專利名稱：：乙肝e抗體磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種乙肝e抗體磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎是一種嚴(yán)重的常見的肝臟疾病，在全球影響到數(shù)百萬人。目前全球人口中，超過20億人已經(jīng)在其生命中的某個(gè)時(shí)期感染過乙型肝炎病毒(HBV),其中，大約3.5億仍然為慢性感染者，成為病毒的攜帶者。全世界四分之三的人口生活在感染的高發(fā)區(qū)。每年HBV急性臨床病例超過4百萬，攜帶者中大約25%,也就是每年100萬人死于慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。對(duì)于HBsAg陽性的慢性感染患者，HBeAg和Anti-HBe可以用于確定感染的狀態(tài)。Anti-HBe在Anti-HBc后出現(xiàn)，它的出現(xiàn)與降低的傳染性相關(guān)。在疾病的恢復(fù)期，Anti-HBe將替代HBeAg。HBeAg向乙型肝炎病毒e抗體(Anti-HBe)的血清轉(zhuǎn)換預(yù)示著循環(huán)中HBVDNA的減少。HBeAg以及Anti-HBe在HBsAg陽性的患者的病情監(jiān)測(cè)中具有及其重要的意義。目前用于檢測(cè)乙肝病毒血清標(biāo)志物的免疫方法主要有酶免疫測(cè)定(enzymeimmunoassay,EIA)、力文射免疫測(cè)定(radioimmunoassay,RIA)、免疫熒光測(cè)定(fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)以及化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)等。這些超微量檢測(cè)技術(shù)的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發(fā)出的信號(hào)各不相同。根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來看，依次為化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技術(shù)因其使用放射性元素作為標(biāo)記物，因此對(duì)環(huán)境有一定污染性，并存在儀器成本貴，靈敏度不高，操作復(fù)雜，測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，試劑保存時(shí)間短等缺點(diǎn)。酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是一種較先進(jìn)而有效的方法，可使檢測(cè)靈敏度達(dá)到10—18摩爾水平，而且檢測(cè)范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)，又因?yàn)槊笜?biāo)記物穩(wěn)定，可長(zhǎng)期使用，因而得到了越來越多的關(guān)注。免疫磁微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒徑大小的磁性微粒作栽體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒。制備好的免疫磁顆?？梢詰腋∮谝后w中，這為免疫反應(yīng)提供了更多的可接觸面積，同時(shí)，免疫磁」微?？梢栽谝后w中運(yùn)動(dòng)，加速抗原抗體碰撞的幾率，使反應(yīng)快速，充分，并且可重復(fù)性好而越來越受到大家的青睞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用免疫磁」徵粒為載體，結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)開發(fā)了一種簡(jiǎn)便、快速、特異、穩(wěn)定的乙肝e抗體測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的目的是提供一種乙肝e抗體的磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括乙肝e抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗體校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光底物液、濃縮洗滌液和反應(yīng)管。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。本發(fā)明試劑盒的制備方法包括以下步驟a)配制乙肝e抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液混合液是由乙肝e抗體包被的磁微粒和辣根過氧化物酶乙肝e抗體以體積比為1:1混合，以含20~40%的新生牛血清的磷酸鹽緩沖液配制而成；所述磁微粒為l~10nm粒徑、三氧化二鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)的聚合物，其使用濃度為l~10mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將乙肝e抗體包被于磁微粒上，以含有0.5%~2.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液為封閉液封閉包被的磁」微粒。b)配制乙肝e抗原作為中和抗原試劑所述中和抗原是為基因工程制備的乙肝e抗原。c)以多克隆乙肝e抗體配制校準(zhǔn)品辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體是以改良過碘酸鈉法標(biāo)記制備。d)配制化學(xué)發(fā)光底物液所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液包括10mM魯米諾、0.5mM的1,6-二溴-2-苯酚、0.05mM4-缺苯硼酸、0.1MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0-10.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。e)配制濃縮洗滌液；洗涂緩沖液是含有0.1~0.5%吐溫-20、0.1%生物防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。f)分裝上述半成品及反應(yīng)管試劑盒使用的反應(yīng)管材料為透明塑料或玻璃。組裝即為成品試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，乙肝e抗體包被的磁微粒先與中和抗原即乙肝e抗原結(jié)合生成^茲微粒e抗體-e抗原復(fù)合物，當(dāng)待測(cè)樣品中含有乙肝e抗體時(shí)，則與酶標(biāo)記的乙肝e抗體同時(shí)與磁微粒復(fù)合物竟?fàn)幗Y(jié)合，當(dāng)樣品中不含乙肝e抗體時(shí)，則酶標(biāo)記的乙肝e抗體直接與磁微粒復(fù)合物反應(yīng)，洗涂除去游離酶標(biāo)記物后，加入化學(xué)發(fā)光底物液，通過化學(xué)發(fā)光儀讀數(shù)，其產(chǎn)生的信號(hào)與樣本中乙肝e抗體的含量成反比。本發(fā)明采用"中和抑制法"反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)結(jié)合磁微粒和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，定量檢測(cè)人體血清、血漿樣品中乙肝e抗體。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點(diǎn)。本發(fā)明"乙肝e抗體磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒"可以非常有效地檢測(cè)出樣品中乙型肝炎病毒e抗體的含量。具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可為臨床乙肝檢測(cè)提供一種很好的方法。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的乙肝e抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒一、乙肝e抗體包被磁微粒與辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液的制備1、乙肝e抗體包被磁微粒的制備將粒徑為l~10nm的磁微粒用戊二醛進(jìn)行活化，室溫?cái)嚢瑁靹?小時(shí)后，加磁場(chǎng)，靜置2025min，倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50~100mg/mL;每毫升懸浮液中加入乙肝e抗體40100嗎，在4。C下攪拌過夜后，加磁場(chǎng)，靜置1015min,倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸援沖液(pH為7.2)于室溫封閉3~4小時(shí)；最后用pH值為7.4、含吐溫-20和生物防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成510mg/mL的工作液。磁微粒在4。C保存。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的乙肝e抗體的制備辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體采用改良過碘酸鈉法，具體標(biāo)記過程如下溶解4.4mgHRP于lmL蒸餾水中，加入0.4mL過碘酸鈉(5Ommol/L)室溫?cái)嚢?0min，經(jīng)lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg乙肝e抗體，攪拌2h，最后用200mmol/LNaBH4進(jìn)行還原，經(jīng)0.02MPBS緩沖液透析后，加等體積甘油，-20。C以下保存。3、混合液的制備將乙肝e抗體包被石茲微粒與辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體以體積比為1:1混合，以20~40%新生牛血清配制而成。二、中和用乙肝e抗原的制備用含1%BSA的pH7.4磷酸鹽緩沖液對(duì)乙肝e抗原進(jìn)行稀釋，選擇合適的濃度，制備成中和抗原，分裝。三、乙肝e抗體沖交準(zhǔn)品的制備用馬血清將高濃度乙肝e抗體稀釋成校準(zhǔn)品，濃度分別為ONCU/mL、2NCU/mL、4NCU/mL、8NCU/mL、16NCU/mL、32NCU/mL,共6瓶。四、酶4示i己物的制備先配制酶稀釋液，每lOOOml酶稀釋液中含Tris12.12g,BSA5g，甘油100ml,Proclin300lml，加雙蒸水至900ml，用鹽酸調(diào)pH至7.4,再用雙蒸水定容至lOOOml，配成酶稀釋液。采用方陣法選擇酶標(biāo)記物的工作濃度范圍為1:1000-5000。五、配制化學(xué)發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法A液A液包括lOmM魯米諾、0.5mM的1,6-二溴-2-苯酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.1MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0-10.0。B液包括3.5mM過氧化脲、0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據(jù)使用量等體積混合，或先加一份的A液，再加一份等體積的B液，混勻。六、配制濃縮洗滌液洗滌緩沖液是含有0.1~0.5%吐溫-20、0.1%生物防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。七、半成品及成品組成上述試劑及反應(yīng)管經(jīng)檢驗(yàn)合格后進(jìn)行分裝，貼上標(biāo)簽，即為半成品。再把各半成品根據(jù)要求組裝成成品試劑盒。實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法一、樣品的準(zhǔn)備采用正確醫(yī)學(xué)方法收集病人血清用于檢測(cè)。二、4企測(cè)方法1、使用本試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，需先取出抗體包被磁微粒與辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的混合液、乙肝e抗原、校準(zhǔn)品/待測(cè)樣品、酶標(biāo)記的親和素在室溫放置15~30分鐘，使它們平衡到室溫；并注意將恒溫溫箱或者水浴鍋調(diào)至37。C;再后，準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對(duì)應(yīng)吸頭并且檢查化學(xué)發(fā)光儀是否正常工作。2、將反應(yīng)試管編號(hào)，向反應(yīng)管中加入50pL血清樣品或系列校準(zhǔn)品溶液，校準(zhǔn)品每管加0NCU/mL、2NCU/mL、4NCU/mL、8NCU/mL、16NCU/mL、32NCU/mL各50pL。3、每管加入抗體包被磁微粒與辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的混合液50^L。4、每管再加入乙肝e抗原各50pL，37。C振蕩反應(yīng)30min。5、每管加入洗涂液500nL,充分混勻，置于磁分離器上分離5min，倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復(fù)5次。6、每管加入化學(xué)發(fā)光底物A液lOO^L，再加入B液100pL，充分混勻，置于磁分離器內(nèi)，待磁微粒富集于底部后，暗處放置10min，而后在管式化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上依序測(cè)量各管的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。7、以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Logit值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)，以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的乙肝e抗體的濃度。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下1、試劑盒精密度測(cè)定(1)校準(zhǔn)品精密度實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批抽取10個(gè)試劑盒。以實(shí)施例1中所抽取的試劑盒測(cè)定4NCU/mL的HBeAb校準(zhǔn)品5次。計(jì)算其變異系數(shù)，結(jié)果表明變異系數(shù)在4.6%7.7%之間。2、試劑盒準(zhǔn)確性測(cè)定用臨檢中心乙肝e抗體4NCU/ml質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)值偏差小于10%。3、試劑盒特異性、靈敏度實(shí)驗(yàn)與HAV、HCV、類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病未見交叉反應(yīng)。用國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)，其中15份陰性國(guó)家參考品全部檢出陰性符合率100%(15/15)，10份陽性國(guó)家參考品全部檢出陽性，符合率100%(10/10)，三個(gè)系列稀釋靈敏度參考血清9份全部檢出陽性。4、試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。C6天加速實(shí)驗(yàn)后，與4'C放置試劑盒平行檢測(cè)高、中、低值質(zhì)控品，結(jié)果表明37。C6天后質(zhì)控血清測(cè)值偏差均小于15%，對(duì)實(shí)施例1試劑盒進(jìn)行28t)8個(gè)月的跟蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)完全符合臨床要求。該試劑盒在37。C放置6天和2~8。C放置8個(gè)月均能通過國(guó)家參考品標(biāo)準(zhǔn)，穩(wěn)定性良好，完全符合臨床需要。實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒同國(guó)外試劑盒臨^jfe樣測(cè)值比對(duì)用本發(fā)明試劑盒和國(guó)外知名公司的進(jìn)口HBeAb化學(xué)發(fā)光試劑盒分別對(duì)1056例隨機(jī)血樣，其檢測(cè)結(jié)果見表l表l臨床檢驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對(duì)照試劑HBeAb陽性率為18.84%,本發(fā)明試劑臨床陽性率為18.94%;兩者間的總符合率為99.72%。通過以上結(jié)果表明，本發(fā)明試劑靈敏度高，特異性好,臨床符合性好，且無污染，對(duì)于臨床檢測(cè)具有很好的推廣價(jià)值。權(quán)利要求1、一種乙肝e抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括乙肝e抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗體校準(zhǔn)品、上述辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液、濃縮洗滌液和反應(yīng)管。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述乙肝e抗體包被磁微粒與辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合比例為1:1。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述乙肝e抗原為中和抗原，采用基因工程乙肝e抗原。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液包括10mM魯米諾、0.5mM的l,6-二溴-2-苯酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.1MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。5、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟配制乙肝e抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液；配制乙肝e抗原作為中和抗原試劑；以多克隆乙肝e抗體配制校準(zhǔn)品；配制辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述半成品及反應(yīng)管。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述配制抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的混合液的步驟中所述的混合液是由乙肝e抗體包被的磁微粒和辣根過氧化物酶乙肝e抗體以體積比為1:1混合，以含20~40%的新生牛血清的磷酸鹽緩沖液配制而成；所述磁微粒為l~10nm粒徑、三氧化二鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)的聚合物，其使用濃度為l~10mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將乙肝e抗體包被于磁微粒上，以含有0.5%2.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液為封閉液封閉包被的磁-微粒。7、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所迷辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體是通過改良過^5典酸鈉法標(biāo)記實(shí)現(xiàn)的。8、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述中和抗原是為基因工程制備的乙肝e抗原。9、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液包括10mM魯米諾、0,5mM的1，6-二溴-2-苯酚、0.05mM4-珙苯硼酸、,0.1MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10,0;B液包括3.5mM過氧化脲、0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。全文摘要本發(fā)明屬于免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種乙肝e抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定試劑盒。主要由乙肝e抗體包被磁微粒和辣根過氧化物酶標(biāo)記乙肝e抗體的混合液、乙肝e抗原、乙肝e抗體校準(zhǔn)品、化學(xué)發(fā)光底物液、濃縮洗滌液和反應(yīng)管組成。本發(fā)明可用于臨床檢測(cè)人血清中乙肝e抗體含量，具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/576GK101592664SQ20081011381公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,宋勝利,應(yīng)希堂,胡國(guó)茂,詹先發(fā)申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司