專利名稱：層層自組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物傳感器中電極的制備方法，尤其涉及一種層層自 組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電極的方法
背景技術(shù)：
功能性多層膜在生物傳感器、生物微反應(yīng)器和生物醫(yī)用材料等方面有 重要應(yīng)用，是近年來十分受關(guān)注的研究領(lǐng)域。層層自組裝方法
(Layer-by-layer assembly, LBL)是一種重要的功能性多層膜構(gòu)筑方法，具 有操作簡單，組裝條件溫和，可以在分子層面控制組裝量、膜結(jié)構(gòu)和膜厚 度等特點。通過層層自組裝方法交替組裝構(gòu)筑具有特殊功能的多層膜具有 重要的研究意義。
修飾電極作為生物傳感器中的重要部件，其制備方法對生物傳感器的 性能有很大影響。過氧化物酶修飾電極被廣泛用于食品生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)測等 領(lǐng)域。發(fā)展無試劑的過氧化物酶生物傳感器是生物傳感器研究的重要方 向。這主要是由于過氧化物酶的氧化還原中心較難與電極發(fā)生直接電子傳 遞，人們通常需引入電子傳遞媒介體促進(jìn)過氧化物酶與電極間的電子傳 遞。因此，電子傳遞i某介體在溶液中的過氧化物酶電極在原位分析或在線 檢測時存在諸多不便。
發(fā)展無試劑過氧化物酶生物傳感器的關(guān)鍵是實現(xiàn)酶和電子傳遞媒介 體的共固定化。小分子有機染料是性能優(yōu)良的電子傳遞々某介體，可有效促 進(jìn)過氧化物酶與電極間的電子傳遞。碳納米管由于具有獨特的理化性質(zhì)而
受到人們的廣泛關(guān)注。較大的比表面積、導(dǎo)體和半導(dǎo)體性質(zhì)使其廣泛應(yīng)用 與生物傳感器的構(gòu)筑中。羧基化的碳納米管表面帶負(fù)電荷，可與帶正電的 陽離子聚電解質(zhì)通過靜電等作用有效復(fù)合。
利用層層自組裝方法制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電 極，構(gòu)筑新型無試劑傳感器具有潛在應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種條件溫和的功能性多層膜修飾電極制備方法。 一種層層自組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電極的方
法，將帶有負(fù)電荷的電極依次分別置入溶液A、溶液B、溶液C和溶液B 中進(jìn)行組裝操作使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾膜，循環(huán)所述的組裝操 作直至帶有負(fù)電荷的電極表面的修飾膜為預(yù)定厚度的多層膜，得到修飾電 極。
所述的組裝才喿作為將電極在溶液中浸泡，浸泡的時間為5-60min，每 次更換溶液時可先用去離子水沖洗電極。
負(fù)電荷的電極可以通過現(xiàn)有技術(shù)中多種方法得到。例如金電極，可以 利用吸附、自組裝等多種方法在電極表面負(fù)栽一層帶負(fù)電荷的單分子膜或 帶負(fù)電的納米物質(zhì)等，這樣電極就帶負(fù)電了。例如氧化銦錫電極，在氫氧 化鈉/乙醇溶液中浸泡就可以使電極表面帶負(fù)電。例如玻碳電極，在硫酸中 進(jìn)行循環(huán)伏安掃描使其表面產(chǎn)生氧化層，就可以使電極表面帶負(fù)電。
所述的溶液A為殼聚糖-碳納米管溶液，殼聚糖-碳納米管溶液的配置 方法力口下
(l)將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為0.5-2.0%的乙酸或質(zhì)量百分比濃 度為0.5-2.0%鹽酸溶液中，用M溶液調(diào)殼聚糖溶液的pH值為4.0-5.8, 得到溶液M;
濃堿溶液一般可以采用質(zhì)量百分比濃度10 ~ 30%的氫氧化鈉或氫氧
化鉀水溶液。
得到的溶液M中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5-4.0%;
(2)向溶液M中加入羧基化的碳納米管，超聲10-30分鐘，得到溶液 A(殼聚糖-碳納米管溶液)；
得到的溶液A中^&化的碳納米管濃度為0.1mg/mL-3mg/mL。
所述的溶液B為聚電解質(zhì)-染料溶液，聚電解質(zhì)-染料溶液的配置方法 如下
(1) 將聚電解質(zhì)溶于濃度為0.02-1.0mol/L、 pH值為4.0-5.8的乙酸-乙 酸鈉緩沖溶液中，得到溶液N;
所述聚電解質(zhì)為聚陰離子電解質(zhì)，具體可采用聚對苯乙烯磺酸鈉、硫 酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧曱基纖維素鈉、聚丙烯酸或海藻酸鈉； 得到的溶液N中聚電解質(zhì)的濃度為0.1-5mg/mL。
(2) 向溶液N中加入染料電子々某介體，得到溶液B(聚電解質(zhì)-染料溶
液)；
所述染料電子媒介體為陽離子染料電子媒介體，具體可以釆用亞曱基 蘭、耐爾蘭或中性紅；
得到的溶液B中，染料電子媒介體的物質(zhì)的量低于(與權(quán)利要求書統(tǒng) 一吧)聚電解質(zhì)的物質(zhì)的量，利用靜電作用將陽離子染料預(yù)先吸附在聚陰 離子電解質(zhì)上后，并使得到的聚電解質(zhì)-染料復(fù)合物帶靜負(fù)電荷；若染料 電子媒介體的物質(zhì)的量高于聚電解質(zhì)的物質(zhì)的量將無法保證聚電解質(zhì)-染 料復(fù)合物帶靜負(fù)電荷。
此步驟組裝過程作用力以靜電作用為主，殼聚糖"友納米管帶正電， 聚電解質(zhì)-染料帶負(fù)電，酶帶正電，聚電解質(zhì)-染料帶負(fù)電，這樣正負(fù)相間 組裝，這也是組裝順序需固定的原因。
作為優(yōu)選，在得到的溶液B中，染料電子媒介體的物質(zhì)的量與聚電解 質(zhì)的物質(zhì)的量的比為0.05 ~ 0.5: 1。
所述的溶液C為酶溶液，酶溶液的配置方法如下 將過氧化物酶溶于濃度為0.02-1.0mol/L、pH值為4.0-5.8的乙酸-乙酸 鈉緩沖溶液中，得到溶液C(酶溶液)；
得到的溶液C中，酶的濃度為0.1-5mg/mL;
所述的過氧化物酶，具體可采用辣根過氧化物酶、蘆,過氧化物酶或 馬鈴薯過氧化物酶。
操作時，將帶有負(fù)電荷的電極按次序分別置入溶液A、溶液B、溶液 C和溶液B中完成一次循環(huán)組裝操作，使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾 膜，為了得到一定厚度的多層膜，按照溶液A、溶液B、溶液C和溶液B 的順序再進(jìn)行若干次循環(huán)組裝操作， 一般循環(huán)3-10次左右，得到(殼聚 糖-碳納米管-染料-酶)n修飾電極，n表示循環(huán)的次數(shù)。
本發(fā)明方法一般均可在常溫下操作。
殼聚糖是來源豐富的天然聚合物，殼聚糖分子中大量的活性氛基可在 酸性溶液中質(zhì)子化，使殼聚糖具有聚陽離子的性質(zhì)。殼聚糖可有效地* 羧基化的碳納米管，形成穩(wěn)定的殼聚糖-碳納米管復(fù)合物。
作為一種天然聚合物，殼聚糖具有良好的生物相容性，被廣泛用作酶 固定化載體。碳納米管近年來已被廣泛用于生物傳感器的構(gòu)筑中，可促進(jìn) 電子傳遞，有效提高傳感器檢測靈敏度。與殼聚糖-碳納米管基質(zhì)復(fù)合的 酶具有高的活性和良好的穩(wěn)定性。同時，染料電子傳遞媒介體可有效促進(jìn) 過氧化氫酶與電極間的電子傳遞。小分子有機染料是性能優(yōu)良的電子媒介 體，但這類分子所帶的電荷較少，直接采用自組裝方法構(gòu)筑多層膜，組裝 上的染料分子在組裝下一層時容易從膜中脫落。因此本發(fā)明將有機陽離子 有機染料與聚陰離子聚電解質(zhì)在溶液中預(yù)混合，利用靜電作用將染料預(yù)先 吸附在聚陰離子上，再與帶正電荷的物質(zhì)靜電組裝。本發(fā)明中，殼聚糖聚 陽離子的作用，使得殼聚糖-碳納米管復(fù)合物帶正電，能夠與帶靜負(fù)電荷 的聚電解質(zhì)-染料靜電自組裝。過氧化物酶在所述pH條件下，帶正電，也 可與表面帶負(fù)電的聚電解質(zhì)-染料發(fā)生靜電自組裝。
因此，將帶有負(fù)電荷的電極分別置入殼聚糖-碳納米管溶液、聚電解質(zhì) -染料溶液、酶、聚電解質(zhì)-染料溶液中進(jìn)行組裝操作，能使帶有負(fù)電荷的 電極表面通過靜電作用附著1奮飾膜，循環(huán)所述的組裝才喿作直至帶有負(fù)電荷 的電極表面的修飾膜達(dá)到預(yù)定厚度，可得到(殼聚糖^友納米管/聚電解質(zhì)-染料/酶/聚電解質(zhì)-染料)n多層膜修飾電極?；跉ぞ厶?碳納米管復(fù)合材 料、電子傳遞媒介體共固定化的層層自組裝方法，可使構(gòu)筑的無試劑傳感 器具有良好的電化學(xué)性能和穩(wěn)定性。
本發(fā)明方法，制備條件溫和，多層膜厚度、染料電子傳遞媒介體固定 量、酶固定量可控。
具體實施方式
實施例1
將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為0.5%的乙酸溶液中，調(diào)溶液pH值為 5.0，得到溶液M,溶液M中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%;向所得殼 聚糖溶液中加入g化的碳納米管，超聲IO分鐘，得到殼聚糖-碳納米管 溶液，殼聚糖-碳納米管溶液中羧基化的碳納米管濃度為0.5mg/mL。
將聚對苯乙烯磺酸鈉溶于濃度為0.1mol/L、 pH值為5.0的乙酸-乙酸 鈉緩沖溶液中，得到溶液N，溶液N中聚對苯乙烯磺酸鈉的濃度為 2mg/mL，向所得溶液中加入染料電子媒介體亞曱基蘭，得到聚電解質(zhì)-染 料溶液。聚電解質(zhì)-染料溶液中亞曱基蘭的濃度為0.5mg/mL。
將辣根過氧化物酶溶于濃度為0.1mol/L、 pH值為5.0的乙酸-乙酸鈉 緩沖溶液中，得到酶溶液，酶溶液中辣根過氧化物酶的濃度為lmg/mL。
將帶有負(fù)電荷的電極先后置入殼聚糖-碳納米管溶液、聚電解質(zhì)-染料 溶液、酶溶液、聚電解質(zhì)-染料溶液中交替自組裝，每種溶液中的組裝時 間為20min,完成一次循環(huán)組裝操作，使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾 膜，按照上述組裝順序再進(jìn)行6次循環(huán)組裝操作，得到(殼聚糖-碳納米管
_染料-酶)6多層膜修飾電極。
實施例2
將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為1%的乙酸溶液中，調(diào)溶液pH值為 4.5，得到溶液M，溶液M中殼聚糖的質(zhì)量百分比濃度為1%;向所得殼 聚糖溶液中加入羧基化的碳納米管，超聲20分鐘，得到殼聚糖-碳納米管 溶液。殼聚糖-碳納米管溶液中羧基化的碳納米管濃度為lmg/mL。
將海藻酸鈉溶于濃度為0.2mol/L、 pH值為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶 液中，得到溶液N，溶液N中海藻酸鈉的濃度為2mg/mL，向所得溶液中 加入染料電子媒介體耐爾蘭，得到聚電解質(zhì)-染料溶液。聚電解質(zhì)-染料溶 液中耐爾蘭濃度為0.25mg/mL。
將,勞過氧化物酶溶于濃度為0.1mol/L、 pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉 緩沖溶液中，得到酶溶液；酶溶液中蘆筍過氧化物酶的濃度為0.5mg/mL。
將帶有負(fù)電荷的電極先后置入殼聚糖-碳納米管溶液、聚電解質(zhì)-染料 溶液、酶溶液、聚電解質(zhì)-染料溶液中交替自組裝，每種溶液中的組裝時 間為15min，完成一次循環(huán)組裝操作，使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾 膜，按照上述組裝順序再進(jìn)行8次循環(huán)組裝操作，得到(殼聚糖-碳納米管 -染料-酶)s多層膜修飾電極。
權(quán)利要求
1、一種層層自組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電極的方法，將帶有負(fù)電荷的電極依次分別置入溶液A、溶液B、溶液C和溶液B中進(jìn)行組裝操作使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾膜，循環(huán)所述的組裝操作直至帶有負(fù)電荷的電極表面的修飾膜為預(yù)定厚度的多層膜，得到修飾電極；所述的溶液A為殼聚糖-碳納米管溶液；所述的溶液B為聚電解質(zhì)-染料溶液，所述的溶液C為過氧化物酶溶液。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液A的配置方法 如下將殼聚糖溶于質(zhì)量百分比濃度為0.5-2.0%的乙酸或質(zhì)量百分比濃度 為0.5-2.0%鹽酸溶液中，用堿液調(diào)pH值至4.0-5.8,得到殼聚糖的質(zhì)量百 分比濃度為0.5-4.0%的溶液；再加入羧基化的碳納米管，M均勻，得到 氛基化的石灰納米管濃度為0.1mg/mL-3mg/mL的溶液A。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液B的配置方法 如下將聚電解質(zhì)溶于濃度為0.02-1.0mol/L、pH值為4.0-5.8的乙酸-乙酸鈉 緩沖溶液中，得到聚電解質(zhì)的濃度為0.1-5mg/mL的溶液，向溶液中加入 染料電子媒介體，得到溶液B;所述染料電子媒介體為亞曱基蘭、耐爾蘭或中性紅；溶液B中，染料 電子々某介體的物質(zhì)的量^f氐于聚電解質(zhì)的物質(zhì)的量。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液C的配置方 法i口下將過氧化物酶溶于濃度為0.02-1.0mol/L、 pH值為4.0-5.8的乙酸-乙酸 鈉緩沖溶液中，得到過氧化物酶的濃度為0.1-5mg/mL的溶液C。
5、 如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的聚電解質(zhì)為聚 對苯乙烯磺酸鈉、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧曱基纖維素鈉、聚丙烯 酸或海藻酸鈉。
6、 如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的過氧化物酶 為辣根過氧化物酶、聲,過氧化物酶或馬鈴薯過氧化物酶。
7、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的組裝操作為將電極 在溶液中浸泡，浸泡的時間為5-60min。
8、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于循環(huán)所述的組裝操作3~ 10次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種層層自組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電極的方法，將帶有負(fù)電荷的電極分別置入殼聚糖-碳納米管溶液、聚電解質(zhì)-染料溶液、酶、聚電解質(zhì)-染料溶液中進(jìn)行組裝操作使帶有負(fù)電荷的電極表面附著修飾膜，循環(huán)所述的組裝操作直至帶有負(fù)電荷的電極表面的修飾膜達(dá)到預(yù)定厚度，得到(殼聚糖-碳納米管/聚電解質(zhì)-染料/酶/聚電解質(zhì)-染料)n多層膜修飾電極。本發(fā)明利用層層自組裝制備殼聚糖-碳納米管-染料-酶多層膜修飾電極的方法，制備條件溫和，多層膜厚度、染料電子傳遞媒介體固定量、酶固定量可控。制備出的無試劑電極靈敏度高，穩(wěn)定性好。
文檔編號G01N27/327GK101354374SQ200810063030
公開日2009年1月28日 申請日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日
發(fā)明者奚鳳娜, 林賢福 申請人:浙江大學(xué)