專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定單胺氧 化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免
疫抑制法和化學(xué)分光光度法。熒光法是以p -苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化
酶，其依據(jù)是e-苯乙胺在10 100mg時(shí)反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色 胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)， 測定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較多的單克隆抗體有 MAO-A3C9、 MAO誦A4F10、 MAO-A7B10、 MAO-A7E10和MA0-B1C2等。
相對而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉?釋放出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲?；?3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、 對苯甲胺-P-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 P-苯 乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又稱"3-對羥基苯乙胺"， 3-parahdroxyphenylethylamine)、 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng) 底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型底物測得的單胺氧化 酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測得的活 性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用節(jié)胺和對 苯甲胺-3 -偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生 成芐醛，然后在強(qiáng)堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙， 這在生化儀上測定較困難；對苯甲胺-e-偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，
限制了該方法的實(shí)用性，且不能應(yīng)用全自動生化儀分析。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單 胺氧化酶活性濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的單胺氧 化酶診斷試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因 而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子+
過氧化氫
過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+
輔酶八+氧
丙酮酸+ 二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)
L-蘋果酸+輔酶
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine oxidase; EC 1.4.3.4; EC 1.4.3.6) 酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1.1.1.83)酶促
反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過 (偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以 測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度 下降的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。
其中，二氧化碳可以用碳酸氫鈉或其他碳酸氫鹽取代。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為 理想
緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶10000 U/L
蘋果酸脫氫酶12000 U/L
胺類化合物9 mmol/L
碳酸氫鈉12 mmol/L
乙酰輔酶A2 mmol/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類 化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙 酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。說 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶。
還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙 酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉 狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
胺類化合物 9 mmol/L
12 mmol/L乙酰輔酶A 2 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，
加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試
劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘
左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K值一4180。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃
度大小。
實(shí)施例二
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
50 mmol/L 0.25 mmol/L
胺類化合物
乙酰輔酶A
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶
9 mmol/L 12 mmol/L 2 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 10000U/試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度
1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試 劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí) 間大約l分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右，理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。 實(shí)施例三
本實(shí)施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
胺類化合物
乙酰輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
蘋果酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
訓(xùn)mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 9 mmol/L 12 mmol/L 2 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 10000 U/L
磨mmol/L 500 mmol/L丙酮酸氧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時(shí)，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反 應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士 0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右， 理論K值一2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果一~^空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0013;吸光 度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線下降；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)250 U/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達(dá)0.0003 ± 0.00015 AA/min/U/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應(yīng)用。
ii
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+水+氧 <u>單胺氧化酶</u> 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨離子+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A <u>丙酮酸氧化酶</u> 丙酮酸+ 輔酶A+氧丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶 <u>蘋果酸脫氫酶(脫羧化)</u> L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小結(jié)果。其中，二氧化碳可以用碳酸氫鈉或其他碳酸氫鹽取代。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括.-緩沖液20~500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L還原型輔酶0.1———0.35 mmol/L丙酮酸氧化酶1000-——80000 U/L蘋果酸脫氫酶1000-——80000 U/L胺類化合物1_50 mmol/L碳酸氫鈉1—50 mmol/L乙酰輔酶Al一50 mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-P-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1^4000mmol/L或0.P/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉、乙酰輔酶A、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464290SQ200710191470
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司