專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)，特別是一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)行的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法是鱟試驗(yàn)法。鱟試驗(yàn)法需要使用鱟試劑(TAL或LAL)，而生產(chǎn)鱟試劑需要消耗珍貴的鱟資源。在我國(guó)，鱟資源已瀕臨枯竭。目前尚沒(méi)有更成熟的或更好的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法能夠取代鱟試驗(yàn)法。如果由于鱟資源的枯竭而導(dǎo)致鱟試劑供應(yīng)緊缺，對(duì)我國(guó)的醫(yī)藥工業(yè)將是災(zāi)難性的打擊。在尚沒(méi)有更好的替代方法的今天，研究一種消耗資源更少的鱟試驗(yàn)法具有重要和實(shí)際的意義?！吨袊?guó)藥典》2005年版收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)(BET)方法分類(lèi)如下-工限量法凝膠法i半定量法BET方法j光度法<L顯色"動(dòng)態(tài)顯色法L終點(diǎn)顯色法上述BET方法的鱟試劑(TAL)用量，凝膠法是每反應(yīng)試管100^1，光度法是每反應(yīng)試管或每反應(yīng)孔50~10(Hil。以下稱(chēng)每反應(yīng)管(或孔)的TAL用量為每單個(gè)試驗(yàn)用量，以pl/T表示(T為T(mén)est的縮寫(xiě))，如凝膠法TAL用量為100fil/T，光度法TAL用量為50100nl/T。終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)的原理是人工合成一種顯色基質(zhì)，通常是一種寡肽(三肽或四肽)，肽鏈的末端連接一個(gè)顯色基團(tuán)對(duì)硝基苯胺(pNA)。當(dāng)TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生凝固酶時(shí)，凝固酶能水解顯色基質(zhì)的肽鍵使pNA分離，游離的pNA使溶液呈黃色。用光度儀測(cè)定溶液的光度值可以建立內(nèi)毒素濃度與光度值的線性關(guān)系。反應(yīng)過(guò)程示意如下-a必a「動(dòng)態(tài)濁度法廣濁度法jL終點(diǎn)濁度法內(nèi)毒素TAL~~^凝固酶凝固酶顯色基質(zhì)~L^肽+pNA(黃色)現(xiàn)行終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟如下(以下步驟所描述的過(guò)程是指每反應(yīng)試管或每反應(yīng)孔的試驗(yàn)過(guò)程)(1)用水分別復(fù)溶凍干的TAL和顯色基質(zhì)。(2)50plTAL+5(^1樣品_11^_^反應(yīng)5~30分鐘(3)加入顯色基M~~^~~^反應(yīng)5~30分鐘(4)加入10(^1反應(yīng)終止液終止反應(yīng)(5)用光度儀測(cè)讀反應(yīng)混合溶液(共300ijI)的光度值(6)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸分析
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是改進(jìn)現(xiàn)行的終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)，減少BET的TAL耗量，提供一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，該方法使用一種用塑料制作的96孔微孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器，使用微量的鱟試劑(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)。所述96孔微孔酶標(biāo)板外周尺寸及各孔中心位置與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)(AmericanNationalStandardsInstitute,ANSI)及生物分子篩選學(xué)會(huì)(SocietyforBiomolecularScreening,SBS)標(biāo)準(zhǔn)ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figure1-Wdlpositionsofa96wellmicroplate的酶標(biāo)板(microplate)的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔的直徑為①3.(K5.0mm，孔深為712mm。所述96孔微孔酶標(biāo)板可用作所有光度法鱟試驗(yàn)的反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器，包括濁度法和顯色法鱟試驗(yàn)。所述孔的最佳尺寸為直徑為04.(K4.4mm，孔深為10mm。一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其步驟如下(以下步驟所描述的過(guò)程是指每單個(gè)孔的試驗(yàn)過(guò)程)(1)用水復(fù)溶凍干的顯色基質(zhì)，用顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶凍干的鱟試劑，使復(fù)溶后的鱟試劑含有顯色基質(zhì)；(2)取1040iJl含有顯色基質(zhì)的鱟試劑加入96孔微孔酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，另加入等量的樣品(水、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素或供試品)，混勾，置適宜溫度(通常是37t:)反應(yīng)一定的時(shí)間(通常是530分鐘)；(3)當(dāng)反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的時(shí)間，另加入一定量的反應(yīng)終止液(通常是鱟試劑量的兩倍)去終止該反應(yīng)；(4)把96孔微孔酶標(biāo)板放入光度儀/酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度值(OD)，對(duì)數(shù)據(jù)作回歸分析并計(jì)算供試品的內(nèi)毒素含量。所述微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法-(1)鱟試驗(yàn)使用96孔微孔酶標(biāo)板作反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器；(2)使用顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶鱟試劑，使鱟試劑溶液含有顯色基質(zhì)；(3)鱟試劑用量為10^4(Hd/T;(4)顯色基質(zhì)存在于反應(yīng)全過(guò)程。本發(fā)明的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法消耗的TAL量?jī)H是現(xiàn)行鱟試驗(yàn)方法的10~20%，即1(K20nl/T，而且實(shí)驗(yàn)操作更簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明的部分內(nèi)容同樣可以應(yīng)用到其它光度法鱟試驗(yàn)，使TAL的用量減少8(K900/。。本發(fā)明從如下兩方面進(jìn)行探索研究，以達(dá)到減少TAL用量之目的-1.反應(yīng)容器現(xiàn)行顯色法鱟試驗(yàn)使用的反應(yīng)容器是一種用塑料制作的，有96個(gè)孔，孔徑(D6.4^6.7mm，孔深10mm的標(biāo)準(zhǔn)微孔板(microplate,也稱(chēng)酶標(biāo)板或細(xì)胞培養(yǎng)板)。反應(yīng)孔結(jié)構(gòu)及尺寸與TAL用量有極大關(guān)系。1)一般認(rèn)為，只要減少被測(cè)溶液的體積，就可以相應(yīng)減少TAL的用量。這只是一種簡(jiǎn)單的直覺(jué)。光度法測(cè)定的原理是基于被測(cè)量參數(shù)(如內(nèi)毒素濃度C)與光度值的相關(guān)性。簡(jiǎn)單地減少被測(cè)溶液的體積會(huì)影響到被測(cè)參數(shù)與光度值的相關(guān)性。根據(jù)吸光度公式A=8LC,要保證光度值(A)對(duì)被測(cè)參數(shù)(C)的變化有足夠的敏感性，被測(cè)溶液必須維持一定的深度(L，即透射光程)。以標(biāo)準(zhǔn)微孔板為例，如果想減少被測(cè)溶液的體積，又要不影響C與A的相關(guān)性，就要保持大致的溶液深度L。要使體積減少而深度不變，只能通過(guò)縮小反應(yīng)孔的孔徑①去實(shí)現(xiàn)。為此，本發(fā)明的96孔微孔酶標(biāo)板的孔徑只有O)3.05.0mm。根據(jù)公式V=r2nh，lOOpl的反應(yīng)混合液(50(JlTAL+50yl樣品)在標(biāo)準(zhǔn)微孔板上達(dá)到的液深為2.86mm，而同樣的液深在(D3.0mm的特制微孔板上只需20pl反應(yīng)混合液就可以達(dá)到。20jj1的反應(yīng)混合液只需要lOpl的TAL。2)最小孔徑雖然反應(yīng)孔徑越小節(jié)省TAL越多，但確定最小孔徑值時(shí)必須考慮如下因素(1)光度儀的透射光束直徑光度儀的投射光束直徑通常在O2.0mm左右，因此反應(yīng)孔徑的最小值理論上應(yīng)不小于2.0mm，否則投射光會(huì)打在反應(yīng)孔的邊緣，影響光度值測(cè)量的準(zhǔn)確性。(2)實(shí)驗(yàn)操作的適用程度反應(yīng)孔徑太小，會(huì)增加實(shí)驗(yàn)操作的難度。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)比較，反應(yīng)孔徑在0)35mm，孔深在7~12mm較適宜。3)反應(yīng)孔位置現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板適合絕大多數(shù)的光度儀/酶標(biāo)儀使用。為了提高本發(fā)明的適用性，本發(fā)明的96孔微孔酶標(biāo)板，各孔的圓心位置及板的周邊尺寸與美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板[1]完全相同。這意味著凡適用標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板的光度儀/酶標(biāo)儀都適用本發(fā)明的96孔微孔酶標(biāo)板。本發(fā)明的96孔微孔酶標(biāo)板的結(jié)構(gòu)及尺寸見(jiàn)圖1。2.實(shí)驗(yàn)方法學(xué)本發(fā)明大幅度減少TAL的用量，要使內(nèi)毒素檢測(cè)所依據(jù)的酶促反應(yīng)至少保持原有的特性(靈敏度、反應(yīng)速度以及抗干擾能力)，還需要改進(jìn)實(shí)驗(yàn)的方法?，F(xiàn)行的顯色鱟試驗(yàn)方法分為動(dòng)態(tài)法和終點(diǎn)法兩種，主要區(qū)別如下動(dòng)態(tài)法終點(diǎn)法內(nèi)驗(yàn)鵬Q"^gjMSTT)內(nèi)驗(yàn)喊C)JM^像OD)分另蛉肺梟分另鵬娜含顯^^TAL繊力瞎fflfp口口^S^娜tal娜瞎fifR賺液<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>特征①顯色基質(zhì)存在于反應(yīng)全過(guò)程①顯色基質(zhì)在反應(yīng)后過(guò)程才加入?yún)⑴c反應(yīng)②靈敏度高②靈敏度相對(duì)低實(shí)驗(yàn)操作方便繁瑣制備技術(shù)要求高較低制備成本高較低終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)的靈敏度一般為0.1EU/mL，而動(dòng)態(tài)顯色法鱟試驗(yàn)的靈敏度可達(dá)0.005甚至0.001EU/mL。動(dòng)態(tài)法鱟試驗(yàn)靈敏度高的原因主要有兩個(gè)一是反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)；二是顯色基質(zhì)始終存在于反應(yīng)的全過(guò)程。動(dòng)態(tài)法的試劑制備是把顯色基質(zhì)與TAL混合在一起冷凍干燥而成。這種制備方法對(duì)TAL和顯色基質(zhì)的純度要求以及制備技術(shù)要求非常高，因而制備成本也相對(duì)高。使用時(shí)，用水復(fù)溶凍干的TAL，TAL溶液就已經(jīng)含有顯色基質(zhì)。當(dāng)TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)把TAL中的凝固酶原激活成凝固酶時(shí)，凝固酶能馬上水解溶液中的顯色基質(zhì)，使其釋放出顯色基團(tuán)pNA。這就是動(dòng)態(tài)顯色法鱟試驗(yàn)靈敏度高的重要原因之一。終點(diǎn)顯色法試劑的制備方法是把TAL與顯色基質(zhì)分開(kāi)凍干。這樣對(duì)TAL原料和顯色基質(zhì)的要求相對(duì)低，制備技術(shù)也較簡(jiǎn)單，因而制備成本也較低。使用時(shí)要用水分別復(fù)溶TAL和顯色基質(zhì)，先用TAL與樣品反應(yīng)，樣品中的內(nèi)毒素使TAL的凝固酶原激活成凝固酶。反應(yīng)過(guò)一段時(shí)間后，才加入顯色基質(zhì)，讓溶液中的凝固酶水解顯色基質(zhì)釋放出顯色基團(tuán)pNA。這種分段反應(yīng)的方式使得終點(diǎn)法的靈敏度、反應(yīng)速度以及抗干擾能力均遜于連續(xù)反應(yīng)方式的動(dòng)態(tài)法。此外，分段反應(yīng)方式還使得實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，增加了影響實(shí)驗(yàn)精確性的因素。正是終點(diǎn)法的這些缺陷導(dǎo)致了該方法的應(yīng)用日漸式微，在今天終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)已幾乎退出市場(chǎng)，取而代之的是動(dòng)態(tài)法鱟試驗(yàn)。本發(fā)明選擇顯色法作為研究對(duì)象，是因?yàn)轱@色法鱟試驗(yàn)使用顯色基質(zhì)參與反應(yīng)，替代了TAL的部分功能。而顯色基質(zhì)是一種人工合成的寡肽，不存在資源問(wèn)題。本發(fā)明選擇終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)作為研究改進(jìn)的對(duì)象，是因?yàn)榻K點(diǎn)法不需要?jiǎng)討B(tài)法所必需的較昂貴的光度儀，使本發(fā)明易于推廣。但是，本發(fā)明要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是在大幅度減少TAL用量的條件下，如何使鱟試驗(yàn)保持足夠的靈敏度、反應(yīng)速度以及抗干擾能力。本發(fā)明分析了動(dòng)態(tài)顯色法鱟試驗(yàn)具有較好性能的原因，認(rèn)為關(guān)鍵在于動(dòng)態(tài)法采用的是連續(xù)反應(yīng)方式，顯色基質(zhì)始終存在于反應(yīng)溶液中。進(jìn)而考慮，如果終點(diǎn)法鱟試驗(yàn)借鑒動(dòng)態(tài)法的連續(xù)反應(yīng)方式，是否具有動(dòng)態(tài)法同樣的良好性能呢？我們使用動(dòng)態(tài)顯色法試劑來(lái)作微量終點(diǎn)顯色法試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們的推測(cè)是完全正確的。如前所述，動(dòng)態(tài)顯色法試劑的制備技術(shù)要求要比終點(diǎn)顯色法高，制備成本也高。本發(fā)明的目的不僅要研制一種微量的鱟試驗(yàn)方法，而且要使該方法易于被推廣應(yīng)用，包括它的優(yōu)良性能及低制造成本。我們分析了動(dòng)態(tài)顯色法試劑的制備工藝，認(rèn)為該工藝的主要特點(diǎn)在于TAL與顯色基質(zhì)混合凍干，使得制備工藝對(duì)原材料及處理的要求比終點(diǎn)顯色試劑更為嚴(yán)格。除了混合凍干法外，是否還有其它方法使顯色基質(zhì)始終存在于反應(yīng)溶液中呢？經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)比較，我們找到一種最簡(jiǎn)捷有效的方法，就是使用顯色基質(zhì)溶液來(lái)溶解TAL，使復(fù)溶的TAL中含有所需濃度的顯色基質(zhì)，這相當(dāng)于用水復(fù)溶動(dòng)態(tài)顯色法試劑的效果。使用這種方法，制備試劑時(shí)可以與制備普通的終點(diǎn)顯色法試劑一樣分別凍干TAL和顯色基質(zhì)，避免象制備動(dòng)態(tài)顯色法試劑所需的高要求高成本。使用試劑時(shí)，先用水復(fù)溶顯色基質(zhì)，再用顯色基質(zhì)溶液去復(fù)溶凍干的TAL。這樣在實(shí)驗(yàn)操作上比動(dòng)態(tài)法鱟試驗(yàn)略顯繁瑣，但比現(xiàn)行的終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)省略了一個(gè)重要且耗時(shí)的操作步驟。綜上所述，本發(fā)明的微量終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)方法學(xué)上與現(xiàn)行終點(diǎn)顯色法有明顯的差異。兩種方法比較如下現(xiàn)行終點(diǎn)顯色法微量終點(diǎn)顯色法相關(guān)變量C國(guó)ODC-ODTAL與顯分別冷凍干燥，分別保存色基質(zhì)存在形態(tài)使用方式①用水分別復(fù)溶TAL和顯色基質(zhì)；②取50~100|J1TAL溶液加等量樣品溶液反應(yīng)一定激隊(duì)顯^^再鵬"^11司;④加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)分別冷凍干燥，分別保存①用水復(fù)溶顯色基質(zhì)，用顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶TAL;②取1040|Jl含顯色基質(zhì)的TAL溶液加等量樣品溶液反應(yīng)一定時(shí)間；③加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)反應(yīng)機(jī)理特征第①步TAL凝固i第②步:顯色,肽+pNA(黃色)①顯色基質(zhì)在反應(yīng)后過(guò)程才加入?yún)⑴c反應(yīng)②靈敏度相對(duì)低，抗干擾能力相對(duì)差TAL~^美顯色^固酶I肽+pNA(黃色)①顯色基質(zhì)存在于反應(yīng)全過(guò)程②靈敏度較高，抗干擾能力較好實(shí)驗(yàn)操作制備技術(shù)較低相對(duì)方便、快捷較低制備成本較低較低圖1是本發(fā)明塑料96孔微孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施例方式舉例使用微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)法對(duì)一種供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的方法及步驟如下。一、制備終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)使用的鱟試劑(TAL)。二、制備終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)使用的顯色基質(zhì)。三、制備細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)。四、制造一種塑料96孔微孔酶標(biāo)板1(Microplate)，該酶標(biāo)板各孔2的直徑為O3.0~5.0nwn,孔深為712mni，酶標(biāo)板外周尺寸及各孔中心位置與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)及生物分子篩選學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figurel-WellPositionsofa96wellmicroplate的酶標(biāo)板的夕卜周尺寸及各孔中心位置相同。五、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(C溶液)，如0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL，制備方法應(yīng)符合《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢査法(BET法)的要求。六、制備供試品溶液(A溶液)和陽(yáng)性供試品對(duì)照溶液(B溶液)，制備方法應(yīng)符合BET法要求。七、按使用說(shuō)明用BET水復(fù)溶凍干的顯色基質(zhì)，輕輕搖勻，然后按TAL的標(biāo)示裝量吸取相應(yīng)量的顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶TAL，輕輕搖勻。八、取步驟四所述的塑料96孔微孔酶標(biāo)1板一塊，按下表設(shè)置的反應(yīng)項(xiàng)目加入相應(yīng)溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>九、加液完畢，把酶標(biāo)板置振板器上振310秒，然后置酶標(biāo)板于37。C恒溫孵育530分鐘。十、孵育到預(yù)定的時(shí)間后，往每孔加入40pl反應(yīng)終止液，然后把酶標(biāo)板置振板器上振310秒。十一、把酶標(biāo)板放入光度測(cè)定儀/酶標(biāo)儀中測(cè)定每孔的吸光度值(OD)，對(duì)OD數(shù)據(jù)作回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度與OD關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品的內(nèi)毒素含量。權(quán)利要求1.一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征是該方法使用塑料96孔微孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器，使用微量的鱟試劑作終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)。2、據(jù)權(quán)利要求1所述的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶標(biāo)板(1)外周尺寸及各孔(2)中心位置與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)及生物分子篩選學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)中的酶標(biāo)板的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔(2)的直徑為①3.05.0mm，孔深為712mm。3、據(jù)權(quán)利要求2所述的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征是所述各孔(2)的直徑為04.(K4.4mm，孔深為10mm。4、據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶標(biāo)板(1)可用作所有光度法鱟試驗(yàn)的反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器，包括濁度法和顯色法鱟試驗(yàn)。5、據(jù)權(quán)利要求1所述的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征是使用微量的鱟試劑TAL或LAL作終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)，其步驟如下，以下步驟所描述的過(guò)程是指每單個(gè)孔的試驗(yàn)過(guò)程-a)用水復(fù)溶凍干的顯色基質(zhì)，用顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶凍干的鱟試劑，使復(fù)溶后的鱟試劑含有顯色基質(zhì)；b)取1040|J1含有顯色基質(zhì)的鱟試劑加入到96孔微孔酶標(biāo)板(1)的反應(yīng)孔(2)中，另加入等量的樣品，混勻，在溫度為37匸的條件下反應(yīng)530分鐘；所述樣品為水、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素或供試品-,c)當(dāng)反應(yīng)達(dá)到預(yù)定的時(shí)間，另加入反應(yīng)終止液，加入量通常是鱟試劑量的兩倍，去終止該反應(yīng)；d)把96孔微孔酶標(biāo)板(1)放入光度儀/酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度值OD，對(duì)數(shù)據(jù)作回歸分析并計(jì)算供試品的內(nèi)毒素含量。6、據(jù)權(quán)利要求5所述的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法，其特征在于a)鱟試驗(yàn)使用塑料96孔微孔酶標(biāo)板(1)作反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器；b)使用顯色基質(zhì)溶液復(fù)溶鱟試劑，使鱟試劑溶液含有顯色基質(zhì)；c)鱟試劑用量為d)顯色基質(zhì)存在于反應(yīng)全過(guò)程。全文摘要本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)，特別是一種微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法。該方法使用96孔微孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器及光度測(cè)定容器，使用微量的鱟試劑(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作終點(diǎn)顯色法鱟試驗(yàn)。本發(fā)明的微量終點(diǎn)顯色鱟試驗(yàn)方法消耗的TAL量?jī)H是現(xiàn)行鱟試驗(yàn)方法的10～20％，即10～20μl/T，而且實(shí)驗(yàn)操作更簡(jiǎn)便快捷。本發(fā)明的部分內(nèi)容同樣可以應(yīng)用到其它光度法鱟試驗(yàn)，使TAL的用量減少80～90％。文檔編號(hào)G01N33/579GK101368967SQ200810198228公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2008年8月28日優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日發(fā)明者馮聚錦,群韋申請(qǐng)人:湛江安度斯生物有限公司