專利名稱：一種微流控芯片裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測裝置，尤其涉及一種能一次并行檢測樣品多種腫 瘤標志物的便攜式快速檢測微流控芯片裝置及其應用。
背景技術：
癌癥是一種威脅全人類的疾病。2007年癌癥死亡人數(shù)達7， 900， 000，其 中大約80%發(fā)生在低、中等收入國家。據(jù)08年衛(wèi)生部發(fā)布的第三次全國死因 調査報告顯示，我國城鄉(xiāng)居民由惡性腫瘤導致的死亡人數(shù)占總人數(shù)的22.32%， 位居我國死亡原因的第二位。我國惡性腫瘤死亡率屬于世界較高水平，而且呈 持續(xù)的增長趨勢。癌癥雖然可怕，但隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，它已經不再是"不 治之癥"。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，30%的癌癥是可以預防的，30%的癌癥如能早 發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是可以痊愈的；30%的癌癥如能得到正確的治療可以減 輕痛苦，延長壽命。因此，早期發(fā)現(xiàn)和診斷對腫瘤的治療與預防至關重要。但 是像我國這樣人口眾多、醫(yī)療資源緊缺、癌癥病患大多數(shù)在農村鄉(xiāng)鎮(zhèn)的發(fā)展中 國家，要想實現(xiàn)全民的腫瘤與疾病的普查和監(jiān)控，迫切需要一種低成本、脫離 專業(yè)的醫(yī)護人員和昂貴的儀器、高通量、診斷結果準確快速的檢測手段。
腫瘤標志物是指在惡性腫瘤發(fā)生和增值過程中，由腫瘤細胞的基因表達而 合成、分泌的，或因機體對腫瘤反應而異常產生和升高的、反映腫瘤存在和生 長的一類物質。這類物質有的只見于胚胎中，有的在腫瘤患者體內的含量超過 正常人體的含量。通過對腫瘤標志物的分析，能夠幫助從正常組織中區(qū)分腫瘤 細胞，經過對腫瘤細胞核、細胞質以及細胞膜上的特性進行分析，作為腫瘤診 斷、分類、預后判斷、指導治療和檢測轉移的臨床檢測手段。尤其是血清腫瘤 標志物，由于樣本采集方便、經濟，更利于做為普適性的腫瘤檢測手段。但 是由于癌癥基因的復雜性，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的腫瘤標志物并不理想，大多數(shù)有敏感 度偏低，特異性不高，不具有器官特異性等缺點。為提高腫瘤標志物檢測的特 異性和減少假陰性，對腫瘤的診斷多采用多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測的方法。
微流控芯片技術已被列入21世紀最為重要的前沿技術的行列，它是通過 分析化學、微機電加工、計算機、電子學、材料科學及生物學、醫(yī)學等的交叉 實現(xiàn)從樣品處理到檢測的整體微型化、自動化、集成化與便攜化。這樣通常需 要在一個實驗室中，多種儀器輔助下才能完成的實驗在一個芯片系統(tǒng)上就可以
3完成，這樣不僅大大提高了實驗速度，減少實驗成本，最為重要的是減少了所 需實驗的樣品劑量和反應時間。充分體現(xiàn)了當今分析設備的微型化、集成化、 便攜化的發(fā)展趨勢，在高通量、低消耗、和大規(guī)模平行處理方面具有極大的優(yōu) 勢。
發(fā)明內容
本實用新型的目的是提供一種微流控芯片裝置，由注射泵、并聯(lián)串口、螺 母、卡具、微流控芯片組件、廢液槽組成，其中微流控芯片組件是由多個微流 控芯片經過并聯(lián)串口連接而成，卡具通過螺母固定微流控芯片組件，微流控芯 片組件由并聯(lián)串口連接的一端為進樣端，其與注射泵連接，微流控芯片組件的 另一端為出樣端，其與廢液槽連接。
所述的微流控組件由多個微流控芯片組成，微流控芯片中構建有結構特殊 的微通道。
微流控芯片選用硅、高聚物等不同材質材料制作，高聚物包括聚甲基丙烯酸
甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧垸(PDMA,)、環(huán)氧樹脂。
微流控芯片中的微通道有多種設計方式，均是以盡量增加目的細胞與通道 表面積的接觸為原則。可以在微通道中設計排列緊密的微柱，來增加樣品與表 面的接觸；可以在面積有限的芯片上設計多種環(huán)路，以增加通道兩壁表面與樣 品的接觸；可以在芯片的前端部分設計不同間距排列的微柱或者改變通道內 徑，達到按細胞大小進行分選的目的，再將分選出的細胞通過連接有特異性的 配體的微通道進行目的細胞的捕獲等。
為實現(xiàn)目的腫瘤細胞的捕獲，需要對微流控芯片進行表面功能化修飾。由 于高聚物自身的缺陷，需要對其微通道表面進行修飾，改善其疏水特性，并對 其功能化，連接特異性的配體分子?？梢愿鶕?jù)芯片材質、微通道功能不同而采 用不同的修飾方法，如用紫外曝光、等離子體處理、化學修飾、硅烷化處理等 方法來改變其疏水表面；使用靜電吸附、受配體結合和共價修飾等方法，在微 通道表面連接不同的特異性的配體分子。
使用本實用新型時,將血樣收集到含有抗凝集素的離心管中4'C震蕩混合， 用緩沖液通過微流控芯片中的微通道，血樣轉到注射泵的注射器中，控制流速 通過微流控芯片中的微通道；緩沖液沖洗非特異性結合的細胞，細胞經固定后， 依次用熒光標記的抗角蛋白抗體、抗CD45抗體和DAPI對細胞進行染色，緩 沖液沖洗去多余的染色液，熒光顯微鏡成像，應用熒光顯微鏡中的軟件進行圖 像處理和統(tǒng)計分析，判斷細胞的形態(tài)特征和含量，對捕獲的腫瘤細胞進行定量和定性分析，從而實現(xiàn)腫瘤的檢測。微流控芯片中捕獲的腫瘤細胞進行計數(shù)， 與健康人的血樣和患各個分期腫瘤的病人的血樣捕獲的腫瘤細胞數(shù)進行對比， 來進行是否患有腫瘤、腫瘤分期的判斷?；蛘咧苯釉谖⒘骺匦酒袑⒉东@的細
胞進行裂解后，對細胞中的腫瘤標志物的進行PCR(聚合酶鏈式反應)分析，也 是與健康人的血樣和患各個分期腫瘤的病人的血樣進行相同的比較，以腫瘤標 志物有無表達、表達含量高低程度等結果，對樣品進行分析。
免疫熒光檢測原理用熒光標記的抗角蛋白抗體、抗CD45抗體和DAPI 依次進入芯片對細胞進行染色。抗角蛋白抗體特異性標記表皮細胞，抗CD45 抗體特異性標記白細胞，DAPI標記活細胞的核酸?？菇堑鞍卓贵w呈陽性、抗 CD45抗體呈陰性和DAPI呈陽性的細胞為脫落到體液中腫瘤細胞。用熒光顯 微鏡進行成像，直接即可判斷結果。
PCR檢觀U:可以利用反轉錄PCR、熒光定量PCR、巢式PCR等多種方法， 對捕獲細胞的腫瘤標志物的表達水平進行分析。
本實用新型的有益之處是由于微流控芯片的材質多為硅、高聚化物，價 格便宜，利于推廣；利用微流控芯片中的特殊構造的通道，盡量增加特異性配 體與樣品的接觸面積，有利于從復雜的樣品中篩選到目的細胞，并進行有效的 富集，增加檢出率；該微流控芯片實現(xiàn)了"一步法"從體液中直接進行目的細胞 的檢測，步驟簡單，操作便捷；由于采用了多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測的方法， 一次可同時檢測多種腫瘤標志物，不僅大大增加了腫瘤細胞檢出的陽性率，而 且需樣量少，20-30mL的血液即可完成檢測；由于微流控芯片組件是有多個微 流控芯片獨立組成，可自主制定多種腫瘤標志物組合方案，不僅可就一種組織 特異性的腫瘤進行檢測，還可就腫瘤的普篩進行檢測；該檢測裝置設計合理， 制作成本低、檢測快速、攜帶便捷，尤其在臨床檢測中對腫瘤的檢測和鑒定方 面具有廣闊的應用前景。

圖1是本實用新型微流控裝置的結構示意圖。 圖2是微流控組件示意圖。
具體實施方式

本實用新型結合附圖和實施例作進一步的說明。 實施例1 一種微流控芯片裝置
由注射泵l、并聯(lián)串口2、螺母3、卡具4、微流控芯片組件5、廢液槽6 組成，其中微流控芯片組件5是由多個微流控芯片7經過并聯(lián)串口 2連接而成，
5卡具4通過螺母3固定微流控芯片組件5，微流控芯片組件5由并聯(lián)串口 2連 接的一端為進樣端，其與注射泵l連接，微流控芯片組件5的出樣端即為微流 控芯片7出樣端，分別直接與廢液槽6連接。
所述微流控芯片7的微通道表面根據(jù)檢測要求連接有不同的特異性的、 可結合腫瘤細胞的配體。
微流控芯片7選用硅、高聚物(PMMA、 PDMA)、環(huán)氧樹脂等不同材質 材料制作。
實施例2結腸癌的檢測 選取三種腫瘤標志物作為結腸癌的檢測
CEA:癌胚抗原， 一種酸性糖蛋白。主要存在于胎兒消化到上皮組織、姨 臟和肝臟。正常成人血清中CEA的含量極低，但發(fā)生腫瘤時可重新表達，并 隨腫瘤分期的進展、愛細胞惡性程度的升高而逐漸升高。其中以結腸癌升高為 甚，約有70%~90%顯示陽性。但是CEA不是結、直腸癌的特異性抗原，它是 一種較光譜的腫瘤標志物。
CK19:細胞角蛋白，對非小細胞肺癌的診斷、病情監(jiān)測及治療判斷有較高 的臨床價值。
CK20:細胞角蛋白，僅在結直腸癌等細胞表達，可作為結腸癌患者血液或 骨髓中腫瘤細胞轉移標志物。 具體步驟
(1) 選取特定的芯片(分別是連接抗CEA、 CK19、 CK20三種腫瘤標志 物抗體的芯片)；
(2) 微流控芯片裝置的連接
采用實施例1的裝置，其中微流控芯片組件是由3個微流控芯片經過并 聯(lián)串口連接而成；
(3) 腫瘤標志物的檢測 采集20例患結腸癌的患者的血樣，各取15mL，將血樣收集到含有抗凝劑
素EDTA的離心管中，4。c震蕩混合至少5min。用2-3mL PBS(磷酸緩沖液)沖洗 芯片的微通道；將15mL血樣轉移到注射泵中的注射器里，控制流速，使血樣 緩慢通過微通道；PBS用〉6mL/min的速度沖洗微通道，以洗去非特異性結合 的細胞。直接原位裂解細胞，收集裂解液，分別從3個芯片中收集的液體，Trizol 抽提制備總的RNA，使用MBI Fermentas公司的反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，42。C50min， 70°C 15min進行逆轉錄；使用CEA、 CK19 、 CK20的上下游 弓I物進行反應，使用SYBR Premix EX Taq試劑盒進行定量PCR，反應條件93 。C3min， 93。Clmin， 50。Clmin， 72。Clmin，共40個循環(huán)。經熒光定量PCR擴 增后，由儀器軟件自動繪制標準曲線，得出個檢測品的濃度。以濃度>500拷 貝數(shù)/mL為陽性結果，濃度<500拷貝數(shù)/mL為陰性結果。
所用CEA的上游引物:5，—AACTTCTCCTGGTCTCCAGCT-3，，下游引物 5， -GCAAA TGCTTTAA GGAA GAAG-3，；所用CK19的上游引物 5'-AATAAATAGGATCCATGCAGGACTGTGGAAAAGA國3'，下游引物5'-TTTTAATGAATTCAGTAGATAGTAATCTCCTCCTC- 3';所用CK20的上游引 物 5'-GAACAGGCTCAGGACTATCT-3，， 下游引物 5 ,-CCACTGTAATATGCGGTAAG國3'。
表1;CEA、 CK19、 CK20三種腫瘤標志物聯(lián)合檢測20例結腸癌的陽性比例
陽性(例) 陰性(例) 陽性率(％) CEAmRNA 9 11 45% CK19mRNA 11 9 55% CKmRNA812 40% CEA+CK19+CK 14 6 70%
實施例3循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的檢測
腫瘤細胞間的黏附力非常弱，腫瘤細胞有可能從瘤體脫落，如果脫落的細 胞進入了血液或淋巴循環(huán)，循環(huán)的腫瘤細胞絕大多數(shù)在短期內死亡。只有極少 具有高度活力、高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，相互聚集形 成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展成轉移灶，因此，檢測血中單個或少量循環(huán) 腫瘤細胞，對推測個體患者預后的準確性和評估治療反應的有效性具有重要意 義。但是循環(huán)腫瘤細胞在代謝腫瘤病患的血中的比例是1個細胞/109個血細胞， 含量極低，不易進行準確的分析和檢測。但通過設計合理的微流控芯片，可以 極大地增加了與循環(huán)患腫瘤細胞接觸的表面積，而對其進行有效的捕獲。如對 前列腺癌患者進行循環(huán)腫瘤細胞的檢測， 一般可使用EpCAM、 PSA、細胞角 蛋白19 (CK19)等三種腫瘤標志物進行檢測。
EpCAM:是一類細胞粘附分子。廣泛表達于上皮來源的組織中。在很多 惡性上皮腫瘤中，EpCAM的表達遠遠超過正常組織的表達水平，EpCAM陽性 細胞的數(shù)量和陽性程度都與腫瘤發(fā)展的程度密切相關。其特異性單抗可以區(qū)分上皮和非上皮來源的組織，可作為上皮型腫瘤的可靠診斷標志物。
PSA:前列腺特異性抗原，是糖蛋白類物質。存在于前列腺內質網和前列 腺上皮細胞及分泌物中，通常血液中不含或知有極微量的PSA。絕大多數(shù)前列 腺癌患者血清PSA水平增高。是目前前列腺癌中最敏感的腫瘤標志物。PMSA: 前列腺特異膜抗原。是一種確定高分級前列腺癌的腫瘤標志物。
具體步驟
(1) 選取特定的芯片(分別是連接EpCAM、 PSA、細胞角蛋白19CCK19) 三種腫瘤標志物相關配體的芯片)；
(2) 微流控芯片裝置的連接
采用實施例1的裝置，其中微流控芯片組件是由3個微流控芯片經過并 聯(lián)串口連接而成；
(3) 腫瘤標志物的測定
取10例前列腺癌患者的血樣，各取15mL，將血樣收集到含有抗凝劑素 EDTA的離心管中，4'C震蕩混合至少5min。用2-3mLPBS(磷酸緩沖液)沖洗芯 片的微通道；將15mL血樣轉移到注射泵中的注射器里，控制流速，使血樣緩 慢通過微通道；PBS用〉6mL/min的速度沖洗微通道，以洗去非特異性結合的 細胞。用多聚甲醛固定細胞，使用Triton X-100通透細胞后，進行捕獲細胞的 熒光染色。依次通過用熒光標記的抗角蛋白抗體、抗CD45抗體和DAPI對細 胞進行染色。經熒光顯微鏡成像，抗角蛋白抗體呈陽性、抗CD45抗體呈陰性 和DAPI呈陽性的細胞為腫瘤細胞。
表2:利用EpCAM、 PSA、 CK19三種腫瘤標志物的特異性抗體從血樣中 捕獲的CTC數(shù)目
每毫升血樣捕獲的CTCs細胞數(shù)量范圍5-50個/mL50-100個/mL>100個/mL
抗EpCAM抗體6例3例l例
抗CK19抗體6例4例0例
抗PSA抗體5例3例2例
根據(jù)捕獲的CTCs細胞的數(shù)目的多少可以腫瘤分期進行輔助判斷。
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權利要求1. 一種微流控芯片裝置，其特征是由注射泵(1)、并聯(lián)串口(2)、螺母(3)、卡具(4)、微流控芯片組件(5)和廢液槽(6)組成，其中微流控芯片組件(5)由微流控芯片(7)經過并聯(lián)串口(2)連接而成，用卡具(4)通過螺母(3)固定微流控芯片組件(5)，微流控芯片組件(5)由并聯(lián)串口(2)連接的一端為進樣端，其與注射泵(1)連接，微流控芯片組件(5)的另一端為出樣端，其與廢液槽(6)連接。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種微流控芯片裝置，其特征是微流控芯片 (7)的材質選用硅、高聚物或環(huán)氧樹脂中的一種。
專利摘要本實用新型提供一種微流控芯片裝置，由注射泵、并聯(lián)串口、螺母、卡具、微流控芯片組件、廢液槽組成，微流控芯片組件由微流控芯片經過并聯(lián)串口連接而成，卡具通過螺母固定微流控芯片組件，微流控芯片組件的一端與注射泵連接，另一端與廢液槽連接。本實用新型設計合理，制作成本低、操作便捷、檢測快速、攜帶便捷。實現(xiàn)了“一步法”從體液中直接進行目的細胞的檢測，一次完成檢測多種腫瘤標志物，對腫瘤的檢測和鑒定具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/50GK201281707SQ200820166589
公開日2009年7月29日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權日2008年10月31日
發(fā)明者穎 牟, 王琳琳, 偉 金, 金欽漢 申請人:浙江大學