處理包括順序地給予至少一種第一以及第二外切糖苷酶(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、和/或更多外切糖苷酶)，以及移出步驟，該移出步驟包括(0在給予該第一外切糖苷酶之后但在給予該第二外切糖苷酶之前移出至少一個(gè)第一樣品；以及(ii)在給予該第二外切糖苷酶之后移出至少一個(gè)該第二樣品。在一些實(shí)施方案中，在所移出的樣品的至少一種中對(duì)切割的聚糖的結(jié)構(gòu)和/或身份進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，該分析步驟包括將在一種或多種所移出的樣品中的切割聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能與在至少一種其他的所移出的樣品中的切割聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，該分析步驟包括將在一種或多種所移出的樣品中的切割聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能與在一種參比樣品中的切割聚糖的結(jié)構(gòu)和/或功能進(jìn)行比較。44N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過任何一種可供使用的方法進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過以下方法進(jìn)行分析色譜方法、質(zhì)譜法(MS)、色譜方法跟隨有MS、電泳法、電泳法跟隨有MS、核磁共振(NMR)法，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過色譜方法進(jìn)行分析，包括但不限于，液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)，超高效液相色譜法(UPLC)，薄層色譜法(TLC)，酰胺柱色譜法，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過質(zhì)譜法(MS)以及相關(guān)的方法進(jìn)行分析，包括但不限于，串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)、傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)、以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖結(jié)構(gòu)和組成可以通過電泳法進(jìn)行分析，包括但不限于毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有使用識(shí)別特定的多糖結(jié)構(gòu)的的抗體蛋白質(zhì)印跡法，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖結(jié)構(gòu)和組成可以通過核磁共振(NMR)以及相關(guān)方法進(jìn)行分析，包括但不限于，一維NMR(1D-NMR)，二維NMR(2D-NMR)，相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)，全相關(guān)光譜NMR(TOCSY-NMR)，異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)，異核多級(jí)量子相干(HMQC-NMR)，旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR),核歐沃豪斯效應(yīng)譜(NOESY-NMR)、以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的幾種N-聚糖。例如，本方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在的幾種N-聚糖小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的具體的連接。例如，本方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在的具體的連接小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種N-聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的幾種單個(gè)的N-聚糖的相對(duì)水平。例如，可以對(duì)液相色譜法中每個(gè)峰之下的面積進(jìn)行測(cè)量并且將其表達(dá)為總數(shù)的一個(gè)百分?jǐn)?shù)。這種分析提供了多種N-聚糖的一個(gè)群體中的每個(gè)N-聚糖種類的相對(duì)百分比的量。應(yīng)用本披露提供了用于分析任何一種聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的方法。僅給出一個(gè)實(shí)例，本披露提供了用于分析一種糖蛋白的糖基化作用模式的方法。本披露涵蓋了以下認(rèn)識(shí)，即確定一種糖蛋白的糖基化作用模式具有多種潛在的商業(yè)性、工業(yè)性、和/或治療性應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的方法可以被施用至獲自各種各樣來源的聚糖中，包括但不限于，治療性配制品(例如，促紅細(xì)胞生成素、胰島素、人生長(zhǎng)激素、等等)、商業(yè)性生物產(chǎn)品(例如，在表3中所呈現(xiàn)的那些生物產(chǎn)品)、以及生物樣品。生物樣本在根據(jù)本披露得到分析之前或之后可以經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)分析和/或純化步驟。僅給出一些實(shí)例，在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種蛋白酶和/或外切糖苷酶對(duì)生物樣本進(jìn)行處理(例如，這樣聚糖被釋放出來)；在一些實(shí)施方案中，用一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)測(cè)的標(biāo)記物或其他試劑對(duì)生物樣本中的聚糖進(jìn)行標(biāo)記(這可促進(jìn)通過例如質(zhì)譜或NMR進(jìn)行分析)。多種分離和/或離析步驟中的任何一個(gè)可以被施用至根據(jù)本披露的一種生物樣本中。可以利用本披露的方法來分析處于多種狀態(tài)中的任何一種的聚糖，例如游離的聚糖、結(jié)合糖(例如，糖肽、糖脂、蛋白聚糖、等等)、與細(xì)胞締合的聚糖(例如，與細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜締合的聚糖、等等)；與細(xì)胞的、細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)、和/或亞細(xì)胞的組分(例如蛋白質(zhì))締合的聚糖；在細(xì)胞外空間的聚糖(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基)、等等。本披露的方法可以用于針對(duì)生產(chǎn)所感興趣的一種治療性或其他商業(yè)上相關(guān)的糖蛋白的工藝開發(fā)的一個(gè)或多個(gè)階段中。可以采用本披露的方法的此類過程進(jìn)展階段的非限制性的實(shí)例包括細(xì)胞選擇、克隆選擇、培養(yǎng)基最佳化、培養(yǎng)條件、處理?xiàng)l件、和/或純化操作。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到其他的過程進(jìn)展階段。還可以利用本披露來監(jiān)測(cè)在一個(gè)具體的細(xì)胞培養(yǎng)物中所發(fā)生的糖基化作用的程度和/或類型，由此允許調(diào)節(jié)或可能地終止培養(yǎng)，以便(例如)實(shí)現(xiàn)一種特別希望的糖基化作用模式或避免發(fā)展一種特別不希望的糖基化作用模式。還可以利于本披露來評(píng)估細(xì)胞或細(xì)胞系的糖基化作用特征，這些細(xì)胞或細(xì)胞系被認(rèn)為用于生產(chǎn)一種特別希望的糖蛋白(例如，甚至是在對(duì)這些細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行工程處理以生產(chǎn)該糖蛋白、或生產(chǎn)一種處于商業(yè)上相關(guān)水平的糖蛋白之前)。例如，其中靶糖蛋白是一種治療性糖蛋白，例如在一個(gè)或多個(gè)國(guó)家中已經(jīng)歷了規(guī)章審査，經(jīng)常會(huì)希望的是監(jiān)測(cè)這些培養(yǎng)物以便評(píng)估它們會(huì)產(chǎn)生具有一種糖基化作用模式(盡可能接近于己確立的藥物產(chǎn)品的糖基化作用模式)的產(chǎn)物的可能性，無論它是否正在通過確實(shí)相同的路徑進(jìn)行生產(chǎn)。如在此所使用，"接近"是指一種糖基化作用模式，該模式與所確立的藥物產(chǎn)品的糖基化作用模式具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98°/。、或99%的相關(guān)性。在此類實(shí)施方案中，典型地在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取生產(chǎn)培養(yǎng)物的樣品并且將它們與一個(gè)已確立的標(biāo)準(zhǔn)或與一個(gè)對(duì)照培養(yǎng)物進(jìn)行比較以便評(píng)估相對(duì)的糖基化作用。例如，在一些實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)一種糖蛋白的生產(chǎn)的方法可以包括以下步驟(i)在一種糖蛋白的生產(chǎn)過程中，從該生產(chǎn)體系中移出至少第一以及第二含聚糖的樣品；(ii)將該第一以及第二含聚糖的樣品各自經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶操作，以便特異性地從在該含聚糖的樣品中的N-連接的聚糖的非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割;并且(iii)將從該第一含聚糖的樣品中獲得的這些切割產(chǎn)物與從該第二含聚糖的47樣品中的那些切割產(chǎn)物進(jìn)行比較，從而確定了差別并且因此使糖蛋白生產(chǎn)的進(jìn)程得到監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)一種糖蛋白的生產(chǎn)的方法涉及在外切糖苷酶反應(yīng)的過程中(例如，外切糖苷酶操作)在某個(gè)點(diǎn)移出至少一種含聚糖的樣品。在一些實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)一種糖蛋白的生產(chǎn)的方法涉及在外切糖苷酶反應(yīng)已完成之前移出至少一種含聚糖的樣品。在一些實(shí)施方案中，用于監(jiān)測(cè)一種糖蛋白的生產(chǎn)的方法涉及一旦外切糖苷酶反應(yīng)完成就移出至少一種含聚糖的樣品。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在以下條件時(shí)被移出外切糖苷酶操作完成了約10%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%，約60%、約70%、約75%、約80%、約90%、約95%、約99%、幾乎100%、基本上100%、或100%。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品當(dāng)外切糖苷酶反應(yīng)完成了幾乎100%時(shí)被移出。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品當(dāng)外切糖苷酶反應(yīng)完成了100%時(shí)被移出。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在外切糖苷酶反應(yīng)完成了100%之前被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品包括多種結(jié)合糖(例如，多種糖蛋白)。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在100%的這些結(jié)合糖已經(jīng)被切割之前被移出。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在100%的這些結(jié)合糖已經(jīng)被切割時(shí)才被移出。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在以下條件時(shí)被移出約10%、約20%、約25%、約30%、約40%、約50%，約60%、約70%、約75%、約80%、約90%、約95°/。、約99%、幾乎100%、基本上100%、或100%的這些結(jié)合糖已經(jīng)被切割。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖的樣品在100%的結(jié)合糖已經(jīng)被切割時(shí)被移出。在一些實(shí)施方案中，至少一種含聚糖樣品是在100%的結(jié)合糖已經(jīng)被切割之前被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品以規(guī)則的間隔被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品按照以下間隔被移出約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約12小時(shí)、或約18小時(shí)的間隔、或以甚至更長(zhǎng)的間隔移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品以不規(guī)則的間隔被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品以5小時(shí)的間隔被移出。在本披露的一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將會(huì)更加廣泛。例如，在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式顯示高度的糖基化位點(diǎn)占用(例如，高于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85°/。、約90%、約95%、約98%、約99%、或更高)；在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式顯示出一個(gè)高分支度(例如，高于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%或更高具有三或四觸角結(jié)構(gòu))。在本披露的一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將會(huì)不太廣泛。例如，在一些實(shí)施方案中，一種所希望的細(xì)胞表面糖基化作用模式顯示出低的糖基化位點(diǎn)占有(例如，小于約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25°/。、約20%、約15%、約15%、約5%、約1%、或更小)；和/或一種低分支度(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%或更少具有三或四觸角結(jié)構(gòu))。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式在一些方面將會(huì)更加廣泛，而在其他方面將會(huì)不太廣泛。例如，采用易于產(chǎn)生具有長(zhǎng)的，未分枝的寡糖鏈的糖蛋白的一種細(xì)胞系，這可能是所希望的?？商娲?，采用易于產(chǎn)生具有短的，高度分支的寡糖鏈的糖蛋白的一種細(xì)胞系，這可能是所希望的。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將會(huì)針對(duì)一種具體類型的聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行富集。例如，在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將會(huì)具有低水平的(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)高甘露糖或雜合結(jié)構(gòu)，高水平的(例如，大于約60°/。、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更高)高甘露糖結(jié)構(gòu)，高水平的(例如，大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更高；例如，每個(gè)糖蛋白至少一個(gè))磷酸化的高甘露糖，或低水平的(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)磷酸化的高甘露糖。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括至少約一種唾液酸。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括一個(gè)高水平的(例如，大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更高)唾液酸化的末端。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的的糖基化作用模式(包括唾液酸化作用)將顯示出至少約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更高的N-乙酰神經(jīng)氨酸禾卩/或小于約20。/。、約15%、約10%、約5%、約1%、或更少的N-乙酰神經(jīng)氨酸。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式顯示出分支延長(zhǎng)的特異性(例如，高于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更多的延長(zhǎng)是在al，6甘露糖分枝上；或大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更多的延長(zhǎng)是在al，3甘露糖分枝上)。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括低水平(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)或高水平(例如，大于約60%、約65%、約70°/。、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更大)的核心巖藻糖基化作用。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括低水平(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)或高水平(例如，大于約60°/。、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更大)的一種硫酸化的聚糖。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括低水平(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)或高水平(例如，大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95°/。、約98%、約99%、或更大)的一種磷酸化的聚糖。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括低水平(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更50小)或高水平(例如，大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更大)的連接到N-乙酰葡糖胺上的一種唾液酸。在一些實(shí)施方案中，一種所希望的糖基化作用模式將包括低水平(例如，小于約20%、約15%、約10%、約5%、約1%、或更小)或高水平(例如，大于約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、或更大)的一種乙?；木厶恰o論是否出于質(zhì)量控制的目的而監(jiān)測(cè)一種具體的耙蛋白的生產(chǎn)，可以利用本披露來例如監(jiān)測(cè)處于發(fā)展的具體階段的，或在具體的生長(zhǎng)條件下的糖基化作用。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法可以用來表征和/或控制或比較多種治療性產(chǎn)品的質(zhì)量。僅給出一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的方法學(xué)可以用于評(píng)估在產(chǎn)生一種治療性蛋白產(chǎn)品的細(xì)胞中的糖基化作用。具體而言，假定糖基化作用可經(jīng)常影響一種治療性蛋白產(chǎn)品的活性、生物利用度、或其他特征，則用于評(píng)估在這種治療性蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中的細(xì)胞的糖基化作用的方法是特別希望的。除其他事項(xiàng)之外，本披露可以促進(jìn)在用于治療性蛋白的生產(chǎn)體系中的糖基化作用的實(shí)時(shí)分析。代表性的治療性糖蛋白(其生產(chǎn)和/或質(zhì)量可以根據(jù)本披露進(jìn)行監(jiān)測(cè))包括，例如，多種血液學(xué)試劑中的任何一種(包括例如，促紅細(xì)胞生成素、血液凝固因子，等等)、干擾素、集落刺激因子、抗體、酶、以及激素。代表性的可商購(gòu)的糖蛋白產(chǎn)品包括，例如表3中所呈現(xiàn)的那些糖蛋白產(chǎn)品-表3:示例性的可商購(gòu)的糖蛋白產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>蛋白質(zhì)產(chǎn)物參考藥物粘多糖-a-L-艾杜糖醛酸水解酶(laronidase)Aldurazyme干擾素a-N3，來源于人白細(xì)胞Alferon人抗血友病因子Alphanate已濾過病毒的人凝結(jié)因子IXAlphaNineSD阿法賽特；重組的，二聚體的融合蛋白LFA3-Ig比伐盧定Angiomax達(dá)貝泊汀a4I'MAranesp貝伐珠單抗Avastm干擾素(3-la;重組體Avonex凝結(jié)因子IXBeneFix'M干擾素I3-IbBetaseron托西莫單抗Bexxar抗血友病因子Bioclate'"人生長(zhǎng)激素BioTropin'"A型肉毒桿菌毒素Botox⑧阿侖珠單抗Campath阿西莫單抗(acritumomab);經(jīng)锝-99標(biāo)記CEA-Scan*阿糖腦苷酶；(3-葡糖腦苷脂酶的修飾形式Ceredase伊米苷酶；P-葡糖腦苷脂酶的重組形式Cerezyme響尾蛇科多價(jià)的免疫Fab(綿羊)CroFab'"地高辛免疫Fab(綿羊)DigiFab'M拉布立酶Elitek吸依那西普Enbrel吸阿法依泊汀(epoietinalfa)「如Epogen西妥昔單抗Erbitux'Mp-半乳糖苷酶(algasidasebeta)Fabrazymc尿促卵泡素Fertinex'M促卵泡素PFollistim'M特立帕肽Forteo吸人生長(zhǎng)激素GenoTropin高血糖素GlucaGen促卵泡素aGonal-F抗血友病因子Helixat,抗血友病因子；因子xmHemofi吸52<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在一些實(shí)施方案中，本披露提供了多種方法，在這些方法中將來自不同來源或樣品的聚糖彼此進(jìn)行比較。在一些此類的實(shí)例中，隨著時(shí)間獲得了來自相同來源的多個(gè)樣品，這樣糖基化作用模式中的變化(并且特別是細(xì)胞表面的糖基化作用模式)就得到監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，樣品之一是一種歷史樣品或歷史樣品的一個(gè)記錄。在一些實(shí)施方案中，樣品之一是一個(gè)參比樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)來自不同的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品的聚糖進(jìn)行比較，這些聚糖在以下條件下進(jìn)行制備，這些條件在一個(gè)或多個(gè)所選擇的參數(shù)方面有所不同(例如，細(xì)胞類型，培養(yǎng)類型[例如，連續(xù)進(jìn)料對(duì)比分批進(jìn)料，等等]、培養(yǎng)條件[例如，培養(yǎng)基的類型、一種或多種具體的培養(yǎng)基中具體成分的存在，或濃度、滲透性、pH、溫度、一種或多種因素(如滲透性、pH、溫度，等等)變換的時(shí)間或程度]、培養(yǎng)時(shí)間，分離步驟，等等)，但在其他方面相同，從而確定所選擇的參數(shù)對(duì)N-糖基化作用模式的影響。在一些實(shí)施方案中，對(duì)來自不同的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品(該樣品在一定的條件下得到制備，這些條件在一個(gè)單一選擇的參數(shù)方面有所不同)的聚糖進(jìn)行比較，從而確定該單一選擇的參數(shù)對(duì)糖基化作用模式的影響。因此，在其他應(yīng)用中，使用在此所說明的技術(shù)可促進(jìn)了確定具體的參數(shù)對(duì)細(xì)胞中的糖基化作用模式的影響。在一些實(shí)施方案中，對(duì)來自不同批次的一種所感興趣的糖蛋白的聚糖(例如，一種治療性糖蛋白)(無論是通過相同的方法還是通過不同的方法進(jìn)行制備，以及無論是同時(shí)制備還是分開制備)進(jìn)行了比較。在此類實(shí)施方案中，本披露促進(jìn)了糖蛋白制品的質(zhì)量控制?？商娲鼗蝾~外地，一些此類的實(shí)施方案促進(jìn)了監(jiān)測(cè)一種具體的培養(yǎng)55物(生產(chǎn)一種所感興趣的糖蛋白)的進(jìn)程(例如，當(dāng)樣品在不同的時(shí)間點(diǎn)從培養(yǎng)物中移出，并且進(jìn)行分析并且彼此進(jìn)行比較時(shí))。在一些實(shí)例中，隨著時(shí)間獲得了來自相同來源的多個(gè)樣品，這樣糖基化作用模式中的變化就得到了監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品按照以下間隔被移出約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約30分鐘、約1小時(shí)、約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)、約5小時(shí)、約10小時(shí)、約12小時(shí)、或約18小時(shí)的間隔、或以甚至更長(zhǎng)的間隔被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品以不規(guī)則的間隔被移出。在一些實(shí)施方案中，含聚糖的樣品以5小時(shí)的間隔被移出。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的方法可以用于監(jiān)測(cè)糖蛋白在其通過細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的過程中的糖基化作用模式。例如，糖蛋白的生產(chǎn)(例如，商業(yè)性生產(chǎn))可以涉及以下步驟(1)培養(yǎng)產(chǎn)生糖蛋白的細(xì)胞，(2)在培養(yǎng)過程中以規(guī)格或不規(guī)則的間隔獲得樣品，并且(3)分析在所獲得的一種或多種樣品中所產(chǎn)生的一種或多種糖蛋白的糖基化作用模式。在一些實(shí)施方案中，此類方法可以包括將在所獲得的樣品中產(chǎn)生的一種或多種糖蛋白的糖基化作用模式彼此進(jìn)行比較的一個(gè)步驟。在一些實(shí)施方案中，此類方法可以包括將在所獲得的一個(gè)或多個(gè)樣品中產(chǎn)生的一種或多種糖蛋白的糖基化作用模式與一個(gè)參比樣品的糖基化作用模式進(jìn)行比較的一個(gè)步驟。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，聚糖分析的特征可以(例如在一個(gè)質(zhì)量控制記錄中)得到記錄。如以上所指明，在一些實(shí)施方案中，與糖蛋白的一個(gè)先前的歷史記錄，或標(biāo)準(zhǔn)批次和/或與一個(gè)參比樣品進(jìn)行了比較。在一些實(shí)施方案中，將來自不同批次的一種所感興趣的糖蛋白的聚糖(例如，一種治療性糖蛋白)(無論是通過相同的方法還是不同的方法進(jìn)行制備，以及無論是通過同時(shí)制備還是分別制備)彼此之間和/或與一個(gè)參比樣品進(jìn)行了比較。在一些實(shí)施方案中，批次對(duì)批次的比較可包括以下步驟(i)提供來自一個(gè)第一批次的糖蛋白的一個(gè)第一聚糖制品；(ii)提供來自一個(gè)第二批次的糖蛋白的一個(gè)第二聚糖制品；(iii)將該第一以及第二聚糖制品各自經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶操作(例如，順序和/或同時(shí)地用1、2、3、4、5、6、7、或更多種外切糖56苷酶進(jìn)行處理)，以便特異性地從在該聚糖制品中的N-連接的聚糖的非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割；并且(iv)將獲自該第一聚糖制品的切割產(chǎn)物與獲自該第二制品的切割產(chǎn)物進(jìn)行比較，這樣這兩個(gè)批次的一致性就得到評(píng)定。在一些實(shí)施方案中，可以通過從來自一個(gè)批次的至少一種糖蛋白中移出至少一種N-聚糖而提供聚糖制品，并且可任選地，分離所移出的N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，聚糖制品可以如在此所說明進(jìn)行標(biāo)記(例如，熒光地和/或放射性地；例如，在分離之前和/或之后)。在一些實(shí)施方案中，本披露促進(jìn)了糖蛋白制品的質(zhì)量控制。聚糖分析的特征可以(例如在一個(gè)質(zhì)量控制記錄中)得到記錄。如以上所指明，在一些實(shí)施方案中，與糖蛋白的一個(gè)先前的歷史記錄或標(biāo)準(zhǔn)批次進(jìn)行了比較。在一些實(shí)施方案中，與一種參比糖蛋白樣品進(jìn)行了比較。在一些實(shí)施方案中，可在多項(xiàng)研究中利用本披露來修飾一種細(xì)胞的糖基化作用特征，(例如)以便確立具有一個(gè)或多個(gè)所希望的糖基化作用特征的一種細(xì)胞系和/或培養(yǎng)條件。然后，可以利用這種細(xì)胞系和/或培養(yǎng)條件(如果希望的話)用于生產(chǎn)一種具體的靶結(jié)合糖(例如，糖蛋白)，預(yù)期這種或此類糖基化作用特征對(duì)其是有益的。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的技術(shù)可被施用至在細(xì)胞的表面存在的聚糖。在一些實(shí)施方案中，所分析的聚糖基本上沒有非細(xì)胞表面聚糖。在一些實(shí)施方案中，所分析的聚糖，當(dāng)存在于細(xì)胞表面上時(shí)，存在于一種或多種細(xì)胞表面的結(jié)合糖(例如，糖蛋白或糖脂類)的環(huán)境中。在一些實(shí)施方案中，一種膜結(jié)合的或跨膜的細(xì)胞表面糖蛋白的糖基化作用模式可以通過以下方法得到確定(1)通過使用一種或多種蛋白酶進(jìn)行處理來釋放該糖蛋白；(2)通過用聚糖酶消化所釋放的糖蛋白來分離一個(gè)聚糖群體；(3)根據(jù)在此說明的方法中的任何一種通過外切糖苷酶消化來消化該聚糖群體；并且(4)使用對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言可供使用的任何一種方法來分析消化產(chǎn)物。在一些具體的實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞表面聚糖進(jìn)行了分析以便評(píng)定一種或多種所感興趣的靶糖蛋白的糖基化作用，特別是其中此類耙糖蛋白不是細(xì)胞表面糖蛋白。在一些實(shí)施方案中，可以監(jiān)測(cè)一種耙糖蛋白的糖基化作用而不將該糖蛋白自身分離。在一些實(shí)施方案中，本披露提供了使用細(xì)胞表面聚糖作為在一個(gè)所感興趣的已表達(dá)的糖蛋白上的一種讀出信息(readout)或代表物(proxy)的方法。在一些實(shí)施方案中，此類方法包括但不限于，后處理、批次、篩選或產(chǎn)品質(zhì)量的"在線"測(cè)量。此類方法可以使用生產(chǎn)反應(yīng)(例如，細(xì)胞)的一個(gè)副產(chǎn)物，提供一種所感興趣的已生產(chǎn)的糖蛋白的一種獨(dú)立的糖基化作用模式的測(cè)量，而不需要任何已生產(chǎn)的糖蛋白的破壞的使用。此外，根據(jù)本披露的方法可以避免產(chǎn)物的分離以及可能在分離過程中發(fā)生的潛在的產(chǎn)物的糖形的選擇所需要的努力。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的技術(shù)可被施用至從細(xì)胞中分泌的聚糖中。在一些此類的實(shí)施方案中，所分析的聚糖是由細(xì)胞在一種結(jié)合糖(例如，一種糖蛋白或糖脂)的環(huán)境下產(chǎn)生的。根據(jù)本披露，在此所說明的技術(shù)可以用于檢測(cè)所希望的或不希望的聚糖，例如用于檢測(cè)在一個(gè)產(chǎn)品中一種或多種污染物的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行定量，或用于檢測(cè)一種或多種活性或所希望的種類的存在或?qū)ζ溥M(jìn)行定量。在不同的實(shí)施方案中，這些方法可以用于檢測(cè)生物標(biāo)記物，這些生物標(biāo)記物在癥狀出現(xiàn)之前和/或疾病狀態(tài)發(fā)展到一種不可處理或處理可能性較小的狀態(tài)之前通過檢測(cè)一種或多種特異性的聚糖來指明例如一種疾病狀態(tài)，這種或這些特異性的聚糖的存在或水平(不論是絕對(duì)或相對(duì)的)可以與一種具體的疾病狀態(tài)(包括對(duì)于一種疾病的易感性)和/或隨著時(shí)間在此類聚糖的濃度方面的變化相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法促進(jìn)了聚糖的檢測(cè)，這些聚糖在一個(gè)來源(例如，一種生物樣品，聚糖制品，等等)中以非常低的水平存在。在此類實(shí)施方案中，有可能檢測(cè)聚糖的水平和/或可任選地對(duì)其進(jìn)行定量，這些聚糖在多種聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在小于約10%、5%、4%、3°/o、2%、1.5°/。、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%、或0,01%。在一些實(shí)施方案中，有可能檢測(cè)聚糖的水平和/或可任選地對(duì)其進(jìn)行定量，這些聚糖包括在0.1%與5%之間，例如，在0.1%與2%之間，例如，在0.1%與1%之間的一種聚糖制品。在一些實(shí)施方案中，有可能檢測(cè)細(xì)胞表面聚糖的水平和/或可任選地對(duì)其進(jìn)行定量，這種細(xì)胞表面聚糖在約0.1fmol與約1mmol之間。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許用于檢測(cè)在多種聚糖的一個(gè)群體中以低水平存在的具體的連接。例如，本方法允許檢測(cè)在多種聚糖的一個(gè)群體中按照以下水平存在的具體的連接小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1%、小于0.75%、小于0.5°/0、小于0.25%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的方法允許檢測(cè)在多種聚糖的一個(gè)群體中幾種單個(gè)的聚糖的相對(duì)水平。例如，可以對(duì)液相色譜法中每個(gè)峰之下的面積進(jìn)行測(cè)量并且將其表達(dá)為總數(shù)的一個(gè)百分?jǐn)?shù)。這種分析提供了在多種聚糖的一個(gè)群體中每個(gè)聚糖種類的一個(gè)相對(duì)百分比的量。在一些實(shí)施方案中，在此所說明的技術(shù)可以與一種或多種技術(shù)相結(jié)合，用于聚糖或結(jié)合糖的檢測(cè)、分析、以及分離。例如，在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露使用一種或多種可供使用的方法對(duì)聚糖進(jìn)行分析(僅給出一些實(shí)例，參見Anumula,Anal.Biochem.350(1):1,2006;Kleinetal.,Anal.Biochem.,179:162,1989;禾口/或Townsend,R.R.CarbohydrateAnalysis"HighPermofrmanceLiquidChromatographyandCapillaryElectrophoresis"Ed.Z.ElRassi,pp181-209,1995，這些文獻(xiàn)中的每一個(gè)其全文均通過引用結(jié)合在此)。例如，在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種色譜方法、電泳法、核磁共振法，以及它們的組合對(duì)聚糖進(jìn)行表征。示例性的此類方法包括例如，NMR、質(zhì)譜法、液相色譜法、2-維色譜法、SDS-PAGE、抗體染色、凝集素染色、單糖定量、毛細(xì)管電泳法、熒光團(tuán)輔助糖電泳(FACE)、膠束動(dòng)電色譜法(MEKC)、外切糖苷酶或內(nèi)切糖苷酶處理，以及它們的組合。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到其他方法，這些方法可以與在此所說明的IMAC方法一起使用來對(duì)聚糖進(jìn)行表征。在一些實(shí)施方案中，聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過色譜方法進(jìn)行分析，包括但不限于，液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)，超高效液相色譜法(UPLC)，薄層色譜法(TLC)，酰胺柱59色譜法，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過質(zhì)譜法(MS)以及相關(guān)的方法進(jìn)行分析，包括但不限于，串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS),傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)，離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)，電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過電泳法進(jìn)行分析，包括但不限于毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有蛋白質(zhì)印跡法(使用識(shí)別特定的多糖結(jié)構(gòu)的抗體)，以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，聚糖的結(jié)構(gòu)和組成可以通過核磁共振(NMR)以及相關(guān)方法進(jìn)行分析，包括但不限于，一維NMR(1D-NMR)，二維NMR(2D-NMR)，相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)，全相關(guān)光譜NMR(TOCSY-NMR)，異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)，異核多級(jí)量子相干(HMQC-NMR)，旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR)，核歐沃豪斯效應(yīng)譜(NOESY-NMR)、以及它們的組合。本披露參照以下的實(shí)例應(yīng)當(dāng)?shù)玫礁_切地闡述。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是本披露不以任何方式通過這些實(shí)例而受到限制。實(shí)例實(shí)例l:使用外切糖苷酶逐步消化N-聚糖材料和方法樣品制備通過N-聚糖酶F將N-聚糖從一種純化的示例性糖蛋白中釋放出來，跟隨有一個(gè)清除步驟以便移出鹽類、洗滌劑、蛋白質(zhì)、以及非聚糖材料。首先將蛋白熱變性，并接著使用過量的N-聚糖酶F在SDS的存在下于37。C進(jìn)行過夜處理。用一種石墨化的碳柱(例如，EnviCarb)將所釋放的聚糖從這些鹽和酶中分離出來。對(duì)N-聚糖在還原性末端(N-聚糖-2AB)進(jìn)行熒光標(biāo)記，并且過量的標(biāo)記物通過加入一個(gè)額外的清除步驟而被移出。首先將2-AB溶解在處于DMSO溶液中的30%乙酸中，并且將氰基氫硼酸鈉加至最終濃度為1.2M。將約5至10pi的這種進(jìn)行標(biāo)記的溶液加到經(jīng)干燥的聚糖中并且加熱至65°C持續(xù)3小時(shí)，以便使標(biāo)記完成。然后通過將該樣品施用到一個(gè)GlycocleanS藥筒中，用96%乙腈洗滌，并用水洗脫而將經(jīng)標(biāo)記的聚糖從游離的標(biāo)記物和鹽類中分離出來。外切糖苷酶反應(yīng)將聚糖混合物(0.25nmol/nl至0.5nmol/pl)經(jīng)受分步處理，該處理采用至少兩種選自下組的外切糖苷酶(每20pl至40pl反應(yīng)體積有l(wèi)^il至2^il序列等級(jí)的糖苷酶)，該組的構(gòu)成為唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶。典型地，這些反應(yīng)在pH約為5.5時(shí)進(jìn)行。在分步分析的每個(gè)步驟之后，在加入下一種酶之前將酶滅活。消化產(chǎn)物的分析通過使用液相色譜法(LC)(該液相色譜法與質(zhì)譜法(MS)相結(jié)合)在一個(gè)酰胺柱中確定了消化產(chǎn)物。聚糖的峰的結(jié)構(gòu)鑒定通過基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)來完成。將聚糖保留時(shí)間與已知的標(biāo)準(zhǔn)物的以及與一種葡萄糖梯(glucoseladder)的保留時(shí)間進(jìn)行比較。結(jié)果在用外切糖苷酶進(jìn)行徹底的分步處理之后，大多數(shù)的N-聚糖被消化成一個(gè)保守的M3N2核心，其中一些小峰稍后在色譜圖上洗脫(圖2B)。質(zhì)譜法(MS)確認(rèn)了對(duì)應(yīng)著乳糖胺的小峰(圖2B)。圖2A示出了消化之前N-聚糖的色譜圖。實(shí)例2:使用多種外切糖苷酶同時(shí)消化N-聚糖材料和方法樣品制備以及消化產(chǎn)物的分析制備N-聚糖并且如在實(shí)例1中所說明對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行分析。外切糖苷酶反應(yīng)61將聚糖混合物(0.25nmol/pl至0.5nmol/|al)經(jīng)受同時(shí)的處理，這種處理采用至少兩種選自下組的外切糖苷酶(每20pl至40pi反應(yīng)體積有1p至2^il序列等級(jí)的糖苷酶)，該組的構(gòu)成為唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶。典型地，這些反應(yīng)在pH為約5.5時(shí)進(jìn)行。結(jié)果當(dāng)用兩種或多種外切糖苷酶對(duì)N-聚糖進(jìn)行同時(shí)處理時(shí)，大多數(shù)的N-聚糖的結(jié)構(gòu)塌陷成一種保守的核心(M3N2)。由于同時(shí)存在半乳糖苷酶以及己糖胺酶的活性，乳糖胺擴(kuò)展被消除。如圖3中所示，存在一些種類，這些種類具有30至70分鐘的LC保留時(shí)間，它們對(duì)所使用的外切糖苷酶中的所有都具有抵抗力。這些種類對(duì)常規(guī)的外切糖苷酶處理而言是難治的這一事實(shí)表明它們包括不常見的修飾作用，這種作用可以通過MS分析得到鑒定并且可以通過測(cè)量峰面積(作為總數(shù)的一個(gè)百分?jǐn)?shù))而進(jìn)行定量。實(shí)例3:使用同時(shí)以及順序的外切糖苷酶消化確定乳糖胺在一種N-聚糖中的存在順序?qū)Ρ韧瑫r(shí)的外切糖苷酶消化的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可以用來獲得有關(guān)在一種聚糖制品中的N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。例如，乳糖胺基團(tuán)的存在可以通過將由順序與同時(shí)的消化所產(chǎn)生的消化產(chǎn)物進(jìn)行比較而得到確定，如在表4中對(duì)于假設(shè)的N-聚糖結(jié)構(gòu)所畫的輪廓在表4中所示的所有外切糖苷酶均具有廣泛的底物特異性，即，它們將會(huì)從一個(gè)非還原性末端切割掉末端的糖，而不管連接的類型。順序(Q)與同時(shí)(S)處理Rx04或Rx05的比較允許在一種待確認(rèn)的聚糖制品中聚乳糖胺基團(tuán)的存在。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>如表4中所示，Rx04(S)以及Rx04(Q)各自均代表了用相同組的酶(廣泛特異性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶)對(duì)同一種N-聚糖進(jìn)行的消化。然而，同時(shí)(S)以及順序(Q)消化產(chǎn)生了獨(dú)特的消化產(chǎn)物。同樣地，Rx05(S)以及Rx05(Q)各自均代表了用相同組的酶(廣泛特異性的唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、以及巖藻糖苷酶)對(duì)同一種N-聚糖進(jìn)行的消化。然而，同時(shí)(S)以及順序(Q)的消化產(chǎn)生了獨(dú)特的消化產(chǎn)物。這個(gè)實(shí)例證實(shí)了一種方式，其中將通過同時(shí)以及順序的消化所產(chǎn)生的消化產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比可以提供有關(guān)聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。以上實(shí)例在圖7中得到進(jìn)一步闡述，該圖示出了如何通過順序?qū)Ρ韧瑫r(shí)的消化將聚乳糖胺結(jié)構(gòu)闡明。在圖7中，該樣品包括一個(gè)聚糖群體。在該聚糖群體用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶進(jìn)行同時(shí)消化之后，多數(shù)的聚糖被切割成Man3Gn2核心結(jié)構(gòu)，如通過液相色譜法(LC;圖7A)以及質(zhì)譜法(MS;圖7B)所指明。具有較長(zhǎng)保留時(shí)間的一些選擇性的峰對(duì)應(yīng)著高甘露糖類型結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及己糖胺酶進(jìn)行順序消化時(shí)，除了與高甘露糖類型結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的峰之外，額外的峰仍然存在。這些額外的峰對(duì)應(yīng)于一些聚糖(具有附連至Man3Gn2核心上的一個(gè)乳糖)，如MS數(shù)據(jù)所指明得到保存。這些峰的存在(以順序以及并非同時(shí))對(duì)應(yīng)著起始的樣品中的聚乳糖胺類型結(jié)構(gòu)。實(shí)例4:使用同時(shí)以及順序的外切糖苷酶消化鑒定在一種N-聚糖中的唾液酸連接順序?qū)Ρ韧瑫r(shí)的外切糖苷酶消化的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可以用來獲得有關(guān)一種聚糖制品中的N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。例如，唾液酸連接的存在和/或類型可以通過將由順序以及同時(shí)的消化所產(chǎn)生的消化產(chǎn)物進(jìn)行比較而得到確定，如在表5中對(duì)于假設(shè)的N-聚糖結(jié)構(gòu)所畫的輪廓表5呈現(xiàn)了一組唾液酸酶，每個(gè)具有一種不同的底物連接特異性。所呈現(xiàn)的實(shí)例證實(shí)了末端a-2，3唾液酸連接是如何可以與a-2,6-連接相區(qū)別的。表5.在N-聚糖中唾液酸連接的確定酶RxllRxl2SRxl2QRxl3SRxl3QRxl4S或QRxl5SRxl5QRxl6S或Qa-2/3，6,8,9-唾液酸酶——XX———X———a-2/3-唾液酸酶———XX—-———XP-l/3,4，6-半乳糖苷酶—XXXXXXXXp-1,4-己糖胺酶—XXXX—-XX—-消化產(chǎn)物Xw還鑒"'1t""1-婁如表5中所示，Rxl2(S)以及Rxl2(Q)各自均代表了用相同組的酶(a-2/3,6,8,9-唾液酸酶、P-l/3,4,6-半乳糖苷酶、以及卩-l，4-己糖胺酶)對(duì)相同的N-聚糖進(jìn)行的消化。然而，同時(shí)(S)以及順序(Q)的消化產(chǎn)生了獨(dú)特的消化產(chǎn)物。如所闡述，順序與同時(shí)的消化之間的比較闡明了聚乳糖胺結(jié)構(gòu)，并且2,6-連接的唾液酸存在于聚乳糖胺擴(kuò)展上，而2，3-連接的唾液酸在具有僅一個(gè)乳糖胺的臂上。這個(gè)實(shí)例證實(shí)了一種方式，其中將通過由同時(shí)以及順序的消化所產(chǎn)生的消化產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比可以提供有關(guān)聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。此外，如表5中所展示，處理Rxl5(Q)將在一個(gè)聚糖群體中的所有非唾液酸化的觸角切割成了三甘露糖基聚糖的核心。這些切割產(chǎn)物包括單、二、三以及四觸角種類，它可以是具有色譜特性的。這種特性提供了起始的聚糖混合物的觸角組合物的一個(gè)可讀物。具體而言，這種特性提供了唾液酸化分支的觸角組合物的一個(gè)可讀物。對(duì)于多個(gè)樣品而言，在進(jìn)行這種糖苷酶處理之后，每個(gè)單個(gè)的聚糖將65具有盡可能多的被唾液酸化的分支，并且這些可以通過色譜法進(jìn)行分離。這在圖4中進(jìn)行進(jìn)一步展示，它代表了一個(gè)示例性N-聚糖群體，該N-聚糖群體經(jīng)受了Rx05(Q)的消化條件的處理，如在表5中所示。對(duì)于在圖4中所示的N-聚糖群體而言，這個(gè)實(shí)例示出了順序的處理怎樣可以產(chǎn)生多種消化產(chǎn)物的一個(gè)群體?？蓪?duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行分析，并且確定它們的結(jié)構(gòu)和/或組成。實(shí)例5:使用同時(shí)以及順序的外切糖苷酶消化來鑒定在一種N-聚糖中的巖藻糖基連接同時(shí)的外切糖苷酶消化的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃可以用來獲得有關(guān)在一種聚糖制品中的N-聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。例如，用外切糖苷酶的不同組合進(jìn)行消化可以用于區(qū)分臂(觸角)的a-l/3，4巖藻糖基化作用與一種先前的去唾液酸化的N-聚糖的核心oc-l，6巖藻糖基化作用。在表6中所示的每種處理的影響在以下示例性的聚糖結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行闡述表6.巖藻糖基連接的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如在表6中所示，用不同組合的酶進(jìn)行外切糖苷酶消化產(chǎn)生了獨(dú)特的消化產(chǎn)物。在這里所呈現(xiàn)的實(shí)例中，僅基于質(zhì)量進(jìn)行的分析表明了兩個(gè)巖藻糖殘基的存在。然而，通過使用以上的方法，可以確定兩個(gè)巖藻糖殘基的位置(即，一個(gè)巖藻糖位于核心并且另一個(gè)巖藻糖位于支鏈，對(duì)比這兩個(gè)巖藻糖殘基出現(xiàn)在支鏈上)。這個(gè)實(shí)例證實(shí)了一種方式，其中將通過由同時(shí)的消化所產(chǎn)生的消化產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比可以提供有關(guān)聚糖的結(jié)構(gòu)和/或組成的信息。實(shí)例6:含聚乳糖胺的聚糖的快速鑒定使用肽將N-連接的聚糖從一種模型糖蛋白中釋放出來N-糖苷酶F(PNGase-F)產(chǎn)生了一個(gè)聚糖樣品。PNGase-F是一種酰胺酶，它可以在最里面的GlcNAc與來自N-連接的糖蛋白的高甘露糖、雜合以及復(fù)合的寡糖的天冬酰胺殘基之間進(jìn)行切割(Maleyetal.，1989,Anal.Biochem.，180:195;通過引用結(jié)合在此)。PNGaseF可以水解來自糖肽和/或糖蛋白的幾乎所有類型的N-聚糖鏈。使用活化的石墨化的碳固相萃取柱柱體將產(chǎn)生的聚糖樣品純化。然后，用2-苯甲酰胺對(duì)該聚糖混合物進(jìn)行熒光標(biāo)記。將該聚糖樣品分成兩個(gè)相等的部分，并且每個(gè)部分與一組外切糖苷酶(即，唾液酸酶、半乳糖苷酶、以及N-乙酰己糖胺酶)以同時(shí)或順序的方式分別進(jìn)行反應(yīng)。隨后通過正相熒光HPLC使用一種酰胺柱或MALDI-MS對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。分析的結(jié)果呈現(xiàn)在圖8(色譜圖)以及圖9(MALDI-MS)中。等效物和范圍本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到、或通過使用不超出使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確定與在此說明的本披露的特定的實(shí)施方案一致的很多等效物。本披露的范圍并非旨在限制于以上的說明，而是如所附的權(quán)利要求書中所給出。67本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到、或通過使用不超出使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)即能夠確定與在此說明的具體實(shí)施方案一致的很多等效物。本披露的范圍并非旨在限制以上說明，而是如所附的權(quán)利要求書中所給出。在權(quán)利要書中，冠詞例如"一個(gè)(種)"以及"該"可以表示一個(gè)或多于一個(gè)，除非指明與此相反或另外從上下文中是明確的。因此，例如，提及"一種納米顆粒"包括多個(gè)此類納米微粒，并且提及"該細(xì)胞"包括提及一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的細(xì)胞，等等。包括一組的一個(gè)或多個(gè)成員"或"在其之間的權(quán)利要求書或說明書被認(rèn)為是滿足以下條件該組成員中的一個(gè)、多于一個(gè)或所有是否存在于，被用于、或者另外涉及了一個(gè)給定的產(chǎn)物或方法，除非指明與此相反或另外從上下文中是明確的。本披露包括多個(gè)實(shí)施方案，其中該組的一個(gè)成員準(zhǔn)確地存在于，被用于、或者另外涉及了一種給定的產(chǎn)物或方法。本披露包括多個(gè)實(shí)施方案，其中該組成員的多于一個(gè)或所有成員準(zhǔn)確地存在于，被用于、或者另外涉及了一種給定的產(chǎn)物或方法。此外，應(yīng)該理解的是本披露涵蓋了多種變體、組合以及排列，其中一個(gè)或多個(gè)限制、要素、條款、描述性術(shù)語(yǔ)、等等，從一個(gè)或多個(gè)所列出的權(quán)利要求中引入到另一個(gè)權(quán)利要求。例如，可以對(duì)從屬于另一個(gè)權(quán)利要求的任何一項(xiàng)權(quán)利要求進(jìn)行修改以便包括在從屬于同一基礎(chǔ)權(quán)利要求的任何一項(xiàng)其他的權(quán)利要求中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)限制。此外，在權(quán)利要求提及一種組合時(shí)，應(yīng)理解的是包括針對(duì)在此所披露的目中任何一種目的的組合的方法，并且包括根據(jù)形成在此所披露的多種方法中的任何一種而形成組合的方法或在本領(lǐng)域已知的其他方法，除非另有說明或者除非對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言明顯會(huì)產(chǎn)生一種矛盾或不一致性。當(dāng)多種要素作為列表(例如以Markush組的格式)來呈現(xiàn)時(shí)，應(yīng)理解的是這些要素中的每個(gè)亞組也已被披露并且任何一個(gè)或多個(gè)要素可以從該組中被移出。應(yīng)當(dāng)理解的是，總體而言，當(dāng)提及本披露或根據(jù)本披露的多個(gè)方面包括具體的要素、特征、等等時(shí)，根據(jù)本披露的一些實(shí)施方案或根據(jù)本披露的多個(gè)方面包括，或基本上包括此類要素、特征，等等。出于簡(jiǎn)單的目的，那些實(shí)施方案沒有在此處的這些詞語(yǔ)中確切地給出。注意到了術(shù)語(yǔ)"包括"旨在是開放性的并且允許附加的要素或步驟的包含物。當(dāng)給出這些范圍時(shí)，包括端點(diǎn)。此外，應(yīng)該理解的是，除非另有指明或另外從上下文中以及本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的理解中是明確的，表達(dá)成范圍的這些值可以采取在根據(jù)本披露的不同實(shí)施方案中所指出的范圍內(nèi)的任何一種特定的值或亞范圍，到該范圍的下限單位的十分之一(除非上下文呢另有清楚地指出)。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，落入現(xiàn)有技術(shù)的本披露的任何一個(gè)具體實(shí)施方案可以明確地從這些權(quán)利要求中的任何一項(xiàng)或多項(xiàng)中排除。因?yàn)榇祟悓?shí)施方案被認(rèn)為是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的，即使沒有在此明確地提出這種排除，它們也可以被排除。根據(jù)本披露的這些組合中的任何一個(gè)具體的實(shí)施方案(例如，任何外切糖苷酶、任何糖苷連接、任何反應(yīng)條件、任何提純的方法、產(chǎn)物分析的任何方法、等等)可以從任何一項(xiàng)或更多項(xiàng)權(quán)利要求以任何原因而被排除，不論是否涉及現(xiàn)有技術(shù)的存在。提供以上以及貫穿本文所討論的的公開文件僅僅是因?yàn)樗鼈兊呐妒窃缫驯旧暾?qǐng)的提交日。在此的任何內(nèi)容都不能被解釋為承認(rèn)諸位發(fā)明人沒有資格由于在先披露而在這種披露之前。權(quán)利要求1.一種方法，包括以下步驟提供一種聚糖制品；將該聚糖制品的一個(gè)第一樣品經(jīng)受一個(gè)第一外切糖苷酶操作；使該聚糖制品的一個(gè)第二樣品經(jīng)受一個(gè)第二外切糖苷酶操作，其中該第二外切糖苷酶操作不同于該第一外切糖苷酶操作并且進(jìn)一步地其中該第一以及第二外切糖苷酶操作選自下組，其構(gòu)成為沒有進(jìn)行處理；順序地進(jìn)行處理；以及同時(shí)地進(jìn)行處理；對(duì)該第一以及第二外切糖苷酶操作的切割產(chǎn)物進(jìn)行表征；以及將該第一外切糖苷酶操作的這些切割產(chǎn)物的表征結(jié)果與該第二外切糖苷酶操作的切割產(chǎn)物的表征結(jié)果進(jìn)行比較，從而確定該聚糖制品的至少一個(gè)糖基化作用的特征。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該比較步驟包括將該第一或第二外切糖苷酶操作的切割產(chǎn)物的表征結(jié)果與一個(gè)參比樣品的切割產(chǎn)物進(jìn)行比較。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用一種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用至少兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶不是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用三種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用四種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用五種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用六種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括用至少七種選自下組的外切糖苷酶來處理該聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶順序地處理該聚糖制品。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶同時(shí)地處理該聚糖制品。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一或第二外切糖苷酶操作包括未用外切糖苷酶處理該聚糖制品。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種切割產(chǎn)物包括含有三個(gè)甘露糖以及2個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基的一個(gè)戊糖核心。17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種觸角的巖藻糖基化物。18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種乳糖胺擴(kuò)展物。19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種硫酸化的聚糖，一種磷酸化的聚糖，連接到N-乙酰葡糖胺上的一種唾液酸，或一種乙?；木厶?。20.如權(quán)利要求l所述的方法，其中提供一種聚糖制品的步驟包括a)提供了多種糖蛋白，每種糖蛋白包括至少一個(gè)N-聚糖，該N-聚糖被連接至這些糖蛋白之一上；b)從至少一種糖蛋白中移出至少一個(gè)N-聚糖；c)可任選地，將所移出的N-聚糖分離出來。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該移出步驟包括將一種糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受一個(gè)聚糖酶的處理。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該聚糖酶包括N-聚糖酶F。23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該移出步驟包括將一種糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受化學(xué)切割處理。24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該移出步驟包括將一種糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受肼處理。25.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。26.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之后使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的步驟。27.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中該熒光標(biāo)記物包括2-氨基苯甲酰胺，2-氨基嘌呤，或苯胺。28.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前使用一種放射性標(biāo)記物以及一種同位素標(biāo)記的試劑中的一種或兩種將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。29.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之后使用一種放射性標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的步驟。30.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受一個(gè)選自下組的操作，該組的構(gòu)成為色譜法、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法(UPLC)、薄層色譜法(TLC)、酰胺柱色譜法、質(zhì)譜法(MS)、串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)、傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)、電泳法、毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有蛋白質(zhì)印跡法(使用識(shí)別特定的聚糖結(jié)構(gòu)的抗體)、核磁共振(NMR):—維NMR(1D-NMR)、二維NMR(2D-NMR)、相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相關(guān)光譜NMR(TOCSY-NMR)、異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)、異核多級(jí)量子相干(HMQC-NMR)、旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR)、核歐沃豪斯效應(yīng)譜(NOESY-NMR)、以及它們的組合。31.如權(quán)利要求1所述的方法，受質(zhì)譜法(MS)處理。32.如權(quán)利要求1所述的方法，受串聯(lián)MS處理。33.如權(quán)利要求1所述的方法，受MALDI-MS處理。34.如權(quán)利要求1所述的方法，受核磁共振(NMR)處理。35.如權(quán)利要求1所述的方法，受色譜法處理。其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)36.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受毛細(xì)管電泳法(CE)處理。37.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受CE-MS處理。38.如權(quán)利要求l所述的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估在該N-聚糖制品中的不常見的修飾作用的存在。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該不常見的修飾作用選自下組，其構(gòu)成為磷酸化、硫酸化、乙酰化、乳糖胺擴(kuò)展、以及觸角的巖藻糖基化作用。40.—種表征多種連接蛋白的N-聚糖的方法，包括a)提供了多種糖蛋白，每種糖蛋白包括至少一種N-聚糖，該N-聚糖被連接至這些糖蛋白之一上；其中這些糖蛋白中的至少一個(gè)成員的糖基化作用模式是不同于這些糖蛋白中的至少一個(gè)其他成員的糖基化作用模式；b)從至少一種糖蛋白中移出至少一個(gè)N-聚糖；c)可任選地，將所移出的N-聚糖分離出來；d)通過將至少一種所移出的N-聚糖經(jīng)受至少一個(gè)外切糖苷酶的酶的處理而從該至少一種所移出的N-聚糖的非還原性末端切割掉至少一個(gè)末端的糖苷鍵以生成多種切割產(chǎn)物；并且e)對(duì)這些切割產(chǎn)物進(jìn)行表征。41.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括將這些切割產(chǎn)物的表征結(jié)果與一種參比樣品進(jìn)行比較的一個(gè)步驟。42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該至少一種外切糖苷酶的酶是選自下組，其構(gòu)成為..一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該分離的N-聚糖經(jīng)受至少兩種選自下組的外切糖苷酶的酶的處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶不是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。46.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該分離的N-聚糖經(jīng)受兩種選自下組的外切糖苷酶的處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。47.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該分離的N-聚糖經(jīng)受三種選自下組的外切糖苷酶的處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。48.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該分離的N-聚糖經(jīng)受四種選自下組的外切糖苷酶的處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。49.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該分離的N-聚糖經(jīng)受五種選自下組的外切糖苷酶的處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。50.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該至少一種移出的N-聚糖順序地經(jīng)受至少一種外切糖苷酶的處理。51.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該切割步驟包括將該至少一種移出的N-聚糖同時(shí)地經(jīng)受至少一種外切糖苷酶的處理。52.如權(quán)利要求40所述的方法，其中至少一種切割產(chǎn)物包括含有三個(gè)甘露糖以及2個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基的一個(gè)戊糖核心。53.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種觸角的巖藻糖基化物。54.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種乳糖胺擴(kuò)展物。55.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該至少一種切割產(chǎn)物包括一種硫酸化的聚糖，一種磷酸化的聚糖，連接到N-乙酰葡糖胺上的一種唾液酸，或一種乙?；木厶?。56.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該移出步驟包括將該糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受一種聚糖酶的處理。57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中該聚糖酶包括N-聚糖酶F。58.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該移出步驟包括將該糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受化學(xué)切割處理。59.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該移出步驟包括將該糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受肼處理。60.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。61.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之后使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的步驟。62.如權(quán)利要求60或61所述的方法，其中該熒光標(biāo)記物包括2-氨基苯甲酰胺。63.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前使用一種放射性標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。64.如權(quán)利要求40所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之后使用一種放射性標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。65.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將這些切割產(chǎn)物經(jīng)受一個(gè)選自下組的操作，該組的構(gòu)成為色譜法、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法(UPLC)、薄層色譜法(TLC)、酰胺柱色譜法、質(zhì)譜法(MS)、串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)、傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)、電泳法、毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有使用識(shí)別特定的多糖結(jié)構(gòu)的抗體的蛋白質(zhì)印跡法、核磁共振(NMR):—維NMR(1D-NMR)、二維NMR(2D-NMR)、相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相關(guān)譜NMR(TOCSY-NMR)、異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)、異核多級(jí)量子相干NMR(HMQC-NMR)、旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR)、核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(NOESY-NMR)、以及它們的組合。66.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受質(zhì)譜法(MS)處理。67.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受串聯(lián)MS處理。68.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受MALDI-MS處理。69.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受核磁共振(NMR)處理。70.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受色譜法處理。71.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受毛細(xì)管電泳法(CE)處理。72.如權(quán)利要求40所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受CE-MS處理。73.—種方法，包括以下步驟將一種聚糖制品經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶操作，其中該外切糖苷酶操作包括順序地給予多種外切糖苷酶，并且其中該外切糖苷酶操作產(chǎn)生了在該聚糖制品中的聚糖的切割；在該外切糖苷酶操作過程中從該聚糖制品獲得了至少一個(gè)第一樣品；并且分析在該至少一個(gè)所獲得的樣品中所切割的聚糖類。74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中該獲得步驟包括從該聚糖制品中移出在時(shí)間上分離開的多個(gè)樣品；并且該分析步驟包括將在一種或多種所移出的樣品中的切割的聚糖類進(jìn)行表征。75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中該分析步驟包括將在至少一種所移出的樣品中的切割的聚糖類與在至少一種其他的所移出的樣品中的切割的聚糖類進(jìn)行比較。76.如權(quán)利要求74所述的方法，其中該分析步驟包括將在至少一種所移出的樣品中的切割的聚糖類與在一種參比樣品中的切割的聚糖類進(jìn)行比較。77.如權(quán)利要求74所述的方法，其中這些樣品以規(guī)則的間隔移出。78.如權(quán)利要求74所述的方法，其中這些樣品以不規(guī)則的間隔移出。79.如權(quán)利要求74所述的方法，10%時(shí)，將這些樣品移出。80.如權(quán)利要求74所述的方法，25%時(shí)，將這些樣品移出。81.如權(quán)利要求74所述的方法，50%時(shí)，將這些樣品移出。82.如權(quán)利要求74所述的方法，75%時(shí)，將這些樣品移出。83.如權(quán)利要求74所述的方法，90%時(shí)，將這些樣品移出。其中在該外切糖苷酶操作完成了約其中在該外切糖苷酶操作完成了約其中在該外切糖苷酶操作完成了約其中在該外切糖苷酶操作完成了約其中在該外切糖苷酶操作完成了約84.如權(quán)利要求74所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了幾乎100%時(shí)，將這些樣品移出。85.如權(quán)利要求74所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了100%之前，將這些樣品移出。86.如權(quán)利要求74所述的方法，其中在這些聚糖被切割了100%之前，將這些樣品移出。87.如權(quán)利要求73所述的方法，其中該外切糖苷酶處理包括順序地給予至少一種第一以及第二外切糖苷酶；并且該獲得步驟包括在給予該第一外切糖苷酶之后但是在給予該第二外切糖苷酶之前移出至少一個(gè)第一樣品；并且在給予該第二外切糖苷酶之后移出至少一個(gè)第二樣P叩o88.用于對(duì)一種糖蛋白的多個(gè)批次的進(jìn)行比較一種方法，該方法包括以下步驟由該糖蛋白的一個(gè)第一批次提供一個(gè)第一聚糖制品；由該糖蛋白的一個(gè)第二批次提供一個(gè)第二聚糖制品；將該第一以及第二聚糖制品各自經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶操作，以便特異性地從在該聚糖制品中的N-連接的聚糖的非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割；并且將由該第一聚糖制品所獲得的切割產(chǎn)物與由第二制品所獲得的切割產(chǎn)物進(jìn)行比較這樣評(píng)定兩個(gè)批次的一致性。89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用一種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。90.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用至少兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。92.如權(quán)利要求90所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶不是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。93.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖>藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。94.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用三種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。95.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括使用四種選自下組的外切糖苷酶進(jìn)行處理，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。96.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用五種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二聚糖制品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。97.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶順序地處理該第一以及第二聚糖制品。98.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶同時(shí)地處理該第一以及第二聚糖制品。99.如權(quán)利要求88所述的方法，其中至少一種切割產(chǎn)物包括一種糖形，該糖形選自下組，其構(gòu)成為含有三個(gè)甘露糖以及2個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基的一個(gè)戊糖核心；一種觸角的巖藻糖基化物；一種乳糖胺擴(kuò)展物；一種硫酸化的聚糖；一種磷酸化的聚糖；連接到一個(gè)N-乙酰葡糖胺上的一種唾液酸；以及一種乙酰化的聚糖。100.如權(quán)利要求88所述的方法，其中提供一種聚糖制品的步驟包括a)從來自該第一或第二批次的至少一種糖蛋白中移出至少一種N-聚糖；b)可任選地，將所移出的N-聚糖分離出來。101.如權(quán)利要求100所述的方法，其中該移出步驟包括將該糖蛋白批次經(jīng)受一個(gè)聚糖酷或化學(xué)切割處理。102.如權(quán)利要求100所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前或之后使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。103.如權(quán)利要求100所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前或之后使用一種放射性標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。104.如權(quán)利要求88所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受一個(gè)選自下組的操作，該組的構(gòu)成為色譜法、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法(UPLC)、薄層色譜法(TLC)、酰胺柱色譜法、質(zhì)譜法(MS)、串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)、傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)、電泳法、毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有使用識(shí)別特定的多糖結(jié)構(gòu)的抗體的蛋白質(zhì)印跡法、核磁共振(NMR):—維NMR(1D-NMR)、二維NMR(2D-NMR)、相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相關(guān)光譜NMR(TOCSY-NMR)、異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)、異核多級(jí)量子相干(HMQC-NMR)、旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR)、核歐沃豪斯效應(yīng)譜(NOESY-NMR)、以及它們的組合。105.用于監(jiān)測(cè)一種糖蛋白的生產(chǎn)的一種方法，該方法包括以下步驟在一種糖蛋白的生產(chǎn)過程中，從該生產(chǎn)體系中移出至少第一以及第二含聚糖的樣品；將該第一以及第二含聚糖的樣品各自經(jīng)受一個(gè)外切糖苷酶操作，以便特異性地從在該含聚糖樣品中的N-連接的聚糖的非還原性末端對(duì)單糖進(jìn)行切割；以及將從該第一含聚糖的樣品中所獲得的切割產(chǎn)物與從該第二含聚糖的樣品中的那些產(chǎn)物進(jìn)行比較，從而確定差別并且因此使糖蛋白生產(chǎn)的發(fā)展得到監(jiān)測(cè)。106.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用一種選自下組外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。107.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用至少兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。108.如權(quán)利要求107所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。109.如權(quán)利要求107所述的方法，其中該至少兩種外切糖苷酶不是以相對(duì)于彼此基本上相等的量進(jìn)行提供。110.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用兩種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。111.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用三種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。112.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用四種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。113.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該外切糖苷酶操作包括用五種選自下組的外切糖苷酶來處理該第一以及第二含聚糖的樣品，該組的構(gòu)成為一種唾液酸酶、一種半乳糖苷酶、一種己糖胺酶、一種巖藻糖苷酶、一種甘露糖苷酶、以及它們的組合。114.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶順序地處理該第一以及第二含聚糖的樣品。115.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該糖苷酶操作包括使用至少一種外切糖苷酶同時(shí)地處理該第一以及第二含聚糖的樣品。116.如權(quán)利要求105所述的方法，其中至少一種切割產(chǎn)物包括一種糖形，該糖形選自下組，其構(gòu)成為含有三個(gè)甘露糖以及2個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基的一個(gè)戊糖核心；一種觸角的巖藻糖基化物；一種乳糖胺擴(kuò)展物；以及一種硫酸化的聚糖；一種磷酸化的聚糖；連接到一個(gè)N-乙酰葡糖胺上的一種唾液酸；以及一種乙酰化的聚糖。117.如權(quán)利要求105所述的方法，其中移出含聚糖樣品的步驟進(jìn)一步包括從該含聚糖的樣品中獲得至少一種聚糖制品。118.如權(quán)利要求117所述的方法，其中獲得至少一種聚糖制品包括a)從在該含聚糖的樣品中所包含的至少一種結(jié)合糖中移出至少一種N-聚糖；并且b)可任選地，將所移出的N-聚糖分離出來。119.如權(quán)利要求118所述的方法，其中該移出步驟包括將一種糖蛋白或多種糖蛋白經(jīng)受一個(gè)聚糖酶或化學(xué)切割處理。120.如權(quán)利要求118所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前或之后使用一種熒光標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。121.如權(quán)利要求118所述的方法，進(jìn)一步包括在分離步驟之前或之后使用一種放射性標(biāo)記物將所移出的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記的一個(gè)步驟。122.如權(quán)利要求105所述的方法，其中該表征步驟包括將該切割產(chǎn)物經(jīng)受一個(gè)選自下組的操作，該組的構(gòu)成為色譜法、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜法(UPLC)、薄層色譜法(TLC)、酰胺柱色譜法、質(zhì)譜法(MS)、串聯(lián)MS、LC-MS、LC-MS/MS、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)、傅里葉變換質(zhì)譜法(FTMS)、離子遷移率分離質(zhì)譜法(IMS-MS)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD-MS)、電泳法、毛細(xì)管電泳法(CE)、CE-MS、凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)跟隨有使用識(shí)別特定的多糖結(jié)構(gòu)的抗體的蛋白質(zhì)印跡法、核磁共振(NMR):一維NMR(1D-NMR)、二維NMR(2D-NMR)、相關(guān)譜磁性角自旋NMR(COSY-NMR)、全相關(guān)光譜NMR(TOCSY-NMR)、異核單量子相干NMR(HSQC-NMR)、異核多級(jí)量子相干(HMQC-NMR)、旋轉(zhuǎn)核歐沃豪斯效應(yīng)譜NMR(ROESY-NMR)、核歐沃豪斯效應(yīng)譜(NOESY-NMR)、以及它們的組合。123.如權(quán)利要求105所述的方法，其中這些含聚糖的樣品以規(guī)則的間隔移出。124.如權(quán)利要求105所述的方法，其中這些含聚糖的樣品以不規(guī)則的間隔移出。125.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了約10%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。126.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了約25%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。127.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了約50%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。128.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了約75%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。129.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了約90%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。130.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了幾乎100%時(shí)，將至少一種含聚糖的樣品移出。131.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在該外切糖苷酶操作完成了100%之前，將至少一種含聚糖的樣品移出。132.如權(quán)利要求105所述的方法，其中在這些聚糖被切割了100%之前，將至少一種含聚糖的樣品移出。全文摘要本披露提供了用于分析N-聚糖類的結(jié)構(gòu)和/或組成的方法。此類方法經(jīng)常涉及用多種外切糖苷酶來消化N-聚糖。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖是用多種外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行消化。在一些實(shí)施方案中，N-聚糖是用多種外切糖苷酶順序地進(jìn)行消化。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本披露的方法涉及將已經(jīng)使用多種外切糖苷酶同時(shí)進(jìn)行消化的N-聚糖類的切割產(chǎn)物與已經(jīng)使用多種外切糖苷酶順序地進(jìn)行消化的N-聚糖類的切割產(chǎn)物進(jìn)行比較。文檔編號(hào)G01N33/68GK101657725SQ200880011806公開日2010年2月24日申請(qǐng)日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日發(fā)明者B·E·柯林斯,C·J·鮑斯克斯,D·A·布里克,I·C·帕森斯,L·蒂魯尼拉坎塔皮拉伊申請(qǐng)人:動(dòng)量制藥公司