專利名稱：?jiǎn)伟费趸冈\斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧 化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單胺氧化酶(MAO)測(cè)定可分為化學(xué)分光光度法、熒光法、免疫抑制法及 現(xiàn)在申請(qǐng)專利的酶法。 一般多用化學(xué)分光光度法，單胺氧化酶反應(yīng)底物以芐 胺(Benzylamine)和對(duì)苯甲胺-e -偶氮萘酚，也可應(yīng)用單胺氧化酶催化胺類 釋放出的&02氧化發(fā)色劑，如10-N-甲基氨基甲?；?3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，單胺氧化酶反應(yīng)底物還有丁基胺(butylamine)、 戊基胺(,lamine)、 P -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-對(duì)羥基苯乙胺3-parahdroxyphenylethylamine ) 、 5-羥色胺 (5-hydroxytirptamine)等，丁基胺、戊基胺、0-苯乙基胺約為3-對(duì)羥基 苯乙胺活性的30%，通常應(yīng)用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要 高。目前單胺氧化酶測(cè)定多用芐胺和對(duì)苯甲胺-e-偶氮萘酚為底物，但對(duì)苯 甲胺-偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實(shí)用性，且不 能應(yīng)用全自動(dòng)生化儀分析；芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成 芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙，在 生化儀上測(cè)定也較困難。
熒光法檢測(cè)單胺氧化酶是以e-苯乙胺作為底物，其在1(Tl00mg時(shí)Km 最大，高于芐胺和5-羥色胺的Km值。免疫學(xué)方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，作用后進(jìn)行
單胺氧化酶同工酶測(cè)定。目前應(yīng)用較多的單克隆抗體是MAO-A3C9、MA0-A4F10、
MA0-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定單 胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的單胺氧 化酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng) 生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高， 因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+
過(guò)氧化氫
肌苷單磷酸+氨+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+
還原性輔酶
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase; EC 1.4.3.4; EC 1.4.3.6) 酶(偶)聯(lián)鳥苷單磷酸還原酶(GMP reductase; EC 1.7丄7)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè) 法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生氨，再通過(guò)(偶)聯(lián)合鳥苷單磷酸 還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶 (在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在 處吸光度上升 的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算單胺氧化酶的活性 濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú) 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
鳥苷單磷酸還原酶 12000 U/L
胺類化合物 12mmol/L 肌苷單磷酸 9 mmol/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷 酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶。
輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶。
輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法，其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
鳥苷單磷酸還原酶 12000 U/L
胺類化合物 12mmol/L 肌苷單磷酸 9 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左 右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
輔酶
胺類化合物
肌苷單磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 12 mmol/L 9 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
鳥苷單磷酸還原酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑 1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
肌苷單磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 9 mmol/L
胺類化合物
100mmol/L 50 mmol/L 12 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
鳥苷單磷酸還原f
500 mmol/L
12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反 應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右， 理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。
申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0005;吸光 度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升；試劑可測(cè)有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)500 U/L;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±5%;試劑測(cè)試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑在2—8X:下保存，活性可以穩(wěn)定一年； ——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測(cè)定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+ 過(guò)氧化氫肌苷單磷酸+氨+輔酶鳥苷單磷酸還原酶鳥苷單磷酸+ 還原性輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑20-500 mmol/L1-4000 mmol/L6 mmol/L鳥苷單磷酸還原酶胺類化合物肌苷單磷酸000--80000 U/L50 mmol/L1-50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸 組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單 磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、鳥苷單磷酸還原酶組成。輔酶、 鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單磷酸 組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、肌苷單 磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 鳥苷單磷酸還原酶組成。輔酶、鳥苷單磷酸還原酶、胺類化合物、肌苷單 磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L或0.1。/o-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、肌苷單磷酸、鳥苷單磷酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的速度，從而測(cè)算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101620088SQ20081012288
公開(kāi)日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司