專利名稱：：血液稀釋液及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血液稀釋液及其使用方法，更具體地講，涉及一種血液細(xì)胞分析儀用的血液稀釋液及其〗吏用方法。
背景技術(shù)：
：正常人的血液及造血器官中，各種血細(xì)胞的數(shù)量有一定的正常范圍，不同血細(xì)胞及細(xì)胞發(fā)育的不同階段有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。血常規(guī)檢查項目包括血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、血細(xì)胞比積(HCT)、紅細(xì)胞平均容量(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等參數(shù)，用自動化儀器可以大大提高工作效率。目前很多儀器在給出細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果之外，同時提供細(xì)胞體積分布圖形，這些可以表示出細(xì)胞群體分布情況的圖形，稱為細(xì)胞分布直方圖。以白細(xì)胞為例，經(jīng)過溶血劑處理后的白細(xì)胞可以根據(jù)其體積分布的直方圖(圖l)初步確認(rèn)其相應(yīng)的細(xì)胞群第一群是小細(xì)胞區(qū)，主要是淋巴細(xì)胞。第二群是單個核細(xì)胞區(qū)，也被稱為中間細(xì)胞(MID),包括單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞，核象左移或白血病可有各階段幼稚細(xì)胞及白血病細(xì)胞。第三群是大細(xì)胞區(qū)，主要是中性粒細(xì)胞(GRAN)。儀器根據(jù)各亞群占總體的比例計算出各亞群的百分率，如果與該標(biāo)本的白細(xì)胞總數(shù)相乘，即得到各類細(xì)胞的絕對值。因此，白細(xì)胞直方圖的形態(tài)對于臨床診斷具有很重要的參考意義。穩(wěn)定、真實的白細(xì)胞直方圖可以幫助醫(yī)生獲得準(zhǔn)確的臨床信息。4由于國外醫(yī)療機(jī)構(gòu)血常規(guī)檢測大多采用靜脈抗凝血作為樣本，國外血液細(xì)胞分析儀及試劑廠商大多關(guān)注全血模式下的計數(shù)及分類準(zhǔn)確性，主要考慮試劑本身滲透壓、電導(dǎo)等特性。但是國內(nèi)有特定的習(xí)慣，在門診等僅做血常規(guī)檢測時經(jīng)常采集末梢血作為檢測樣本，這就對預(yù)稀釋模式下的檢測提出了嚴(yán)格的要求。針對國內(nèi)各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)對于末梢血采集后長期放置的情況，不能滿足末梢血與稀釋液混合后仍能長期穩(wěn)定血液細(xì)胞的要求，尤其是不能滿足長期穩(wěn)定白細(xì)胞的要求，不能輸出長時間穩(wěn)定的白細(xì)胞直方圖，出現(xiàn)分類錯誤，或者不分類的情況，為臨床診斷帶來困難，甚至提供錯誤信息。US5,008,202是美國SequoiaTurner公司關(guān)于紅細(xì)胞分析用稀釋液的專利，除使用硫酸鈉、氯化鈉、EDTA調(diào)節(jié)電導(dǎo)和滲透壓外，還使用了1，3-二曱基脲、l-羥基吡啶-2-硫酮和N-0乙酰氨基)-2-亞氨基二乙酸(ADA)穩(wěn)定紅細(xì)胞并對白細(xì)胞不造成影響；US5,227,304也是美國S叫uoiaTurner公司的專利，包括等滲稀釋液和等滲清潔液，全血稀釋液和清潔液的體系，稀釋液中主要使用咪唑有機(jī)溶液作為細(xì)胞穩(wěn)定劑和維持細(xì)胞形態(tài)的緩沖劑，此外還包含抗菌劑、無機(jī)鹽和pH調(diào)節(jié)劑；US5，935，857是美國庫爾特公司有關(guān)血液稀釋液的專利，該技術(shù)主要用于分析紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血紅蛋白。其中不使用六氫-l，3,5-三(2-羥乙基)-s-三嗪，主要使用5-氯-2-甲基-異噻唑啉-3-酮、2-曱基-4-異噻唑啉-3-酮、5-溴-5-硝基-l,3-二氧雜環(huán)己烷作為防腐劑，使用氨基苯曱酸酯及其衍生物作為細(xì)胞穩(wěn)定劑；CN03116849.3是中國稀釋液專利，其中使用鹽酸普魯卡因，并以磷酸取代ADA酸，還加入了表面活性劑起到彌散作用；CN200610078646.7是中國血液細(xì)胞分析儀用多功能稀釋液及制備方法的專利，其中使用非離子表面活性劑，及山梨酸、苯甲酸、酉旨、鹽、吡啶或者吡啶衍生物中的一種物質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)中主要集中于提供合適的滲透壓和電導(dǎo)環(huán)境，不涉及既可以長期保存血液樣本，又可以用于血液細(xì)胞分析檢測的稀釋液。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明正是為了滿足臨床檢測的要求，延長末梢血合理的放置時間，并在全血和預(yù)稀釋模式下均能提供白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白等各項血液檢測指標(biāo)的準(zhǔn)確、穩(wěn)定的計數(shù)及測定，并保證白細(xì)胞三分群分類特性不發(fā)生改變而專門研制的稀釋液系統(tǒng)。本發(fā)明一方面提供了一種用于分析血液成分的血液稀釋液，所述稀釋液包括至少一種噤呤類化合物或其鹽。所述稀釋液任選還包括a)至少一種堿金屬鹽；和/或b)至少一種有機(jī)緩沖劑和/或無機(jī)緩沖劑。本發(fā)明另一方面提供一種分析血液成分的方法，所述方法包括將本發(fā)明的血液稀釋液、任選的溶血劑與血樣混合的步驟。本發(fā)明經(jīng)臨床驗證，可以提供真實準(zhǔn)確的各項血常規(guī)參數(shù)測量結(jié)果，同時達(dá)到末梢血樣采血后放置2小時以上保持白細(xì)胞分類穩(wěn)定，無明顯變化。還有，經(jīng)本發(fā)明的血液稀釋液穩(wěn)定的血液樣本適用于各種血液細(xì)胞分析儀，在各種測試條件下進(jìn)行血液成分的分析測試。圖l是三分群血液分析儀測得的白細(xì)胞分布直方圖圖2-4分別為包含0.05g/L、0.5g/L以及25g/L咖啡因的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖5-6分別為pH5.0和9.5的包含咖啡因的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖；圖7為包含氨茶堿的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖(右)，并與不含本發(fā)明稀釋液的血樣分析圖(左)作對比；圖8為包含茶堿的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析囝(右)，并與不含本發(fā)明稀釋液的血樣分析圖(左)作對比；圖9為包含尿酸的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖(右)，并與不含本發(fā)明稀釋液的血樣分析圖(左)作對比；圖10為包含咖啡因的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖(右)，并與不含本發(fā)明稀釋液的血樣分析圖(左)作對比。圖ll為包含次黃嘌呤的本發(fā)明的稀釋液的血樣分析圖(右)，并與不含本發(fā)明稀釋液的血樣分析圖(左)作對比。具體實施例方式本發(fā)明的稀釋液主要用于對血液樣本進(jìn)行稀釋，提供電阻抗法檢測適宜的導(dǎo)電環(huán)境，及合適的滲透壓，同時穩(wěn)定各類血液細(xì)胞，使其保持一定的形態(tài)，便于儀器檢測獲得準(zhǔn)確的各參數(shù)計數(shù)結(jié)果；并且對白細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定，使得白細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較為明顯的區(qū)分，可以通過阻抗法分為三個類群，從而實現(xiàn)白細(xì)胞的三分群計數(shù)。本發(fā)明所定義的"嘌呤類化合物"是指含有以下所示結(jié)構(gòu)的嘧啶并咪唑稠環(huán)體系的化合物及其衍生物噪呤的氨基和羥基衍生物廣泛分布于動植物中。重要藥物如可可堿、咖啡因、茶堿等與核酸的組成成分及代謝產(chǎn)物如黃噪呤、次黃噪呤、尿酸的結(jié)構(gòu)相似，均為嘌呤類化合物。上述物質(zhì)分別具有如下結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>連接形成的其它物質(zhì)及其前體或代謝產(chǎn)物，只要其結(jié)構(gòu)中包含以上所列噪呤類化合物的結(jié)構(gòu)或與所述結(jié)構(gòu)類似。所述嘌呤類化合物在本發(fā)明稀釋液中的含量可為0.05-25g/L的范圍。其中優(yōu)選噤呤類化合物在本發(fā)明稀釋液中的含量為0.3-10g/L。適用于本發(fā)明，能夠為本發(fā)明的血液稀釋液提供合適的導(dǎo)電性和滲透壓的堿金屬鹽可選自堿金屬硫酸鹽、堿金屬卣化物以及其他堿金屬鹽。其中優(yōu)選硫酸鈉、氯化鈉等作為調(diào)節(jié)滲透壓并提供導(dǎo)電性的成分；在血液細(xì)胞測試中，合適的電導(dǎo)率為16-22mS/cm;合適的滲透壓為250-350mOsm/Kg。本發(fā)明的血液稀釋液中還含有調(diào)整pH值用的緩沖劑。對于緩沖劑沒有特定的要求，可以為常用的緩沖體系如甲酸、鄰苯二曱酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、碳酸等。本發(fā)明中pH范圍對分類沒有明顯影響，可以調(diào)整到5.0-9.5范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供分析血液成分的方法，所述方法包括將本發(fā)明的血液稀釋液、任選的溶血劑與血樣混合，隨后測試血液中各種成分例如白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板的各種參數(shù)的步驟。如對白細(xì)胞進(jìn)行測試，優(yōu)選先采用溶血劑溶解并除去其中的紅細(xì)胞。實施例以下通過實施例對本發(fā)明的血液稀釋液作進(jìn)一步描述，<旦應(yīng)理解，本發(fā)明并不限于此。在以下各制備本發(fā)明血液稀釋液的實施例中，將各種成分混合即可得到本發(fā)明的血液稀釋液。實施例l:稀釋液咖啡因0.05g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0實施例2:稀釋液咖啡因0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0實施例3:稀釋液咖啡因25g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0實施例4:稀釋液咖啡因0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g10磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH5.0實施例5:稀釋液咖啡因0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH9.5實施例6:稀釋液氨茶堿0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0對比實施例l:稀釋液N-(2-乙酰氨基)-2-亞氨基二乙酸(ADA)0.1g二甲基脲0.5g疏基吡啶氧化鈉O.lg硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0實施例7:稀釋液茶堿0.5g石克酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7,0對比實施例2:稀釋液組成同對比實施例1。實施例8:稀釋液尿酸0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0對比實施例3:稀釋液組成同對比實施例1。實施例9:稀釋液咖啡因0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0對比實施例4:稀釋液組成同對比實施例1。實施例10:稀釋液次黃嘌呤0.5g硫酸鈉10g氯化鈉3.5g磷酸鹽緩沖溶液0.05M補(bǔ)水到1LpH7.0對比實施例5:稀釋液組成同對比實施例1。實施例ll將以上所得稀釋液應(yīng)用于血液分析。采用邁瑞B(yǎng)C-:3000Plus(以及BC-1800、BC-2800、BC-2300等三分類血液細(xì)胞分析儀)型血液細(xì)胞分析儀。本領(lǐng)域:技術(shù)人員會理解，其他廠家或型號的血液細(xì)胞分析儀也適用于本發(fā)明。在血液中，各種細(xì)胞互相之間重疊以至于無法準(zhǔn)確計數(shù)和測量體積的大小，所以就需要用稀釋液對血樣進(jìn)行稀釋，使稀釋過的血細(xì)胞單個地通過測定孔，同時為計數(shù)提供導(dǎo)電環(huán)境。完成細(xì)胞個數(shù)和體積大小的測量。在全血模式下，全血和稀釋液混合，形成第一濃度的稀釋后樣品。將第一濃度稀釋后樣品分成兩部分。取一部分的第一濃度稀釋后樣品和一定量的稀釋液混合，形成第二濃度的樣品，用于紅細(xì)胞和血小板的計數(shù)測量。剩下的第一濃度稀釋后樣品和一定量的溶血劑混合，形成第三濃度的樣品，用于白細(xì)胞的計數(shù)測量。在預(yù)稀釋模式下，增加一個機(jī)外預(yù)稀釋的步驟一一采末梢血和一定量的稀釋液混合(機(jī)外稀釋)，形成第一濃度的稀釋后樣品。之后步驟與全血模式一致。本發(fā)明血液稀釋液適用于以上所有稀釋步驟，尤其適用于預(yù)稀釋模式下的稀釋步驟，其中溶血劑可采用例如如下配方溶血劑三哇10g十二烷基三曱基氯化銨(50%溶液)35ml十四烷基三甲基溴化銨3.5g補(bǔ)水到1LpH6.19得到各種末梢血樣與本發(fā)明血液稀釋液混合物后所測得的白細(xì)胞、紅細(xì)胞以及血小板的直方圖。參見說明書附圖2-11。附圖中測試樣本均取自新鮮的醫(yī)院臨床末梢血樣；附圖2-6中對比均為同一支血液樣本在新鮮取樣(一般為取樣5分鐘左右)和取樣后放置2小時(或以上)后的測試結(jié)果；附圖7-ll中對比結(jié)果分別為同一支血液樣本在新鮮取樣(一般為取樣5分鐘左右，不超過10分鐘)和取樣后放置2小時(或以上)后的測試結(jié)果；同時左右兩組分別為不同稀釋液結(jié)果對比(見圖表標(biāo)題說明)。圖2-4分別對應(yīng)于實施例1-3，以咖啡因作為噪呤類化合物有效成分，濃度分別為0.05g/L、0.5g/L以及25g/L。由圖2-4可見，在將加入本發(fā)明稀釋液的血樣放置2小時后，得到的血液分析曲線與放置5分鐘時的基本一致。圖5、6分別對應(yīng)于實施例4和5，以咖啡因作為。票呤類化合物有效成分，采用的稀釋液pH值分別為5.0和9.5。由圖5、6可見，在pH為5.0-9.5下，本發(fā)明稀釋液同樣可有效穩(wěn)定血樣2d、時以上。圖7-11分別對應(yīng)于實施例6-10,以氨茶堿、茶堿、尿酸、咖啡因以及次黃。票呤作為噪呤類化合物有效成分，同時采用N-O乙酰氨基)-2-亞氨基二乙酸(ADA)、二曱基脲及巰基吡啶氧化鈉作為對比，即對比實施例(l-5)，進(jìn)行穩(wěn)定性測試。由圖可見，本發(fā)明實施例6-9的血液稀釋液在一段時間內(nèi)(圖7為2小時33分、圖8為2小時3分、圖9為3小時、圖10為3小時30分、圖11為2小時5分)能夠有效地穩(wěn)定血樣各種成分，而對比實施例l-4的白細(xì)胞分析圖在相應(yīng)的時間已經(jīng)發(fā)生改變。由以上具體實施例可見，本發(fā)明的血液稀釋液能夠有效穩(wěn)定血樣中紅細(xì)胞、白細(xì)胞至少2小時以上，并在血液細(xì)胞分析4義上獲得較好的結(jié)果?，F(xiàn)已通過具體實施方式和實施例說明了本發(fā)明的技術(shù)方案，但是不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠領(lǐng)會，所有對本發(fā)明技術(shù)方案的明顯變形和等同方案都落入本發(fā)明的才青神和范圍內(nèi)。1權(quán)利要求1.一種用于分析血液成分的血液稀釋液，所述稀釋液包括至少一種嘌呤類化合物或其鹽。2.—種用于分析血液成分的血液稀釋液，所述稀釋液包括a)至少一種噪呤類化合物或其鹽；b)至少一種堿金屬鹽；和/或c)至少一種有機(jī)緩沖劑和/或無機(jī)緩沖劑。3.按照權(quán)利要求l-2中任一項中所述的稀釋液，其中所述嘌呤類化合物或其鹽包括次黃噪呤或黃嘌呤類化合物或其鹽。4.按照權(quán)利要求3中所述的稀釋液，其中所述次黃噤呤或黃噪呤類化合物或其鹽包括選自以下的物質(zhì)咖啡因、茶堿、氨茶石威、膽茶堿、二羥丙茶堿、多索茶堿、咖麻黃堿、巴米茶堿、可可堿、己酮可可堿、丙戊茶堿、登布茶堿、次黃。票呤、黃嘌呤、1-甲基黃噤呤、3-曱基黃噪呤、7-甲基黃噤呤、1,7-二曱基黃嘌呤、尿酸、1-甲基尿酸、1,3-二曱基尿酸、7-甲基尿酸，以及其衍生物和鹽。5.按照權(quán)利要求l-4中任一項所述的稀釋液，其中所述嘌呤類化合物或其鹽的濃度為0.05-25g/L,優(yōu)選濃度為0.3-10g/L，甚至更優(yōu)選0.5g/L。6.按照權(quán)利要求2-5中任一項所述的稀釋液，其中所述堿金屬鹽選自石咸金屬硫酸鹽和石成金屬卣化物。7.按照權(quán)利要求2-6中任一項所述的稀釋液，所述稀釋液的電導(dǎo)率為16-22mS/cm，滲透壓為250-350mOsm/Kg。8.按照權(quán)利要求2-7中任一項所述的稀釋液，其中所述有機(jī)緩沖劑和/或無機(jī)緩沖劑選自曱酸、鄰苯二曱酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、》灰酸及其鹽。9.按照權(quán)利要求2-8中任一項所述的稀釋液，所述稀釋液的pH值為5.0-9.5。10.按照權(quán)利要求1-9中任一項所述的稀釋液，其中所述血液成分選自白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白。11.一種分析血液成分的方法，所述方法包括將權(quán)利要求i-io中任一項所述的血液稀釋液、任選的溶血劑與血樣混合的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于分析血液成分的血液稀釋液，所述稀釋液包括至少一種嘌呤類化合物或其鹽；和/或至少一種堿金屬鹽和/或至少一種有機(jī)緩沖劑和/或無機(jī)緩沖劑。本發(fā)明的稀釋液可以提供合適的電導(dǎo)和滲透壓環(huán)境，保證在血液細(xì)胞分析儀檢測時提供稀釋及穩(wěn)定細(xì)胞的作用，并且能夠在室溫條件下使未經(jīng)處理的新鮮血液樣本穩(wěn)定放置2小時以上，可以通過血液細(xì)胞計數(shù)儀完成白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血紅蛋白等各項血液檢測指標(biāo)的準(zhǔn)確測定及白細(xì)胞三分群檢測，并保證白細(xì)胞三分群分類特性不發(fā)生改變。文檔編號G01N1/38GK101451931SQ20071019943公開日2009年6月10日申請日期2007年12月4日優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日發(fā)明者丹劉,劉牧龍,張利娜,許文娟申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司