己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒，該法結合了免疫反應和化學發(fā)光技術，通過優(yōu)化實驗條件，將傳統(tǒng)兩步式化學發(fā)光酶免疫分析法簡化為一步。該法應用在動物源性食品中己烯雌酚殘留檢測，具有快速、簡便、特異、靈敏、準確、檢測范圍寬等特點，更加符合快速檢測的要求，具有較好的應用前景。本發(fā)明試劑盒的最低檢測限是0.006μg/L，IC50為0.50μg/L，回收率為72.43～113.62％，與英國Randox雌酚類酶聯(lián)免疫試劑盒的陰陽性符合率為100％，適合用于己烯雌酚的痕量分析與批量檢測。
【專利說明】己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于己烯雌酚檢測分析領域，尤其涉及一種己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。
【背景技術】
[0002]己烯雌酹(DiethyIstilbesrtol, DES)是一種人工合成的雌激素,在促進子宮、輸卵管、乳腺的生長發(fā)育和蛋白質合成、減少脂肪、提高日增重等方面效果顯著，因而曾作為促生長劑用于畜禽、水產(chǎn)生產(chǎn)中。然而，許多科學研究表明DES能通過改變內(nèi)分泌系統(tǒng)引發(fā)人和動物的癌癥，還可以經(jīng)胎盤致癌，即妊娠期使用，可導致胎兒生殖器官的畸變，甚至癌變。另外，DES很難降解，如排出體外，會嚴重污染水源和土壤，并通過食物鏈威脅人類健康和生態(tài)環(huán)境，形成惡性循環(huán)。因此，我國在1999年制定《中國人民共和國動物及動物源食品殘留監(jiān)測計劃》中規(guī)定在動物源性食品衛(wèi)生中不得檢出DES，2002年又將其列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農(nóng)業(yè)部公告193號)。然而，由于巨大利益的驅使，違法添加DES的情況仍屢禁不絕，嚴重威脅著人類健康。
[0003]目前，文獻報道的DES檢測方法主要有色譜法(氣相色譜、氣相色譜-質譜聯(lián)用、高效液相色譜等)、免疫法(放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光酶免疫分析法)以及熒光分光光度計法、輻照分光光度法、生物分析法等。由于DES在體內(nèi)代謝快，組織濃度較低，所以其檢測方法應更靈敏、準確?；瘜W發(fā)光酶免疫分析法(Chemiluminescence enzymeimmunoassay, CLEIA)以其靈敏度高、特異性好、操作簡便、無福射、標記物有效期長等優(yōu)點，越來越多地用于臨床樣品的高通量篩選，是一項十分有發(fā)展前景的分析監(jiān)測技術，近年來已被應用于多種藥物殘留的檢測。目前我國DES檢測試劑盒主要是ELISA檢測試劑盒，而且?guī)缀跬耆M口，如英國RAND0X、德國r-Biopharm等，因此，建立檢測DES的化學發(fā)光酶免疫分析法及其試劑盒有較好的實際意義。
[0004]中國專利“一種檢測己烯雌酚的方法及其專用化學發(fā)光免疫試劑盒”(專利號201010244284.0
【公開日】2011年I月5日)采用兩步式化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測體系，操作步驟繁多且復雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、準確、檢測范圍寬的己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。
[0006]本發(fā)明要解決的另一技術問題是提供一種特異性高、親和力強的己烯雌酚單克隆抗體。
[0007]為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案:
[0008]己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法，包括以下步驟:
[0009]<1>處理待測樣品；
[0010]〈2>將半抗原己烯雌酚與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物(DES-OVA)作為抗原包被于發(fā)光固相載體，封閉后，依次加入系列標準樣品或經(jīng)前處理的待測樣品、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚單克隆抗體(DES-McAb)進行反應，然后再加入化學發(fā)光液，測定系列標準樣品和待測樣品的發(fā)光值；
[0011]<3>以步驟〈2>測得的發(fā)光值計算抑制率，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中己烯雌酚的含量。
[0012]步驟〈1>按以下操作進行:取5g組織樣品加入IOmL叔丁基甲基醚，劇烈震蕩5min后，超聲提取IOmin, 3000g/min離心10min,移出上清液后,用IOmL叔丁基甲基醚重復提取沉淀物，將兩次的上清液合并，吹干，用ImL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗滌甲醇溶液；蒸發(fā)甲醇，用ImL 二氯甲烷溶解后，再用3mLlN NaOH溶液提取，最后，用300 μ L磷酸中和提取液，用于檢測；[0013]步驟〈2>按以下操作進行:用包被液將抗原稀釋成0.5 μ g/mL,每孔加入100 μ L,4°C孵育過夜，傾去包被液，用洗板機洗滌化學發(fā)光板3次，拍干；然后，每孔加入350μ L封閉液，37°C孵育2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37°C烘干后，用錫箔紙真空密封，4°C保存；將化學發(fā)光板從4°C中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50 μ L將系列標準樣品溶液和待測樣品加入化學發(fā)光板，各設3孔重復，然后依次加入各50 μ L酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混勻，37°C孵育45min ;傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入100 μ L化學發(fā)光液，混勻，盡快測定各孔發(fā)光值。
[0014]封閉液是5%的脫脂奶粉；DES_McAb稀釋為0.2 μ g/mL ;系列標準樣品溶液的濃度為 O μ g/L,0.001 μ g/L,0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;包被液是 ρΗ9.6
的碳酸鹽緩沖液。
[0015]己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒，包括包被有DES-OVA的化學發(fā)光板、DES系列標準樣品溶液、DES-McAb工作液、濃縮洗滌液、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化學發(fā)光液；包被抗原(DES-OVA)為DES與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物；DES系列標準樣品溶液為7個濃度梯度，分別是O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;濃縮洗滌液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐溫-200.50mL，加水定容至IOOmL制成；化學發(fā)光液來自超敏ECL化學發(fā)光試劑盒 P0018 — BeyoECL Plus。
[0016]上述試劑盒在動物源性食品中己烯雌酚殘留檢測中的應用。
[0017]己烯雌酚單克隆抗體，按以下操作制備:以己烯雌酚與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(DES-BSA)作為免疫原，免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，按照常規(guī)方法進行細胞融合和陽性株的篩選，對篩選出的陽性細胞株連續(xù)克隆3次，經(jīng)過鑒定、凍存和建株后，進行腹水的制備，然后通過純化腹水，獲得能特異性識別己烯雌酚的單克隆抗體。
[0018]上述己烯雌酚單克隆抗體，按以下操作制備::
[0019]〈1>動物免疫
[0020]將健康的6周齡雌性BALB/c小鼠通過基礎免疫和5次加強免疫后，對效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫；
[0021]〈2>細胞融合和克隆篩選
[0022]沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，融合小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞，融合后的細胞懸液加至已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞；
[0023]待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準確吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶標板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100 %時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力；
[0024]<3>細胞凍存與復蘇
[0025]用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中
培養(yǎng)；
[0026]〈4>腹水的制備與純化
[0027]采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，即得DES-McAb。
[0028]本發(fā)明首次探討了檢測己烯雌酚殘留的一步式化學發(fā)光酶免疫機理，發(fā)明人結合了免疫反應和化學發(fā)光技術，在不需要另外制備酶標單克隆抗體的情況下，將傳統(tǒng)兩步式化學發(fā)光酶免疫分 析法簡化為一步，成功建立了一步式己烯雌酚化學發(fā)光酶免疫分析檢測法及試劑盒。本發(fā)明“一步法”的線性檢測范圍(0.001~100 μ g/L)寬，最低檢測限(0.006 μ g/L)低，試劑盒的 IC50 為 0.50 μ g/L,回收率為 72.43 ~113.62%，與英國 Randox雌酚類酶聯(lián)免疫試劑盒(產(chǎn)品編號:SJ2152)的陰陽性符合率為100%，適合用于己烯雌酚的痕量分析與批量檢測，特別適合應用于檢測動物源性食品中己烯雌酚的殘留。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為實施例2己烯雌酚殘留一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法的標準曲線。
[0030]圖中:X軸為己烯雌酚梯度濃度標準樣品濃度的對數(shù)值；Y軸為各濃度己烯雌酚標準樣品的發(fā)光值除以“O”濃度孔發(fā)光值(RLU/RULc^ )。
【具體實施方式】
[0031]實施例1己烯雌酚單克隆抗體(DES-McAb)的制備
[0032]1.1動物免疫
[0033]以己烯雌酚與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(DES-BSA)作為免疫原，對健康的6周齡雌性BALB/c小鼠McAb進行基礎免疫和5次加強免疫后，測定血清效價和IC5tl，選取效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫；
[0034]1.2細胞融合和克隆篩選
[0035]沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，融合小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞，融合后的細胞懸液加至已事先鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞；
[0036]待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準確吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶標板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100%時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，命名為3E8，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力；
[0037]1.3細胞凍存與復蘇
[0038]用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中
培養(yǎng)；
[0039]1.4腹水的制備與純化
[0040]采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7_14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水分別用飽和硫酸銨法和親和層析法進行純化，即得 DES-McAb。
[0041]1.5單克隆抗體的鑒定
[0042]1.5.1雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及純化后抗體效價的測定
[0043]采用間接ELISA方法，測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中DES-McAb的效價為1:512，親和層析純化后的腹水效價達到1:1X 105，蛋白含量為10mg/mL。
[0044]1.5.2親和力的測定
[0045]通過非競爭ELISA，分別以OD450值為縱坐標，以DES-MAb的濃度為橫坐標，繪制親和曲線，以公式I計算不同抗原包被濃度下的親和常數(shù)，取平均值得出DES-McAb的親和常數(shù)(Ka)為 1.2 X109L/moI .
【權利要求】
1.一種己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于包括以下步驟: <1>處理待測樣品； <2>將半抗原己烯雌酚與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物DES-OVA作為抗原包被于發(fā)光固相載體，封閉后，依次加入系列標準樣品或經(jīng)前處理的待測樣品、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚單克隆抗體DES-McAb進行反應，然后再加入化學發(fā)光液，測定系列標準樣品和待測樣品的發(fā)光值； <3>以步驟〈2>測得的發(fā)光值計算抑制率，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線的回歸方程和待測樣品的抑制率計算待測樣品中己烯雌酚的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于: 步驟〈1>按以下操作進行:取5g組織樣品加入IOmL叔丁基甲基醚，劇烈震蕩5min后，超聲提取IOmin, 3000g/min離心10min,移出上清液后，用IOmL叔丁基甲基醚重復提取沉淀物，將兩次的上清液合并，吹干，用ImL甲醇溶液溶解，再用3mL石油醚洗滌甲醇溶液；蒸發(fā)甲醇，用ImL 二氯甲烷溶解后，再用3mLlN NaOH溶液提取，最后，用300 μ L磷酸中和提取液，用于檢測； 步驟〈2>按以下操作進行:用包被液將抗原稀釋成0.5 μ 8/!111^每孔加入10(^ L,4°C孵育過夜，傾去包被液，用洗板機洗滌化學發(fā)光板3次，拍干；然后，每孔加入350 μ L封閉液，37°C孵育2h，傾去封閉液，用洗板機洗滌3次，拍干；37°C烘干后，用錫箔紙真空密封，4°C保存；將化學發(fā)光板從4°C中取出，待溫度平衡至室溫，按照每孔50 μ L將系列標準樣品溶液和待測樣品加入化學發(fā)光板，各設3孔重復，然后依次加入各50 μ L酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb，混勻，37°C孵育45min ;傾去液體，用洗板機洗滌5次，拍干；每孔中加入IOOyL化學發(fā)光液，混勻，盡快測定各孔發(fā)光值。
3.根據(jù)權利要求2所述的己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測法，其特征在于:所述封閉液是5%的脫脂奶粉；所述DES-McAb稀釋為0.2 μ g/mL ;所述系列標準樣品溶液的濃度為 0μ g/L、0.001μ g/L、0.01μ g/L、0.1μ g/L、ly g/L、10y g/L、100y g/L ;所述包被液是PH9.6的碳酸鹽緩沖液。
4.一種己烯雌酚一步式化學發(fā)光酶免疫分析檢測試劑盒，其特征在于包括包被有DES-OVA的化學發(fā)光板、DES系列標準樣品溶液、DES-McAb工作液、濃縮洗滌液、酶標二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化學發(fā)光液；所述包被抗原DES-OVA為DES與載體蛋白卵清蛋白的偶聯(lián)物；所述DES系列標準樣品溶液為7個濃度梯度，分別是O μ g/L、0.001 μ g/L、0.01 μ g/L、0.1 μ g/L、I μ g/L、10 μ g/L、100 μ g/L ;所述濃縮洗滌液由 NaC18.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4.12H202.90g、KC10.20g、吐溫-200.50mL，加水定容至 IOOmL 制成；所述化學發(fā)光液來自超敏ECL化學發(fā)光試劑盒P0018— BeyoECL Plus。
5.權利要求4所述試劑盒在動物源性食品中己烯雌酚殘留檢測中的應用。
6.一種己烯雌酚單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備:以己烯雌酚與載體蛋白牛血清白蛋白的偶聯(lián)物DES-BSA作為免疫原，免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，按照常規(guī)方法進行細胞融合和陽性株的篩選，對篩選出的陽性細胞株連續(xù)克隆3次，經(jīng)過鑒定、凍存和建株后，進行腹水的制備，然后通過純化腹水，獲得能特異性識別己烯雌酚的單克隆抗體。
7.根據(jù)權利要求6所述的己烯雌酚單克隆抗體，其特征在于按以下操作制備:: 〈1>動物免疫將健康的6周齡雌性BALB/c小鼠通過基礎免疫和5次加強免疫后，對效價最高、競爭性最強的小鼠進行沖擊免疫； <2>細胞融合和克隆篩選 沖擊免疫3天后，摘除小鼠眼球放血后處死，收集血液、無菌取脾臟，融合小鼠免疫脾細胞與Sp2/0細胞，融合后的細胞懸液加至已鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，采用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞； 待細胞生長至培養(yǎng)孔面積1/10時，無菌準確吸取100 μ L上清，加至已包被抗原DES-OVA的酶標板內(nèi)；以間接ELISA法測細胞培養(yǎng)上清效價，采用有限稀釋法對陽性細胞連續(xù)克隆3次，直至陽性率為100%時，對細胞株進行擴大培養(yǎng)、鑒定、凍存和建株，對鑒定后細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)傳代2個月以上，每隔5代檢測其穩(wěn)定性和抗體分泌能力； <3>細胞凍存與復蘇 用凍存液將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞制成細胞懸液，分裝于凍存管，置于液氮中保存；復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液，移入細胞瓶中培養(yǎng); <4>腹水的制備與純化 采用體內(nèi)誘生法，將滅菌石蠟油注入8周齡Balb/c小鼠腹腔，7-14天后注入雜交瘤細胞，7-10天后收集腹水；收集的腹水用飽和硫酸銨法進行初純后，再用親和層析法進一步純化，即得DES-McAb。
【文檔編號】C07K16/44GK103954780SQ201410180431
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權日:2014年4月28日
【發(fā)明者】吳健敏, 馬玲, 張啟模, 韋建興, 張怡軒, 白安斌, 陳鳳蓮, 覃紹敏, 林俊, 劉金鳳, 饒桂波 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所