專利名稱:熒光分光光度計的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種以特定的波長光作為激發(fā)光來照射樣品,并測定樣品 發(fā)出的熒光的熒光分光光度計。
背景技術:
熒光分光光度計是一種如下的裝置使物質(zhì)吸收光(激發(fā)光)而變?yōu)?激發(fā)狀態(tài),并測定從激發(fā)狀態(tài)再回到基態(tài)時所發(fā)出的光(熒光),以進行和 樣品相關的定性 定量分析。焚光分光光度計在定量的靈敏度 精度方面 優(yōu)異,且也可用作液相層析儀的檢測器。
根據(jù)圖5對普通焚光分光光度計加以說明。光源31發(fā)出的光由第1分 光部也就是激發(fā)側(cè)分光部(衍射光柵32、狹縫33)進行分光后,將預期的 波長光(激發(fā)光)照射到樣品元件35中的樣品上。照射到樣品上的光,使 與其能量相應的樣品分子中的 一部分電子得到激發(fā),使樣品分子成為激發(fā) 狀態(tài)。從激發(fā)狀態(tài)再回到基態(tài)時所發(fā)出的光,由第2分光部也就是熒光側(cè) 分光部(衍射光柵36、狹縫37)進行分光后,作為樣品熒光的預期的波長 光入Em將到達檢測部38。熒光強度取決于激發(fā)光的強度,因此激發(fā)光強度 的波動會對熒光強度的測定產(chǎn)生大的影響。為了補償激發(fā)光強度的波動,而 于入射到樣品元件35前利用分光鏡34,使來自激發(fā)光側(cè)分光部的激發(fā)光 入ex分支,并將其一部分的光作為參照光入k而導入到參照光檢測部39。來 自熒光檢測部38及參照光檢測部39的信號傳遞到運算部40后,對作為熒 光檢測器的輸出進行運算。通過以焚光強度與激發(fā)光強度的比作為焚光檢 測器的輸出,而使激發(fā)光的波動的影響得到抑制。如日本專利特開昭63-88412號公報、日本專利特開平3 - 274427號公報、日本專利特開2001 -83093號公報等所示,使入射到樣品元件35中的光分支的構(gòu)成較為普遍。
發(fā)明內(nèi)容
如上所述,為了獲得參照光AR,而將入射到樣品元件35中的激發(fā)光 入h分支,因此入射到樣品中的激發(fā)光會減少。如果激發(fā)光強度減少,則樣 品發(fā)出的焚光也會減少。作為熒光分光光度計的輸出變?nèi)鹾?,作為熒光?光光度計優(yōu)點的靈敏度也會降低,使高靈敏度分析受到妨礙。另外,為了 使信號穩(wěn)定化,而消耗出射光的一部分能量,導致潛在性能的發(fā)揮受到妨 礙。本發(fā)明的目的在于不損及光強度,而對經(jīng)分光的預期的光線補償強度。鑒于上述課題的本發(fā)明具備光源;第1分光部,將所述光源發(fā)出的 光進行分光后,選擇預期的波長光;樣品元件部,以所述第1分光部選擇 的全部波長光作為激發(fā)光而入射至樣品元件部;第2分光部,對來自所述 樣品元件部的光進行分光;光4企測部,;險測來自所述第2分光部的光;參 照光檢測部,檢測出未經(jīng)所述第1分光部選擇的光;光譜數(shù)據(jù)儲存部,儲 存由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出作為光譜數(shù)據(jù)。
利用此構(gòu)成,光源發(fā)出的光經(jīng)分光后,經(jīng)選擇的所有波長將入射到樣 品元件中,另一方面,未經(jīng)選擇的光將入射到參照光檢測部中。入射到參
"此外,本發(fā)明的熒光分光光度計具備運算部,此運算部從光語數(shù)據(jù)儲 存部中讀出光語數(shù)據(jù),并根據(jù)光譜數(shù)據(jù)中激發(fā)光波長下的光強度與參照光 波長下的光強度的比、及參照光檢測部的輸出,以補償入射到樣品元件部 中的激發(fā)光強度。
利用此構(gòu)成,進行如下的運算從光譜數(shù)據(jù)儲存部中讀出光譜數(shù)據(jù)后,根 據(jù)光鐠數(shù)據(jù)中激發(fā)光波長下的光強度與參照光波長下的光強度的比、及參 照光檢測部的輸出,以補償入射到樣品元件部中的激發(fā)光強度。
此外,本發(fā)明的熒光分光光度計中,入射到所述樣品元件部中的激發(fā) 光與未經(jīng)所述第1分光部選擇的光的關系為波長不同,或者衍射次數(shù)不同 且波長相同。至于選擇作為激發(fā)光以外的光時,波長和激發(fā)光不同的光,或者衍射次 數(shù)不同且波長相同的光將作為參照光。 [發(fā)明效果]
由于無需使照射樣品的激發(fā)光分支便可補償激發(fā)光強度,因此不會損 失激發(fā)光便可激發(fā)樣品。另外,由于可測定且儲存光源的光譜,因此可抑 制光源光譜經(jīng)時變化的影響。即,可針對激發(fā)光的波長下的光強度及參照 波長下的光強度,算出更準確的比值,由此可準確補償激發(fā)光強度,使定 量性提高。
圖l是本發(fā)明熒光分光光度計的概略圖。
圖2是用以說明經(jīng)本發(fā)明焚光分光光度計記錄的光譜的概念圖。 圖3是用以儲存光源光譜的處理的流程圖。 圖4是本發(fā)明熒光分光光度計的補償光強度的處理流程圖。 圖5是先前熒光分光光度計的概略圖。
11、 31:光源 12、 16、 32、 36:衍射光4冊
13、 17、 33、 37:狹縫 34:分光鏡15、 35:樣品元件 19、 39:參照光一企測部 21:光譜數(shù)據(jù)儲存部 S101 S106:步驟
18、 38:熒光檢測部 20、 40:運算部 23: 鏡面 S201 S209:步驟
具體實施例方式
參照圖l及圖2,對本發(fā)明熒光分光光度計加以說明。其與先前的焚光 分光光度計同樣具備:光源11;第1分光部即激發(fā)側(cè)分光部(衍射光柵12、狹
置有用于測定的樣! 。;第^分光部即熒光側(cè)分:光部(衍'射光:慨16、狹縫17),對 樣品元件15中的樣品發(fā)出的焚光選擇預期的波長;4企測部18,測定焚光強 度。本發(fā)明的熒光分光光度計中,參照光檢測部19如圖1所示,配置為能夠
檢測部19的受光面較大時,在參照光檢測部19之前還設有狹縫。并且,具 備光譜數(shù)據(jù)儲存部21,和衍射光柵12的轉(zhuǎn)動角相對應地記錄由參照光檢測 部19所測定的光強度。光源11的發(fā)光光譜作為波長人s和此波長中以光強 度Is表示的數(shù)據(jù)而儲存于光譜數(shù)據(jù)儲存部21,當進行激發(fā)光的強度補償時,數(shù) 據(jù)從光i普數(shù)據(jù)儲存部21中讀出。激發(fā)光波長入E,是根據(jù)設定值而算出的數(shù)
值,入射到參照光檢測部19中的光的波長入k是根據(jù)激發(fā)光波長的設定值 及光學系統(tǒng)的配置而算出的數(shù)值。根據(jù)所獲得的2個波長(AEx、入r)、以 及經(jīng)讀出的光譜,而獲得經(jīng)讀出的光譜中各波長的光強度Uex、s、 Iu)。
運算部20實施激發(fā)光強度L與熒光強度L之比的運算,以及基于儲 存于光譜數(shù)據(jù)儲存部21中的光譜而進行補償激發(fā)光強度的運算。由參照光 檢測部19實際測定的參照光的強度h和iEx、s/Iu的積成為入射到樣品元件 15中的激發(fā)光的強度IEx。根據(jù)經(jīng)補償?shù)募ぐl(fā)光強度L與熒光強度L,而 獲得作為熒光分光光度計的輸出。
如圖2 (a)所示,利用參照光^r測部19測定的光譜、與激發(fā)光的波長 范圍內(nèi)的光譜,在波長范圍內(nèi)完全不一致,如果使設定為激發(fā)光的波長范 圍為A , ~入2,則由參照光4企測部19測定的波長范圍將成為入+ △入~入2 十A入(或者,入,-A人 入2-A入)。A入值的大小根據(jù)參照光檢測部 19的配置位置而定,參照光一企測部19的配置位置,可考慮衍射光4冊n的 衍射特性、使來自光源的光入射的角度、僅使經(jīng)選擇的波長的光透射的狹 縫配置而任意設定。
如果減小AA值,則獲得波長接近于激發(fā)光波長"x的參照光。如圖2 (b)所示,在狹縫13的開口部附近設置鏡面23,使由鏡面23反射的參照 光XR,入射到參照光檢測部19中,并取出參照光入k即可。此時,因狹縫13的開口部為經(jīng)選擇的波長光進行成像的部分,所以為了不使激發(fā)光減少,而
優(yōu)選將鏡面23設置為不進入光路上。
當使用衍射i^冊進行分光時,關于衍射光柵周期d、每lmm中的縫數(shù)N、衍 射次數(shù)m(m-0、 ±1、 士2…)、波長人、入射光與衍射光柵法線所成的角 度(入射角)a 、衍射光與衍射光柵法線所成的角度(衍射角)e,將使d (sina士sinP ) =mA的關系式(光柵方程式)成立,則入射到衍射光柵 中的光根據(jù)衍射次數(shù)m的值而在各種角度上進行衍射。作為參照光檢測部 19設置時的位置,最簡便的設計是使相同衍射次數(shù)的波長范圍的光能夠入 射。
通??芍?,光源會因使用而劣化,導致發(fā)光光譜發(fā)生變化。圖2 (c) 以橫軸為波長,并在縱軸上以光為強度來表示光源發(fā)光光譜。2C-1是使用 時間尚短的光源光譜,2C-2是因使用而劣化的光源光譜。光源劣化后,則 整個波長范圍中光強度會減小,光譜形狀(具有特征性的波峰的波長)會 發(fā)生變化。如同從光譜2C-1向光譜2C-2變化那樣,光源的劣化在特定的 波長區(qū)域中較為顯著的情況并不少見。在此情況下,特定的波長(A4)的 變化量與其他波長(例如A3)的變化量不同,特定的波長(D的變化量 會變得較大。即便如此情況時,本發(fā)明熒光分光光度計,也由于光譜數(shù)據(jù) 儲存部21中儲存有與變化后的光譜相對應的光譜數(shù)據(jù),并以最近測定的光 譜數(shù)據(jù)為基礎來進行強度的補償,因此可以準確的激發(fā)光強度為基礎來進 行已算出的分析。
另外,作為熒光分光光度計的光源ll,優(yōu)選從紫外線 可見光延伸到紅 外線的寬廣波長范圍內(nèi)發(fā)出較強連續(xù)光譜的氙燈。作為熒光檢測部18、參 照光檢測部19,可使用光電二極管或光電倍增管。
參照圖3 ~ 4,對本發(fā)明焚光分光光度計補償光強度的運作,加以詳細闡 述。光源、衍射光柵等中所付與的符號,與圖1相對應。
若接通熒光分光光度計的電源,則光源ll被點亮(SIOI)。除光源11 被點亮外,也同樣進行控制部的初始化運作或光學系零件的運作檢查。
光源11點亮后并不會立即穩(wěn)定發(fā)光,而且檢測部(熒光檢測部18、參 照光檢測部19)的溫度也不會達到恒定狀態(tài)。接通電源后,在通電狀態(tài)下 待機適當時間(例如15分鐘),以進行所謂的暖機運行(S102)。
經(jīng)過特定的時間后,使衍射光柵12轉(zhuǎn)動,并設定于激發(fā)光對樣品元件l5 的波長范圍內(nèi)最長波長的光能夠入射的角度(S103)。此時,與入射到樣品 元件15中的波長入h不同的波長入K的光將入射到參照光檢測部19中,因 此參照光檢測部19的輸出將儲存在光譜數(shù)據(jù)儲存部21中(S104 )。
其次,以使短波長側(cè)的光入射到樣品元件15的方式使衍射光柵12轉(zhuǎn)動 (S105)。使由激發(fā)光的波長分辨率而定的最小單位的波長的短波長的光,入射到樣品元件15中,則可獲得更詳細的光譜數(shù)據(jù)。
重復轉(zhuǎn)動衍射光柵(S104)、記錄該參照光檢測部19的輸出信號(S105) 的運作,直至達到激發(fā)光波長范圍內(nèi)最短波長的it^射的角度為止(S106 )。根 據(jù)一系列運作,入射到參照光檢測部19中的光強度將儲存在光譜數(shù)據(jù)儲存 部21中。在光譜數(shù)據(jù)儲存部21中,以入射到參照光檢測部19中的光的波 長和光對參照光檢測部19的入射強度的關系,儲存成光語數(shù)據(jù)。
利用本發(fā)明熒光分光光度計來測定樣品時,如果設定激發(fā)波長入e,
(S201),則會使衍射光柵12轉(zhuǎn)動,并使波長hx的光入射到樣品元件15 中。同時,與激發(fā)光不同的波長"的光作為參照光而入射到參照光檢測部 19中,因此參照光強度L得以測定(S203 )。
此處,確認光語數(shù)據(jù)是否存在于光譜數(shù)據(jù)儲存部21中(S204 )。判斷 用以適當補償該激發(fā)光的光譜數(shù)據(jù)是否存在,并在特定的判定基準下進行 判定。判定基準為(1)光譜數(shù)據(jù)本身的存在與否,(2)光譜數(shù)據(jù)的可靠 性,(3)光譜數(shù)據(jù)經(jīng)測定的時期?;谌康呐卸ɑ鶞?,如果光譜數(shù)據(jù)判 定為合格,則適于補償該激發(fā)光。
(1) 關于光譜數(shù)據(jù)本身的存在,就是判斷光譜數(shù)據(jù)是否儲存在于光譜 數(shù)據(jù)儲存部21中。如果光譜數(shù)據(jù)不存在,則進入后述的S207的處理。如 果光譜數(shù)據(jù)存在,則繼續(xù)進行如下的判斷。
(2) 光譜數(shù)據(jù)的可靠性是針對存在于光語數(shù)據(jù)儲存部21中的光譜數(shù) 據(jù),由如下的評估來進行,例如,數(shù)據(jù)是在初始化運作時任何部位均發(fā)現(xiàn) 不良情形的狀態(tài)下得到測定的。熒光分光光度計處于不良狀態(tài)下所取得的 數(shù)據(jù)欠缺可靠性,因此判斷為用以適當補償該激發(fā)光的光譜數(shù)據(jù)不存在,并 進入S207的處理。光譜數(shù)據(jù)的可靠性如無問題,則接著繼續(xù)進行如下的判 斷。
(3) 對光譜數(shù)據(jù)經(jīng)測定的時期進行評估。如果光譜數(shù)據(jù)經(jīng)測定的時期 較長,則光源11的經(jīng)時變化繼續(xù)進展,光譜發(fā)生變化的可能性高。利用如 熒光分光光度計那樣的分析裝置所獲得的數(shù)據(jù)中,通常記錄有取得數(shù)據(jù)的 時日,因此利用其進行評估即可。或者,如果是作業(yè)系統(tǒng)(OS, operating system)方面,則因生成文件的時日插入在文件中,因此利用其進行評估 即可。另外,即使光譜數(shù)據(jù)的時間較新,也會因點亮'熄滅的運作,而使 光源11的發(fā)光部分受到相當多的負荷,因此優(yōu)選包括有無點亮 熄滅的運 作來進行評估。
當存在正常的光譜數(shù)據(jù)時,讀出光譜數(shù)據(jù)(S205 )。算出以波長與光強 度的關系所記錄的光譜數(shù)據(jù)中激發(fā)光的波長人h的強度Iex,s、和參照光的波 長入r的強度k s的比(L,s/Us) (S206 ),并輸出此比值與經(jīng)測定的參照光 的強度Ia的乘積(IRXIEx, S/IR, J以作為入射到樣品元件15中的光強度?;谏鲜雠卸ǎ庾V數(shù)據(jù)不存在,或者欠缺可靠性,或者光譜數(shù)據(jù)時
間較久時,顯示為無適當?shù)墓庾V數(shù)據(jù)(S207 ),并將經(jīng)測定的數(shù)據(jù)(熒光光
譜)是并未進行補償該激發(fā)光強度的數(shù)據(jù)通知給操作者。了解到光源11的 光譜數(shù)據(jù)為不存在狀態(tài)的操作者,在結(jié)束實施中的分析后,進行用以補充
光源11的光譜數(shù)據(jù)的操作。對于此測定,使L,s/h,s為1以進行處理(S208 )。 并且,熒光分光光度計基于IRXIEx, S/IR, s的數(shù)值,以輸出結(jié)果(S209 )。 經(jīng)過S208的處理后,由于使IBx,s/IR.s= 1,因此光強度并未進行補償。
在進行波形處理或者定量計算等之前,補充光譜數(shù)據(jù),進行光強度的補償
的運算。
接通焚光分光光度計的電源,并且在光源11發(fā)出的光的強度穩(wěn)定后(點 亮后約15分鐘左右),或者進行樣品分析之前,或者進行樣品分析之后,由 參照光檢測部19進行光譜測定,由此可準確補償光強度。
所述實施例僅為本發(fā)明的一例,也可于本發(fā)明的宗旨范圍內(nèi)進行適當 的變更或者修正。明確的是,經(jīng)過這些變更或者修正后,它們也包含在本 發(fā)明中。
將流動單元用作樣品元件部時,該流動單元也可用作液相層析儀用的 檢測器。此時則具備輸送流動相的泵、將樣品導入到由泵輸送的流動相 中的進樣器、以及將導入的樣品分離為每一成分的管柱。
本發(fā)明可用作熒光分光光度計、液相層析儀用途的熒光分光光度檢測器。
權利要求
1.一種熒光分光光度計,其特征在于其具備光源;第1分光部,將所述光源發(fā)出的光進行分光后,選擇預期的波長光;樣品元件部,以所述第1分光部選擇的所有波長光作為激發(fā)光而入射至樣品元件部;第2分光部,將來自所述樣品元件部的光進行分光;光檢測部,檢測來自所述第2分光部的光;參照光檢測部,檢測未經(jīng)所述第1分光部選擇的光;光譜數(shù)據(jù)儲存部,儲存由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出作為光譜數(shù)據(jù)。
2. 根據(jù)權利要求1所述的焚光分光光度計,其特征在于具備運算部,所 述運算部從所述光譜數(shù)據(jù)儲存部中讀出光譜數(shù)據(jù),并根據(jù)所述光譜數(shù)據(jù)中 激發(fā)光波長下的光強度與參照光波長下的光強度的比,及所述參照光檢測 部的輸出,以補償入射到所述樣品元件部中的激發(fā)光強度。
3. 根據(jù)權利要求1所述的焚光分光光度計,其特征在于入射到所述樣 品元件部的激發(fā)光與未經(jīng)所述第1分光部選^^的光的波長不同。
4,根據(jù)權利要求1所迷的焚光分光光度計,其特征在于入射到所述樣 品元件部的激發(fā)光與未經(jīng)所述第1分光部選擇的光,衍射次數(shù)不同,且波 長相同。
5. —種液相層析儀,其特征在于其具備輸送流動相的泵、將樣品導入 到所述泵所輸送的流動相中的進樣器、將所導入的樣品分離為每一成分的 管柱、根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的焚光分光光度計,并將經(jīng)分離 的樣品導入到所述樣品元件部中。
6. 根據(jù)權利要求1所迷的熒光分光光度計,其特征在于光源發(fā)出的光 經(jīng)分光后,經(jīng)選擇的所有波長將入射到樣品元件中,未經(jīng)選擇的光將入射 到參照光4企測部中。
7. 根據(jù)權利要求1或6所述的熒光分光光度計,其特征在于入射到參 照光檢測部中的光將作為光譜數(shù)據(jù)而儲存于光譜數(shù)據(jù)儲存部中。
8. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的焚光分光光度計,其特征在于 選擇作為激發(fā)光以外的光時,波長和激發(fā)光不同的光,或者衍射次數(shù)不同 且波長相同的光將作為參照光。
全文摘要
本發(fā)明可補償光源發(fā)光強度的波動。本發(fā)明可利用第1分光部(12、13)將光源發(fā)出的光進行分光后,將具有特定的波長(λ<sub>Ex</sub>)的激發(fā)光入射到樣品元件15。利用第2分光部(16、17)將來自樣品元件部的光進行分光,并利用熒光檢測部18來測定熒光強度(I<sub>Em</sub>)。另一方面,參照光檢測部19檢測未經(jīng)第1分光部選擇的光的特定的波長(λ<sub>R</sub>),將由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出儲存于光譜數(shù)據(jù)儲存部21中。根據(jù)光譜數(shù)據(jù)的激發(fā)光波長、參照光波長、參照光強度,算出激發(fā)光強度(I<sub>Ex</sub>)。依據(jù)經(jīng)測定的熒光強度(I<sub>Em</sub>)、經(jīng)算出的激發(fā)光強度(I<sub>Ex</sub>),求得熒光分光光度計的輸出。
文檔編號G01N21/64GK101308092SQ20071019659
公開日2008年11月19日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權日2007年5月16日
發(fā)明者軍司昌秀 申請人:株式會社島津制作所