專利名稱：：膜聯(lián)蛋白a2的血清檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及單獨使用新的標志物檢測HCC或者與AFP聯(lián)用使用檢測HCC的方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用.
背景技術(shù)：
肝癌(Livercancer)是一種嚴重危害人類健康的惡性肺瘤，2000年全世界新發(fā)病例約564，000人，在所有惡性腫瘤中排第五位。由于其惡性程度髙、預(yù)后不良，五年生存率不足10%。中國是肝癌的高發(fā)區(qū)，集中了全世界約54%的新發(fā)病例，其中肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinomas,HCC)占原發(fā)性肝癌的90%以上[1'2]。據(jù)1991-2000年間，中國169，871人口的死因抽樣調(diào)查顯示，它的死亡率排在全部惡性腫瘤的第2位，年死亡率為54.7/100,000(男81.2，女29.0)[3]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是目前臨床上公認的HCC診斷標志物。20世紀5Q年代，Bergstrand等人首次在人類胎兒血清中發(fā)現(xiàn)了這種電泳遷移率相當于甲種球蛋白的蛋白質(zhì)，在正常成人血清中并沒有檢測到它的存在[4]。1960年，AbelevG及其同事在小鼠的肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)了這種甲種球蛋白，它不存在于正常小鼠的任何組織中，經(jīng)證實它是胎鼠血清中的主要成分，在成年鼠肝細胞再生時會重新出現(xiàn)[51。后來，HCC患者和畸胎瘤患者血清中胚胎特異性的甲種球蛋白也被檢測出來[6'7]。因此，人們將這種主要存在于胎兒組織的蛋白命名為甲胎蛋白。目前已知，AFP是一種分泌型糖蛋白，與白蛋白同屬于白蛋白樣基因家族。它主要存在于嚙齒類動物和人胚胎期血清中，由胚胎發(fā)育時期卵黃囊內(nèi)胚層和胎肝合成并分泌到血液中。在人類胚胎中AFP最高濃度可達3-4mg/ml,出生后，血清中AFP濃度迅速下降，新生兒期約為10-50ng/ml，正常成人一般在10ng/ml以下。懷孕期間母體血清中AFP濃度的變化可以提示多種胚胎發(fā)育缺陷8]。而成人中，升高的血清AFP水平不僅存在于60%-70%的HCC病人，也可見于大約20%的慢性肝炎，20%-60%的肝炎肝硬化和某些胚胎性癌患者[9]。在有慢性肝炎和肝硬化背景的HCC患者中，AFP的診斷價值更低[1°'11]。因此，AFP對于HCC患者的診斷靈敏度介于41%-97%之間，特異度在80%-95%，而陽性預(yù)測值徘徊在9%-58%之間[1°—12。更為重要的是，臨床上有20%-30%的HCC患者血清AFP水平并不升高，從而大大限制了其在HCC臨床檢查中的應(yīng)用價值。因此，目前迫切需要找到能與AFP聯(lián)合使用，提高HCC診斷準確度的新標志物。綜上所述，由于目前尚缺乏有效的肝癌檢測方法，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)建立新的肝癌患者血清ELISA檢測方法和可以方便快捷檢測的試劑盒。為此，本發(fā)明人進行了大量的研發(fā)工作，在前期工作中，發(fā)明人提取了三個肝癌細胞系HepG2、Hep3B和SK-HEP-1，及一個正常肝細胞系HL-7702的亞細胞組分，并經(jīng)雙向電泳分離(2-DE)，選取具有三倍以上差異的蛋白質(zhì)點，膠內(nèi)酶解后經(jīng)MALDI-TOF-TOF質(zhì)i脊鑒定。在胞漿組分中，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了一個在AFP陰性肝癌細胞系SK-HEP-1中特異性高表達的蛋白質(zhì)點，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為膜聯(lián)蛋白2(AnnexinA2，ANXA2)。ANXA2屬于annexins蛋白家族成員，是一種Ca2+離子結(jié)合蛋白，其C端核心結(jié)構(gòu)域包含磷脂、F-actin和肝素的結(jié)合位點，而N端包含PKC(Ser-25)和Src(Tyr-23)的磷酸化調(diào)節(jié)位點"3-15。ANXA2在細胞內(nèi)以三種形式存在單體、二聚體和四聚體。二聚體由一分子的ANXA2和一分子的3-磷酸甘油酸激酶組成。四聚體由兩分子的ANXA2和兩分子的SIOOAIO(P11)組成。四聚體對單體的相對量隨著細胞或組織的類型而不同，小腸上皮細胞中ANXA2的四聚體大約是100%,而培養(yǎng)的成纖維細胞中單體形式的ANXA2占了50%以上。目前認為，ANXA2可以中介細胞的胞泌、胞吞、actin依賴的嚢泡轉(zhuǎn)運、胞飲等過程，調(diào)節(jié)離子通道并影響細胞骨架重建、細胞間黏附和運動，而且，其在造血干細胞歸巢、植入和維持骨髓微環(huán)境中發(fā)揮重要作用fl6-w。在各種轉(zhuǎn)化細胞中，如v-src、v-H-ras、v-mos和SV40轉(zhuǎn)化細胞等，ANXA2的表達均會被誘導(dǎo)。而且，其基因表達受多種生長因子，如胰島素、IGF和EGF的調(diào)節(jié)。在多種人類腫瘤中如胰腺癌、高分化膠質(zhì)瘤、胃癌、腎細胞癌、肺癌、HCC和急性早幼粒細胞白血病中ANXA2均表達上調(diào)，但在前列腺癌中表達下調(diào)(35—421。因此表明，ANXA2的上調(diào)與細胞轉(zhuǎn)化過程相關(guān)。另外，大約10%-15%的細胞內(nèi)ANXA2與細胞核相關(guān)。ANXA2可以與DM序列結(jié)合，是刺激DNA聚合酶a活性的引物識別復(fù)合物的組成成分["—w。ANXA2具有RNA結(jié)合能力，是體內(nèi)mRNP的組成成分，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ANXA2可以直接和c-MycmRM的3，-UTR相互作用，將其特異的轉(zhuǎn)運并定位到胞漿中的細胞骨架。細胞過表達ANXA2后，導(dǎo)致c-Myc蛋白表達水平同時上調(diào)["'48]。在乳腺癌和頭頸部腫瘤中的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANXA2是潛在的纖溶酶原和組織型纖溶酶原激活蛋白(t-PA)受體，可能參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程49'5°]。DreierR等人曾利用免疫組織化學(xué)染色研究了Annexin蛋白家族成員在人體各個正常器官、組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)的肝細胞和Kupffer細胞均不表達AnnexinA2f51]。TuckerCJ等人在動物模型中研究了砷酸誘發(fā)的HCC與對照正常肝臟之間的差異表達基因譜，其中鑒定到的一個差異表達基因就是AnnexinA2，其在腫瘤組織中明顯上調(diào)，realtimePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常對照成年雄性C3H小鼠中，ANXA2的表達水平為1.0±0,3,在誘發(fā)HCC的小鼠癌旁正常組織和腫瘤組織中AnnexinA2的表達水平升高9倍和49倍(52。LimS0等人利用2-DE-MAILDI-T0F技術(shù)策略對比了正常、肝硬化和肝細胞肝癌組織蛋白表達譜的差異，鑒定到的差異蛋白之一就是AnnexinA2，該蛋白在正常和肝硬化組織中的表達水平明顯低于HCC腫瘤組織加。但是，這兩篇研究僅僅從基因組和蛋白質(zhì)組的角度篩查了HCC與健康肝臟之間的表達差異，并沒有在臨床樣品上對AnnexinA2進行任何驗證，而且，目前沒有任何AnnexinA2可以在人類血清中檢測到，并與人類疾病相關(guān)的報道。
發(fā)明內(nèi)容鑒于ANXA2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，發(fā)明人對其在肝癌組織中的表達情況進行了大樣本量的驗證分析，結(jié)果顯示，在19例配對肝癌組織的Westernblot結(jié)果中，ANXA2在腫瘤組織中的表達上調(diào)率為68.4(13/19),而40例配對HCC組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，其在胂瘤組織中的表達陽性率為60%(24/40)，而在癌旁正常組織中的表達陽性率僅為10%,經(jīng)過Chi-square檢驗證明，ANXA2是一種在肝癌組織中高表達的蛋白質(zhì)(p<0.0001)。因此，發(fā)明人認為ANXA2蛋白的表達與肝癌具有十分重要的聯(lián)系，可以作為肝癌相對特異性的敏感標志蛋白。雖然ANXA2不具有信號肽，但是，文獻報道，它存在于外體(exosome)中，我們推測，它可以經(jīng)非經(jīng)典分泌途徑分泌入血(5"5]，在肝癌患者血清/血漿中可檢測到，并作為肝癌早期血清學(xué)檢測的特異性標志物。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人首次建立了人類ANXA2的血清間接雙夾心ELISA檢測方法，并對其檢測結(jié)果進行了評價。進而本發(fā)明提供了提高HCC診斷準確度的新的標志物AnnexinA2的血清ELISA檢測方法、檢測試劑盒及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明包括以下幾個方面。一方面，本發(fā)明提供了下述獲得作為中間結(jié)果的信息的方法，所述方法為檢測待測生物樣品中的AnnexinA2水平是否異常，進而獲得作為中間結(jié)果的信息的方法，所述方法包括步驟i)測定待檢生物樣品中的AnnexinA2水平；252)比較待檢生物樣品中的AnnexinA2水平和正常生物樣品對照的AnnexinA27jC平；3)獲得作為中間結(jié)果的信息，4)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否有可能是HCC樣品。2.上述1的方法，進一步包括與AFP聯(lián)合檢測。3.上述1或2的方法，其中步驟1)的生物樣品是已經(jīng)脫離人體或者動物體的組織、體液或者排泄物。4.上述1或者2的方法，其中步驟1)的生物樣品是血清。5.上述1或2的方法，其中步驟l)的測定是血清ELISA法。6.使用AnnexinA2檢測HCC的方法，所述方法包括步驟1)測定待檢生物樣品中的AnnexinA2水平；2)比較待檢生物樣品中的AnnexinA2水平和正常生物樣品對照的AnnexinA2水平j(luò)3)根據(jù)比較結(jié)果確定待檢生物樣品是否是HCC樣品。7.上述6的方法，進一步包括與AFP聯(lián)合檢測。8.上述6的方法，其中步驟l)的生物樣品是血清。9.上述6的方法，其中步驟l)的測定是血清ELISA法。10.AnnexinA2作為HCC的標志物的用途。11，上述10的用途，其中AnnexinA2與AFP聯(lián)合應(yīng)用。12.用于檢測AnnexinA2的HCC檢測試劑盒。13.上述12的HCC檢測試劑盒，其中包括作為標準的AnnexinA2、抗AnnexinA2抗體。14,用于聯(lián)合檢測AnnexinA2和AFP的HCC檢測試劑盒。圖1為血清AFP、ANXA2和兩個指標聯(lián)合使用的受試者檢測曲線。圖中虛線代表AFP,點虛線代表ANXA2，實線代表兩個指標聯(lián)合使用。A表示曲線下面積。具體實施例方式為了進一步清楚地闡述本發(fā)明，下面提供了本發(fā)明的具體實施例，不過本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于所述實施例，任何本法的方法和產(chǎn)品的等價的變形和修飾等都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1:采用人類ANXA2的血清間接雙夾心ELISA檢測方法為了對生物樣品進行檢測，進行了如下的ELISA檢測方法，所述方法的具體步驟為1.包被用pH9.6的50mM碳酸鹽緩沖液(15mMNa2C03;35mMNaHC03)作為稀釋液，將山羊抗人ANXA2抗體(SantaCruzBiotechnology公司，Cat.No.sc-1924)稀釋為2pg/ml。在聚苯乙烯的96孔酶標板的微孔中加入50m1包被液，用保鮮膜封好，在4。C水箱中放置過夜(>16h)。次日，用350m1150mM的PBST緩沖液(137mMNaCl，2mMKH2P04，10mMNa2HPO4，加入0.05%的Tween-20，調(diào)節(jié)至pH7.4)浸泡式洗板，3minx3次。2.封閉每孔加入300n1的2%BSA(Sigma-Aldrich公司，Cat.No.A7906)，室溫封閉4h。用350p1PBST緩沖液浸泡式洗板，1minx3次。3.抗原孵育在每個反應(yīng)孔中加入50jLi1的HCC患者血清(用PBST緩沖液1:10稀釋)或梯度稀釋的人重組ANXA2蛋白(Abnova公司，Cat.No.H00000302-P02)，37X:孵育1h，同時，用洗滌緩沖液替代抗原作為陰性對照。每個樣品設(shè)置3個平行孔。孵育結(jié)束后，棄去抗原，用350plPBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。4.檢測抗原反應(yīng)在每個反應(yīng)孔中加入50jli1用PBST緩沖液稀釋的lpg/ml的小鼠抗人ANXA2抗體(SantaCruzBiotechnology公司，Cat.No.sc-28385)作為檢測抗體，室溫孵育1h。而后棄去，用350piPBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。5.二抗孵育在每個反應(yīng)孔中加入50ja1用PBST緩沖液1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoReasearch/>司，Cat.No.115-005-003)，室溫孵育1h。而后棄去，用350jalPBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。6.TMB(3，3，，5,5，-四甲基聯(lián)苯胺)底物顯色稱取10mgTMB(Sigma-Aldrich^^司，Cat.No.15053)溶于5ml無水乙醇中，配置成TMB|&存液。而后取0.5mlTMB|&存液加入10ml磷酸杵檬酸底物緩沖液(51.4mMNa2HP04，24.3mM檸檬酸，pH5.0)中，并加入32ja10.75%的11202混勻，配置成TMB顯色溶液。在每個反應(yīng)孔中加入100jj1TMB顯色溶液，輕輕混勻，室溫孵育30min。7.終止待顏色滿意并穩(wěn)定以后，每孔加入100jal2M112304溶液終止反應(yīng)，并輕輕混勻。8.OD值的測定立即將酶標板置于Model680酶標儀(Bio-Rad公司)中，OD450/570雙波長讀數(shù)。9.結(jié)果的判讀首先確定3個陰性對照孔的讀數(shù)，取平均值作為本底讀數(shù)。然后對于每一例血清樣品或重組ANXA2標準品，先計算3個平行孔的孔間變異系數(shù)(CV)，對于那些CV值小于15%的樣品，取3次重復(fù)的平均值作為該樣品的0D值；CV值大于15。/。的樣品，去除一個異常值后，重新計算孔間變異(孔間變異-兩孔0D值之差/兩孔0D值之和)，如果該變異值<15%,認為該樣品為有效病例，并取兩孔平均值作為該樣品的0D值，否則，舍棄該例樣品。而后，利用梯度稀釋的重組ANXA2標準品繪制標準曲線，從而計算出每一例有效病例的血清ANXA2濃度。注上述實驗方法所用材料，除特殊注明以外，均為國產(chǎn)分析純試劑。實施例2:人類ANXA2的血清間接雙夾心ELISA檢測方法的臨床檢測應(yīng)用利用實施例1的上述方法，對年齡、性別相匹配的30例健康成人(平均年齡51歲，最大年齡70歲，最小年齡33歲)和98例HCC患者(平均年齡54歲，最大年齡83歲，最小年齡15歲)的血清ANXA2濃度進行了測定。試驗結(jié)果和標準曲線的濃度梯度和扣除本底的0D值見表l，兩者的線性相關(guān)系數(shù)為0.971，表明這一濃度梯度基本落在檢測反應(yīng)的線性范圍內(nèi)。同樣表明所建立的這一系統(tǒng)比較穩(wěn)定，對所有病例結(jié)果均有效，絕大多數(shù)樣品的CV值控制在10%以內(nèi)。表1:ANXA2標準曲線的設(shè)定和檢測的0D值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康成人血清ANXA2的濃度為17.58jag/ml，檢測區(qū)間為4.81~29.29Mg/ml。而HCC患者的血清ANXA2平均濃度是28.68Mg/ml，最小值為13.45，最大值為230.66jng/ml。經(jīng)過Mann-WhitneyRankSum檢驗，兩者差異具有顯著性(p<0.0001)。同時，健康對照中的血清ANXA2濃度與其年齡、性別之間沒有明顯的相關(guān)性(P=0.9462，p=0.3646)。AFP陽性和陰性的HCC患者，血清ANXA2表達水平?jīng)]有明顯差異(p-0.1595)。而且，我們發(fā)現(xiàn)，低分化HCC患者的血清ANXA2明顯高于中高分化患者(p<0.05)。實施例3:采用對照方法進行的平行檢測利用電化學(xué)發(fā)光方法(臨床上常規(guī)使用的方法)測定了前述實施例2的所有ELISA樣品的血清AFP濃度，結(jié)果表明，健康成人和HCC患者的血清AFP平均濃度分別是3.5875ng/ml和31.415ng/ml。分別繪制這兩個蛋白用于HCC檢測的受試者曲線(ROC曲線)(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFP的曲線下面積為0.81，ANXA2的曲線下面積為0.78，這兩個蛋白的診斷價值基本相同(卡方檢驗，p-O.6096)。此時，獲得最佳診斷效果的血清AFP濃度是llng/ml，診斷靈敏度為93.3%,特異度為63.5%。而ANXA2的闊值為27.93pg/ml，此時的診斷靈敏度和特異度分別為96.7%和52.1%。當聯(lián)合使用這兩個血清學(xué)指標時，ROC曲線下面積增加到0.87，診斷靈敏度和特異度增加到100%和72.9%。上述結(jié)果表明，所建立的血清ANXA2ELISA檢測方法具有重復(fù)性好、靈敏度高的特點。將其用于128例健康成人和HCC患者的血清ANXA2測定發(fā)現(xiàn)，這一指標具有很高的檢測靈敏度，表明它可能是一個很有潛力的血清早期篩查指標。而且，其與AFP的診斷效力基本相同，具體而言，單獨使用ANXA2可以獨立對HCC進行檢測，其與目前臨床常用的AFP具有近似的診斷價值，而且更加靈敏(ANXA2的診斷靈敏度為96.7%，而AFP為93.3。/。)，特別適合于腫瘤的人群篩查。如果聯(lián)合使用這兩個血清學(xué)指標，則可以100%的檢出HCC患者。實施例4:檢測ANXA2的肝癌檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種肝癌檢測試劑盒，其中含有重組的人ANXA2作為蛋白標準，含有抗人ANXA2抗體(包被抗體工作濃度2jig/ml，稀釋緩沖液為50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.0;檢測抗體工作濃度1jlig/ml，稀釋緩沖液為150mM的PBST緩沖液，pH7.4)，以及實施例1中其它的檢測試劑。使用本發(fā)明的試劑盒采用實施例1的方法已完成臨床試驗128例，檢測陽性率為100%,靈敏度高達96.7%。根據(jù)文獻檢索，目前國內(nèi)外尚無相同工作的報道。參考文獻1.ParkinDM，BrayF，F(xiàn)erlayJ，PisaniP.Globalcancerstatistics,2002.CA.CancerJ.Clin.2005;55(2)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