專利名稱：：唾液分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及唾液的光譜分析，具體地講涉及唾液光譜的多變量分析。此類分析可用于評估個體或群體的口腔健康，或用于表征諸如牙膏或漱口水等處理產(chǎn)品對口腔環(huán)境的影響。
背景技術(shù)：
：人類和其他動物易患諸如齲齒、齒齦炎和口臭等許多不可取的口腔病癥。這些病癥中有許多是由口腔內(nèi)的細(xì)菌或其他微生物引起的或介導(dǎo)的。正常情況下，各式各樣的細(xì)菌存在于口腔中，通常作為生物膜駐留在口腔的表面上，尤其是在牙齒、齒齦和舌頭上。一些細(xì)菌或微生物比其它的更有害。通常，不可取的口腔病癥作為低級的幾乎不可察覺的小毛病開始。如果不進(jìn)行處理，將會發(fā)展成更嚴(yán)重的病癥。在早期階段檢測這些小毛病可能很難。雖然醫(yī)生和專業(yè)牙醫(yī)在此類檢測方面受過訓(xùn)練，但是正確的檢查很費(fèi)時。此外，即使受過訓(xùn)練的專業(yè)人員也很難量化小毛病的程度，并且評定時的主觀因素會導(dǎo)致可重復(fù)性很差。評定個體內(nèi)的小毛病隨時間加重或減輕尤其是個難題。結(jié)果，當(dāng)評價用于處理此類小毛病的產(chǎn)品時，可靠的臨床試驗(yàn)通常需要大的基礎(chǔ)規(guī)模，并且可能必須進(jìn)行幾個月以便能夠檢測不同產(chǎn)品之間的差異，盡管這些差異可能在臨床上很重要。影響這些評定的其他因素包括受試者之間的高度易變性、適于參與試驗(yàn)的個體的相對不足、以及在進(jìn)行試驗(yàn)時個別參與者背離所要求的方案，諸如忘記使用或未正確使用處理產(chǎn)品。所有這些使進(jìn)行臨床試驗(yàn)非常昂貴，繼而阻滯改進(jìn)的處理產(chǎn)品的開發(fā)。人們已經(jīng)在用于評定口腔健康的改良方法中投入了許多努力。一種評定口腔的情形的簡單并且熟知的實(shí)例為使用用于染色的牙斑顯露表，從而展現(xiàn)牙齒上細(xì)菌斑點(diǎn)的量。盡管該測試進(jìn)行起來筒單，但是不能充分區(qū)分有害細(xì)菌和其他細(xì)菌，因此不能作為疾病狀態(tài)的可靠指示。人們長久認(rèn)為，細(xì)菌代謝物可能與口腔疾病有關(guān)。例如，Singer和Bruckner曾在1981年5月的InfectionandImmunity第458-463頁報道了丁酸鹽和丙酸鹽的細(xì)胞毒性質(zhì)，兩種鹽均由牙斑菌分泌。Singer也在US5,376,532中描述了齦溝液(GCF)中(3-葡萄糖醛酸酶含量的分光光度曲線分析作為檢測處于牙周病危險中的患者的方法。2004年5月20日公布的俄羅斯專利2229130通過定量唾液中的短鏈脂肪酸(特別是乙酸、丙酸和丁酸)使用類似的發(fā)現(xiàn)物作為確定口腔微生物群落紊亂的基礎(chǔ)。這些公開的方法許諾對多種細(xì)菌菌種數(shù)目進(jìn)行更加"i,細(xì)的分才斤。唾液分析的使用也有長久的歷史。EP158796(Shah等人)描述了使用比色試驗(yàn)來確定唾液樣本中的過氧化物酶作為檢測由牙周病引起的炎癥的存在的方法。最近，JP2002/181815描述了使用涂有抗人體血色素單克隆抗體的帶條來檢測人類唾液中的潛血來作為用于牙周病的篩選試驗(yàn)。在該方法中，描述了個體通過用漱口水漱口并吐出來提供唾液樣本。WO03/083472的發(fā)明也使用受試者的唾液來評定牙周病的危險，在該案例中通過凝膠電泳檢查特定蛋白質(zhì)的存在/不存在，而WO2005/050204使用唾液作為樣品通過檢測乳鐵蛋白多肽來診斷牙周病的危險。此外，Denny等人在US2003/0040009中報道了使用唾液分析通過定量唾液中的粘液素來預(yù)測疾病危險，尤其是齲齒危險。Silwood等人在J.Dent.Res.81(6):422-427，2002中報道了人類唾液的和13C核磁共振譜。作者報道了幾種生物分子以及生物分子的樣式在受試者之間的高度內(nèi)外易變性的識別。得出以下結(jié)論"核磁共振譜可用作人類唾液的多組分分析的強(qiáng)有力技術(shù)，，。作者建議該技術(shù)可以用來跟蹤口腔健康護(hù)理產(chǎn)品對牙周病患者的影響。前述的公開內(nèi)容主要涉及唾液中具體化學(xué)成分的分析。一種使用通過多種分析(包括光i普和色譜分析)獲得的小分子特征圖的技術(shù)被WO01/78652的作者描述為"代謝組學(xué)"。這里強(qiáng)調(diào)使用整個特征圖而不是個別化學(xué)信號來診斷并預(yù)測疾病狀態(tài)、預(yù)測個體對治療劑的響應(yīng)、以及用于監(jiān)測治療劑在臨床試驗(yàn)中的效力。在過去幾年，使用一種包括光諳數(shù)據(jù)的多變量分析的技術(shù)"代謝組學(xué)"來評定疾病狀態(tài)也已受到很大關(guān)注，特別是來自Nicholson及其合作者的關(guān)注。例如，W002/086478提供了光譜分析的詳細(xì)公開，具體地講提供了'H核磁共振譜的主要成分分析及其作為診斷技術(shù)的使用。該公布公開了可能應(yīng)用該技術(shù)的一長串疾病，包括例如齲齒、齒齦疾病和齒齦炎等牙齒疾病。該公布還公開了可應(yīng)用該技術(shù)的許多流體樣本類型，包括唾液。W003/107270建立于用于受試者的新陳代謝顯型的代謝組學(xué)方法。該專利申請?zhí)貏e描述了代謝組學(xué)的下列應(yīng)用預(yù)測對定量給藥的響應(yīng)、挑選一批表現(xiàn)型類似的受試者、以及用于使生物標(biāo)記容易識別。W02004/038602進(jìn)一步描述了與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集有關(guān)的數(shù)據(jù)采集的通用技術(shù)。US2007/0043518(Nicholson等人)在可在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集上進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析以及它們用于識別復(fù)雜體系的組分(例如識別生物流體中的生物標(biāo)記)方面進(jìn)行了詳述。盡管有前述內(nèi)容，仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)臨床試驗(yàn)的管理、開發(fā)改進(jìn)的處理產(chǎn)品，尤其是用于口腔護(hù)理的產(chǎn)品、以及表征處理產(chǎn)品對口腔環(huán)境影響的更結(jié)構(gòu)化的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及分析唾液樣本的方法，具體地講通過使用唾液的光譜代謝組學(xué)分析來獲得個體的口腔生物化學(xué)的全貌。為了方便，本文也稱該方法為"唾液代謝組學(xué)"。唾液樣本的取得是非侵入性的，并且可以由個體在方便的時間于家中進(jìn)行。樣本容易被穩(wěn)定和運(yùn)送，并且光譜技術(shù)能夠產(chǎn)生適于產(chǎn)生進(jìn)一步分析的形式的大量數(shù)據(jù)。該技術(shù)不需要識別具體的化合物就能夠例如區(qū)別不同的個體并且跟蹤他們對處理的響應(yīng)。此外，可以通過使此類分析與醫(yī)師對同一個體的口腔健康的評定發(fā)生相關(guān)聯(lián)來構(gòu)造一個模型，該模型可用于獲得對更多個體的口腔健康的測定?？梢愿呱a(chǎn)量低成本地進(jìn)行該分析。例如，該分析使得能夠通過篩選潛在的參與者并每天跟蹤實(shí)際的參與者來管理臨床試驗(yàn)。該方法用作篩選步驟來識別潛在的參與者，使能夠挑選更類似的相關(guān)參與者的群體，或挑選逐日的唾液組成最一致的個體，從而提高檢測處理產(chǎn)品之間差異的試驗(yàn)?zāi)芰?。作為另外一種選擇或除此之外，該方法還用作試驗(yàn)期間的監(jiān)測步驟，以便能夠?qū)Ξa(chǎn)品的作用進(jìn)行更方便或更敏感和客觀的評價，以及檢測試驗(yàn)參與者是否未能堅(jiān)持規(guī)定的試驗(yàn)方案。為具體個體提供口腔健康測定的能力也使得可能將該技術(shù)用作輔助診斷手段。此外，可以通過多變量分析如主要組分分析跨越個體對所提供的大量數(shù)據(jù)加和來提供產(chǎn)品測定，該測定可以促使深入了解處理產(chǎn)品的作用機(jī)理。本文的方法可以用來例如(i)確定產(chǎn)品作用的動力學(xué),例如需要多少產(chǎn)品應(yīng)用或多少處理的天數(shù)來實(shí)現(xiàn)受試者的唾液組成的給定變化；(ii)通過確定使用產(chǎn)品后關(guān)鍵代謝物濃度的平均變化來測定產(chǎn)品的功效，(iii)通過例如比較在使用產(chǎn)品后哪種具體的化學(xué)物品變化來比較不同處理產(chǎn)品之間作用模式的不同?？梢蕴峁╆P(guān)于唾液代謝物中具體變化的詳情，例如丙酸、丁酸或三曱胺，他們是可用于比較產(chǎn)品功效的關(guān)鍵代謝物。本文所用的可被描述為"唾液代謝組學(xué)，，的唾液分析也可以被用來理解消費(fèi)者感覺。例如，一些消費(fèi)者體驗(yàn)到"早晨嘴(morningmouth)",—種醒來后令人不悅的味道和紋理。這些受試者的代謝組學(xué)評定將確定他們的感覺是具有真的生物化學(xué)基礎(chǔ)，還是僅存在于他們的頭腦中。繼而，這種知識可用于開發(fā)更好的產(chǎn)品(例如，利用活性物質(zhì)來瞄準(zhǔn)消費(fèi)者感覺(如果發(fā)現(xiàn))的生物化學(xué)基礎(chǔ))。附圖概述圖1示出了包含異常高含量乙醇的樣本的檢測；圖2顯示了一種主要組分分析的結(jié)果，對頭兩種組分繪出干預(yù)階段樣本圖3顯示了與圖2中的樣本相同的樣本，但是在參考階段標(biāo)準(zhǔn)化之后；圖4為實(shí)測的來自一個依照本發(fā)明的模型的相對于所預(yù)測的階段標(biāo)識符的圖5顯示了用于實(shí)施例2的對照產(chǎn)品的"作用速率"的圖6顯示了用于一種測試產(chǎn)品的"作用速率"的圖7為所觀察到的總體健康得分相對于由依照本發(fā)明的方法所預(yù)測的那些得分所繪的圖8顯示了對于一系列口腔護(hù)理處理產(chǎn)品，組分的后續(xù)配合對來自通過依照本發(fā)明的方法所建立的模型的特征向量大小的影響；圖9顯示了沿來自依照本發(fā)明的模型(用于圖8所示的產(chǎn)品)的健康向量的平均改進(jìn)；圖10為用于遵守幾種處理產(chǎn)品之一的用法的個體的凈變化圖，該圖在由兩個主要組分所限定的區(qū)間中顯示并且與一個健康向量相關(guān)。發(fā)明詳述除非另外指明，本文中所有百分比和比率均以總組合物的重量計(jì)，并且所有的測量均在25°C下進(jìn)行。如本文所用，"醫(yī)師"是指有資格評定口腔健康的任何受過訓(xùn)練的專業(yè)人員，例如醫(yī)生、牙醫(yī)或牙齒臨床醫(yī)生。如本文所用，口腔健康測定可用來評估直接影響口腔的疾病或病癥，例如牙斑、牙結(jié)石、齒齦炎、牙周炎或舌苔或口臭，或者他們可以是一些疾病或病癥的間接測定，這些疾病或病癥主要影響身體的另一個部分但是仍然反映在口腔化學(xué)中的一些變化中，例如胃病或糖尿病。在間接測定的群體成員;唾液樣本得到的參考光譜相關(guān)聯(lián)l建造評價唾液樣本的參考模型。在本文的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及為個體計(jì)算間接口腔健康測定，包括以下步驟a)收集該個體的唾液樣本；b)從該個體的唾液樣本獲得個體光譜；C)將數(shù)字化的個體光譜與儲存在電腦存儲器中的參考模型進(jìn)行比較來計(jì)算間接口腔健康測定，其中通過使參考群體中的多個成員中的每一個的口腔健康的一種或多種直接測定與得自參考群體成員的唾液樣本的參考光譜相關(guān)聯(lián)(特別是通過多變量分析)來導(dǎo)出參考模型，參考光語與個體光譜在類型上對應(yīng)。"直接"口腔健康測定是指一般作為能夠支持基本的口腔健康狀況(例如齒齦炎或齲齒)的診斷被接受的觀察。"間接"口腔健康測定是指不是該癥狀的必要診斷而是與其相關(guān)，并且可以用來代替直接測定的觀察，雖然在最終診斷中接受較大程度的錯誤。唾液樣本可以容易地由個體自己在自己家里舒適和私密地產(chǎn)生，因此避免了拜訪臨床醫(yī)生的需要。唾液樣本可以冷凍貯藏，并且在適當(dāng)穩(wěn)定后可以經(jīng)郵政或快遞送到中心研究所來分析。因此，間接測定可以比直接測定更容易或更便宜地獲得，和/或可以更容易地在幾天后重復(fù)以改善測定中的置信度。本文的方法可以為私人健康評定提供基礎(chǔ)。本文的直接口腔健康測定優(yōu)選地選自醫(yī)師對口腔健康的定量評定；齒齦圖象；牙齒圖象；以及口氣惡臭的機(jī)器讀數(shù)或?qū)＜以u定；其在每種情況下用于參考群體中的每一個成員。一種基于齒齦緣分析的收集齒齦圖象數(shù)據(jù)的優(yōu)選方法公開于美國專利申請11/880908(Gerlach等人)和相當(dāng)?shù)腜CT專利申請IB2007/052965中。類似的成象方法可用于牙齒。US2007/0092061公開了一種可用于拍攝數(shù)字牙齒圖象的圖象捕獲裝置、體系和方法，并且W097/06505公開了一種基于數(shù)字式x-射線圖象的齲齒檢測系統(tǒng)。所有這些測定可以被還原為數(shù)字形式用于在電腦上進(jìn)一步分析，尤其是多變量分析。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種表征處理產(chǎn)品的方法，該方法包括以下步驟a)從一批個體中的每一個收集至少一個開始的唾液樣本；b)用處理產(chǎn)品處理這些個體；c)從這些個體中的每一個收集至少一個結(jié)束的唾液樣本；d)從所有的唾液樣本獲得并且數(shù)字化光譜，并且將數(shù)字化的光譜儲存在數(shù)據(jù)庫中，每個光語與一個個體標(biāo)識符關(guān)聯(lián)，并且與一個樣本類型標(biāo)識符關(guān)聯(lián)；13e)對光譜的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多變量分析以獲得一個或多個與處理產(chǎn)品對該批個體的影響相關(guān)聯(lián)的處理向量。如本文所用，術(shù)語"光譜"是指通過對單個樣本進(jìn)行機(jī)器測定所獲得的一組鏈?zhǔn)綌?shù)據(jù)并且能夠作為一列數(shù)據(jù)以數(shù)字形式被捕獲。復(fù)數(shù)"光譜"是指兩組或更多組此類數(shù)據(jù)。除了核磁共振、紅外、紫外和質(zhì)語(麗R、IR、UV和MS)之外，該術(shù)語還包括色譜，例如通過液相或氣相色譜法或毛細(xì)管區(qū)域電泳獲得的那些。優(yōu)選的為核磁共振譜，并且具體地講為'H核磁共振語。本文的方法還包括用幾批個體進(jìn)行臨床研究，并且經(jīng)由獲自唾液樣本的光語確定來自個體唾液樣本的唾液代謝物含量。本文的"代謝組學(xué)"方法的優(yōu)點(diǎn)是，盡管可能識別并測定具體的代謝物，但是可以在不識別具體代謝物的情況下通過分析來自光譜的數(shù)據(jù)來獲得樣本的總貌。當(dāng)過使用于個體唾液的光譜數(shù)據(jù)與醫(yī)師對相同個體口腔健康的定量評定、其選擇的方面、或其他直接口腔健康測定相關(guān)聯(lián)可以構(gòu)造可以對照其比較更多的唾液光譜，以獲得間接口腔健康測定的參考模型。醫(yī)師對個體的定量評定可以包括一個或多個選自牙斑指數(shù)、牙結(jié)石指數(shù)、齒齦指數(shù)、牙周指數(shù)和舌苔指數(shù)的指數(shù)。甚至在沒有與醫(yī)師的口腔健康評定或其他直接口腔健康測定相關(guān)聯(lián)的情況下，光i普的分析也可以揭示與例如處理產(chǎn)品對口腔環(huán)境(通常充滿復(fù)雜種類的細(xì)菌和其他生物體以及他們的有關(guān)代謝物)的影響相關(guān)的重要信息。在取得和分析唾液樣本以及遞送間接口腔健康測定(可用于評估受試者對于口腔疾病的易感性或患口腔疾病的程度)中的步驟通常包括以下內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解可能有許多變型。確定口腔史在參與代謝組學(xué)研究之前，由注冊的牙科醫(yī)生給每個潛在的受試者進(jìn)行一次口腔軟組織檢查。記下患者病史，并要求受試者閱讀并簽署知情同意表。如果認(rèn)為受試者的健康和病史適于該研究，并且滿足合適的研究入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，那么將該受試者登記入該研究。可以收集健康的個體或患有口腔疾病(例如齲齒、齒齦炎、口腔千燥)的那些個體的唾液。在一個典型的研究中，首先"洗凈"受試者3周。即，向他們供應(yīng)能夠提供清潔但不含抗菌活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)堿性牙膏(例如CrestCavityProtection)和特殊的牙刷(例如OralBIndicator35)。要求受試者象平常一樣每天刷牙兩次，并且忍住不使用所有其他口腔護(hù)理產(chǎn)品。這個步驟的目的是從口腔中去除可能來自受試者的日?？谇蛔o(hù)理產(chǎn)品的任何殘留的抗菌或其他活性物質(zhì)。接著，獲得"基線"或"參考階段"數(shù)據(jù)。受試者在例如2周的時間里提供幾批唾液樣本。這些樣本提供在產(chǎn)品干預(yù)之前的唾液代謝物含量的參考階段讀數(shù)。最后，f另外的或不同的口腔護(hù)理產(chǎn)品"干預(yù)"受試者，將其加入或取k現(xiàn)有的口腔護(hù)理方案。從干預(yù)的開始收集唾液樣本，通常進(jìn)行3至6周的時間(每周5個唾液樣本)。這些樣本使能夠通過監(jiān)測唾液代謝物濃度隨時間的變化來跟蹤產(chǎn)品干預(yù)的影響。唾液收集和貯藏向研究受試者提供一套貼標(biāo)簽的螺帽小瓶U5mL,有刻度)。這些小瓶包含1.OmL的去離子水，水中含0.9%w/w的氟化鈉。NaF的作用是防止在樣本收集之后進(jìn)一步的細(xì)菌作用。也可以使用其他唾液穩(wěn)、定劑。通常要求受試者在每個研究周的星期一至星期五每天提供一個樣本。在醒來后，要求受試者忍住不進(jìn)行口腔衛(wèi)生程序、不吃或不喝。受試者將2.OmL的干凈自來水到入一次性巴氏吸管或小瓶中，然后用其徹底漱洗口腔一段30秒鐘的時間。然后，將口中的全部內(nèi)容物吐入供應(yīng)的適當(dāng)小瓶中，并將小瓶密封。作為另外一種選擇，可以使用直接收集的未受激的或受激的唾液。收集"醒來"唾液相當(dāng)重要，因?yàn)閾?jù)發(fā)現(xiàn)它里面代謝物最豐富，這是由于有限的睡眠唾液充滿細(xì)菌代謝物沒有被沖掉。任選地，受試者可以在就寢時間使用糖漱口液或其他合適的細(xì)菌食物來增強(qiáng)這種方法的靈敏度。口腔細(xì)菌整夜利用糖并產(chǎn)生增高含量的細(xì)菌代謝物。這類似于在口氣研究中有時用來增強(qiáng)口臭的半.胱氨酸漱口液。在每個研究日，受試者將新收集的唾液小瓶遞送至中心收集點(diǎn)或?qū)⑿∑縥丈入冰箱稍后遞送，例如每周一次。立即深凍這些小瓶，通常在-18°C。這些小瓶保持冷凍直到準(zhǔn)備進(jìn)行分析。驗(yàn)證這種唾液取樣和貯藏方案，以確定該方法固定樣本中的代謝物濃度。該方法的一個優(yōu)點(diǎn)是它消除了受試者必須拜訪牙齒診所由牙科醫(yī)生評價口腔健康或給出微口腔藥簽或鄰間樣本的需要。這提供了更便宜的樣本收集，并且由于受試者只需要在醒來時漱口，因此更有可能會在研究中招募并保留受試者，并且受試者更有可能遵守研究方案。用于分析的唾液制備在唾液分析日，從深凍狀態(tài)取回樣本，并使它們解凍一小時。在對數(shù)紙上記下受試者身份、樣本日期和樣本體積。以8000rpm(=6654G)的速度離心密封的小瓶30分鐘，將離心機(jī)中的溫度控制在20°C。在離心后，立即從旋轉(zhuǎn)下的固體上將上清液潷析入貼適當(dāng)標(biāo)簽的螺旋頂小瓶中。丟棄固體。用吸移管將80yL的核》茲共振參考標(biāo)準(zhǔn)移入Eppendorf管中。如下制備參考標(biāo)準(zhǔn)將17.24g磷酸鈉(二價的)和10.8化磷酸鈉(一價的)溶解在1L去離子水中。用NaOH或磷酸將pH調(diào)節(jié)到7.0。將50mL這種pH7的磷酸鹽緩沖液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。將這些鹽再溶解到50mL的D20中，再次將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。最后，將這些鹽再溶解到50mL的D20中，然后加入40mL的。達(dá)嗪。將800juL的離心唾液加入Eppendorf管中。經(jīng)由長玻璃巴氏吸管將Eppendorf管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到5mm直徑的核磁共振管中。然后，密封核該磁共振管。在制備后的48小時之內(nèi)進(jìn)行唾液樣本的核磁共振或其他光譜分析。準(zhǔn)備樣本的數(shù)據(jù)庫來包括唯一的樣本標(biāo)示碼、受試者代碼、樣本日期、樣本的體積、處理階段、受試者性別和年齡。核磁共振i普的采集采集具有預(yù)飽和水信號的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)子('H)核磁共振譜。通常，使用NOESY預(yù)飽和序列，128掃描和10秒馬也豫延遲以及大約2秒的采集時間。用來自研究的唯一樣本號標(biāo)注這些光譜。在采集之后，對核磁共振譜進(jìn)行處理(通常0.5Hz指數(shù)線加寬)、定相、基線校正和定位(通常將乙酸鹽峰設(shè)定為1.95ppm)。作為另外一種選擇，不進(jìn)行定相和基線校正，而是取光譜數(shù)據(jù)的導(dǎo)數(shù)和絕對值然后如上定位。核磁共振譜的分析然后，將通常32K復(fù)點(diǎn)的核磁共振譜"分箱"，其中通過將光譜分到給定數(shù)目的箱內(nèi)并計(jì)算這些箱內(nèi)點(diǎn)的總數(shù)來減少光譜點(diǎn)總和的總數(shù)目。分析人員可以選擇箱的寬度，該選擇通常在2至10Hz之間的范圍內(nèi)。在分箱的過程中，將每個光譜歸一化至來自內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的信號大小，使得每個分箱光譜中來自內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的信號的總積分相同。對于'H核磁共振譜，使用具有落在0.5至3.5ppm之間的化學(xué)位移的那部分光譜就足夠。優(yōu)選使用至少包括0.5至4.5ppm,更優(yōu)選0.5至8.6ppm的化學(xué)位移的光譜部分。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用每個光譜的至少包括代表丙酸、丁酸和三曱胺的峰的部分是有用的。優(yōu)選地，所用部分還包括代表曱酸鹽、N-乙?；?、乳酸鹽、曱胺和二曱胺的峰，并且更優(yōu)選地還包括一個或多個選自代表以下物質(zhì)的那些峰的峰曱醇、三曱胺氧化物、苯基丙氨酸、膽堿、組氨酸、酪氨酸、甲基胍、肌氨酸、(3-羥基丁酸鹽、琥珀酸鹽、丙酮酸鹽、異丁酸鹽、正丁酸鹽、亮氨酸、丙氨酸、正戊酸鹽和乙醇。然后將分箱的光i普輸入MicrosoftExcel,其中向每個光譜添加額外的信息，例如受試者代碼、樣本的日期、研究的階段(例如千預(yù)前后)、受試者的性別、年齡等。在此階段，可以采取的選項(xiàng)是可以通過從每個光譜移除水和噠溱內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)核磁共振信號來進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)。在移除水和噠喚信號之后，可以將用于每個光諳的全部積分歸一化為相同的標(biāo)稱值。然后，在隨后的多變量分析中通常使用兩個數(shù)據(jù)集。然后，可以將以上電子表格加載到合適的多變量包中，例如得自UmetricsInc.的SIMCA-P+?？梢詫㈦S后的分析分成一些離散的步驟。在分箱的核磁共振譜(X數(shù)據(jù))上進(jìn)行主要組分分析(PCA),以便識別"孤立點(diǎn)"-即異常的并與總數(shù)據(jù)集非常不同的那些數(shù)據(jù)(光譜)。PCA本質(zhì)上是一種投影法，其中許多潛變量(主要組分-PC)由初始變量(核磁共振語中的點(diǎn))形成。第一個PC設(shè)法構(gòu)成數(shù)據(jù)中的最大變型，第二個PC構(gòu)成第二大等等。這樣，分箱的核磁共振譜(大約1000個點(diǎn))的復(fù)雜性可以由少得多的PC(通常2至10個)代表，使得能夠視覺比較好幾百個個體樣本。識別樣本3瓜立點(diǎn)是j吏用統(tǒng)計(jì)工具("distancetomodel"、"Hoteling，sT2")與使用者根據(jù)合理化判斷異常行為是什么信號從而存在什么原因的組合。移除可以有理由地從數(shù)據(jù)集中移除的任何孤立點(diǎn)，然后重復(fù)分析。這里可能有幾次反復(fù)回路，以便獲得更好的數(shù)據(jù)集。根據(jù)PCA模型分析"加載"即構(gòu)成多個PC的初始變量(初始核磁共振譜中的點(diǎn))的組合，以確保如此創(chuàng)建的模型基于真實(shí)的數(shù)據(jù)，而不是核磁共振光譜假象。這涉及使用者判斷。必須校正建立于實(shí)驗(yàn)假象的模型，例如可以從數(shù)據(jù)中移除引起實(shí)驗(yàn)假象的核磁共振譜信號，例如信號中微小的化學(xué)位移差異(特別是位于約1.95ppm處的乙酸鹽信號，其一般為明顯的最大代謝物信號)可能導(dǎo)致模型受到顯著影響。通常通過從分析中略去乙酸鹽信號可以獲得更好的模型。作為另外一種選擇，可以通過形成覆蓋所討論信號的化學(xué)位移的跨距的新數(shù)據(jù)箱來校正信號的化學(xué)位移差異。18可以使用PCA模型來識別口腔護(hù)理試驗(yàn)中已偏離了試驗(yàn)方案的受試者，例如識別在給出早晨唾液樣本之前使用了漱口水/潔齒劑或吃了食物/飲料。然后，可將這些數(shù)據(jù)和/或受試者從試驗(yàn)中移除，從而產(chǎn)生更好質(zhì)量的試驗(yàn)。也可以使用PCA模型來預(yù)篩選潛在的參與者并且?guī)椭x擇將預(yù)計(jì)在試驗(yàn)中會做得更好的那些，例如(i)具有更一致的逐日唾液組成的那些受試者(例如，可能反映了生活方式)-因此如果他們的唾液組成天生更穩(wěn)定那么更有可能能夠測定產(chǎn)品所誘導(dǎo)的人唾液組成的變化或(ii)基于人唾液中關(guān)鍵代謝物的含量來選擇和平衡研究的一個對照處理小組。一旦建立了PCA模型并且已經(jīng)移除了孤立點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)假象，即可根據(jù)需要應(yīng)用其他多變量分析方法PLS區(qū)別分析(PLS-DA)。這里，使用唾液樣本的來源的一些前期知識來標(biāo)注樣本，例如產(chǎn)品處理"之前"和"之后"所取的唾液，或按照產(chǎn)品處理使用的特定時間段例如0至7天、7至14天等。然后為來自唾液的所有核磁共振譜(X數(shù)據(jù))創(chuàng)建一系列"虛擬的Y"變量，其中"標(biāo)簽，，-例如產(chǎn)品處理之前/之后由取值0或1的Y變量來表示。隨后的PLS-DA分析確保組成主要組分的潛變量使得PC集中于類區(qū)別(例如產(chǎn)品處理之前/之后)上。這樣，PLS-M以樣本的X-變量(核磁共振i普中的點(diǎn))為基礎(chǔ)分開樣本的種類。這樣可以使用PLS-DA模型來確定一種產(chǎn)品是否對唾液組成產(chǎn)生影響，并且如果產(chǎn)生影響，產(chǎn)品多快起作用來改變唾液組成。因此，可用它來比較不同產(chǎn)品之間的作用動力學(xué)。也可以使用該模型來識別在使用產(chǎn)品之后哪種化學(xué)物種(來自微生物的代謝物)已經(jīng)變化。然后可以從核^茲共振譜(使用噠嗪內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))定量這些物種，然后使用特定化學(xué)物種的量的變化程度來比較不同產(chǎn)品之間的功效。如果PLS-DA模型基于特殊診斷的疾病狀態(tài)，例如選擇健康的和患病的群體來形成模型，那么也可使用它來診斷疾病。PLS或0-PLS。這里建立一個模型，其中使來自該批唾液樣本的核磁共振數(shù)據(jù)與第二數(shù)據(jù)集(例如一套醫(yī)師為每個受試者評定的健19康得分)相關(guān)聯(lián)。這樣，可以使用來自唾液的核磁共振譜來預(yù)測醫(yī)師對更多個體評定的口腔健康，并且用作個體口腔健康的客觀間接測定。這些衍生的口腔健康測定容易獲得，并且可以通過向同一個體提供多個日子中每天的口腔健康測定用來為個體建立口腔史。當(dāng)口腔健康測定和歷史與用測試物質(zhì)或組合物處理受試者相結(jié)合獲得時，它們可用于評定測試物質(zhì)或組合物的健康有益效果、功效或作用機(jī)理。SIMCA:這里，規(guī)定X-數(shù)據(jù)具有特定類(例如產(chǎn)品使用之前/之后、健康狀態(tài)的程度)的成員資格并且建立模型，隨后可用該模型來預(yù)測未知樣本具有所定義的類的成員資格。對于每個上述多變量方法中，試驗(yàn)各變量(來自核磁共振譜的箱)的X-數(shù)據(jù)的不同定標(biāo)(中心的(Ctr)、單變量的(UV)、帕累托(Par))。也評價了例如通過取分箱光譜的對數(shù)或負(fù)對數(shù)來轉(zhuǎn)換X-數(shù)據(jù)(確保數(shù)據(jù)的正規(guī)性)。也可以進(jìn)行"正交信號校正"轉(zhuǎn)換，其中在建立模型之前首先移除不與Y矩陣相關(guān)聯(lián)的X-數(shù)據(jù)。根據(jù)最大化模型的預(yù)測力來評價上述的最佳組合。例如通過最優(yōu)化"Q2值"來測試如此形成的模型的有效性/預(yù)測力，所述"Q2值"通過略去一部分分析數(shù)據(jù)，在剩余的數(shù)據(jù)上建立模型，然后預(yù)測被略去的數(shù)據(jù)落在何處來計(jì)算。通過比較預(yù)測值與已知的實(shí)際值，可以形成用于預(yù)測力(Q2)的測定。作為另外一種選擇，操作者也可以略去數(shù)據(jù)的任意部分，然后對預(yù)測值與實(shí)際值進(jìn)行比較。也可以通過任意擾亂X和Y矩陣數(shù)據(jù)并且檢查相關(guān)性隨任意擾亂的數(shù)目的減少來對照偶發(fā)相關(guān)性檢查PLS/PLS-DS模型。這樣，可以獲得模型的預(yù)測能力的測定，并且通過幾次反復(fù)得到最好的模型。臨床研究管理如上所提到，從唾液樣本的光譜測定得到的口腔健康測定和歷史可用來改進(jìn)臨床研究的運(yùn)行和管理。例如，可基于受試者的唾液組成的逐日一致性來選擇他們進(jìn)行臨床試驗(yàn)。通過選擇具有較低的唾液組成逐日變化的受試者，也就是說，通過識別唾液組成逐日變化比將該批受試者作為整體所取的唾液組成的平均逐日變化更低的受試者的子組，可以增強(qiáng)臨床試驗(yàn)區(qū)別不同的產(chǎn)品處理的能力。用于從一批候選受試者中挑選受試者的可供選擇的標(biāo)準(zhǔn)可以為a)候選人的口腔健康測定，例如選擇一批口腔健康不佳的受試者，b)如從每個候選人的光語所確定的所選代謝物的含量，例如選擇具有高含量的特定目標(biāo)代謝物的受試者；或者c)通過積分來自個體光語中的多個峰的數(shù)據(jù)而獲得的復(fù)合測定。在已經(jīng)與醫(yī)師的評定相關(guān)聯(lián)的意義上這可能不是口腔健康測定，但是仍然可以作為比可自單個代謝物含量所獲更寬的特定口腔化學(xué)指示。這種測定可以為例如特定口腔微生物群落的間接測定。除了為臨床試驗(yàn)挑選受試者之外，上述口腔健康測定或其他唾液光譜派生的測定可用于包括兩個或更多個小組的試驗(yàn)，因?yàn)榭梢赃x擇每個小組內(nèi)的受試者以便平衡口腔健康測定或貫穿每個小組的受試者的代謝物含量。本文方法的一個特殊優(yōu)點(diǎn)是通過檢查試驗(yàn)中受試者的口腔健康史(這可以每日進(jìn)行)，可以檢測到與臨床試驗(yàn)方案不一致的跡象，如使用非規(guī)定的處理產(chǎn)品或錯過處理。然后可以就是否因非一致性從試驗(yàn)中排除受試者采取客觀的決定，從而促使產(chǎn)生更有效或更有力的試驗(yàn)。本文的方法的一個特殊優(yōu)點(diǎn)是可以由受試者自己在家里取得唾液樣本并且相對快速和容易地遞送至中心收集點(diǎn)。唾液樣本的隨后分析可以相對低的成本高生產(chǎn)量的方式進(jìn)行。因此，本文的發(fā)明的一個方面是管理臨床試驗(yàn)的方法，所述方法包括以下步驟a)招募一批遵守包括多日的測試或安慰劑口服處理的預(yù)定方案的個體；b)要求這些個體在所述多天的一天或多天取樣他們自己的唾液，并將唾液樣本送回中心收集點(diǎn)；c)在樣本返回收集點(diǎn)之后從這些樣本獲得核磁共振譜；和d)從核磁共振譜獲得一個或多個測定，所述測定選自(i)有關(guān)在多天內(nèi)應(yīng)用到個體上的處理效力的數(shù)據(jù)；和21(ii)有關(guān)該批個體中的個體的逐日響應(yīng)的數(shù)據(jù)。其他用途和方法除了用于改進(jìn)臨床試驗(yàn)的管理之外，本文所述的方法還可用于改進(jìn)個體健康的管理。例如，個體可以如本文所述取得唾液的樣本，并將其送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如本文所述的光i普分析，以產(chǎn)生口腔健康測定或口腔健康史。然后，可以例如將口腔健康測定或歷史提供給該個體的醫(yī)師以幫助診斷口腔健康或由口腔的化學(xué)變化所反映的其他疾病狀態(tài)。通過檢查如本文所提供的個體的口腔健康測定或歷史，該信息可能用來例如幫助為個體開具處理產(chǎn)品的處方。也可以通過例如用處理產(chǎn)品處理個體并在用產(chǎn)品處理之前或之后評定個體的口腔健康來以隨訪方式使用該方法。本文的方法當(dāng)然可用于測定處理產(chǎn)品的功效或作用機(jī)理，因此在產(chǎn)品開發(fā)方面具有價值。此類測定可以包括根據(jù)參與臨床試驗(yàn)的受試者的口腔健康史為產(chǎn)品計(jì)算產(chǎn)品功效測定，或根據(jù)產(chǎn)品誘導(dǎo)的唾液中的組成變化(如從唾液光譜所確定)為參與試驗(yàn)的一批受試者計(jì)算產(chǎn)品功效測定。測定可以包括把測試產(chǎn)品與參考產(chǎn)品進(jìn)行比較。如此獲得的產(chǎn)品功效測定當(dāng)然可以通過使產(chǎn)品功效測定與產(chǎn)品相關(guān)聯(lián)來用于為產(chǎn)品產(chǎn)生廣告標(biāo)記。此類標(biāo)記可以通過顯示測試產(chǎn)品與參考產(chǎn)品之間唾液中不同產(chǎn)品誘導(dǎo)的組成變化來包括區(qū)別產(chǎn)品的作用模式與參考產(chǎn)品的作用模式。實(shí)施例1-作用模式調(diào)查利用'H核磁共振的唾液代謝組學(xué)(SM)被用于調(diào)查兩種測試牙膏A和B相對于標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)產(chǎn)品C的作用模式(MoA)。產(chǎn)品A包括三氯生作為抗微生物劑，而產(chǎn)品B包括既含鋅又含亞錫鹽的抗微生物體系。產(chǎn)品C不含抗微生物劑。挑選了一群30名參與者并指導(dǎo)他們每天兩次使用產(chǎn)品C來進(jìn)行四周的"洗凈，，期。在洗凈期的最后兩周(參考階段)，參與者每人遞交最多10個洗出唾液樣本，所有樣本均在不同日子在醒來時取得。在每個取樣日，參與者使用吸移管將2mL自來水灌入他們的口中；漱口30秒，然后吐出到清潔的離心管中。這些管包含lmL的0.9°/w/vNaF作為防腐劑，并且一旦填充即被貯藏在(TC以下，直到提交用于分析。在參考階段之后，將這組人分成三個小組。根據(jù)存在于參考階段唾液中的y。丙酸的平均值(由參考階段核磁共振譜確定)來平衡各小組中的個體。發(fā)給第一個小組一管新的產(chǎn)品C作為安慰劑，發(fā)給第二個小組產(chǎn)品A,而第三個小組收到產(chǎn)品B。參與者使用他們的新產(chǎn)品三周時間(干預(yù)階段)，然后再用兩周(恢復(fù)階段)的時間返回在洗凈(基線)期所用的產(chǎn)品C。在這五周期間，參與者繼續(xù)提供每周最多5個樣本。每個小組包括8至9名參與者，并且盡管參與者與小組之間的關(guān)系始終是已知的，但是在數(shù)據(jù)采集和處理階段，產(chǎn)品小組和產(chǎn)品之間的關(guān)系是未知的。將所4是交的唾液樣本記入日志，用唯一的標(biāo)識符標(biāo)注并貯藏在冰箱中。當(dāng)制備樣本以用于分析時，按它們的大致提交次序(與小組無關(guān))從冰箱中取出樣本，并且使它們解凍2小時。當(dāng)充分融化后，記下樣本體積，并且以8000rpm的速度在20°C下離心樣本10分鐘。然后，潷析出上清液，并且貯藏在貼有相同標(biāo)識符的新的小瓶中。通過向新的長18cra且直徑為5隱的核》茲共振管中加入800juL的樣本和8Q]iL的包含噠。秦作為參考的緩沖液來制備核磁共振樣本。在樣本管上貼相同的標(biāo)識符并提交，在400MHzBruker光譜儀上進(jìn)行'H核石茲共振分析。按提交樣本的次序，將它們放在120位的自動取樣機(jī)架上，然后整夜運(yùn)行或者運(yùn)行一個周末。通常每夜運(yùn)行30個，有約40分鐘的時間可以供每次加載、鎖定、調(diào)整和采集循環(huán)。在運(yùn)行第一個樣本之前，校準(zhǔn)機(jī)器并選擇標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)整設(shè)定。使用位于9.2的噠嗪三重峰來評定采集的量。如果必要，在運(yùn)行的結(jié)束重復(fù)樣本采集并且重寫舊光譜文件。使用水抑制來獲得所得光語。使用Bruker的XWIN-NMlT軟件進(jìn)行核」磁共振預(yù)處理，使一批中的所有樣本大致定位在1.95卯m的乙酸鹽峰。然后，在每個光譜上應(yīng)用相同的光譜處理宏(方案l.l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>方案1.1預(yù)處理宏宏(軟件的使用者將理解其命令)在光譜上執(zhí)行線加寬和傅里葉轉(zhuǎn)換操作，取光譜的一階導(dǎo)數(shù)的量級，然后進(jìn)行光i普基線校正。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通過取光譜的導(dǎo)數(shù)顯著提高了總處理速度，這有助于處理大量樣本。該技術(shù)減小了找到基于寬信號的統(tǒng)計(jì)性突變的可能性，但是為小的尖峰給出更好的分辨率。應(yīng)當(dāng)理解，它因此減小了在光譜中比較一個峰與另一個峰的正確性，但是可能跨越幾個光譜比較相同的峰。然后，將處理過的光譜輸出到Bruker的AMIX程序，在那里更精確地使它們定位在1.95ppm的乙酸鹽>%,然后使用方案1.2中所列的參數(shù)進(jìn)行分箱。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>方案1.2AMIX分箱參數(shù)然后將箱文件輸出，把箱列表與對于特定樣本和提交它的人所記錄的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。以同樣的操作分箱來自整個試驗(yàn)的所有樣本。'通過將位于3.1和0.7ppm之間的曲線下的面積歸一化至100開始數(shù)據(jù)分析，然后移除1.995至1.905(歸因于乙酸鹽中的CH2質(zhì)子)的箱來防止乙酸鹽含量的任何改變支配該模型。聯(lián)合一些范圍內(nèi)的箱以防止峰變化減弱所形成的模型的能力。具體區(qū)域列在方案1.3中。在樣本信息中給來自同一產(chǎn)品小組的所有樣本一個整數(shù)標(biāo)識符。給所有樣本一個第二標(biāo)識符(階段標(biāo)識符)。對于參考階段樣本，等于第一整數(shù)減去0.1;對于干預(yù)樣本，等于第一整數(shù)；而對于恢復(fù)樣本，其為初始整數(shù)加上O.1。2.9252.9152.4452.4252.4152.3952.2352.1952.1052.0751.9951.9051.3851.3351.1251.055方案1.3箱面積被平均的區(qū)域從由個別受試者提交的所有光譜的每個樣本中減去用于那個人的參考階段光i普的平均值，即以人為基礎(chǔ)參考階段標(biāo)準(zhǔn)化一個人的光譜，因此僅呈現(xiàn)從干預(yù)開始以來對于每個人所發(fā)生的變化。據(jù)發(fā)現(xiàn)，這減小了數(shù)據(jù)中的噪音，并且改善了所形成的模型。然后，在所有的核磁共振數(shù)據(jù)上進(jìn)行主要成分分析(PCA)以找到孤立點(diǎn)(中心定標(biāo)應(yīng)用于所有箱)。移除在DModX中顯著在3標(biāo)準(zhǔn)偏差以上或在Hotelling，sf上異常高的樣本，同樣移除其乙醇含量(由位于1.2ppm的曱基顯示)顯著高于參考階段含量的那些樣本(參見圖1)。孤立點(diǎn)可能由食物或牙膏組分的存在引起，表明參與者沒有收集真正的醒來唾液。也可能是在收集和提交之間樣本降解了。食物、飲料、牙膏或酒精的存在容易識別；降解的樣本通常具有異常高的乳酸鹽含量。乙醇的含量因人而異，并且因日期而異。乙醇由存在于口中的一些細(xì)菌產(chǎn)生，并且也可以從前一天/夜所喝的飲料轉(zhuǎn)入。最高的含量很可能來自在給出樣本之前使用了漱口水的那些人；這會違背方案，應(yīng)當(dāng)立即移除它們。記下廢棄的樣本和理由。PCA分析的結(jié)果可以作為沿頭兩種主要組分(第一種在水平軸上顯示而第二種在垂直軸上顯示)的分布來顯示，如圖2或圖3所示，他們描繪26了同一套數(shù)據(jù)，但是分別是沒有應(yīng)用參考階段標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用了參考階段標(biāo)準(zhǔn)化。用一個標(biāo)識符標(biāo)注每個數(shù)據(jù)點(diǎn)，所述標(biāo)示符包括指示產(chǎn)品小組的大寫字母(A、B或C)和指示在該小組上的個體的小寫字母。所有在3.1和0.7ppm之間的數(shù)據(jù)已被歸一化至100面積單位。已經(jīng)移除了乙酸鹽(峰)，因?yàn)樗谠搮^(qū)域支配光譜，并且據(jù)發(fā)現(xiàn)，它不會提供有用的區(qū)分信息。圖3示出了參考階段標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果。乳酸鹽是該區(qū)域中微分光i普中的第二大峰，并且在圖2中其變化強(qiáng)烈影響樣本沿第一主要組分軸向右的展開。在圖3中，當(dāng)減去參考階段值并且分析參考階段和千預(yù)階段之間的差異時，這種歪斜幾乎失去。頭兩種組分通常構(gòu)成數(shù)據(jù)中約60%的所有變化。一旦已經(jīng)刪除了數(shù)據(jù)中的孤立點(diǎn)，即分別分析每個產(chǎn)品小組(A、B和C)來識別"作用模式，，向量，該向量把參考階段光譜和干預(yù)階段光譜區(qū)別開。這通過移除所有的恢復(fù)階段數(shù)據(jù)并且將每個產(chǎn)品小組設(shè)定為不同的類來進(jìn)行。然后在階段標(biāo)識符中使用0.1的差異作為Y變量對所有的類進(jìn)行正交局部最小二乘(0-PLS)分析。圖4顯示了所觀察到的分布相對于所預(yù)測的分布的圖。在該圖中，算法試圖獲得被識別為來自參考階段的樣本與被識別為來自干預(yù)階段的樣本之間的最大間距。參考階段樣本應(yīng)當(dāng)在6.95的左邊，而干預(yù)階段樣本應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)在右邊。只有一個值(突出的)未滿足這一點(diǎn)。模型通過一下來進(jìn)行預(yù)測試驗(yàn)從模型中移除三分之一的受試者，建立模型，然后基于另三分之二所產(chǎn)生的模型來預(yù)測所移除的三分之一。對所選擇的三個隨意的三分之一中的每一個進(jìn)行這種測試，并且所確定的預(yù)測統(tǒng)計(jì)基于它們?nèi)?。在該研究中，所建立的模型能夠給出76%正確的分類。取用于每個產(chǎn)品的作用模式向量作為O-PLS第一組分的加載。這在質(zhì)量上用來確定哪種代謝物因每種產(chǎn)品的干預(yù)而增加或減少。在產(chǎn)品C的情況下，發(fā)現(xiàn)乳酸鹽含量趨于增加，而丙酸鹽和丁酸鹽含量趨于減少。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品B增加乳酸鹽和琥珀酸鹽，但丙酸鹽或丁酸鹽的減少不顯著。產(chǎn)品A顯示的變化不明顯；盡管乳酸鹽看起來象是增加了，但是誤差很大，并且變化不具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性。實(shí)施例2-作用速率調(diào)查27依賴于來自實(shí)施例1的工作，使用來自0-PLS的得分圖來確定產(chǎn)品的作用速率。對于每個階段(參考、干預(yù)和恢復(fù))按周對數(shù)據(jù)分批，在同一軸上按順序?yàn)槊颗嫵隹驁D。通過將恢復(fù)樣本投入所建模型中來獲得恢復(fù)階段數(shù)據(jù)，以便查看從干預(yù)的結(jié)束返回到參考階段含量。用于產(chǎn)品c和另一個測試產(chǎn)品的圖示于圖5和圖6。在這些圖中，沿x軸顯示三種產(chǎn)品使用階段的周數(shù)。標(biāo)簽Bl和B2表示兩個參考階段周，Wl至W3表示干預(yù)周，而Rl和R2表示"恢復(fù)"周。用于每個產(chǎn)品的圖僅可以獨(dú)立觀看，因?yàn)樗鼈內(nèi)拷⒃诓煌哪Ｐ蜕?，即它們的y軸不同。然而，由于效果的保留、達(dá)到穩(wěn)定水平的速度以及誤差棒的大小的本性，可以在質(zhì)量上比較它們。如果產(chǎn)品具有類似的作用模式，原則上可以使用共同的PLS組分軸并直接比較它們彼此。繪在圖6中的產(chǎn)品顯示比產(chǎn)品C(圖5)更好的效果的保留，然而產(chǎn)品C在第二周達(dá)到其最大效果，而圖6的產(chǎn)品花了三周時間來達(dá)到其最大效果。這些圖可用于支持例如比較廣告，但也可用于設(shè)計(jì)其中重新使用參與者(例如在交叉研究中)的更好的研究，以便在處理之間可以有足夠長的洗凈期。實(shí)施例3-健康相關(guān)性為了使唾液代謝組學(xué)與臨床效果聯(lián)系起來，按齒齦炎、牙周炎和其他癥狀的跡象將試驗(yàn)中的許多參與者分等級(參見下面的方案3.1)。結(jié)果是一系列指數(shù)和根據(jù)方案3.1計(jì)算出的一個總健康得分。GI=齒齦炎指數(shù)(0-4)PI=牙斑指數(shù)(0至4)BPE=基本牙周檢查(0-6)Calc=牙結(jié)石指數(shù)(0-3)Tong=舌苔(0-3)健康=GI+PI+(2xBPE)+Calc+Tong方案3.1健康量表如下使總健康得分與細(xì)菌代謝物相關(guān)聯(lián)。如實(shí)施例1中那樣進(jìn)行預(yù)處理和移除孤立點(diǎn)，但是在這種情況下只取與進(jìn)行分級同一周收到的那些樣本。用于分級周的每個患者的樣本附有相同的臨床信息并將這用作該批的y變量。建立模型來使代謝物含量與具體指數(shù)或與總健康相聯(lián)系。據(jù)發(fā)現(xiàn)，可以取得與總健康的相關(guān)性。為了正確驗(yàn)證這種模型，必需進(jìn)行與實(shí)施例1中所述類似的預(yù)測程序。將個體任意分配到三類之一。繼而，將三類中的每一個的數(shù)據(jù)放在一邊作為預(yù)測的一套數(shù)據(jù)，并且從剩下的兩類建立模型。然后，將該套預(yù)測數(shù)據(jù)放入模型中，并且為這些數(shù)據(jù)點(diǎn)繪出所觀察到的相對于所預(yù)測的總健康得分圖，如圖7所示?？梢詫⒔Y(jié)果形成的三個圖全部結(jié)合起來并繪在相同的軸上，并且稱為預(yù)測的均方根誤差(脂SEP)的RM直取y=x的線(如圖7中所示)。實(shí)施例4-作用的比較程度為了將如實(shí)施例1中所論述的作用模式(MoA)轉(zhuǎn)換為作用程度(EoA)，必需定標(biāo)MoA向量以代表已經(jīng)發(fā)生的變化的數(shù)量。來自0-PLS模型的加載圖表作為具體類型的單位向量(稱為特征向量)產(chǎn)生。特征向量的相應(yīng)特征值描述了向量或轉(zhuǎn)化的數(shù)量。通過用來自模型的每個特征向量乘以相應(yīng)的特征值可能比較地定標(biāo)它們。來自0-PLS模型的特征值取決于例如由數(shù)據(jù)所展示的間距、被分開的各組中點(diǎn)的分散和每個組中點(diǎn)的數(shù)目。它也取決于適合于數(shù)據(jù)的組分的數(shù)目，并且這會變化很大。當(dāng)形成0-PLS模型時，連續(xù)的附加組分移除數(shù)據(jù)被認(rèn)為是不能解釋的，從而于其上建立模型的信息的量減少。通常雖然這樣，對于每個附加組分，被移除的數(shù)據(jù)的比例減小。特征值隨附加組分減小，但連續(xù)特征值之間的差異逐漸變得更小。得自潛在的復(fù)雜行為但是很少噪音的數(shù)據(jù)集會產(chǎn)生強(qiáng)的模型，該模型包括許多組分，每個組分應(yīng)當(dāng)被包括但是具有降低的附加解釋價值。相反，反映許多隨機(jī)噪音的數(shù)據(jù)集會產(chǎn)生弱的模型，該模型具有很少組分，因?yàn)轭^幾種組分移除了許多數(shù)據(jù)，并且接連的組分顯得對模型產(chǎn)生很少改進(jìn)。這具有以下效果如果讓軟件在不經(jīng)檢查的情況下運(yùn)行，最弱的模型中的一些顯得象是最強(qiáng)的，即包括較少的組分。圖8顯示了組分的后續(xù)配合對來自為一系列口腔護(hù)理處理產(chǎn)品A至I所建的模型的特征向量大小的影響。在該圖中，產(chǎn)品E和I是基于使用相同商業(yè)牙膏(相當(dāng)于實(shí)施例1中的產(chǎn)品C并且不含抗微生物劑)的重復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)。同樣，產(chǎn)品F和G是基于使用相同的含三氯生的商業(yè)牙膏(相當(dāng)于實(shí)施例1中的產(chǎn)品A)的重復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)。產(chǎn)品A為可商購獲得的含氯己定的漱口水，并且發(fā)現(xiàn)其在該評價中建立了最強(qiáng)的模型。注意，y軸為對數(shù)的，以便更好地在低值處分開不同的線。對于本文的方法，一般運(yùn)行0-PLS模型直到特征值"和特征值"+1之間的差小于0.1(典型的定標(biāo)從100左右運(yùn)行至2)以確保穩(wěn)定的特征值。這種要求的結(jié)果是許多組分適合，但是后面的一些逐漸越來越不適合模型。然而重要的方面不是已經(jīng)移除了什么，而是留下了什么。留下的信息只有與參考和干預(yù)階段的差異有關(guān)的信息。試驗(yàn)了進(jìn)行分析的三種不同方法1.將同一產(chǎn)品小組的所有個體集中在一起，其中參考階段標(biāo)準(zhǔn)化。對于涉及那種產(chǎn)品使用的所有樣本，在參考階段和干預(yù)樣本之間的差異上建立模型。2.將同一產(chǎn)品小組的所有個體集中在一起，其中參考階段標(biāo)準(zhǔn)化，但是由三個干預(yù)周中的每一個周來分組干預(yù)階段樣本?；谶@些周中的每一個周與參考階段之間的差異建立三個模型。3.基于所有的干預(yù)階段樣本和參考階段樣本之間的差異為試驗(yàn)中的每個個體中建立模型。一旦已經(jīng)建立并且定標(biāo)上述模型，就將它們用作輸入在五維中進(jìn)入PCA圖。根據(jù)其他特征值的平均大小定標(biāo)健康相關(guān)性，并且將其插入正的(健康狀況較差)和負(fù)的(健康狀況良好)表格中。取得分圖的坐標(biāo)并且投影到健康線上，以便每個人或產(chǎn)品具有能顯示從參考階段前進(jìn)到干預(yù)階段時總口腔健康改善或退化的量的得分。這些值的乘積的平均值具有置信區(qū)間，其示于圖9用于上面提到的方法3。也據(jù)發(fā)現(xiàn)，將人們完全一起分組(方法1和2)是不可取的，因?yàn)檫@假定所有人將以類似的方式行動。即使在應(yīng)用參考階段標(biāo)準(zhǔn)化時，在干預(yù)期間所經(jīng)歷的影響仍有很大的不同，或許是來自參與者在干預(yù)期刷或處理它們自己的不同程度。當(dāng)為每個人形成個別模型并且比較時獲得最好的結(jié)果；這產(chǎn)生了最好的統(tǒng)計(jì)分析，并且使各組能進(jìn)行t;^驗(yàn)來識別何時差異具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性。在該實(shí)施例中，所有的參考階段樣本和所有的干預(yù)階段樣本以相等的重量包括在模型中，其中對于何時取得干預(yù)階段樣本沒有應(yīng)用區(qū)別。因此，凈變化為貫穿整個三周干預(yù)期所發(fā)生變化的復(fù)合值。在產(chǎn)品使用約三周之后發(fā)生變化的更準(zhǔn)確評估通過在分析中只包括第三周的樣本可以獲得。當(dāng)然，干預(yù)期可以更加長，如4周至12周，其中在干預(yù)期結(jié)束時取樣。圖9顯示在產(chǎn)品E和I之間或F和G之間沒有顯著差異，這是可取的，因?yàn)槿缟纤⒃诿糠N情況下產(chǎn)品是相同的。另外，由于產(chǎn)品E/I是也用在參考(洗凈階段)中的產(chǎn)品，也期望有零或與零沒有顯著差異的凈改善。圖10的圖上的每個點(diǎn)代表在由頭兩種主要組分(PC1和PC2)限定的兩組分區(qū)間中參考階段和干預(yù)階段之間的個體的凈變化。如從總模型所確定，用于改善總口腔健康的向量也投影到該區(qū)間中，并且由所示的虛線代表。盡管沒有在圖10中準(zhǔn)確顯示，但是健康向量穿過原點(diǎn)。如對個體中的三個所示，通過投影到健康向量上，個體在參考和干預(yù)階段之間的變化可以被描繪為沿健康向量的移動和在與潛在健康測定無關(guān)的垂直方向上的移動。盡管在前述實(shí)例中產(chǎn)品使用涉及一次僅系統(tǒng)使用一種產(chǎn)品，但是該方法也準(zhǔn)許遵循包括牙線潔齒、刷牙、漱口和用糊粘的產(chǎn)品體系，以及使用該方法在相同產(chǎn)品的不同體系之間進(jìn)行比較。本文所公開的量綱和值不旨在被理解為嚴(yán)格地限于所述的精確值。相反，除非另外指明，每個這樣的量綱是指所引用的數(shù)值和圍繞該數(shù)值的功能上等同的范圍。例如，公開為"40mm"的量綱旨在表示"々40mm"。權(quán)利要求1.一種為個體計(jì)算間接口腔健康測定的方法，所述方法包括以下步驟a)收集所述個體的唾液樣本；b)從所述個體的唾液樣本獲得并數(shù)字化個體光譜；c)將所述數(shù)字化個體光譜與儲存在電腦存儲器中的參考模型進(jìn)行比較以計(jì)算間接口腔健康測定，其中通過經(jīng)由多變量分析使參考群體的多個成員中的每一個的口腔健康的一種或多種直接測定與得自所述參考群體成員的唾液樣本的參考光譜相關(guān)聯(lián)來導(dǎo)出所述參考模型，所述參考光譜與所述個體光譜在類型上對應(yīng)。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個體光譜為核-磁共振語，優(yōu)選'H核》茲共振譜。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述個體光譜為'H核磁共振譜，并且所述個體光語與所述參考模型的比較包括使用所述光i普落在0.5至3.5ppm,優(yōu)選0.5至4.5ppm，更優(yōu)選0.5至8.6ppm之間的那部分。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中每個光譜的使用部分包括丙酸、丁酸鹽和三曱胺的峰。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中每個光譜的使用部分還包括曱酸鹽、N-乙?；?、乳酸鹽、甲胺和二曱胺的峰。6.如權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的方法，其中每個光譜的使用部分還包括一個或多個選自以下那些物質(zhì)的峰曱醇、三曱胺氧化物、苯基丙氨酸、膽堿、組氨酸、酪氨酸、曱基胍、肌氨酸、|3-羥基丁酸鹽、琥珀酸鹽、丙酮酸鹽、異丁酸鹽、正丁酸鹽、亮氨酸、丙氨酸、正戊酸鹽和乙醇。7.如權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中從所述分析中移除乙酸鹽的峰。8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過讓每個個體按照標(biāo)準(zhǔn)化的方案漱洗口腔并吐出到容器中來得到所述唾液樣本，其中在吐出每個唾液樣本之后，用穩(wěn)定劑處理所述才羊本以防止所述樣本的進(jìn)一步細(xì)菌代謝。9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中在收集之后深凍每個唾液樣本。10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述參考群體的每個成員的口腔健康的一種或多種直接測定選自a)醫(yī)師對口腔健康的定量評定；b)齒齦圖象；c)牙齒圖象；和d)口氣惡臭的機(jī)器讀數(shù)或?qū)＜以u定。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中醫(yī)師對所述群體成員的定量評定包括選自下列指數(shù)中的一個或多個牙斑指數(shù)、牙結(jié)石指數(shù)、齒齦指數(shù)、牙周指數(shù)和舌苔指數(shù)。12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中通過對包括所述唾液光譜的數(shù)字表示的數(shù)據(jù)集的PLS或0-PLS分析和醫(yī)師對所述群體成員的定量評定來建造所述參考模型。13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法用于評估所述個體對口腔疾病的易感性或口腔疾病程度的用途。14.一種為個體產(chǎn)生口腔健康史的方法，所述方法包括提供間接口腔健康測定，所述間接口腔健康測定獲自依照權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法在多天中的每一天收集的該個體的唾液樣本。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述歷史的產(chǎn)生與用測試物質(zhì)處理所述受試者相結(jié)合。16.—種為臨床試驗(yàn)挑選受試者的方法，所述方法基于如由權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法測定的他們的唾液的組成的逐日一致性。17.—種為臨床試驗(yàn)挑選受試者的方法，所述方法包括基于下述內(nèi)容從試驗(yàn)候選人中挑選受試者的步驟a)依照權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法獲得的用于所述候選人的間接口腔健康測定；或b)從每個所述候選人的唾液樣本獲得的光譜。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述臨床試驗(yàn)包括兩個或更多個小組，并且選擇用于每個小組的受試者以便跨越每個所述小組來平衡受試者的間接口腔健康測定或代謝物含量，其中所述代謝物含量由所述個體光譜確定。19.一種管理臨床試驗(yàn)的方法，所述方法包括以下步驟a)依照預(yù)定的方案在一批個體上進(jìn)行臨床試驗(yàn)；b)依照權(quán)利要求14所述的方法為所述個體的至少一個樣本中的每一個產(chǎn)生口腔健康史；c)檢查如此獲得的口腔健康史以找出與所述臨床試驗(yàn)方案不一致的指征。20.—種管理臨床試驗(yàn)的方法，所述方法包括以下步驟a)招募一批遵從包括在多天內(nèi)測試或安慰劑口服處理的預(yù)定方案的個體；b)要求這些個體在所述多天的一天或多天取樣他們自己的唾液并將唾液樣本送回中心收集點(diǎn)；c)在樣本返回所述收集點(diǎn)之后，從所述樣本獲得光譜；和d)從所述光譜得到一個或多個測定，所述測定選自(i)有關(guān)在多天內(nèi)應(yīng)用到所述個體上的處理效力的數(shù)據(jù)；和(ii)有關(guān)該批個體中個體的逐日響應(yīng)的數(shù)據(jù)。21.—種為個體開具處理產(chǎn)品的處方的方法，所述方法包括檢查所述個體的間接口腔健康測定的步驟，所述測定由依照權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法提供。22.—種確定處理產(chǎn)品對個體的功效的方法，所述方法包括用所述處理產(chǎn)品處理所述個體并且在用所述產(chǎn)品處理之前和之后評定所述個體的口腔健康史，所述口腔健康史依照權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生。23.—種測定處理產(chǎn)品功效的方法，所述方法包括以下步驟a)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，期間用所述處理產(chǎn)品處理一批受試者中的每一個，并且依照權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生每個受試者的口腔健康史；和b)從該批受試者的口腔健康史，或從該批受試者的所述光譜確定的由產(chǎn)品誘導(dǎo)的所述唾液的組成的變化來為所述產(chǎn)品計(jì)算產(chǎn)品功*文測定。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中將所迷產(chǎn)品的功效測定與參考產(chǎn)品的功效測定進(jìn)行比較。25.如權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的方法，其中在歸一化處理階段之后完成所述產(chǎn)品處理。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中在歸一化處理階段期間收集每個受試者唾液的樣本。27.—種用于為處理產(chǎn)品產(chǎn)生廣告標(biāo)記的方法，所述方法包括a)依照權(quán)利要求23所述的方法測定所述處理產(chǎn)品的功效；和b)使所述產(chǎn)品功效測定與所述產(chǎn)品相聯(lián)系。28.—種用于為處理產(chǎn)品產(chǎn)生廣告標(biāo)記的方法，所述方法包括通過展示不同的產(chǎn)品誘導(dǎo)的試驗(yàn)受試者唾液組成改變來將所述產(chǎn)品的作用模式與參考產(chǎn)品的作用模式區(qū)別開。29.—種表征處理產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟a)從一批個體中的每一個收集至少一個開始的唾液樣本；b)用處理產(chǎn)品處理這些個體；c)從這些個體中的每一個收集至少一個結(jié)束的唾液樣本；d)獲得所有所述唾液樣本的光譜，并且將所述光譜儲存在數(shù)據(jù)庫中，使每個光譜與個體標(biāo)識符相聯(lián)系和與樣本類型標(biāo)識符相聯(lián)系；e)對光譜的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行多變量分析以獲得一個或多個與處理產(chǎn)品對該批個體的影響相關(guān)聯(lián)的處理向量。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述向量中的至少一個描述了由于使用所述產(chǎn)品而導(dǎo)致的該批個體的變化。31.如權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的方法，其中所述向量中的至少一個根據(jù)對所述產(chǎn)品的響應(yīng)將第一子組的個體和所述整批個體或第二子組的個體區(qū)別開。32.如權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中在用所述處理產(chǎn)品處理個體之前獲得所述開始的唾液樣本。33.如權(quán)利要求29至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在用所述處理產(chǎn)品處理個體之后獲得所述結(jié)束的唾液樣本。34.如權(quán)利要求29至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中獲得所述個體的一個或多個中間唾液樣本，接著將從所述中間唾液樣本得到的光譜儲存在數(shù)據(jù)庫中，使其與個體和樣本類型標(biāo)識符相聯(lián)系，并且將其包括在所述多變量分析中。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中在用所述處理產(chǎn)品處理個體期間獲得所述中間唾液樣本。36.如權(quán)利要求29至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中取多個個體的開始唾液樣本的光譜數(shù)據(jù)的平均值來為每個個體提供歸一化測定，并且在進(jìn)行所述多變量分析之前從所述個體的光譜中的每一個的相應(yīng)數(shù)據(jù)中減去所述歸一化測定。37.—種比較兩種或更多種處理產(chǎn)品的方法，所述方法包括比較與依照權(quán)利要求29至36中任一項(xiàng)所述的方法獲得的每種產(chǎn)品相關(guān)聯(lián)的處理向量。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述多變量分析為主要組分分析，并且所述比較包括將所述向量中的每一個標(biāo)繪在由一種或多種主要組分限定的區(qū)間中。39.如權(quán)利要求31所述的方法，其中用第一處理產(chǎn)品處理第一子組的個體，用所述第一處理產(chǎn)品和第二處理產(chǎn)品處理第二子組的個體，并且將所述第一子組和所述第二子組區(qū)別開的所述至少一個向量表征了所述第二處理產(chǎn)品對于所述第一處理產(chǎn)品的補(bǔ)充效果。40.如權(quán)利要求22、23或29至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述處理產(chǎn)品為牙膏、漱口水、牙齒粘合劑或機(jī)械口腔處理裝置形式的口腔處理產(chǎn)品。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述口腔處理產(chǎn)品包括抗微生物劑。全文摘要本發(fā)明涉及唾液光譜的多變量分析，以用于評估個體或群體的口腔健康。該技術(shù)使能夠快速取樣和評價，并且尤其可用于方便篩選和監(jiān)測臨床試驗(yàn)中的參與者，并且用于評價開發(fā)的處理產(chǎn)品，以及提供簡單的非侵入性診斷方法。文檔編號G01N24/08GK101501479SQ200780028875公開日2009年8月5日申請日期2007年8月16日優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日發(fā)明者喬納森·理查德·斯通豪斯,小唐納德·詹姆斯·懷特,戈登·羅伯特·戴維森,朱塞佩·巴塔伊尼,邁克爾·詹姆斯·坎農(nóng)申請人:寶潔公司