專利名稱：：風(fēng)疹病毒IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種風(fēng)疹病毒IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：風(fēng)疹病毒屬于披膜病毒科，具單股正鏈RNA，直徑為60nm，僅有一個(gè)血清型。風(fēng)疹病毒的抗原結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，是一種最危險(xiǎn)的致畸因素。風(fēng)疹病毒與巨細(xì)胞病毒、弓形蟲病毒、皰疹病毒1型和2型共同命名為T0RCH。這五大病毒的共同危害是造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、殘疾兒。僥幸存活的新生兒?？砂l(fā)生生長發(fā)育遲緩、白內(nèi)障、神經(jīng)性耳聾、先天性心臟病、腦膜腦炎、巨細(xì)胞肝炎、溶血性貧血、視力、聽力障礙等，因此TORCH檢測對于優(yōu)生優(yōu)育至關(guān)重要。風(fēng)疹是由風(fēng)疹病毒引起的。風(fēng)疹在我國己列入法定報(bào)告的傳染病。80年代以來曰本、美國、印度、墨西哥、澳大利亞等均有較大的流行。孕婦屬易感人群，一旦感染便可發(fā)生子宮內(nèi)感染致胎兒畸形及嚴(yán)重后遺癥，流產(chǎn)及死產(chǎn)率較正常妊娠高2-4倍。妊娠早期感染者致畸率為50%，中期為25%，末期為15%。因此，早期妊娠婦女若確診為風(fēng)疹病毒感染時(shí)應(yīng)行人工流產(chǎn)終止妊娠。為避免孕早期受到風(fēng)疹病毒感染，在孕前必須檢查風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體，若IgG抗體陽性則表示曾經(jīng)感染過風(fēng)疹病毒，并有終生免疫力，不會(huì)再受感染，可以懷孕。若IgG抗體陰性則表示無抵抗力，容易受到風(fēng)疹病毒感染，因此必須立即注射風(fēng)疹疫苗，使體內(nèi)產(chǎn)生抗體，然后再懷孕即可避免本病。因孕婦為易感人群，因此婚前和孕前風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體的檢測至關(guān)重要，避免感染風(fēng)疹造不必要的后果。當(dāng)前檢測風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體的診斷技術(shù)有金標(biāo)、ELISA、PCR等方法。金標(biāo)試劑操作簡單，快速，但肉眼觀察有一定誤差，準(zhǔn)確率低；PCR具有靈敏度極高的特點(diǎn)，直接檢測病原體基因，但操作繁瑣、需要先進(jìn)的儀器設(shè)備和較高的費(fèi)用，不適用于基層推廣；而ELISA檢測方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，目前臨床應(yīng)用比較普遍，但存在漏檢、假陽性等問題。上述診斷技術(shù)，均有其特定的優(yōu)缺點(diǎn)。本發(fā)明利用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，是一種較先進(jìn)而有效的方法，其優(yōu)點(diǎn)是把高靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異性強(qiáng)的免疫分析方法相結(jié)合，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測定技術(shù)，主要具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑價(jià)格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期長、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)以被廣大研究人員所認(rèn)可，并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測技術(shù)。另外，現(xiàn)有技術(shù)中的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，既可應(yīng)用于開放式的半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測量儀，也可用于全自動(dòng)的測量系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)與間接反應(yīng)檢測法相結(jié)合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體的試劑盒。另外目前臨床應(yīng)用普遍的。ELISA試劑盒樣品稀釋比例一般為1:100或者1:1000，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而本試劑盒的樣品稀釋，采用l:IO稀釋，大大節(jié)約了時(shí)間與成本，操作更簡便，且能夠減少非特異反應(yīng)，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明"風(fēng)疹病毒IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以準(zhǔn)確地檢測出病人血清中風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體，它具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，某些指標(biāo)均優(yōu)于酶聯(lián)免疫分析法。并且，本發(fā)明可使用的檢測系統(tǒng)為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測手段。本發(fā)明的目的是提供一種化學(xué)發(fā)光免疫分析測定風(fēng)疹病毒IgG抗體的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的試劑盒包括陰、陽性對照，包被的風(fēng)疹病毒抗原固相載體，樣品稀釋液，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG單抗，化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗漆液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清經(jīng)1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋的溶液；所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管；所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH為7.4的磷酸鹽緩沖液；所述化學(xué)發(fā)光底物l，2-二氧乙垸類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSTO或CDP-Star。本發(fā)明還提供了一種制備上述試劑盒的方法1)配制陰、陽性對照；該陰性對照為正常人血清經(jīng)1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋的溶液，陽性對照為風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清經(jīng)1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋的溶液。2)以風(fēng)疹病毒抗原包被固相載體；所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管，包被固相載體的步驟為將0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當(dāng)濃度的風(fēng)疹病毒抗原混合，并將所得混合液負(fù)載于固相載體上，BSA封閉，抽濕干燥后用鋁箔袋密封。3)配制樣品稀釋液；該樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。4)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG單抗，用戊二醛交聯(lián)發(fā)制備。5)配制化學(xué)發(fā)光底物；化學(xué)發(fā)光底物液為含2(m的AMPPD溶液；6)配制濃縮洗滌液；所述洗滌液為20倍濃縮的Tris-HCl緩沖液；7)分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、酶標(biāo)記物和化學(xué)發(fā)光底物；以及8)組裝為成品。具體的上述試劑盒包括包被有抗原的化學(xué)發(fā)光微孔板48或96孔、樣品稀釋液1瓶、酶標(biāo)記物1瓶、陰性和陽性對照各1瓶、化學(xué)發(fā)光底物液1瓶、濃縮洗漆液1瓶。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，試劑盒采用風(fēng)疹病毒純化的抗原包被固相載體，繼而加入酶標(biāo)記的抗人IgG單抗，再與化學(xué)發(fā)光底物作用，測值即與標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒IgG抗體成正相關(guān)。該檢測方法有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理，又具有反應(yīng)逐層加大，因而極大的提高了檢測的特異性和靈敏性。另外，樣品稀釋后能夠減少非特異反應(yīng)，本法較常規(guī)ELISA試劑盒樣品稀釋比例大大縮小，直接在微孔板內(nèi)加稀釋液與樣品即可完成樣品的稀釋，極大地節(jié)約了時(shí)間與成本。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的風(fēng)疹病毒IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒本發(fā)明的風(fēng)疹病毒IgG抗體診斷試劑盒包括陰、陽性對照，包被的風(fēng)疹病毒抗原固相載體，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG單抗，化學(xué)發(fā)光底物。本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進(jìn)行了篩選試驗(yàn)和質(zhì)量鑒定，包括包被抗原、標(biāo)記抗體、白色微孔板的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光持續(xù)時(shí)間等。然后對固相載體用不同的包被緩沖液和封閉液進(jìn)行試驗(yàn)，選擇出最適合的包被緩沖液和封閉液，通過不同包被濃度試驗(yàn)找到最佳的濃度條件。對于ALP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比試驗(yàn)最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法，并對樣品稀釋液和酶標(biāo)記物使用的稀釋液進(jìn)行了長期的考察試驗(yàn)，配制出了能夠減少非特異反應(yīng)、靈敏度高、特異性好且長期保持活性而穩(wěn)定的稀釋液。一、風(fēng)疹病毒抗原預(yù)包被化學(xué)微孔板的制備(1)包被將風(fēng)疹病毒純化抗原加至0.046MpH值為4.6檸檬酸緩沖液中混勻制成包被液，每孔lOOuL加入微孔板各孔內(nèi)，4'C過夜。具體地，所述包被方法為檸檬酸4.44g檸檬酸三鈉7.3g去離子水定容至1000mL，調(diào)pH至4.6加入純化的風(fēng)疹病毒抗原制成濃度為1:500的包被液，每孔100uL加入微孔板各孔內(nèi)，4'C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次，拍干。(3)封閉每孔分別加入封閉液200uL，室溫放置3小時(shí)，甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。具體地，封閉液配制方法為NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin300lmL去離子水定容至1000mL，調(diào)ra至7.0室溫除濕干燥1824小時(shí)。然后進(jìn)行封袋。二、陰、陽性對照的制備混合的正常人血清經(jīng)過濾除菌后，用含有1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋為溶液配制成陰性對照；將風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清經(jīng)過濾除菌，滅活后，用含有1%BSA的磷酸鹽緩沖液按1:200稀釋，配制成陽性對照；三、樣品稀釋液的制備BSAlg甘油lmL吐溫-20lmL二巰基乙醇0.5mLProclin300lmL用0.02M的磷酸鹽緩沖液定容至1000mL，調(diào)PH至7.4四、濃縮洗滌液的制備Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去離子水定容至1000mL，調(diào)pH至7.4使用時(shí)用去離子水稀釋20倍。五、堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG單抗的制備用戊二醛交聯(lián)法將抗人IgG單抗與堿性磷酸酶偶聯(lián)在一起，對PBS充分透析，加等體積甘油，—20。C以下保存。使用時(shí)用含有1.2%Tris，0.5%BSA，0.l%Proclin300的稀釋液稀釋，濃度為1:1000。六、化學(xué)發(fā)光底物液的制備本發(fā)明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLAMPPD200mLProclin300lmL去離子水定容至1000mL，調(diào)pH值為8.09.0七、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成風(fēng)疹病毒IgG抗體測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實(shí)施例23制備本發(fā)明的風(fēng)疹病毒IgG抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒除分別以塑料珠、塑料管作為載體，其余均以與實(shí)施例1相同的方法制備本發(fā)明的測定試劑盒。實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法1)自4t:冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)將試劑盒提供的20倍濃縮洗滌液用去離子水20倍稀釋后，配制成應(yīng)用洗滌液。3)取出包被板條，插入板架上。4)設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔，每孔分別加入100uL。將樣品稀釋液加于孔內(nèi)100uL，再將待測血清10uL加入樣品稀釋液中，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白l孔。用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37'C溫育30分鐘；5)用全自動(dòng)洗板機(jī)或手工洗板5次，每孔400uL，最后在干凈的吸水紙上扣干；6)除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)記物100uL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，貼上封板膜，置37。C溫育30分鐘；7)洗板方法同5);8)每孔加化學(xué)發(fā)光底物液100uL，振蕩混勻，置室溫避光反應(yīng)5分鐘。9)必須于加化學(xué)發(fā)光底物液后的第530分鐘內(nèi)測量，在化學(xué)發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，測量時(shí)間1秒/孔。10)結(jié)果判定根據(jù)測定標(biāo)本(S)的RLU值與臨界值(CUT-OFF)的比值確定。臨界值(CUT-OFF)=2.1X陰性對照孔平均RLU值。若S/C0值》1，則為陽性反應(yīng)，說明樣本中含有風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體。若S/C0值〈1，則為陰性反應(yīng)，說明樣本中不含有風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體。實(shí)施例5本發(fā)明的試劑盒與其類似物交叉反應(yīng)本發(fā)明試劑盒對TORCH其他四項(xiàng)IgG抗體陽性血清66例進(jìn)行檢測，其中CMV-IgG陽性血清21例、T0X-IgG陽性血清18例、HSVl-IgG陽性血清16例和HSV2-IgG陽性血清11例，檢測結(jié)果如下表l表l本發(fā)明的試劑盒交叉試驗(yàn)的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表l檢測結(jié)果可以看出，本試劑盒與其類似物無交叉，有很強(qiáng)的特異性。實(shí)施例6本發(fā)明的試劑盒與ELISA試劑盒對血樣測值的比較本發(fā)明試劑盒與ELISA試劑盒同時(shí)檢測58例風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清標(biāo)本和532例風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陰性血清標(biāo)本，兩種試劑盒的檢測結(jié)果分別見下表2與3:表258例陽性血清標(biāo)本的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表2可以看出，本試劑盒對陽性血清的檢出率98.2%(57/58)，ELISA試劑盒對陽性血清的檢出率96.5%(56/58)，可以看出本發(fā)明試劑盒對陽性血清的檢出率高于ELISA試劑盒。從表3可以看出，本試劑盒對陰性血清的檢出率97.4%(518/532)，ELISA試劑盒對陰性血清的檢出率96.0%(511/532)，可以看出本發(fā)明試劑盒對陰性血清的檢出率高于ELISA試劑盒。結(jié)果顯示本試劑盒的檢測結(jié)果與臨床具有更高的符合率，更適用于臨床推廣應(yīng)用，安全可靠。權(quán)利要求1.一種用于檢測風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，包括陰、陽性對照，包被有風(fēng)疹病毒抗原的固相載體，樣品稀釋液，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG的單抗，化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗滌液。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清經(jīng)1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋的溶液。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0,l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。6、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟配制陰、陽性對照；以純化的風(fēng)疹病毒抗原包被固相載體；配制樣品稀釋液；用堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG的單抗；配制化學(xué)發(fā)光底物以及配制濃縮洗滌液；分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、酶標(biāo)記物和該酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物；以及組裝為成品。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述陰、陽性對照分別為正常人血清、風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體陽性血清經(jīng)1%BSA的磷酸鹽緩沖液稀釋的溶液。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體采用以下方法將0.046MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液與適當(dāng)濃度的風(fēng)疹病毒抗原混合，并將所得混合液負(fù)載于固相載體上，BSA封閉，抽濕干燥后用鋁箔袋密封。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述樣品稀釋液為含有0.1%BSA、0.1%甘油、0.1%吐溫-20、0.05%二巰基乙醇、0.l%Proclin300的0.02MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。全文摘要一種用于檢測風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析診斷試劑盒，包括陰、陽性對照，包被有風(fēng)疹病毒抗原的固相載體，樣品稀釋液，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG的單抗，化學(xué)發(fā)光底物以及濃縮洗滌液。所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)配制陰、陽性對照；2)包被固相載體；3)配制樣品稀釋液；4)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG的單抗；5)配制化學(xué)發(fā)光底物；6)配制濃縮洗滌液；7)分裝上述陰、陽性對照、樣品稀釋液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物及濃縮洗滌液；8)組裝為成品。采用本試劑盒及其制備方法，可以簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測人血清中的風(fēng)疹I(lǐng)gG抗體，且便于推廣應(yīng)用。文檔編號G01N21/76GK101368959SQ20081010267公開日2009年2月18日申請日期2008年3月25日優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日發(fā)明者唐寶軍,宋勝利,應(yīng)希堂,坤張,胡國茂,趙娟娟申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司