專利名稱：：一種測定豆類凝集素活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于測定豆類凝集素活性的方法。
背景技術(shù)：
：凝集素(Lectin)是動物細胞和植物細胞都能夠合成和分泌的、能與糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，因其能凝集紅血球，故名凝集素。凝集素具有一個以上同糖結(jié)合的位點，因此能夠參與細胞的識別和粘著，將不同的細胞聯(lián)系起來。凝集素主要可用于以下幾個方面(1)分離純化含糖高分子和細胞；(2)鑒定微生物；(3)研究細胞表面糖蛋白與糖脂的分布等；(4)鑒定糖鏈結(jié)構(gòu)；(5)診斷惡性腫瘤疾??；(6)鑒別血型；(7)定向輸送藥物等。目前，測定凝集素活性的方法包括細胞凝集法、Mancini沉淀法、Kocourek親和電泳、光散射法、印跡法、酶聯(lián)免疫檢測、刷狀緣凝集素凝集檢測(BBLAA)等幾種方法。其中細胞凝集法是目前應(yīng)用最為廣泛的測定方法，該方法利用天然的、酶處理的、戊二醛固定的兔、羊等動物血紅細胞，配制成一定濃度的懸液，將凝集素溶液進行系列二倍稀釋，然后向其中加入等量的細胞懸液，在一定條件下靜置一定時間后，利用肉眼觀測或比色等方法進行判定?，F(xiàn)有的測定凝集素活性的方法主要存在以下缺點(1)使用儀器價格昂貴，操作步驟煩瑣、操作難度大；(3)只能進行定性或者半定量測定；(4)配制標(biāo)準(zhǔn)細胞懸液方法不一，重現(xiàn)性差，而且許多種方法要求用新鮮血液當(dāng)天配制紅細胞懸液；其次，(5)確定讀取終點時間的隨意性較大，有的用肉眼觀察結(jié)果，主觀性大，造成結(jié)果誤差大，精確度降低；(6)測定方法繁多，測得結(jié)果之間難以進行比較。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種簡單、且準(zhǔn)確性高的測定豆類凝集素活性的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種測定豆類凝集素活性的方法，按照如下步驟進行(1)、制備豆類凝集素溶液；(2)、制備標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液；(3)在96孔酶標(biāo)板上將步驟(1)所得豆類凝集素溶液進行系列二倍稀釋，然后按照l:l的體積比分別加入步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，混和均勻，再用酶標(biāo)儀測定凝集素紅細胞凝集活性。上述測定豆類凝集素活性的方法步驟(1)中所述的豆類凝集素溶液，按照如下方法制備將豆類粉碎，過4060目篩，然后按照1:1020比例將豆粉置于0.05MPBS緩沖溶液中，再在05'C下攪拌46小時，然后在04'C、1200016000Xg下離心1520min;收集上清液；將離心所得沉淀用PBS緩沖溶液溶解，然后在05'C下攪拌25小時，再在04°C、1200016000Xg下離心1520min;合并收集兩次上清液，即得豆類凝集素溶液；其中所述的PBS緩沖溶液含0.15MNaCl、pH為7.0。所述的豆類可以是綠豆、紅豆或大豆等豆類之一種。上述測定凝集素活性的方法步驟(2)中所述的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，按照如下方法制備(a)將加有510%抗凝劑的新鮮兔血在12001277Xg下離心1520min，收集沉淀，將紅血球沉淀懸浮于生理鹽水中，再離心，如此重復(fù)35次；直至生理鹽水無明顯紅色為止；收集紅細胞沉淀；(b)按照1:1525的體積比向步驟(a)所得紅細胞沉淀中添加磷酸鉀生理鹽水緩沖液(pH8.59.0，510niM)，得紅細胞懸浮液，并按照胰蛋白酶液與紅細胞懸浮液之間1:510的體積比添加胰蛋白酶液(活力為720U/ml)，然后在3540。C下保溫12h;接著在12001277Xg下離心1520min，去掉上清液，用生理鹽水洗滌紅血球沉淀35次；再按照1:50100的體積比向所得紅血球沉淀中加入生理鹽水，混勻，得紅細胞懸浮液；(c)將步驟(b)所得的紅細胞懸浮液用生理鹽水調(diào)至在620nm下的吸光值為1.0的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入2025%的戊二醛，使紅細胞懸浮液中紅細胞的最終濃度達到O.1%，進行固定化1020min，然后在12001277Xg下離心1015min，去上清液，用生理鹽水洗滌紅細胞沉淀，然后用生理鹽水配制成410%(v/v)紅細胞懸浮液；(d)用生理鹽水稀釋步驟(c)所得的紅細胞懸浮液，使其在光徑0.5cm的玻璃比色池內(nèi)的620mn處吸光值等于1.0，以這種溶液Al為起始紅細胞懸液濃度然后從中吸取lml吸光值為1.0的紅細胞懸浮液，用生理鹽水稀釋1倍，然后再測定620nm處的吸光值，如此反復(fù)地在Al溶液添加生理鹽水，直至Al溶液的稀釋一倍后的吸光值是0.5,所得A1即為標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液?？紤]到紅細胞的沉降、溶血、器壁吸附等因素可能影響測定結(jié)果，該紅細胞懸浮液應(yīng)于測定當(dāng)天配制。所述的抗凝劑是指檸檬酸鈉等。上述標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸浮液中步驟(b)或步驟(c)所得的紅細胞生理鹽水懸液皆可于410'C冷藏備用。上述冷藏備用的紅細胞懸浮液在使用時先用生理鹽水將紅細胞洗漆并離心三次，除去壞損細胞，留取沉淀紅細胞。上述方法步驟(3)中所述的用酶標(biāo)儀測定凝集素紅細胞凝集活性，按照如下步驟進行(a)、將96孔酶標(biāo)板放在微型混合器上，然后向96孔酶標(biāo)板各個孔中滴加等體積生理鹽水；(b)、將豆類凝集素溶液作倍比稀釋，按照相同體積分別加入到上述96孔酶標(biāo)板的各個孔中；(c)向96孔酶標(biāo)板的各個孔中滴加等體積的標(biāo)準(zhǔn)紅血球懸浮液，震蕩，然后將96孔酶標(biāo)板在室溫下靜置60120min，用酶標(biāo)儀測定在620nm下的吸光值；通過下述公式求出X的數(shù)值，即為豆類凝集素活力；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式中x為滿足定義的凝集素溶液稀釋倍數(shù)；Es。是從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%的吸光度；A為管A的稀釋倍數(shù)，管A為吸光度數(shù)值低于但是最接近Es。的試管；RA為管A的吸光度；RB為管B的吸光度，管B為吸光度數(shù)值高于但是最接近E5。的試管；上述生理鹽水濃度為0.9%。凝集活力通過凝集素溶液稀釋倍數(shù)x來表示。上述對凝集素溶液的倍比稀釋，可以按照如下方法進行(a)在96孔酶標(biāo)板的每行的第一孔滴加與生理鹽水等體積的豆類凝集素溶液，并混勻；(b)將步驟(a)的豆類凝集素溶液與生理鹽水混勻，吸取50%體積溶液加入本行的第二孔，并混勻；(c)從第二孔吸取50%體積溶液加入本行的第三孔，依此類推，做倍比稀釋，直到第十一孔吸取50%體積溶液加入第十二孔，混勻后吸棄50%體積溶液。上述(a)中所述的生理鹽水的體積可以是150ul。上述(b)和(c)中所述的5(m體積可以是150ul。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果(1)、本發(fā)明方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性和精確度高，可比性強；(2)、本發(fā)明建立了制備標(biāo)準(zhǔn)血紅細胞的方法，可以長期存儲放置；(3)、本發(fā)明方法所需要的被測樣品和標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸浮液量少，能夠同時測定多個樣品；(4)、本發(fā)明操作方法簡便，通過酶標(biāo)儀直接讀取數(shù)據(jù)，適用于大樣本的凝集素活性測定。圖1綠豆粗提液不同稀釋度的吸光度值曲線圖。具體實施例方式實施例1綠豆凝集素活性的測定(1)綠豆凝集素溶液的制備取綠豆25g，粉碎后過40目篩，用100mlPBS緩沖溶液(0.05M,pH7.0,含O.15MNaCl)浸泡，在(TC下攪拌6h，然后在4。C、16000Xg下離心15min，收集上清液，將所得沉淀用PBS緩沖溶液(0.05M,pH7.0，含0.15MNaCl)浸泡，并在0'C下攪拌3小時，然后再在4-C、16000Xg下離心15min，收集合并兩次上清液，得綠豆凝集素溶液。(2)標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液的制備取加有10%的檸檬酸鈉的新鮮兔血，于1277Xg下離心15min，然后將收集得到的紅血球沉淀懸浮于生理鹽水中，再離心，如此重復(fù)5次，至上清液無明顯紅色；按照每毫升紅血球加25ml的比例向紅血球沉淀中添加磷酸鉀生理鹽水緩沖液(pH8，5，5mM，每毫升血球加25ml)，并向紅血球懸液中添加胰蛋白酶液(活力為15U/ml),酶液與紅血球懸浮液之體積比為1:10，在37。C保溫lh，然后在1277Xg下離心15min，用生理鹽水洗滌紅血球沉淀5次；最后配制成紅血球生理鹽水懸液，生理鹽水與血紅球之體積比為50:1，充分混合后，放置在4'C冰箱內(nèi)備用。用戊二醛對上述用胰蛋白酶處理過的紅細胞進行固定化用生理鹽水將紅細胞懸浮液調(diào)至在620nm下的吸光值為1.0的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入25%的戊二醛，使懸浮液的最終濃度達到0.1%，固定化10min后，離心，用生理鹽水洗滌紅細胞沉淀，并用生理鹽水配制成4%(v/v)紅細胞懸浮液于4。C冷藏備用。使用之前，先用生理鹽水將紅細胞洗滌并離心三次，除去壞損細胞，留取沉淀紅細胞。然后按一下步驟進行試驗(a)取少量紅細胞用生理鹽水進行稀釋，使其在光徑0.5cm的玻璃比色池(以下測定Aei時均采用此種比色池，WXDXH=lX0.5X4cm)內(nèi)的620nm處吸光值約等于1.0，以這種懸液為起始紅細胞懸液濃度；(b)吸取lml該懸液(作為A液)，用生理鹽水稀釋至2ml(稀釋1倍)后再測定620nm的吸光值，再向A液中加入生理鹽水，如此反復(fù)，直至A液稀釋一倍后在620nm處的吸光值等于0.5，用A液作為測定紅細胞凝集活性的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)用酶標(biāo)儀測定綠豆凝集素紅細胞凝集活性將96孔酶標(biāo)板放在微型混合器上，往酶標(biāo)板各個孔中滴加150ul生理鹽水(0.9%)，在每一行的第一孔滴加150ul的步驟(1)的綠豆凝集素溶液，與生理鹽水混合后，吸取150ul溶液加入本行的第二孔，混勻后吸取150ul溶液加入本行的第三孔，……依此類推，做倍比稀釋，直到第十一孔吸取150ul溶液加入第十二孔，混勻后吸棄150ul溶液。之后，往各個孔中滴加150ul標(biāo)準(zhǔn)紅血球懸浮液，振蕩后，將凝血板在室溫下靜置90min，用酶標(biāo)儀測定在620nm下的吸光值，然后按照下述公式求出X的值，即為所求凝集素的活力；logx=log爿+~~xlog2=logj+~~^xlog2-Aj^-Wj式中x為滿足定義的凝集素溶液稀釋倍數(shù)；Es。是從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%的吸光度；A為管A的稀釋倍數(shù)，管A為吸光度數(shù)值低于但是最接近Es。的試管；RA為管A的吸光度；RB為管B的吸光度，管B為吸光度數(shù)值高于但是最接近Es。的試管。采用的工作溶液是0.9%鹽水。凝集活力定義為在沉降開始90min時，引起標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%沉降的凝集素溶液的稀釋倍數(shù)。通過公式(1)可以算出稀釋倍數(shù)。結(jié)果(見圖1)當(dāng)稀釋倍數(shù)約為128256倍時，可引起標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%沉降，通過公式計算，稀釋倍數(shù)為170倍。實施例2不同凝集素測定方法的比較試驗各種測定方法如下(1)分光光度法綠豆凝集素溶液制備、標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸浮液配制與酶標(biāo)法相同(見實施例l)。將實施例1制備的綠豆凝集素溶液進行系列二倍稀釋后依次進行如下操作吸取上述溶液各lml分別裝入15支0.5X8cm的試管，再分別取lml實施例1制備的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液加入每支試管，用漩渦混合器混合，隨即裝入光徑0.5cm比色池并靜置90~120分鐘，然后小心地(盡量減小搖動)將其放入分光光度計測定A62Qnm。再根據(jù)下列公式計算logx=logJ+——xlog2=logj+~~xlog2一-式中x為滿足Liener定義的凝集素溶液稀釋倍數(shù)；Eso是從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%的吸光度；A為管A的稀釋倍數(shù)，管A為吸光度數(shù)值低于但是最接近E5()的試管；RA為管A的吸光度；RB為管B的吸光度，管B為吸光度數(shù)值高于但是最接近Es。的試管。采用的工作溶液是0.9%鹽水。(2)原血法紅細胞不做胰蛋白酶處理和戊二醛固定化處理。操作步驟如下將96孔的"V"形孔凝血板放在微型混合器上，往凝血板各個孔中滴加25nl生理鹽水(0.9%)，在每一行的第一孔滴加25^d實施例1制備的的綠豆凝集素溶液，與生理鹽水混合后，吸取25pl溶液加入本行的第二孔，混勻后吸取25pl溶液加入本行的第三孔，……依此類推，做倍比稀釋，直到第十一孔吸取25^1溶液加入第十二孔，混勻后吸棄25pl溶液。之后，往各個孔中滴加25pl實施例l制備的紅血球懸浮液，振蕩lmin后，將凝血板在室溫下靜置30min，觀察其結(jié)果。(3)酶處理法紅細胞用胰蛋白酶處理，但是不用戊二醛固定化。操作步驟如下將96孔的"V"形孔凝血板放在微型混合器上，往凝血板各個孔中滴加25^1生理鹽水(0.9。％)，在每一行的第一孔滴加25^1的實施例1中所制備的綠豆凝集素溶液，與生理鹽水混合后，吸取25pl溶液加入本行的第二孔，混勻后吸取25^1溶液加入本行的第三孔，……依此類推，做倍比稀釋，直到第十一孔吸取25pl溶液加入第十二孔，混勻后吸棄25pl溶液。之后，往各個孔中滴加25^il實施例1中制備的紅血球懸浮液，振蕩lmin后，將凝血板在室溫下靜置30min，觀察其結(jié)果。上述三種方法測定綠豆凝集素活性的結(jié)果(見表l)。表1不同凝集活性測定方法精確度比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結(jié)果(見表1和表2)本發(fā)明酶標(biāo)法的精確度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的相對偏差明顯低于原血法和酶處理法，和分光光度法相對偏差接近說明本發(fā)明酶標(biāo)法精確度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好。但本發(fā)明酶標(biāo)法用血量和所需樣品量都極少，一次性處理樣品多，適合大規(guī)模檢測。權(quán)利要求1、一種測定豆類凝集素活性的方法，按照如下步驟進行(1)、制備豆類凝集素溶液；(2)、制備標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液；(3)在96孔酶標(biāo)板上將步驟(1)所得豆類凝集素溶液進行系列二倍稀釋，然后按照1:1的體積比分別加入步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，混和均勻，再用酶標(biāo)儀測定凝集素紅細胞凝集活性。2、按照權(quán)利要求1所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于其步驟(1)中所述的豆類凝集素溶液，按照如下方法制備將豆類粉碎，過4060目篩，然后按照1:1020比例將豆粉置于0.05MPBS緩沖溶液中，再在05。C下攪拌46小時，然后在04。C、1200016000Xg下離心1520min;收集上清液；將離心所得沉淀用0.05MPBS緩沖溶液溶解，然后在05。C下攪拌25小時，再在04。C、1200016000Xg下離心1520min;合并收集兩次上清液，即得豆類凝集素溶液；其中所述的PBS緩沖溶液含0.15MNaCl、pH為7.0。3、按照權(quán)利要求1或2所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于所述的豆類是指綠豆、紅豆或大豆等豆類之一種。4、按照權(quán)利要求1或2所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，按照如下方法制備(a)將加有510%抗凝劑的新鮮兔血在12001277Xg下離心1520min，收集紅血球沉淀，將紅血球沉淀懸浮于生理鹽水中，再離心，如此重復(fù)35次，直至生理鹽水無明顯紅色為止；收集紅細胞沉淀；(b)按照1:1525的體積比向步驟(a)所得紅細胞沉淀中添加磷酸鉀生理鹽水緩沖液，得紅細胞懸浮液；并按照胰蛋白酶液與紅細胞懸浮液之間1:510體積比向其中添加胰蛋白酶液，然后在354(TC下保溫12h;接著在12001277Xg下離心1520min，去掉上清液，用生理鹽水洗滌紅血球沉淀35次；再按照1:50100的體積比向所得紅血球沉淀中加入生理鹽水，混勻，得紅細胞懸浮液；其中所述磷酸鉀生理鹽水緩沖液為510mM，pH8.59.0;(c)將步驟(b)所得的紅細胞懸浮液用生理鹽水調(diào)至在620nm下的吸光值為1.0的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入2025%的戊二醛，使紅細胞懸浮液中紅細胞的最終濃度達到O.1%，進行固定化1020min;然后在12001277Xg下離心1015min，去上清液，用生理鹽水洗滌紅細胞沉淀，然后用生理鹽水配制成410%紅細胞懸浮液；(d)用生理鹽水稀釋步驟(c)所得的紅細胞懸浮液，使其在光徑0.5cm的玻璃比色池內(nèi)的620nm處吸光值等于1.0，以這種溶液Al為起始紅細胞懸液濃度然后從中吸取lml吸光值為1.0的紅細胞懸浮液，用生理鹽水稀釋1倍，然后再測定620nm處的吸光值，如此反復(fù)地在Al溶液添加生理鹽水，直至A1溶液的稀釋一倍后的吸光值是0.5，所得A1即為標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液。5、按照權(quán)利要求4所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于所述的抗凝劑是指檸檬酸鈉等。6、按照權(quán)利要求5所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于其步驟(3)中所述的用酶標(biāo)儀測定凝集素紅細胞凝集活性，按照如下步驟進行-(a)、將96孔酶標(biāo)板放在微型混合器上，然后向96孔酶標(biāo)板各個孔中滴加等體積生理鹽水；(b)、將豆類凝集素溶液作倍比稀釋，按照相同體積分別加入到上述96孔酶標(biāo)板的各個孔中；(c)向96孔酶標(biāo)板的各個孔中滴加等體積的標(biāo)準(zhǔn)紅血球懸浮液，震蕩，然后將96孔酶標(biāo)板在室溫下靜置60120min，用酶標(biāo)儀測定在620nm下的吸光值；通過下述公式求出稀釋倍數(shù)X的數(shù)值，X即為豆類凝集素活力；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式中x為滿足定義的凝集素溶液稀釋倍數(shù);E5。是從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸液50%的吸光度；A為管A的稀釋倍數(shù)，管A為吸光度數(shù)值低于但是最接近E5。的試管；RA為管A的吸光度；RB為管B的吸光度，管B為吸光度數(shù)值高于但是最接近Es。的試管；上述生理鹽水濃度為0.9%。7、按照權(quán)利要求6所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于所述的對凝集素溶液的倍比稀釋，可以按照如下方法進行(a)在96孔酶標(biāo)板的每行的第一孔滴加與生理鹽水等體積的豆類凝集素溶液，并混勻；(b)將步驟(a)的豆類凝集素溶液與生理鹽水混勻，吸取50%體積溶液加入本行的第二孔，并混勻；(c)從第二孔吸取50%體積溶液加入本行的第三孔，依此類推，做倍比稀釋，直到第十一孔吸取50%體積溶液加入第十二孔，混勻后吸棄50%體積溶液。8、按照權(quán)利要求7所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于(a)中所述的生理鹽水的體積可以是150ul。9、按照權(quán)利要求7所述的測定豆類凝集素活性的方法，其特征在于其(b)和(c)中所述的50W體積可以是150ul。全文摘要本發(fā)明公開了一種測定豆類凝集素活性的方法，主要包括制備豆類凝集素溶液、制備標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，然后在96孔酶標(biāo)板上對豆類凝集素溶液進行系列倍比稀釋，再向每孔中加等體積的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞溶液，最后利用酶標(biāo)儀測定在620nm下的吸光值，然后根據(jù)公式求出凝集素的活性。本發(fā)明方法測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性和精確度高，可比性強；其次本發(fā)明建立了制備標(biāo)準(zhǔn)血紅細胞的方法，可以長期存儲放置；還有本發(fā)明方法所需要的被測樣品和標(biāo)準(zhǔn)紅細胞懸浮液量少，并能夠同時測定多個樣品；此外本發(fā)明操作方法簡便，通過酶標(biāo)儀直接讀取數(shù)據(jù)，適用于大樣本的凝集素活性測定。文檔編號G01N1/28GK101382543SQ20081011635公開日2009年3月11日申請日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者群沈,郇美麗申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)