專利名稱：一種測(cè)定阿巴芬凈含量和雜質(zhì)的高效液相色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及阿巴芬凈與其雜質(zhì)的分離測(cè)定。具體涉及色譜柱和 流動(dòng)相的優(yōu)化條件，從而實(shí)現(xiàn)用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定阿巴芬凈原料或其制劑中阿 巴芬凈的含量和雜質(zhì)，達(dá)到控制阿巴芬凈原料藥及其制劑質(zhì)量的目的。
背景技術(shù)：
阿巴芬凈是氨基噻唑類抗真菌藥物，它的適應(yīng)癥包括指(趾)甲真菌病、陰道念珠
菌病、外陰陰道炎(特別是在細(xì)菌巻入時(shí))，各種皮膚細(xì)菌性皮炎和某些可能的痤瘡。其結(jié)
構(gòu)式為
化學(xué)名為N-[4-[2-(2，4-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]_1， 4， 5， 6_四 氫_2-嘧啶胺。在合成該化合物的過程中，起始原料2， 4-二甲酚中含有少量的鄰甲酚、對(duì)甲 酚、2，6-二甲酚、3，5-二甲酚，參與反應(yīng)最終成為反應(yīng)副產(chǎn)物(即通常藥品質(zhì)量控制中的雜 質(zhì))，這些反應(yīng)副產(chǎn)物的性質(zhì)與阿巴芬凈極為相似，分離難度大，質(zhì)量難以控制，可能會(huì)由于 去除不完全而影響藥物的純度和質(zhì)量。阿巴芬凈合成過程中由起始原料引入的反應(yīng)副產(chǎn)物 主要有四個(gè)，分別是N- [4- [2- (2-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1 ， 4， 5， 6-四氫-2-嘧啶 胺(簡(jiǎn)稱雜質(zhì)A)，N-[4-[2-(4-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-l，4，5，6-四氫-2-嘧啶胺 (簡(jiǎn)稱雜質(zhì)B)，N-[4-[2-(2，6-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氫_2_嘧 啶胺(簡(jiǎn)稱雜質(zhì)C)， N-[4-[2-(3，5-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四 氫-2-嘧啶胺(簡(jiǎn)稱雜質(zhì)D);反應(yīng)過程中在強(qiáng)堿作用下醚鍵斷裂生成少量N-[4-(2-羥 基-苯基)-2-噻唑基]-l，4，5，6-四氫-2-嘧啶胺(簡(jiǎn)稱雜質(zhì)E)。它們的結(jié)構(gòu)式分別為
雜質(zhì)A
雜質(zhì)B
3
雜質(zhì)C
雜質(zhì)D 雜質(zhì)E 因此，實(shí)現(xiàn)阿巴芬凈及反應(yīng)副產(chǎn)物的有效分離在阿巴芬凈的合成和制劑過程的質(zhì) 量控制方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 在分析方法的研究過程中，曾試用Inertsil 0DS_2、 Inertsil 0DS_3、 ZORBAX SB-C18、 EclipseXDB-C18等色譜柱，選擇了不同的緩沖溶液體系，但阿巴芬凈的峰形很差 (峰對(duì)稱因子均小于0.5)，且阿巴芬凈與反應(yīng)副產(chǎn)物(雜質(zhì)C、雜質(zhì)D)難以有效分離。經(jīng) 反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18， 250mmX 4. 6mm， 5 ii m)，采用乙腈-甲醇-二乙胺緩沖溶液(1%， V/V，磷酸調(diào) 節(jié)pH至7.5) = 50 : 25 : 25為流動(dòng)相，可以將阿巴芬凈及其雜質(zhì)進(jìn)行有效分離，從而可 以準(zhǔn)確控制阿巴芬凈原料藥及制劑的質(zhì)量。本發(fā)明的方法能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地分析阿巴芬 凈的純度和含量并能有效的控制其雜質(zhì)。 本發(fā)明的目的在于提供一種分離測(cè)定阿巴芬凈或其雜質(zhì)的高效液相色譜方法，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)阿巴芬凈原料藥及制劑的質(zhì)量控制。 本發(fā)明的一種測(cè)定阿巴芬凈或其制劑中雜質(zhì)和含量的高效液相色譜方法，包括將 含阿巴芬凈的供試品溶液，注入到色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱的色譜儀中，進(jìn)行分 離檢測(cè)阿巴芬凈的含量或其有關(guān)的雜質(zhì)，其中，流動(dòng)相為有機(jī)溶劑和緩沖溶液的混合物，檢 測(cè)器為紫外檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器。 在上述的流動(dòng)相中，有機(jī)溶劑與緩沖溶液的體積比為60 : 40 85 : 15，優(yōu)選 80 : 20 65 : 35，最優(yōu)選75 : 25 ;其中，所述的有機(jī)溶劑為乙腈、甲醇或乙腈與甲醇的混
合溶液，優(yōu)選乙腈與甲醇的混合溶液，其體積比為4 : i i : 3，優(yōu)選體積比為2 : i ;所 述的緩沖液由堿性物質(zhì)和酸性物質(zhì)組成，其中堿性物質(zhì)為三乙胺、二乙胺或其混合物，優(yōu) 選二乙胺；酸性物質(zhì)為磷酸。所說的緩沖液，當(dāng)堿性物質(zhì)分別為三乙胺、二乙胺時(shí)，其緩沖液
分別稱為三乙胺緩沖液和二乙胺緩沖液，其中，二乙胺緩沖液的濃度為0. 1% 2% (V/V)， 優(yōu)選1 % (V/V)，緩沖液的pH值為6. 0 9. 0，優(yōu)選pH值為7. 0 8. 0，更優(yōu)選pH值為7. 5。
本發(fā)明所述的用高效液相色譜法分離測(cè)定阿巴芬凈及其制劑的含量和雜質(zhì)的方 法，優(yōu)選的色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18， 250mmX4.6mm，5iim)，更優(yōu)選的色譜柱為ZORBAX Extend C18或Crest Premium C18柱
發(fā)明內(nèi)容
上述所說的液相色譜法是指高效液相色譜法或是高效液相色譜法與質(zhì)譜法聯(lián)合 應(yīng)用。 在具體實(shí)施方案中，所述的本發(fā)明的液相色譜方法，包括將含阿巴芬凈的供試 品溶液，注入到色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠的色譜儀中，進(jìn)行分離檢測(cè)阿巴芬凈的
含量或其有關(guān)的雜質(zhì)，流動(dòng)相為乙腈甲醇二乙胺緩沖溶液的混合溶液，其比值為
50 : 25 : 25，緩沖液為含二乙胺的水溶液，二乙胺濃度為1% (V/V)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5。
本發(fā)明的方法，用于適用于阿巴芬凈的原料藥的分離測(cè)定，也適用于含有阿巴芬
凈的組合物如制劑中阿巴芬凈或其有關(guān)物質(zhì)(雜質(zhì))的分離測(cè)定，特別是與阿巴芬凈結(jié)構(gòu)
相似的雜質(zhì)的分離，如N-[4-[2- (2-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1 ， 4， 5， 6-四氫-2-嘧 啶胺(雜質(zhì)A)， N-[4-[2-(4-甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-l，4，5，6-四氫-2-嘧啶胺 (雜質(zhì)B)， N-[4-[2-(2，6-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氫_2_嘧啶胺 (雜質(zhì)C)， N-[4-[2-(3，5-二甲基苯氧基)苯基]-2-噻唑基]-1，4，5，6-四氫_2_嘧啶胺 (雜質(zhì)D)。 上述本發(fā)明的方法，還進(jìn)一步包括以下過程 (1)配制流動(dòng)相；取乙腈或/和甲醇與二乙胺緩沖液按一定體積比混合而得，用磷 酸調(diào)pH范圍6. 0 9. 0，優(yōu)選pH值為7. 5 ; (2)取阿巴芬凈樣品適量，用甲醇溶解樣品并用流動(dòng)相稀釋制成每lmL中含阿巴 芬凈0. 05 5. 0mg的供試品溶液，優(yōu)選0. 2mg/ml ;若為含阿巴芬凈制劑樣品，則用相應(yīng)的 樣品預(yù)處理方法制備成每lmL中含阿巴芬凈0. 05 5. 0mg供試品溶液，優(yōu)選0. 2mg/ml。
(3)設(shè)置流動(dòng)相流速為0. 5 2. 0ml/min，優(yōu)選為1. OmL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 250nm，優(yōu)選為240nm ;柱溫為室溫至4(TC，優(yōu)選室溫。 (4)取供試品溶液5 50y L注入液相色譜儀，完成阿巴芬凈與其它雜質(zhì)的分離與 檢測(cè)。 本發(fā)明的方法，在有機(jī)溶液與緩沖溶液的體積比為60 : 40 85 : 15，優(yōu)選 80 : 20 65 : 35，最優(yōu)選75 : 25的條件下，阿巴芬凈與其類似物雜質(zhì)容易被分離，并得 到有效的檢測(cè)，有利于阿巴芬凈的產(chǎn)品的質(zhì)量控制。


圖1、實(shí)施例1的HPLC圖，圖中1號(hào)峰為雜質(zhì)E，2號(hào)峰為雜質(zhì)A、 B的合峰，3號(hào)峰 為雜質(zhì)C、D的合峰，4號(hào)峰為阿巴芬凈，在該條件下阿巴芬凈主峰可以和類似物雜質(zhì)完全分離。 圖2、實(shí)施例2的HPLC圖，圖中1號(hào)峰為雜質(zhì)E， 2號(hào)峰為雜質(zhì)A、 B的合峰，3號(hào)峰 為雜質(zhì)C、D的合峰，4號(hào)峰為阿巴芬凈，在該條件下阿巴芬凈主峰和相鄰雜質(zhì)峰的分離度為 1. 02。 圖3、實(shí)施例4的HPLC圖，圖中1號(hào)峰為雜質(zhì)E， 2號(hào)峰為雜質(zhì)A、 B的合峰，3號(hào)峰 為雜質(zhì)C、 D的合峰，4號(hào)峰為阿巴芬凈。 圖4、實(shí)施例5的HPLC圖，圖中1號(hào)峰為雜質(zhì)E、2號(hào)峰為雜質(zhì)A， 3號(hào)峰為雜質(zhì)B， 4 號(hào)峰為雜質(zhì)C，5號(hào)峰為雜質(zhì)D，6號(hào)峰為阿巴芬凈。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步解釋本明發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的范圍。
5
實(shí)施例1 高效液相色譜儀Agilent 1100LC色譜柱ZORBAX Extend C18， 4. 6mmX 250mrn， 5 ii m 流動(dòng)相乙腈_甲醇_ 二乙胺緩沖液(1 %， V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至7. 5)=
50 : 25 : 25 流速1.0ml/min 檢測(cè)波長(zhǎng)；240nm 柱溫室溫 進(jìn)樣體積20iiL 實(shí)施步驟 分別取雜質(zhì)A、 B、 C、 D、 E約5mg，阿巴芬凈對(duì)照品約lOmg，置50ml量瓶中，加甲醇 適量超聲處理使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。另分別稱取單一雜 質(zhì)及阿巴芬凈約5mg，分別置6個(gè)50ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理使溶解，用流動(dòng)相稀釋 至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)定性的對(duì)照溶液。 分別取各對(duì)照溶液和混合樣品溶液，按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色 譜圖。結(jié)果見附圖1。
實(shí)施例2 流動(dòng)相乙腈-二乙胺緩沖液(1 % ， V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至7. 5) = 80 : 20
其它條件同實(shí)施例l。
實(shí)施步驟 取實(shí)施例1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖。結(jié)果見附圖2。
實(shí)施例3 流動(dòng)相乙腈-二乙胺緩沖液(1 % ， V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至7. 5) = 60 : 40
其它條件同實(shí)施例l。
實(shí)施步驟 取實(shí)施例1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖。結(jié)果見附圖4。
實(shí)施例4 流動(dòng)相乙腈-甲醇(2 : 1，V/V)-二乙胺緩沖液(1^，V/V，磷酸調(diào)節(jié)pH至7.5) =60 : 40 其它條件同實(shí)施例l。
實(shí)施步驟 取實(shí)施例1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜 圖。結(jié)果見附圖5。
實(shí)施例5色i普柱Crest Premium C18， 4. 6mmX 250mm， 5 u m
其它條件同實(shí)施例l。
實(shí)施步驟
6
取實(shí)施例1項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜
圖。結(jié)果阿巴芬凈保留時(shí)間為19.832分鐘，雜質(zhì)C與D的合峰保留時(shí)間為19.090分鐘，雜
質(zhì)A與B的合峰保留時(shí)間為16. 310分鐘，雜質(zhì)E的保留時(shí)間為3. 431分鐘，阿巴芬凈與相
鄰雜質(zhì)C與D的合峰的分離度為1. 84。 實(shí)施例6 條件同實(shí)施例l。 實(shí)施步驟 稱取阿巴芬凈乳膏適量(約相當(dāng)于阿巴芬凈20mg)，置小燒杯中，加入甲醇20ml， 于8(TC的水浴中加熱2分鐘，并充分?jǐn)嚢枋拱头覂羧芙?，用甲醇轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加 流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻；在ot:的冰浴中放置IO分鐘，取出，轉(zhuǎn)入離心管中，離心(轉(zhuǎn)速為 3500轉(zhuǎn))10分鐘，取上清液用0. 45 ii m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄 色譜圖。阿巴芬凈保留時(shí)間為20. 421分鐘，阿巴芬凈與相鄰雜質(zhì)C與D的合峰的分離度為 1. 94。
權(quán)利要求
一種分離測(cè)定阿巴芬凈或其雜質(zhì)和含量的高效液相色譜方法，其特征在于將含阿巴芬凈的供試品溶液，注入到色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱的色譜儀中，進(jìn)行分離測(cè)定阿巴芬凈的含量或其有關(guān)的雜質(zhì)，其中，流動(dòng)相為有機(jī)溶劑和緩沖溶液的混合物，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所說的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱為Z0RBAX Extend C18或Crest Premium C18柱。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所說的流動(dòng)相，其有機(jī)溶液與緩沖溶液的 體積比為60 : 40 85 : 15。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，有機(jī)溶液與緩沖溶液的體積比為80 : 20 65 : 35， 優(yōu)選75 : 25。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的方法，其特征在于所述的有機(jī)溶液為乙腈、甲醇，或 乙腈與甲醇的混合溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述的乙腈與甲醇的體積比為4 : i i : 3，優(yōu)選體 積比為2 : i。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的方法，其特征在于所述的緩沖液由堿性物質(zhì)和酸 性物質(zhì)組成，其中、堿性物質(zhì)為三乙胺、二乙胺或其混合物，優(yōu)選二乙胺，酸性物質(zhì)為磷酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的緩沖液，其特征為緩沖液的pH值為6. 0 9. 0的，優(yōu)選pH 值為7.5。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的緩沖液，其特征為三乙胺或二乙胺緩沖液的濃度為0. 1% 2% (V/V)，優(yōu)選1% (V/V)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于進(jìn)一步包括以下幾個(gè)步驟(1) 配制流動(dòng)相；(2) 取阿巴芬凈樣品適量，用甲醇溶解樣品并用流動(dòng)相稀釋制成每lmL中含阿巴芬凈 0. 05 5. Omg的供試品溶液；若為含阿巴芬凈制劑樣品，則用相應(yīng)的樣品預(yù)處理方法制備 成每lml中含阿巴芬凈0. 05 5. Omg供試品溶液。(3) 設(shè)置流動(dòng)相流速為0. 5 2. Oml/min，優(yōu)選為1. Oml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為220 250nm， 優(yōu)選為240nm ;柱溫為室溫至4(TC，優(yōu)選室溫。(4) 取供試品溶液5 50iU注入液相色譜儀，完成阿巴芬凈與其它雜質(zhì)的分離與檢
全文摘要
本發(fā)明為一種高效液相色譜(HPLC)法分離測(cè)定阿巴芬凈(Abafungin)及其制劑的含量和雜質(zhì)的方法，涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。其技術(shù)方案為樣品用適當(dāng)預(yù)處理方法制備成供試品溶液，以乙腈-甲醇-緩沖液為流動(dòng)相，在十八烷基硅烷鍵合硅膠柱上將主成分阿巴芬凈和有關(guān)的雜質(zhì)進(jìn)行分離，用紫外檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。此方法可以有效地分離測(cè)定阿巴芬凈及其制劑中的雜質(zhì)，特別是可將阿巴芬凈與幾種類似物雜質(zhì)分離，并可準(zhǔn)確測(cè)定阿巴芬凈及其制劑的含量。該方法可用于控制阿巴芬凈及其制劑的質(zhì)量，方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)G01N30/60GK101762651SQ20081023332
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者付曉泰, 易中宏, 林蒙, 樊斌, 羅杰 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司