專利名稱：多個傳染病項目同時檢測的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種多個傳染病項目同時檢測的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷
試劑盒。
背景技術(shù)：
艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immure Deficiency Syndrome,AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)引起的嚴(yán)重疾病。AIDS可通過性傳播、血液傳播和母嬰傳播三種途徑感染人類。HIV(l+2)抗體的檢出是艾滋病診斷的必要條件，目前的艾滋病病原學(xué)診斷技術(shù)主要包括HIV病毒分離、HIV病毒載量測定、HIV核酸測定，以及病毒抗原檢測和病毒特異性抗體檢測等。其中抗體檢測是常規(guī)檢測方法，包括ELISA、 CLIA、 PA、 IFA和斑點印跡在內(nèi)的檢測技術(shù)用于篩選實驗，免疫印跡試驗(WB)用于確認(rèn)實驗，抗體檢測以外的方法用于特殊情況的檢測。 梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(又稱蒼白螺旋體，TP)引起的常見性傳播疾病之一。其臨床病程漫長，臨床表現(xiàn)極為復(fù)雜，幾乎可侵犯全身各種組織和器官，并產(chǎn)生多種多樣復(fù)雜的臨床癥狀和體癥，可反復(fù)發(fā)作。梅毒是一種全身性的疾病，早期主要侵犯皮膚粘膜，晚期侵犯內(nèi)臟器官，嚴(yán)重者可引起嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損害。
乙型肝炎是一種嚴(yán)重的常見的肝臟疾病，目前全球人口中，超過20億人已經(jīng)在其生命中的某個時期感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中，大約3.5億仍然為慢性感染者，成為病毒的攜帶者。全世界四分之三的人口生活在感染的高發(fā)區(qū)。每年HBV急性臨床病例超過4百萬，攜帶者中大約25%，也就是每年100萬人死于慢性活動性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。我國是世界上乙肝病毒感染最嚴(yán)重的國家，約有1. 2億人為乙肝病毒攜帶者，占世界的三分之一。其中3000萬為慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌，每年有30萬人死于慢性肝病，其中約13萬人為原發(fā)性肝癌患者。 丙型肝炎是一種主要經(jīng)血液傳播、由丙型肝炎病毒引起的嚴(yán)重肝臟疾病。全世界目前有l(wèi)億丙型肝炎病毒攜帶者，中國約占四千萬人。80%的丙型肝炎病毒攜帶者會患上慢性肝炎，其中約10-30%的病人將發(fā)展為肝硬化，5-10%的肝硬化患者可發(fā)展成肝癌。
這些傳染性疾病已嚴(yán)重威脅人類的健康，對付傳染病最有效的方法就是切斷其傳播途徑，傳染病標(biāo)志物的檢測對疾病的早發(fā)現(xiàn)，早治療、早預(yù)防尤顯重要，傳統(tǒng)的檢測方法主要是單個項目進行檢測，操作繁瑣，檢測時間長，成本高，而且容易出現(xiàn)操作錯誤。
臨床上對上述血清標(biāo)志物的檢測常常都一份樣本需同時檢測幾個項目，最常見的檢測項目組合有血源篩查四項(HIV抗體、TP抗體、HCV抗體和HBsAg)，肝五項(HBsAg、HBsAb、 HBeAg、 HBeAb和HBcAb)和傳染病八項(HIV抗體、TP抗體、HCV抗體、HBsAg、 HBsAb、HBeAg、 HBeAb和HBcAb)。血源篩查四項常用于供血者和患者手術(shù)前的常規(guī)檢測，乙肝五項是國內(nèi)一個最常見的檢測組合，目前廣泛用于臨床檢測，傳染病八項也常?；颊呤中g(shù)前的檢測項目，在很多醫(yī)療機構(gòu)已經(jīng)成為一項入院常規(guī)檢測。
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與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明采用先進的微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析法，在一次試驗中可以同時對一份樣本進行多個傳染病項目的檢測，同時得到檢測結(jié)果；具有與傳統(tǒng)試劑盒一樣的靈敏度和特異性，但操作易用性大大提高，縮短了操作時間、操作程序，可靈活地組合幾種不同的檢測項目。有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本發(fā)明的反應(yīng)與傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光法幾乎一樣，應(yīng)用表面特殊處理的標(biāo)準(zhǔn)不透明96孔微孔板作為載體，保證了反應(yīng)的方便性與快捷性，兼容市場上通用的所有型號洗板機或全/半自動板式化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)；解決了其它基于玻片或膜等的生物芯片反應(yīng)步驟的手工操作過多且操作復(fù)雜、可重復(fù)性差、均一性差等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了簡便、快捷、準(zhǔn)確的同時檢測多個傳染病項目的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒。 本發(fā)明是由96孔位的支撐架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板條組成，其中，每12孔為一個反應(yīng)條，每個反應(yīng)條負(fù)載相同的抗原或抗體，檢測同一個傳染病項目，可以同時檢測4-8種傳染病項目。 本發(fā)明精心設(shè)計的96孔板酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒，高度靈敏和特異，操作簡便快速，可在一次試驗中同時檢測4-8種傳染病項目是否含有待測物，費用低廉。它簡便快速，多個檢測項目同時加樣，同時洗板，減少加樣時間，避免反復(fù)使用樣本造成樣本的污染和順序顛倒等操作失誤，根據(jù)多項檢測結(jié)果對受檢者進行綜合判斷，便于樣本結(jié)果的處理等優(yōu)點。本發(fā)明特別適合體檢中心，臨床醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有實用價值的檢測手段。


圖1、2本發(fā)明實施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3本發(fā)明實施例2的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4本發(fā)明實施例3的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
實施例1制備血源篩查4項同時檢測酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒
—、酶標(biāo)記物的制備 用改良的過碘酸鈉氧化法標(biāo)記人類免疫缺陷病毒1+2型抗原、梅毒螺旋體抗原、抗人IgG、乙型肝炎表面抗體。 酶標(biāo)記物稀釋液配制稱量12. 12g的Tris，9g NaCl， 200mL新生牛血清，0. 5mLTween 20和lmL Proclin 300，將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，調(diào)pH值7. 0 7. 5加雙蒸水至1L，溶解混勻。 分別采用棋盤實驗選擇四種酶標(biāo)記物的工作濃度。每個產(chǎn)品分裝一瓶，共分裝四
瓶或四種酶標(biāo)記物混合在一瓶中。 二、傳染病項目復(fù)合對照品的制備 用人類免疫缺陷病毒抗體(Anti-HIV)、梅毒螺旋體抗體(Anti-TP)、丙型肝炎病毒抗體(Anti-HCV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性血清經(jīng)滅活后，配制成血源篩查4項復(fù)合陽性對照，用正常人血清或新生牛血清配制成復(fù)合陰性對照，2mL/瓶分裝。
三、固相微孔板條的制備 如圖1所示，在反應(yīng)條A、B板條上的微孔中包被上HIV l+2型抗原，C和D板條上的微孔中包被上梅毒抗原(TP15， TP17， TP47蛋白)，在E和F板條上的微孔中包被上丙型肝炎病毒抗原，在G和H板條上的微孔中包被上乙型肝炎病毒表面抗體。如檢測樣本量較少，可在A D排依次按上HIV、 TP、 HCV和HBsAg的固相微孔板條，如圖2所示。四種檢測項目包被板條尾翼上分別貼上標(biāo)有"HIV、 TP、 HCV、 sAg"的小標(biāo)簽。
四、化學(xué)發(fā)光底物液 化學(xué)發(fā)光底物A液，包括10mM魯米諾、0. 3mM 4_羥基聯(lián)苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8. 0 10. 0 ; 化學(xué)發(fā)光底物B液，包括3. 5mM過氧化脲、0. 1 % Tween20、0. 2M pH7. 2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7. 0 7. 6。
五、20倍洗滌液 稱量24g Tris，4g的KC1， 160g NaCl于潔凈容器中，加雙蒸水至1L，溶解混勻，調(diào)整PH至7. 4。 六、半成品及成品組成 上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成血源篩查四項同時檢測酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒。組裝成試劑盒后需抽檢合格后才能出廠。 實施例2制備乙肝五項同時檢測酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒
—、酶標(biāo)記物的制備 用改良的過碘酸鈉氧化法標(biāo)記乙型肝炎病毒表面抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體。 酶標(biāo)記物稀釋液配制稱量12. 12g的Tris，9g NaCl， 200mL新生牛血清，0. 5mLTween 20和lmL Proclin 300，將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，調(diào)pH值7. 0 7. 5加雙蒸水至1L，溶解混勻。 分別采用棋盤實驗選擇四種酶標(biāo)記物的工作濃度。每個產(chǎn)品分裝一瓶，共分裝四瓶，其中酶標(biāo)乙型肝炎病毒e抗體可同時用于乙型肝炎病毒e抗原和e抗體的檢測。
二、傳染病項目復(fù)合校準(zhǔn)品的制備 采用基因工程HBsAg、基因工程HBeAg用新生牛血清稀釋至一定濃度，配制成乙肝抗原復(fù)合陽性對照，用多克隆HBsAb、多克隆HBeAb和多克隆HBcAb用新生牛血清稀釋至一定濃度，配制成乙肝抗體復(fù)合標(biāo)準(zhǔn)品，用乙肝五項全陰性正常人血清或新生牛血清配制成乙肝復(fù)合陰性對照，分別分裝陰陽性對照品，2mL/瓶。
三、固相微孔板條的制備 如圖3所示，在板條A的微孔中包被乙型肝炎病毒表面抗體，在板條B中包被乙型肝炎病毒表面抗原，在板條C微孔中包被乙型肝炎病毒e抗體，在板條D微孔中先包被乙型肝炎病毒e抗體，再包被適量的乙型肝炎病毒e抗原，在板條E的微孔中包被乙型肝炎病毒核心抗原，板條A-E分別用于檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，并在板條尾翼上分別
5打上標(biāo)簽"sAg， sAb， eAg， eAb， cAb，，。
四、化學(xué)發(fā)光底物液 化學(xué)發(fā)光底物A液，包括10mM魯米諾、0. 3mM 4-羥基聯(lián)苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8. 0 10. 0 ; 化學(xué)發(fā)光底物B液，包括3. 5mM過氧化脲、0. 1 % Tween20、0. 2M pH7. 2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7. 0 7. 6。
五、20倍洗滌液 稱量24g Tris，4g的KC1， 160g NaCl于潔凈容器中，加雙蒸水至1L，溶解混勻，調(diào)整PH至7. 4。 六、半成品及成品組成 上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成同時檢測乙肝五項酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒。組裝成試劑盒后需抽檢合格后才能出廠。 實施例3制備傳染病八項同時檢測酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒
配制HIV抗體、TP抗體、HCV、HBsAg、HBeAg混合陽性對照，用于HIV、TP、HCV、HBsAg和HBeAg，配制HBsAb、 HBeAb、 HBcAb為乙肝抗體混合陽性對照，用新生牛血清配制陰性對照。分別分裝陰陽性對照品，2mL/瓶。 酶標(biāo)記物和固相微孔板條的制備方法同實施例1和2，將包被好的微孔板條按HIV、TP、HCV、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb順序依次安插于96孔支撐架A H排上，如圖4。 試劑盒中其余成分的制備方法同實施例1和2。
實施例4同時檢測試劑盒的使用方法 當(dāng)樣本需要同時檢測HIV抗體、TP抗體、HCV抗體和HBsAg時，使用實施例1試劑 當(dāng)樣本需要同時檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb時，使用實施例2試劑 當(dāng)樣本需要同時檢測HIV抗體、TP抗體、HCV抗體、HBsAg、 HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb和HBcAb時，使用實施例3試劑盒。 實施例1 3同時檢測酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒的使用方法如下
取出試劑盒室溫平衡20 30分鐘，拆開包裝，取出所用板條，剩余板條用自封袋
密封，4t:保存。 1、每個檢測項目設(shè)陰性對照1 L陽性對照1孔，取每份樣本分別加入板條相應(yīng)孔內(nèi)，每孔50 iU，同一份血可以不換加樣槍頭連續(xù)加樣，不同樣本間需更換槍頭，再往陰性對照孔內(nèi)加入復(fù)合陰性對照50 iU，陽性對照孔內(nèi)加入相應(yīng)的復(fù)合陽性對照50 ii 1，振蕩混勻后，置入37。C溫育30分鐘。 2、用稀釋后的洗滌液進行洗板，可手工洗板，也可用全自動洗板機進行洗板，每孔加入洗滌液50iU，浸泡至少10秒，后棄液或吸干，如此反復(fù)3 5次。
3、每孔加入相應(yīng)的酶工作液50 iU，置37。C溫育30分鐘。
4、如步驟3洗板5次
5、每孔加入已1 : 1混合的化學(xué)發(fā)光底物液50 lOOul，置室溫反應(yīng)5分鐘。
6、用微孔板化學(xué)發(fā)光分析儀進行讀數(shù)，根據(jù)Cutoff值判斷樣本中是否還有待測 物。
權(quán)利要求
一種多個傳染病項目同時檢測的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒，其特征在于，所描述試劑盒是一個可以同時檢測4-8種傳染病項目的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述4-8種傳染病項目同時檢測包括血源篩查4項同時檢測；乙肝五項同時檢測；傳染病八項同時檢測。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括包被有不同抗原或抗體 的微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗原或抗體的混合物、陰性對照血清、混合的陽性對 照血清，濃縮洗滌液以及作用于辣根過氧化物酶的化學(xué)發(fā)光底物液。
4. 如權(quán)利要求2所述的傳染病項目，其特征在于，所述血源篩查4項為人類免疫缺 陷病毒(HIV)抗體、梅毒螺旋體(TP)抗體、丙型肝炎病毒(HCV)抗體、乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)。
5. 如權(quán)利要求2所述的傳染病項目，其特征在于，所述乙肝五項為乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、 乙型肝炎核心抗體(HBcAb)。
6. 如權(quán)利要求2所述的傳染病項目，其特征在于，所述傳染病八項為人類免疫缺陷病 毒抗體、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎表面抗體、乙型 肝炎e抗原、乙型肝炎e抗體、乙型肝炎核心抗體。
7. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其微孔板是由96孔位的支撐架及放置其上的可拆卸的 不透明微孔板條組成，在每個可拆卸的不透明反應(yīng)條上設(shè)置反應(yīng)孔，在每個反應(yīng)孔上包被 有相應(yīng)的抗原或抗體，其特征在于每12孔為一個反應(yīng)條，每個反應(yīng)條負(fù)載相同的抗原或 抗體，檢測同一個傳染病項目，不同的反應(yīng)條組合可以4-8種傳染病項目同時檢測。
8. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)抗原或抗體的混合物包 含人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體、梅毒螺旋體(TP)抗體、丙型肝炎病毒(HCV)抗體、乙型肝 炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗 體(HBeAb)和乙型肝炎核心抗體(HBcAb)，其特征在于其混合物分成2瓶，HBsAg、HBeAg的 標(biāo)記物和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb中任意混合物裝成一瓶，HBsAb、 HBeAb和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb 中任意混合物裝成另一瓶。
9. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其混合的陽性對照血清包含人類免疫缺陷病毒(HIV) 抗體、梅毒螺旋體(TP)抗體、丙型肝炎病毒(HCV)抗體、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝 炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)和乙型肝炎核心 抗體(HBcAb)，其特征在于其混合物分成2瓶，HBsAg、HBeAg和HIV、TP、HCV、HBcAb中任意 混合物裝成一瓶，HBsAb、 HBeAb和HIV、 TP、 HCV、 HBcAb中任意混合物裝成另一瓶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種多個傳染病項目同時檢測的酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析定性診斷試劑盒。本發(fā)明是由包被不同的相應(yīng)抗原或抗體的微孔板條、混合的辣根過氧化物酶標(biāo)記物、陰性對照血清、混合的陽性對照血清、濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光底物組成。其特征在于每12孔為一個反應(yīng)板條，每個反應(yīng)板條負(fù)載相同的抗原或抗體，檢測同一個傳染病項目，不同的反應(yīng)條組合，可以同時檢測4-8種傳染病項目。本發(fā)明能方便、快捷同時檢測多種傳染病項目。
文檔編號G01N33/576GK101750493SQ200810240128
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者于尚永, 唐寶軍, 應(yīng)希堂, 胡國茂, 詹先發(fā), 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司