專利名稱：：煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：氨基酸是煙葉中的重要組成部分，是與煙氣香味、巻煙品質(zhì)和品牌特征密切相關(guān)的煙草成分，氨基酸參與煙葉中的非酶棕色反應(yīng)，即美拉德反應(yīng)，此反應(yīng)可產(chǎn)生多種重要的致香成分。因此，測(cè)定煙草中的氨基酸對(duì)配方研制、工藝生產(chǎn)和品質(zhì)控制都有十分重要的意義。在氨基酸的分析檢測(cè)中，亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)和正纈氨酸(Nva)互為同分異構(gòu)體，無法單用質(zhì)譜加以鑒定，需結(jié)合色譜分離進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明在采用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析煙草樣品氨基酸的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化方法與條件，期望能對(duì)上述氨基酸同分異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確分離測(cè)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法，采用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離測(cè)定，包括以下步驟(1)通過液相色譜法對(duì)氨基酸同分異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離；(2)通過質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。步驟(1)所述色譜分離條件是熱電HyPURTTYC18色譜柱200mmx2.1mm,5|jm;安捷倫Reliance保護(hù)柱套和EclipseXDB-C8保護(hù)柱12.5X2.1mm，5jam;進(jìn)樣方式5pL全環(huán)；流速200pL/min;柱溫箱25°C;樣品盤溫度15°C;注射器沖洗體積1000洗針體積800JiL;流動(dòng)相A:99%水-1%乙腈-0.1%九氟戊酸，流動(dòng)相B:10%水-90%乙腈-0.1%九氟戊酸。所述色譜分離流動(dòng)相的梯度如下表1所示表1流動(dòng)相梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的有益效果是(1)適當(dāng)降低柱溫可以明顯增加同分異構(gòu)體亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(He)在色譜柱上的分離度。(2)ThermoHyPURITYC18色譜柱配合99%水-1%乙腈-0.1%NFPA以及10%水-90%乙腈-0.1%NFPA作流動(dòng)相可以獲得良好的色譜峰形以及適宜的色譜運(yùn)行時(shí)間，并且可使同分異構(gòu)體Leu和Ile、Val和Nva達(dá)到基線分離。(3)本發(fā)明通過加標(biāo)法，分別加入一定量的lie和Val，對(duì)出峰順序進(jìn)行判斷。加入He或Val標(biāo)準(zhǔn)后，前面流出的色譜峰明顯增高，峰面積明顯增大，可以判定He和Val分別較Leu和Nva先流出。綜上所述，本發(fā)明應(yīng)用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析煙草中氨基酸同分異構(gòu)體，對(duì)氨基酸同分異構(gòu)體進(jìn)行液相色譜分離后再進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，通過控制液相色譜柱溫、選擇流動(dòng)相等，有效提高氨基酸同分異構(gòu)體的分離度，解決了氨基酸同分異構(gòu)體基線分離的技術(shù)難題。圖120種氨基酸和內(nèi)標(biāo)正纈氨酸的提取離子流圖圖2加標(biāo)前Ile和Leu提取離子流圖圖3加標(biāo)后lie和Leu提取離子流圖圖4加標(biāo)前Val和Nva提取離子流圖圖5加標(biāo)后Val和Nva提取離子流圖圖6氨基酸Ile、Leu、Val和Nva的二級(jí)質(zhì)譜圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例1液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析煙草制品中20種氨基酸的實(shí)驗(yàn)，尤其涉及氨基酸同分異構(gòu)體的分離檢測(cè)。1、儀器、材料與試劑美國(guó)熱電公司LC-MSLTQ液相色譜-離子阱質(zhì)譜儀，配備自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度質(zhì)譜泵，LTQ離子阱質(zhì)譜帶電噴霧電離源(ESI)，Xcalibur1.4SR1系統(tǒng)控制軟件；意大利ClaindN2LCMS氮?dú)獍l(fā)生器；法國(guó)MilliporeElementA10純水機(jī)；美國(guó)Cole-Parmer8892超聲清洗器；SartoriousCP225D電子天平(Max220g，d二0.01mg(80g)，0.1mg(220g));Whatman0.2尼龍針式濾頭；煙草粉末。混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(Fluka公司)，含17種氨基酸，濃度各為ImM;內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-正纈氨酸(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司)；天冬酰胺.水(上海伯奧生物科技有限公司)；色氨酸，脯氨酸和谷氨酰胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；Y-氨基丁酸(Sigma公司)；L-哌啶-2-羧酸、九氟戊酸(NFPA)(Aldrich公司);甲醇和乙腈(MERCK公司)；優(yōu)級(jí)純濃鹽酸；Milli-Q級(jí)水，由MillioreElementA10制備，若不經(jīng)特別說明，實(shí)驗(yàn)中用水均為Milli-Q級(jí)水。2、實(shí)驗(yàn)方法2.1色譜條件熱電HyPURITYC18色譜柱(200mmX2.1腿，5Mm)，安捷倫Reliance保護(hù)柱套和EclipseXDB-C8保護(hù)柱(12.5X2.1mm，5Mm)。進(jìn)樣方式全環(huán)(5叱)；流速200ML/min;柱溫箱25°C;樣品盤溫度15°C;注射器沖洗體積(flushvolume):1000HL;洗針體積(washvolume):800叱。流動(dòng)相A:99%水-1%乙腈-0.1%NFPA;流動(dòng)相B:10%水-90%乙腈-0.1%NFPA。流動(dòng)相梯度見表l。表l流動(dòng)相梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2質(zhì)譜條件氮?dú)鈮毫?.64MPa;氦氣壓力0,38MPa;極性正電離；掃描形式全掃描；采集時(shí)間40min;激活時(shí)間30ms;吹掃氣OLTQ單位；噴霧電壓5kV;毛細(xì)管溫度350°C;掃描范圍標(biāo)準(zhǔn)；掃描速率標(biāo)準(zhǔn)；分段、分段時(shí)間、分離寬度、歸一化碰撞能量等設(shè)置見表2，其中第3分段的鞘氣和輔助氣分別為38LTQ單位和OLTQ單位，其余分段的鞘氣和輔助氣分別為46LTQ單位和19LTQ單位。其他參數(shù)由自動(dòng)調(diào)諧確定或依照LTQ質(zhì)譜的默認(rèn)設(shè)置。表2分段、分段時(shí)間、分離寬度、歸一化碰撞能量等條件設(shè)置氨基酸分段分段時(shí)間離子變換分離寬度歸一化碰撞激活Q掃描范圍AminSegmeSegmentTransitionsIsolation能量ActivatiMassrangeoacidnttime(m/z)widthNormalizedonQCmz)(min)Cm/z)collisionenergy(%)Asn133.0—87.02350.2583-mAsp134.0—116.02.5300.2587.3-120Ser106.0~>60,0350.3055~90Gin147.0^130.02300.2580-133Thrl12120.0—102.02.5320.2570~105Glu148.0—102.02.5300.30100-133Pro116,0—70.02300.2560-120Cys241.0—152.02300.25150-181Gabal(H.O—87.02.5300.2584-105Pip130.0~>84.02.530(X2582-132Val118.0472.02350.3568-75Met150.0j132.82300.30100-135His156.0—110.02300.2590-113215.5Tyr182.0~>165.03300.25100-185Lys147-0~>130.02300.25128-132He,Leu132.0—86.02300.2582-89Aig175.04158.02300.2557-161Phe34166.0—120.02300.25110-170Tiy48.5205,0j188.02300,25150-1902.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用內(nèi)標(biāo)法定量。配制含內(nèi)標(biāo)正纈氨酸濃度為1.7iiM的氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液I(天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)、胱氨酸(Cys)、Y-氨基丁酸(Gaba)、哌啶酸(Pip)、纈氨酸(Val)、甲硫氨基酸(Met)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Try)的濃度均為50^iM的0.03MHC1溶液)；配制含內(nèi)標(biāo)正纈氨酸濃度為1.7|uM的氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)溶液II(脯氨酸(Pro)和天冬酰胺(Asn)的濃度分別為500^iM的0.03MHC1溶液)。用含正纈氨酸濃度為1.7^iM的0.03MHC1把標(biāo)準(zhǔn)溶液I和標(biāo)準(zhǔn)溶液II配成系列濃度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.4樣品處理稱取0.10.2g煙末置于錐形瓶中，加入20mL含正纈氨酸濃度為1.7|iM的0.03MHC1溶液，超聲震蕩15min，搖蕩錐形瓶片刻使溶液濃度分配均勻，經(jīng)0.2Mm濾膜過濾后直接進(jìn)樣。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1色譜條件的確定3.1.1氨基酸對(duì)溫度的要求溫度較高時(shí)，氨基酸混標(biāo)容易發(fā)生反應(yīng)，使某些氨基酸含量降低。因此，所有氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不使用時(shí)應(yīng)及時(shí)保存在2。C以下，并且在分析樣品時(shí)把樣品盤設(shè)定在較低的溫度15°C。為了避免柱溫較高時(shí)氨基酸可能在柱內(nèi)產(chǎn)生變化，把柱溫箱設(shè)定在25°C。適當(dāng)降低柱溫的另一個(gè)目的是可明顯增加同分異構(gòu)體亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(lie)在色譜柱上的分離度，見附圖1。但柱溫不宜設(shè)定過低，以免柱壓過大，同時(shí)亦使Phe和Try出峰延遲，增加分析時(shí)間。3.1.2色譜柱和流動(dòng)相本發(fā)明在C18分析柱上試驗(yàn)過多種流動(dòng)相，結(jié)果表明ThermoHyPURITYC18配合99%水-1%乙腈-0.1%NFPA以及10%水-90%乙腈-O.1%NFPA作流動(dòng)相可以獲得良好的色譜峰形以及適宜的色譜運(yùn)行時(shí)間，同時(shí)可使同分異構(gòu)體Leu和lie達(dá)到基線分離，見附圖1。NFPA用作流動(dòng)相改性劑。此外，NFPA還有利于增強(qiáng)電噴霧質(zhì)譜對(duì)氨基酸的正電離檢測(cè)信號(hào)。乙腈容易洗脫NFPA，過多的NFPA容易增加背景干擾，影響檢測(cè)靈敏度，因此，流動(dòng)相B的使用比例不易過高，實(shí)驗(yàn)把流動(dòng)相B的比例控制在25%以下，可達(dá)到良好分離檢測(cè)的效果。需注意的是，NFPA會(huì)在色譜柱內(nèi)不斷積聚并慢慢改變固定相的性質(zhì)，使氨基酸的出峰時(shí)間改變。為了保證良好的保留時(shí)間重現(xiàn)性，更方便的進(jìn)行定性定量分析，在進(jìn)樣100針后，用100%乙腈沖洗色譜柱30min，洗脫過多積聚的NFPA，再用流動(dòng)相平衡色譜柱后進(jìn)樣。3.1.3內(nèi)標(biāo)物的選擇正纈氨酸不存于煙草氨基酸中，在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定且能和其同分異構(gòu)體纈氨酸在色譜上完全分離，且價(jià)格較低，是比較理想的內(nèi)標(biāo)物。3.1.4氨基酸同分異構(gòu)體的鑒別亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)和正纈氨酸(Nva)互為同分異構(gòu)體，二級(jí)質(zhì)譜相似，無法單用質(zhì)譜加以鑒定，因此本發(fā)明設(shè)計(jì)結(jié)合色譜分離進(jìn)行區(qū)分。實(shí)驗(yàn)通過加標(biāo)法，分別加入一定量的lie和Val，對(duì)出峰順序進(jìn)行判斷，lie和Val的加入量按照實(shí)驗(yàn)常規(guī)。加入Ile(或Val)標(biāo)準(zhǔn)后，前面流出的色譜峰高明顯增高，峰面積明顯增大，可以判定lie和Val分別較Leu和Nva先流出，見附圖2附圖5加標(biāo)前后提取離子流圖對(duì)照。3.2質(zhì)譜條件的確定在優(yōu)化色譜分離條件的同時(shí)本發(fā)明對(duì)質(zhì)譜的條件也進(jìn)行恰當(dāng)設(shè)置，這對(duì)氨基酸的準(zhǔn)確及高靈敏度檢測(cè)十分重要。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了二級(jí)全掃描(FullMS2)和選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)兩種掃描模式。二級(jí)全掃描能有效地降低背景干擾，獲得更高的靈敏度，且選擇性優(yōu)于SIM，檢測(cè)效果較佳，因此實(shí)驗(yàn)選擇二級(jí)全掃描進(jìn)行定量分析。在21種氨基酸的二級(jí)質(zhì)譜中，除Arg和Cys外，其余氨基酸主要的離子碎片均為脫羧基、脫羥基或脫氨基峰，即[M-HCOOH+H]+、[M-H20+H]+或[M-N2H+H]+。定量離子的準(zhǔn)確選擇關(guān)系到質(zhì)譜定量的特征選擇性。定量離子優(yōu)先選取相對(duì)豐度較大的特征子離子，以獲得較好的靈敏度。對(duì)于Glu，因子離子m/z130的特征性不強(qiáng)，有干擾峰重疊，因此選擇相對(duì)豐度次強(qiáng)的脫羧基峰m/z102。不同的分段(Segment)可調(diào)用獨(dú)立的調(diào)諧文件，有利于提高檢測(cè)的靈敏度。實(shí)驗(yàn)根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間間隔，劃為4個(gè)分段。適當(dāng)?shù)膾呙璺秶欣诮档捅尘霸胍艏半s質(zhì)干擾，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)對(duì)各氨基酸的掃描范圍進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)置，見表2所示。3.3前處理?xiàng)l件的確定3.3.1不同提取溶液對(duì)色譜峰形的影響實(shí)驗(yàn)用不同濃度的酸性溶液對(duì)煙草中的氨基酸進(jìn)行提取，包括甲酸、乙酸和鹽酸溶液。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，lmM乙酸提取溶液使Val、Nva、His、lie和Leu等氨基酸的色譜峰分叉開裂，且隨著濃度的提高，色譜峰分叉開裂的現(xiàn)象越為明顯。甲酸提取溶液也有類似的現(xiàn)象。而HC1提取溶液則能在ds柱上獲得較好的峰形。3.3.2不同提取溶液的提取效果實(shí)驗(yàn)對(duì)比了幾種較常用的提取溶液的提取效果，即70%甲醇溶液、80%乙醇溶液和0.1MHC1。稱取等量的煙草樣品，通過對(duì)比氨基酸色譜峰面積，來比較三種溶液的提取效果。由表3可見，80%乙醇提取的氨基酸含量最低，709&甲醇提取的Val、His、Tyr、Lys、Phe和Try等多種氨基酸含量均明顯低于用0.1MHC1提取的。綜合比較，0.1M的鹽酸溶液的提取效果較好。表3不同提取溶液的提取效果對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.3.3不同濃度的HCl溶液的提取效果稱取等量煙末樣品，對(duì)比不同濃度HC1提取溶液的提取效果(表4)。0.1MHCl對(duì)Ser、Glu、Lys和Arg的提取效果較差，0.05MHC1的對(duì)Lys和Arg的提取效果均不好。0.03MHCl對(duì)Lys的提取效果明顯增加。綜合比較，選用0.03MHC1作為提取溶液。表4不同濃度的HCl溶液的提取效果對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>稱取O.lg煙末，加入20mL萃取溶液，在超聲震蕩下分別萃取15min、30min、45min和60min，過0.2Mm濾膜后進(jìn)LC-MS分析。每個(gè)樣品進(jìn)兩針，峰面積取平均值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15min的提取時(shí)間已經(jīng)能達(dá)到提取效果。由于稱樣量較少，萃取溶劑量大大超過稱樣量，而氨基酸能較快的溶解于鹽酸溶液，因此能較快的達(dá)到溶解平衡。3.4小結(jié)氨基酸待測(cè)試樣經(jīng)本發(fā)明方法所述前處理過程后經(jīng)過液相色譜分離，分離條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置，亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)和正纈氨酸(Nva)的分離度得到有效提高，二級(jí)質(zhì)譜圖見附圖6。3.5實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證煙草中的20種待測(cè)氨基酸的含量相差懸殊，有的低于檢測(cè)限，如Cys，有的則含量高達(dá)0.2°/。以上，如Pro。為了同時(shí)測(cè)定20種氨基酸，本發(fā)明建立了兩種不同濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即對(duì)含量較高的Pro和Asn建立一種濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)其他氨基酸建立另一種濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，一個(gè)樣品一次進(jìn)樣便可得出所有氨基酸的測(cè)試數(shù)據(jù)，達(dá)到節(jié)約時(shí)間，提高效率的目的。方法的檢出限通過實(shí)際測(cè)定系列低濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，以S/N二3來確定。方法檢出限良好，在0.010.05(iM(S/N二3)之間，相關(guān)系數(shù)(一)均大于0.9977，精密度在0.784.93RSDW之間。實(shí)驗(yàn)通過標(biāo)準(zhǔn)加入法確定方法的回收率。準(zhǔn)確稱取煙末204.09mg，用20mL萃取液提取，平行測(cè)定5次，取平均值作為回收率計(jì)算的依據(jù)。然后稱取煙末三份，分別為191.60mg、209.80mg和159.33mg，根據(jù)2.4的樣品處理方法，分別加標(biāo)，使加標(biāo)濃度分別為l一、10jiM和20hM。其中，對(duì)含量低于1,的氨基酸，只進(jìn)行l(wèi)!LiM加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)含量低于L5^M的氨基酸，進(jìn)行1^M和1(^M加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于含量較高的Asn和Pro，進(jìn)行10一和20jJI加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。氨基酸回收率基本在81108%之間，Ile和Arg的回收率較低，分別為75%和53%。20種氨基酸的檢出限、定量限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、精密度和回收率見表5。表520種氨基酸的檢出限(LOD)、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(一)、精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.一種煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法，采用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離測(cè)定，其特征在于包括以下步驟(1)通過液相色譜對(duì)氨基酸同分異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離；(2)通過質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。全文摘要本發(fā)明公開了一種煙草中氨基酸同分異構(gòu)體的分離測(cè)定方法，采用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離測(cè)定，包括通過液相色譜法對(duì)氨基酸同分異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)步驟。本發(fā)明在應(yīng)用液相色譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析煙草中氨基酸含量時(shí)，通過控制柱溫、選擇流動(dòng)相、以及加標(biāo)法的應(yīng)用，有效解決了氨基酸同分異構(gòu)體基線分離的技術(shù)難題。文檔編號(hào)G01N30/02GK101285800SQ20081002769公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年4月25日優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日發(fā)明者黃翼飛申請(qǐng)人:廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司