專利名稱：：一種測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及葡萄糖的測(cè)定方法，具體地說是一種測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法。
背景技術(shù)：
：葡萄糖是生命活動(dòng)中不可缺少的物質(zhì)，它在人體內(nèi)能直接參與新陳代謝過程，在消化道中，葡萄糖比任何其他單糖都容易被吸收，而且被吸收后能直接為人體組織利用，具有補(bǔ)充體液、供給能量、補(bǔ)充血糖、強(qiáng)心利尿、促進(jìn)解毒功能，對(duì)癌癥也有一定治療作用。此外，葡萄糖還用在印染制革、制鏡工業(yè)和熱水瓶膽鍍銀工藝中。目前，葡萄糖的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、酶催化法、斐林法等。前二種方法或儀器成本較高或使用較昂貴的酶試劑；雖然準(zhǔn)確度較高，但要求在沸騰狀態(tài)下滴定，操作不便且選擇性不高。因此，建立一種簡(jiǎn)便快速、選擇性較好、低成本的葡萄糖檢測(cè)方法是非常有意義的。近年來，金屬納米粒子的催化性能研究及應(yīng)用是一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域。貴金屬金曾被認(rèn)為是催化活性極低的元素，但近來發(fā)現(xiàn)小粒徑的納米金具有很好的催化性能。1939年James等人發(fā)現(xiàn)硝酸銀在膠體金表面被對(duì)苯二酚還原，膠體金起到了催化作用；Dansher建立了用銀顯影液增強(qiáng)光鏡下金顆?？梢娦缘慕疸y染色法；1983年Holgate等人進(jìn)一步把這個(gè)發(fā)現(xiàn)運(yùn)用到組織學(xué)的研究中去，創(chuàng)立了免疫金銀染色法。金催化金增強(qiáng)引起了人們濃厚的研究興趣，它極大地提高了檢測(cè)信號(hào)并避免了銀增強(qiáng)帶來的問題。此外，還可用作為標(biāo)記物金納米粒子催化金增強(qiáng)檢測(cè)DNA和人免疫球蛋白G。近來，Mao等人將納米金催化銅增強(qiáng)用于檢測(cè)人免疫球蛋白G，結(jié)果同樣滿意。銅增強(qiáng)試劑易制備、易保存及穩(wěn)定性好，有廣泛的應(yīng)用前景。共振散射光譜法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn)，已用于無機(jī)物、有機(jī)物、蛋白質(zhì)、核酸等分析。迄今為止有關(guān)納米金催化共振散射光譜法檢測(cè)葡萄糖的方法尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是要為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而公開一種操作簡(jiǎn)便、快速、且靈敏度高、成本低的測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法。本發(fā)明測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法包括以下步驟1、制備已知葡萄糖濃度的測(cè)試體系(1)在具塞比色管中，依次移取0.8-1.0mg.mL"硫酸銅溶液，10-12mg.mL—1斐林試劑A(以氫氧化鈉計(jì))，1.912-3.0ng.mL"金膠，一定量的濃度為1mg.mL"葡萄糖，0.60-0.72mg.mU1溴化鉀溶液，定容至一定體積，于75'C水浴槽內(nèi)反應(yīng)8-10min;(2)反應(yīng)完成后將試管放入冷水中冷卻至室溫終止反應(yīng)；(3)用熒光分光光度計(jì)，設(shè)置電壓450V，激發(fā)狹縫二發(fā)射狹縫二2.5nm，同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(^m—^x=Onm)得到體系的RSS光譜。在610nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度；2、依據(jù)步驟一的方法制備試劑空白體系求得試劑空白體系的(l6K)nm)b;3、計(jì)算Al610nm-l610nm—(l610nm)b值；4、以加入的葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，AI為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線；5、依照步驟一的方法制備檢測(cè)體系其中加入的是未知葡萄糖濃度的被測(cè)物，求被測(cè)物的AI;6.根據(jù)工作曲線，即可求得被測(cè)樣品中葡萄糖在一定線性范圍內(nèi)的濃度，其工作曲線為厶1610細(xì)=7.830(:-60.60，相關(guān)系數(shù)為0.9959，檢出極限為8嗎.mL—1。步驟1所述的具塞試管為5mL的具塞試管，依次加入的硫酸銅溶液最佳濃度為0.828mg.mL—1，斐林試劑A(以氫氧化鈉計(jì))最佳濃度為11mg.mL'1，金膠最佳濃度為1.91嗎.m!/1，1mg.mL'1葡萄糖用量為5(HiL12(HiL,溴化鉀溶液最佳濃度為0.72mg.mL—1,定容體積為2.5mL，水浴溫度為75t:，最佳水浴反應(yīng)時(shí)間為9min;所述的冷卻方式為流水冷卻；所述的共振散射測(cè)定波長(zhǎng)為610nm;所述的測(cè)定葡萄糖的線性范圍為2048嗎.mL—1。本發(fā)明方法的原理是金納米微粒催化斐林試劑-葡萄糖-溴化鉀的反應(yīng)，存在以下兩個(gè)機(jī)理①酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物陰離子被納米金晶種吸附至表面，使膠粒帶負(fù)電，當(dāng)加入葡萄糖溶液后，它迅速被葡萄糖還原成溴化亞銅納米微粒，得到溴化亞銅-金復(fù)合納米，如圖1(A)所示；②生成的溴化亞銅納米微粒作為晶種催化斐林試劑-葡萄糖反應(yīng)，生成粒徑更大溴化亞銅納米微粒，如圖1(B)所示。本方法加入適量濃度的溴化鉀，使產(chǎn)物較穩(wěn)定，這是因?yàn)檫m量濃度的溴化鉀可以生成較穩(wěn)定的溴化亞銅，抑制了亞銅離子的歧化反應(yīng)，使產(chǎn)物不易被氧化。隨著葡萄糖的不斷加入，生成的復(fù)合鈉米微粒增多，從而導(dǎo)致共振散射強(qiáng)度增大。葡萄糖在一定濃度范圍內(nèi)與Al,nm存在良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立一個(gè)測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是與現(xiàn)有的方法相比，本方法將催化反應(yīng)與共振散射光譜技術(shù)相結(jié)合，方法靈敏度高，檢測(cè)限低，可達(dá)到pg/mL水平，選擇性較好，操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，只需要熒光分光光度計(jì)即可完成，并且所用試劑易得，成本低廉。圖1為本發(fā)明催化反應(yīng)原理2為本發(fā)明實(shí)施例納米金催化體系的共振散射光譜圖，其中，a:11mg.mL"斐林試齊!j-0.828mg.mL—1硫酸銅-1.91ng.m1/1膠體金-0.72mg.mL-'溴化鉀；b:a-18嗎.mL;1葡萄糖；c:a-22嗎.mL"葡萄糖；d:a-30ng.mL—1葡萄糖；e:a-36ng.m1/1葡萄糖；f:a-4化g.mL"葡萄糖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例的工作曲線；具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述下面的實(shí)施例是應(yīng)用納米金對(duì)Cu(n)-葡萄糖-KBr生成溴化亞銅微粒反應(yīng)的催化作用，建立的檢測(cè)葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法。實(shí)施例檢測(cè)1#樣品(紫光古漢集團(tuán)衡陽制藥有限公司)；2#樣品(六技工礦集團(tuán)大華藥業(yè)有限公司)；3#樣品(鄭州羚銳制藥有限公司)；3種不同的葡萄糖注射液樣品的葡萄糖濃度，操作步驟如下1、制備已知葡萄糖濃度的測(cè)試體系(1)在5mL具塞比色管中，依次移取30nL69mg.mL"硫酸銅溶液，110nL0.25g.mL"斐林試劑A(以氫氧化鈉計(jì))，100^L47.8昭.mL—1金膠，50pL120pL的1mg.mL"葡萄糖，30tiL60mg.mL"溴化鉀溶液，定容至2.5mL，于75。C水浴槽內(nèi)反應(yīng)9min;(2)反應(yīng)后將試管放入冷水中冷卻至室溫終止反應(yīng)；(3)用CaryEclipse熒光分光光度計(jì)(美國Varian公司)，設(shè)置電壓450V,激發(fā)狹縫=發(fā)射狹縫二2.5nm，同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(X^—A^-0nm)得到體系的RSS光譜。在610nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度I610nm;2、用步驟一的方法，制備反應(yīng)空白體系求得試劑空白(l6H)nm)b;3、計(jì)算Al610腦l610腦一(l610nm)b值；4、根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以加入的葡萄糖濃度Cg^。se為橫坐標(biāo)，AIwo^為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，隨著葡萄糖濃度C(2048嗎.mi;')的增大，/翩^值增加。其工作曲線為A/柳鵬。7.830C-60.60(圖3)，相關(guān)系數(shù)為0.9959，檢出限為8昭.mL";5、依據(jù)步驟一的方法，分別取1#樣品、2#樣品、3#樣品3種不同的葡萄糖注射液樣品制備檢測(cè)體系分別求得"、2#、^樣品的AI;6、根據(jù)工作曲線，即可求得葡萄糖注射液樣品中葡萄糖的濃度。圖2a表明，空白體系的同步散射很弱，圖2b、c、d、e、f表明，當(dāng)加入葡萄糖反應(yīng)后，體系在542nm、610nm、723nm出現(xiàn)3個(gè)較明顯的同步散射峰，其中610nm的同步散射峰最強(qiáng)。己知該儀器在465nm處有最強(qiáng)發(fā)射，因此542nm、610nm、723nm的同歩散射峰均為納米微粒共振散射效應(yīng)產(chǎn)生的共振散射峰。隨著葡萄糖濃度的增加，610nm處共振散射強(qiáng)度線性增大。本發(fā)明選取波長(zhǎng)為610nm進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明實(shí)施例中3種不同的葡萄糖注射液樣品的分析結(jié)果見表1;結(jié)果證明本法測(cè)定的結(jié)果和廠家所標(biāo)濃度和誤差很小。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明實(shí)施例中共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)40嗎.mL"葡萄糖的影響見表2，結(jié)果表明，本方法選擇性較好。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表權(quán)利要求1、一種測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法，其特征是測(cè)定方法包括如下步驟(1)制備已知葡萄糖濃度的測(cè)試體系①在具塞比色管中，依次移取0.8-1.0mg.mL-1硫酸銅溶液，10-12mg.mL-1斐林試劑A(以氫氧化鈉計(jì))，1.912-3.0μg.mL-1金膠，一定量的濃度為1mg.mL-1葡萄糖，0.60-0.72mg.mL-1溴化鉀溶液，定容至一定體積，于75℃水浴槽內(nèi)反應(yīng)8-10min；②反應(yīng)后將試管放入冷水中冷卻至室溫終止反應(yīng)；③用熒光分光光度計(jì)設(shè)置電壓450V，激發(fā)狹縫＝發(fā)射狹縫＝2.5nm，同步掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(λem-λex＝0nm)得到體系的RSS光譜，在610nm處測(cè)定體系的散射光強(qiáng)度I610nm；(2)用步驟一的方法，制備反應(yīng)空白體系求得試劑空白(I610nm)b；(3)計(jì)算ΔI610nm＝I610nm-(I610nm)b值；(4)根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以加入的葡萄糖濃度Cglucose為橫坐標(biāo)，ΔI610nm為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線；(5)依據(jù)步驟一的方法，制備檢測(cè)體系求得被測(cè)樣品的ΔI；(6)根據(jù)工作曲線，即可求得被測(cè)樣品中葡萄糖的濃度。2、如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是步驟(1)所述的具塞試管為5mL的具塞試管，依次加入的硫酸銅溶液最佳濃度為0.828mg.mL-1，斐林試劑A(以氫氧化鈉計(jì))最佳濃度為llmg.mL-1，金膠最佳濃度為1.91嗎.mL"，1mg.mL"葡萄糖用量為50nL120pL，溴化鉀溶液最佳濃度為0.72mg.mU1，定容體積為2.5mL，水浴溫度為75'C，最佳水浴反應(yīng)時(shí)間為9min。3、如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是步驟(1)所述的冷卻方式為流水冷卻。4、如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是:步驟(l)所述的共振散射測(cè)定波長(zhǎng)為610nm。5、如權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是步驟(6)所述的測(cè)定葡萄糖的線性范圍為20-48ug.mL-1。全文摘要本發(fā)明公開了一種測(cè)定葡萄糖的納米金催化共振散射光譜法，它利用納米金對(duì)Cu(II)-葡萄糖-KBr生成的溴化亞銅微粒反應(yīng)的催化作用，葡萄糖在一定濃度內(nèi)與ΔI_610nm存在良好的線性關(guān)系而建立起來的方法。本方法的優(yōu)點(diǎn)是與現(xiàn)有的方法相比，本方法將催化反應(yīng)與共振散射光譜技術(shù)相結(jié)合，方法靈敏度高，檢測(cè)限低，可達(dá)到μg/mL水平，選擇性較好，操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，只需要熒光分光光度計(jì)即可完成；并且所用試劑易得、成本低廉。文檔編號(hào)G01N21/75GK101226151SQ200810073470公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月4日優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日發(fā)明者廖獻(xiàn)就,溫桂清,蔣治良申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)