專利名稱：：檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化特征蛋白的質(zhì)譜模型及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于質(zhì)譜檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及對原發(fā)性膽汁性肝硬化血液優(yōu)化的質(zhì)譜檢測方法。一種通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的磁珠基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化生物標(biāo)志。在此提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到已經(jīng)脫離人體的體液中的原發(fā)性膽汁性肝硬化生物標(biāo)志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性自身免疫性肝臟疾病，該病以肝內(nèi)細(xì)小膽管非化膿性進(jìn)行性破壞并伴門脈炎癥性改變，長期持續(xù)性肝內(nèi)膽汁淤積、最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化的慢性進(jìn)展性自身免疫性疾病為主要特征。近年的調(diào)査研究表明，PBC在世界范圍內(nèi)已經(jīng)不再是罕見疾病，特別是在東方人群中，無癥狀的PBC患者可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我們現(xiàn)在估計(jì)的數(shù)量，而且PBC在中國人群中的發(fā)病率和死亡率可能都高于其它地方。目前，對于PBC診斷最可靠的方法仍然是肝臟組織病理活解。然而，很多PBC患者不愿意接受這種具有創(chuàng)傷性的侵入檢查，很多接受檢查的PBC患者肝臟組織病理活解并不能找到特征性的病理改變。除此之外，血清中高滴度的抗線粒體抗體(AMA)目前也作為診斷PBC的一個重要指標(biāo)，但是該抗體對于PBC的診斷并不特異，在其它疾病狀態(tài)，如感染性肝病等也經(jīng)常出現(xiàn)，這對于像我們這樣的肝炎大國來說顯得非常不利。還有研究發(fā)現(xiàn)，1(m左右的PBC患者血清中檢測不到AMA。由于現(xiàn)有的檢測技術(shù)限制導(dǎo)致很多PBC患者到了疾病終末期才被檢測，這一現(xiàn)狀已經(jīng)不能滿足臨床對于疾病早期診斷、早期治療的要求，在臨床醫(yī)療中仍然迫切需要診斷PBC的新方法。原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性自身免疫性肝臟疾病，以肝內(nèi)細(xì)小膽管非化膿性進(jìn)行性破壞并伴門脈炎癥性改變，長期持續(xù)性肝內(nèi)膽汁淤積、最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化為主要特征。由于現(xiàn)有的檢測技術(shù)限制導(dǎo)致很多PBC患者到了疾病終末期才被檢測，在臨床醫(yī)療中迫切需要檢測PBC的新方法?，F(xiàn)有的研究表明蛋白指紋圖譜技術(shù)可用于很多疾病的早期檢測，膽汁郁積性疾病在人群中的發(fā)生率非常高，因此把PBC患者從這類人群中區(qū)分出來在臨床診療中顯得非常重要(KimWR,LudwigJ,LindorKD.Variantformsofcholestaticdiseasesinvolvingsmallbileductsinadults.勘/fe^roe/7"rW2000;95:1130-1138)。目前依靠組織病理活解、生化檢查以及血清自身抗體檢查僅能發(fā)現(xiàn)并診斷50-60y。的PBC患者，這一現(xiàn)狀無法很好的滿足臨床診療需求，因此，PBC的診斷仍舊顯得并不十分完善(HeXS，AnsariAA，RidgwayWM，C叩pelRL，GershwinME.Newinsightstothei鵬unopathologyandautoimmuneresponsesinprimarybiliarycirrhosis./鵬""o72006;239:1-13.)。蛋白質(zhì)的分離技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個目的。第一、通過將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物；第二、通過標(biāo)記的方法可以比較兩個蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳(two_dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HP1X)、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親禾口層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,簡稱磁珠)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點(diǎn)，具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復(fù)性好、可機(jī)械化操作和方法靈活等特點(diǎn)。待測樣品來源廣泛，不需作特殊前處理，可以直接點(diǎn)樣檢測，如血清、尿液及組織液等；檢測快速，一般一例標(biāo)本的檢測時間僅需約5分鐘，從標(biāo)本制備到出結(jié)果全過程僅約1小時。蛋白芯片和磁珠兩項(xiàng)新的蛋白指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在生物標(biāo)志(biomarker)檢測方面創(chuàng)造革命性突破(許洋，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷與臨床醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:134-142)。基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-T0F-MS)。2-DE最先被用于臨床蛋白組學(xué)研究，但其對疏水性、強(qiáng)酸性和強(qiáng)鹼性蛋白的分辯率不夠，而且不能檢測低豐度蛋白，故實(shí)用價(jià)值受限。近來，蛋白芯片與質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-T0F-MS)的結(jié)合，己被成功地用于腫瘤研究；但由于磁珠表面的結(jié)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高(劉建棟等，血液蛋白質(zhì)組與質(zhì)譜儀檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化初探?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:193-197)。磁珠具有優(yōu)于二維電泳、蛋白芯片和其他質(zhì)譜方法的特點(diǎn)，已被廣泛地用于腫瘤生物標(biāo)志的篩査等研究(屠世良等，癌胚抗原陰性結(jié)直腸癌的檢測和結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:926-931)。該技術(shù)具有操作簡便、無需離心樣品、可直接分析原始生物樣本(如血清、尿液等)、樣本用量小等特點(diǎn)，同時適合多樣品平行檢測和直接進(jìn)行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補(bǔ)，目前已被廣泛地用于腫瘤標(biāo)志的篩査和臨床檢測，并均己獲得很好的結(jié)果。但國內(nèi)迄今尚無采用磁珠與質(zhì)譜技術(shù)獲得檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清特征蛋白的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為克服對目前原發(fā)性膽汁性肝硬化血清檢測技術(shù)的不足之處，建立一種檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型及其制備方法和應(yīng)用，該模型為早期檢測提供了新的途徑和方法，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提出的檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出69蛋白作為特征蛋白；選取上述69個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M,建立了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者與正常人相鑒別的患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z二8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19;分子量(m/z)誤差〈0.01°/。，臨界峰值均值M的CV<5亂本發(fā)明提出上述的檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)4'C條件下2小時內(nèi)收集經(jīng)明確診斷的原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清及經(jīng)體檢確定為正常健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行一80'C低溫冷凍備用；病人和血清樣本隨后被分成兩組一組為訓(xùn)練集，另一組為盲測組(表l);表1原發(fā)性膽汁性肝硬化患者、其他肝臟疾病患者與健康對照組臨床資料分組例數(shù)男/女年齡范圍平均年齡健康對照組4327/1625-7838.6±10.9PBC組443/4116-7454.1±11.3其他肝病組3217/1518-7550.6±13.12)采用WCX磁珠對所述原發(fā)性膽汁性肝硬化患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)對結(jié)合在弱陰離子表面的WCX磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，設(shè)定最高檢測分子量為50kDa，優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080，激光強(qiáng)度150-180，檢測敏感度為7-8，收集總數(shù)為130次，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差〈0.01%，從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜；5)定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至50%信號強(qiáng)度的最大值，使臨界峰值均值M的CV〈510%，并收集精確的質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；6)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-WhitneyV檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者和正常人血清之間蛋白峰值的差異(共得到260個蛋白峰，認(rèn)定P值小于0.05時具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，檢測出2組血清蛋白指紋質(zhì)譜圖譜之間有69個穩(wěn)定的差異蛋白，見表3:表3原發(fā)性膽汁性肝硬化組、其他肝臟疾病組和健康對照組之間存在的69個差異蛋白峰質(zhì)荷比M/Z,值質(zhì)荷比M/Z尸值質(zhì)荷比M/Z尸值30882.70E-09164890.00094236810.01216925431.31E-0833750.001028287900.0123738133A2.20E-0792800.00104577610.01245776282.71E-0728690.0012803445A0.01350086002.95E-07160770.001831250990.01511754771.55E--0558550.00225945280.018915318422.06E--0537740.002416432190.01939639354.21E--0582900.002421240150.02350127594.67E--0543820.00266846760,02356542817.05E-05280260.00267970490.0272957.9犯-0546450.00270833970.02999979670.00013794870.00272238870.03001439550.000150233860.00327396060.033309227980.00015152460.003700325500.035143158740.000196140160.00419852140.038265114850.00021256340.00508653840.04137140680.00022497940.00555375540.04186780710.000280141030.0056224260A0.043380156080.00032574050.006566476330.04407258030.00037953150.00751914980.045245116970.000571439170.01010893990.04633368460.000664466140.01109991160.04741516290A0.00078085540.01144255250.048693m/z表示質(zhì)荷比P由原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的對照產(chǎn)生標(biāo)志著的峰被選為原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?biāo)記峰將上述69個差異蛋白作為原發(fā)性膽汁性肝硬化質(zhì)譜檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶卣鞯鞍?；由于多個特征蛋白組合起來才可將原發(fā)性膽汁性肝硬化與正常人等完全分開，故選取上述69個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者與正常人兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型(圖2)，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/^8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19。將統(tǒng)計(jì)分析得到的69個差異蛋白峰篩選PBC的最佳標(biāo)志物。結(jié)果顯示分子量為3445、4260、8133和16290Da的4個蛋白為檢驗(yàn)PBC的最佳標(biāo)志物，如圖l。這4個蛋白標(biāo)志物組成的檢驗(yàn)?zāi)Ｐ湍芎芎玫膶BC患者區(qū)分出來，其檢驗(yàn)?zāi)Ｐ腿鐖D2。該檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拿舾行詾?3.3%,特異性為95.1%，如表4，其檢驗(yàn)R0C曲線如圖3。表4PBC檢測模型的診斷特性及盲法驗(yàn)證結(jié)果實(shí)驗(yàn)分組臨床分組例數(shù)檢測正確例數(shù)檢測正確率建模組PBC302893.33%對照413995.12%盲法驗(yàn)證組PBC141392.86%對照342882.35%AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者蛋白指紋圖譜比較采用軟件對AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者蛋白指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)分子量為3682、3935、4068、4472和8133的5個蛋白質(zhì)峰在兩組患者之間存在顯著性差異(代0.05)，如圖4。利用該質(zhì)譜模型，只要將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)檢驗(yàn)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本發(fā)明的特點(diǎn)及效果本發(fā)明與其他原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的檢測方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)第一、本發(fā)明采用原發(fā)性膽汁性肝硬化患者與正常人具有差異的多個特征蛋白組合起來進(jìn)行對原發(fā)性膽汁性肝硬化血清的檢測，提供的質(zhì)譜模型是原發(fā)性膽汁性肝硬化早期檢測和篩査的新方法和新途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的原發(fā)性膽汁性肝硬化生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)；第二、與以往的血清學(xué)檢測方法比較具有較高的敏感性和特異性，是一種在蛋白組學(xué)水平上的檢測，對原發(fā)性膽汁性肝硬化的早期檢測提供了新標(biāo)準(zhǔn)；第三、本發(fā)明由于磁珠表面的結(jié)合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白芯片，從而磁珠的靈敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的靈敏度，從而優(yōu)化了質(zhì)譜模型；第四、本發(fā)明采用了定量性質(zhì)譜調(diào)控，CV〈510%，使磁珠的臨界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精確；第五、本發(fā)明采用了用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性的2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差<0.01%，從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜；第六、本發(fā)明質(zhì)譜模型的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)精確及合理可行，為降低我國原發(fā)性膽汁性肝9硬化的病死率、提高原發(fā)性膽汁性肝硬化的臨床治愈提供了一種新的篩查評估方法。說明書附圖圖1建立PBC檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?個蛋白峰在PBC、其它肝臟疾病組(HD)和健康對照組(Nor)之間的典型圖譜圖2PBC檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛨D圖3PBC檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腞OC曲線圖4AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者5個差異蛋白峰的典型圖譜圖中m/z表示特異蛋白的質(zhì)荷比，M代表該特異蛋白的臨界峰值均值具體實(shí)施例方式本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1正常與原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實(shí)驗(yàn)方法119例血清樣品，其中包括PBC患者44例(所有病例符合PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn))，其它肝臟疾病患者32例(包括自身免疫性肝炎10例、乙型肝炎10例、肝硬化9例、酒精性肝炎1例、藥物性肝炎l例和原發(fā)性硬化性膽管炎l例)，健康體檢者43例，詳細(xì)臨床資料及分組信息見表l，2:表1PBC患者、其他肝臟疾病患者與健康對照組臨床資料<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2用于建模和盲法驗(yàn)證的血清分組資料臨床分組建模組盲法驗(yàn)證組總數(shù)健康對照組23iTPBC組301444其他肝病組181432磁珠操作步驟血清樣品處理從-8(TC冰箱中取出血清，于4°C，10000rpm離心5min。取10叱血清樣品，加20叱U9處理液(9mo1/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50腿ol/LTris-CL,pH9.0),充分混勻，冰浴振蕩30min后取出，加入360A結(jié)合緩沖液(10Ommol/LNaAc，pH4.0),立即混勻。所有樣本在分析前僅被凍溶一次(劉建棟等，血液蛋白質(zhì)組與質(zhì)譜儀檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化初探?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007,27:193-197)。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOO叱加至已裝好WCX磁珠(弱陰離子表面，羧酸基團(tuán)，捕獲正電荷基團(tuán)蛋白)的PCR管中，置磁性處理器上孵育30rain，除去液體。加IOO叱磁珠結(jié)合緩沖液(50mmol/LNaAc，pH4.04.3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復(fù)上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脫標(biāo)本至上清液。取5叱上清液移至另一個PCR管中，加入5PLSPA飽和溶液充分混勻，取1A混合溶液加樣到Au或Steel片上，晾干后上機(jī)測量。數(shù)據(jù)收集將處理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。在讀取數(shù)據(jù)前，用加有aU-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差〈0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數(shù)設(shè)定為，最高檢測分子量為50kDa,優(yōu)化分子量范圍100015000Da，最佳聚集中心8000Da，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍2080，收集總數(shù)為130次。軟件中設(shè)定讀片程序，以讀取數(shù)據(jù)。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號強(qiáng)度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，使分子量誤差〈0.01%，從而獲得的精確的蛋白質(zhì)譜圖譜。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白質(zhì)譜圖譜。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至4050%信號強(qiáng)度的最大值，并且用最顯著的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n〉5)。分析所有150kDa之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢査了每個相應(yīng)的峰，計(jì)算出峰的平均值M，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。用Mann-Whitney"檢驗(yàn)比較配對樣本的蛋白峰，計(jì)算尸值。原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)檢測多肽蛋白篩選用Mann-Whitney〃檢驗(yàn)比較配對樣本的蛋白峰，CV〈510%;初步分析篩選出尸〈0.05的PBC組與對照組之間蛋白指紋圖譜比較對建模組的71例樣本檢測得到的蛋白指紋圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)69個蛋白質(zhì)峰存在顯著性差異，詳見表3。表3PBC組、其他肝臟疾病組和健康對照組之間存在的69個差異蛋白峰<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>16290A0.00078085540.01144255250.048693m/z表示質(zhì)荷比P由原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的對照產(chǎn)生標(biāo)志著'▲，的峰被選為原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?biāo)記峰將上述69個差異蛋白作為原發(fā)性膽汁性肝硬化質(zhì)譜檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶卣鞯鞍?；?shí)施例2臨床試用及雙盲測試由于多個特征蛋白組合起來才可將原發(fā)性膽汁性肝硬化與正常人等完全分開，故選取上述69個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者與正常人相鑒別的兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型(圖2)，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z=8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M>0.23;m/z=4260，M《2.19。PBC患者血清蛋白標(biāo)志物的篩選及檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒔y(tǒng)計(jì)分析得到的69個差異蛋白峰篩選診斷PBC的最佳標(biāo)志物。結(jié)果顯示分子量為3445、4260、8133和16290Da的4個蛋白為檢驗(yàn)PBC的最佳標(biāo)志物，如圖l。這4個蛋白標(biāo)志物組成的檢驗(yàn)?zāi)Ｐ湍芎芎玫膶BC患者區(qū)分出來，其檢驗(yàn)?zāi)Ｐ腿鐖D2。該檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拿舾行詾?3.3%，特異性為95.1%，如表4，其檢驗(yàn)R0C曲線如圖3。AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者蛋白指紋圖譜比較采用軟件對AMA-M2陽性與AMA-M2陰性PBC患者蛋白指紋圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)分子量為3682、3935、4068、4472和8133的5個蛋白質(zhì)峰在兩組患者之間存在顯著性差異(代0.05)，如圖4。檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷拿し?yàn)證采用48例樣本檢測得到的蛋白指紋圖譜對己建立的PBC檢驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行盲法驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果表明該模型對PBC的檢驗(yàn)敏感性為92.9M，特異性為82.4%，如表4。表4PBC檢測模型的診斷特性及盲法驗(yàn)證結(jié)果實(shí)驗(yàn)分組臨床分組例數(shù)檢測正確例數(shù)檢測正確率建模組PBC302893.33%對照413995.12%盲法驗(yàn)證組PBC141392.86%對照342882.35%利用該質(zhì)譜模型，只要將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可用于原發(fā)性膽汁性肝硬化檢驗(yàn)。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。1權(quán)利要求1、一種檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清特征蛋白的質(zhì)譜模型，其特征在于從血清中篩選出69蛋白作為特征蛋白；選取上述69個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者與正常人相鑒別的患者兩兩鑒別的血清特征蛋白檢測質(zhì)譜模型，所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z＝8133，M≤9.27；m/z＝3445，M≤1.67；m/z＝16290，M≥0.23；m/z＝4260，M≤2.19；2、一種檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清蛋白質(zhì)譜模型的制備方法，包括以下步驟1)4'C條件下2小時內(nèi)收集經(jīng)明確診斷的原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清及經(jīng)體檢確定為正常的健康者的血清作為兩組血清標(biāo)本，進(jìn)行一8(TC低溫冷凍備用；2)采用WCX磁珠對所述原發(fā)性膽汁性肝硬化患者及正常人的兩組血清標(biāo)本的蛋白進(jìn)行吸附；3)用激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離己洗脫的血清蛋白后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)對結(jié)合在弱陰離子表面的WCX磁珠或C8及C18疏水基質(zhì)磁珠上的兩組血清蛋白進(jìn)行讀取，由此獲得兩組蛋白質(zhì)譜圖譜；4)在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白及質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控0型血清校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差〈0.0W和臨界峰值均值M的CV〈510%，并精確地、定量地收集原發(fā)性膽汁性肝硬化患者和正常人優(yōu)化的血清質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)；5)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者和正常人血清之間蛋白峰的差異，檢測出2組血清蛋白質(zhì)譜圖譜之間有69個穩(wěn)定的差異蛋白及其臨界峰值；將所述69個差異蛋白作為原發(fā)性膽汁性肝硬化蛋白質(zhì)譜模型的特征蛋白；6)選取所述69個特征蛋白中任意兩個或兩個以上的蛋白，以各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M構(gòu)成用于檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化血清特征蛋白質(zhì)譜模型；所說的特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比m/z和臨界峰值均值M分別為m/z^133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19;分子量(m/z)誤差〈0.01%，臨界峰值均值M的CV<510%;3、選取如權(quán)利要求1所述的血清69個蛋白中任意兩個或兩個以上的特征蛋白，利用該質(zhì)譜模型，將受檢者血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發(fā)明的質(zhì)譜模型逐一進(jìn)行對比分析，就可應(yīng)用于原發(fā)性膽汁性肝硬化的早期檢測、篩査。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測原發(fā)性膽汁性肝硬化特征蛋白的優(yōu)化質(zhì)譜模型及其制備方法，屬于質(zhì)譜檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的原發(fā)性膽汁性肝硬化生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明對于原發(fā)性膽汁性肝硬化的檢測優(yōu)于目前所采用的任何單一檢測方法，為原發(fā)性膽汁性肝硬化的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了一種非侵入性檢測技術(shù)，從而為降低原發(fā)性膽汁性肝硬化的病死率、提高原發(fā)性膽汁性肝硬化的治愈率，并進(jìn)一步為高危人群篩查原發(fā)性膽汁性肝硬化提供了一種新方法。文檔編號G01N27/64GK101487817SQ20081000051公開日2009年7月22日申請日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日發(fā)明者寧李,李永哲,胡朝軍,洋許申請人:洋許