專利名稱：：蜂王漿新鮮度檢測試紙制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種屬于醫(yī)藥、食品及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中用于蜂王漿新鮮度檢測的檢測設(shè)備、其制備及應(yīng)用方法，更具體地，涉及一種可用于簡便、快捷、有效地評判蜂王漿新鮮度的檢測試紙、其制備及應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：由于鮮王漿通常貯存在一2(TC或更低的溫度以保持其活性成分，如果貯存溫度不當(dāng)，將會(huì)導(dǎo)致功能成分丟失或變質(zhì)而失去商業(yè)價(jià)值，但目前尚無簡便、快捷、有效的方法評判蜂王漿的新鮮度和品質(zhì)。我們最近通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證明蜂王漿中的葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5可做為新鮮度的蛋白標(biāo)記物。由于納米級膠體金(Colloidalgold)具有高電子密度，能與生物大分子結(jié)合,膠體金技術(shù)己成為繼熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記和酶標(biāo)記三大標(biāo)記技術(shù)后新發(fā)展起來的一種常用的固相標(biāo)記技術(shù)。納米膠體金檢測試紙技術(shù)以免疫層析反應(yīng)和膠體金技術(shù)為基礎(chǔ)，利用目標(biāo)蛋白與其抗體的特異性反應(yīng)，快速鑒別樣品中是否存在目標(biāo)蛋白。檢測試紙工作是原理，試紙條上的硝酸纖維膜(NC膜)檢測線固定有目標(biāo)蛋白抗體，質(zhì)控線則固定有前述抗體的二抗，檢測線和控制線前的膠體金釋放墊含有表面標(biāo)記上了目標(biāo)蛋白抗體的納米膠體金顆粒，樣品溶液在層析作用下移動(dòng)到膠體金釋放墊時(shí)將膠體金標(biāo)記的抗體解吸下來并繼續(xù)移動(dòng)，如果樣品溶液中含有目標(biāo)蛋白，將形成目標(biāo)蛋白-抗體-'納米膠體金復(fù)合物，到檢測線時(shí)，復(fù)合物將與固定在檢測線上的目標(biāo)蛋白抗體結(jié)合，未結(jié)合上的復(fù)合物和剩余的膠體金標(biāo)記抗體會(huì)繼續(xù)移動(dòng)到質(zhì)控線與二抗結(jié)合，使檢測線和質(zhì)控線顯現(xiàn)膠體金的紅色。納米膠體金檢測試紙制作的具體數(shù)據(jù)方法極易從相關(guān)科學(xué)書籍和文獻(xiàn)中獲得。通過對蜂王漿中的葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5進(jìn)行色譜分離純化、基因克隆表達(dá)和蛋白質(zhì)表位氨基酸分析合成，分別獲得上述三種天然蛋白，三種表達(dá)蛋白和三種人工合成多肽，制備這些蛋白多肽的單克隆抗體或多克隆抗體，可用于上述檢測蜂王漿新鮮度的納米膠體金檢測試紙的制作?；蚩寺”磉_(dá)、蛋白質(zhì)表位氨基酸分析合成、單克隆抗體制備和多克隆抗體制備的具體數(shù)據(jù)方法極易從相關(guān)科學(xué)書籍和文獻(xiàn)中獲得。
發(fā)明內(nèi)容在已有的科學(xué)知識基礎(chǔ)上，以蜂王漿中易受貯存溫度影響的蛋白質(zhì)為檢測目標(biāo)評價(jià)蜂王漿新鮮度和品質(zhì)，發(fā)明了一種快速、低成本和高靈敏度的用于蜂王漿及其他相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)、銷售和使用過程中的原料品質(zhì)鑒定、產(chǎn)品質(zhì)量控制和活性價(jià)值測定等方面的納米膠體金檢測試紙。首先使用雙向電泳分離/色譜分離-質(zhì)譜分析技術(shù)確定蜂王漿中易受貯存溫度影響的檢測目標(biāo)蛋白，如葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5。利用多肽合成、基因克隆表達(dá)和蜂王漿中天然蛋白分離技術(shù)獲得檢測目標(biāo)蛋白及特異肽片段，獲得檢測目標(biāo)蛋白及特異肽片段的單抗或多抗，制備可檢測一種或多種易受貯存溫度影響的目標(biāo)蛋白的蜂王漿新鮮度納米膠體金檢測試紙。本發(fā)明檢測試紙包括濾紙(l)、釋放墊(2)、檢測線(3)、質(zhì)控線(4)和襯板(5)。本發(fā)明檢測試紙檢測目標(biāo)為蜂王漿中最易受貯存溫度影響的葡萄糖氧化酶。本發(fā)明檢測試紙檢測目標(biāo)為蜂王漿中最易受貯存溫度影響的王漿蛋白4。本發(fā)明檢測試紙檢測目標(biāo)為蜂王漿中易受貯存溫度影響的王漿蛋白5。本發(fā)明檢測試紙檢測目標(biāo)蛋白在室溫貯存下易降解。本發(fā)明檢測試紙制備檢測目標(biāo)蛋白或特異肽片段的單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明檢測試紙?jiān)诘鞍踪|(zhì)組分析比較結(jié)果基礎(chǔ)上，利用多肽合成、基因克隆表達(dá)和蜂王漿中天然蛋白分離技術(shù)獲得檢測目標(biāo)蛋白及特異肽片段。本發(fā)明檢測試紙的方法，其特征在于獲得葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5或特異肽片段的單抗或多抗，用抗體標(biāo)記膠體金制作釋放墊，用抗體作為檢測線，用相應(yīng)的二抗作為質(zhì)控線，檢測蜂王漿新鮮度和含量。本發(fā)明檢測試紙檢測蜂王漿中的蛋白降解情況指示蜂王漿新鮮度和品質(zhì)。本發(fā)明檢測試紙用于蜂王漿品質(zhì)的快速、低成本和高靈敏度檢測。本發(fā)明檢測試紙用于蜂王漿生產(chǎn)、銷售和使用過程中的原料品質(zhì)鑒定、產(chǎn)品質(zhì)量控制和活性價(jià)值測定等方面。本發(fā)明檢測試紙用于其他相關(guān)產(chǎn)品中蜂王漿含量檢測。圖l:納米膠體金檢測試紙腑視圖。圖2:納米膠體金檢測試紙側(cè)視圖。'圖3:不同儲存條件下王漿蛋白的雙向電泳圖譜。(a),(b),(c)和(d)分別對應(yīng)新鮮王漿、一2(TC儲存一年、4'C儲存一年和室溫儲存一年的王漿圖譜。電泳上樣量均為200ug，考馬斯亮蘭G-250染色。圖4:不同儲存條件下王漿蛋白4(Apa4)的雙向電泳圖譜(從圖1對應(yīng)位置切割而來)。(a)，(b),(c)，(d)同圖2。從圖中可以較為直觀的看出隨著儲存溫度的升高，王槳蛋白4(Apa4)降解程度越來越高，最后甚至消失殆盡。'說明這種王漿蛋白對儲存溫度比較敏感。圖5:不同儲存條件下王漿蛋白5(APa5)和葡萄糖氧化酶(God)電泳圖譜(從圖1對應(yīng)位置切割而來)。(a),(b),(c)，(d)同圖2。從圖中可以較為直觀的看出隨著儲存溫度的升高，王漿蛋白5(Apa5)和葡萄糖氧化酶(God)降解程度越來越高，最后甚至消失殆盡。說明這兩種王漿蛋白對儲存溫度比較敏感。圖6:王漿蛋白4的肽質(zhì)量指紋圖譜。圖7:王漿蛋白5的肽質(zhì)量指紋圖譜。圖8:葡萄糖氧化酶的肽質(zhì)量指紋圖譜。圖9:新鮮蜂王漿的Superosel2HR分子篩色譜分離結(jié)果。從圖中可看出，新鮮蜂王漿蛋白經(jīng)Superose12HR分子篩分離可明顯得到7個(gè)色譜峰。圖10:—20'C儲存一年、4。C儲存一年和室溫儲存一年的王漿經(jīng)Superose12HR分子篩色譜分離得到的7個(gè)蛋白質(zhì)多肽峰相對峰面積比較，結(jié)果顯示不同條件下儲存的王漿7個(gè)蛋白組分含量存在較大差異。圖lh4。C儲存一年的王漿經(jīng)Superose12HR分子篩色譜分離得到的第4個(gè)蛋白質(zhì)多肽峰的NanoLCMS/MS序列分析結(jié)果，表明示4'C儲存王漿的第4個(gè)色譜峰中可檢測到王漿蛋白l、王漿蛋白2、王漿蛋白7、王漿蛋白3。圖12:—2(TC儲存一年的王漿經(jīng)Superose12HR分子篩色譜分離得到的第4個(gè)蛋白質(zhì)多肽峰的NanoLCMS/MS序列分析結(jié)果，表明示-2(TC儲存王漿的第4個(gè)色譜峰中可檢測到王漿蛋白1、王漿蛋白2、王漿蛋白7、王漿蛋白3和王漿蛋白5，表明示4'C儲存王漿的第4個(gè)色譜峰中可檢測到王漿蛋白1、王漿蛋白2、王漿蛋白7、王漿蛋白3，而王漿蛋白5只能在-20'C儲存王漿的第4個(gè)色譜峰中檢測到。序列表1、王漿蛋白4的肽序列及匹配結(jié)果:(注加粗標(biāo)識部分為與NCBI數(shù)據(jù)庫中所示肽段相匹配的部分)。1MTKWLLLMVCLGIACQNIRGGVVRENSSGKNLTNTLNVIHKWKYLDYDFD51NDERRQAAIQSGEYDRTKNYPLDVDQWHNKTFLAVIRYNGVPSSLNVVSD101KTGNGGRLLQPYPDWSFAKYEDCSGIVSAPKIAIDEYERLWVLDSGLVNN151TQPMCSPKLFAFDLNTSQLLKQVEIPHDVATTGKGELVSLTVQAMDSTNT201MVYMVDNKNTLIIYQNADDSFHRLSSHTLNHNSDKMSDQQENLTLKEVDN251KVYGMALSPVTHNLYYNSPSSENLYYVNTESLMKSENQGNDVQYERVQDV301FDSQLTVKAVSKNGVLLFGLA麗TLSCWNEHQSLDRQNIDVVARNEDTLQ351MVVSMKIKQNVPQSGRVNNTQRNEYLLAlisDRNQNVL麗DLNLEHVNFQI401LGANVNDLIRNSRCANFDNQDNNHYNHNHNQARHSSKSDNQNNNQHNDQA451HHSSKS麗RHNNND■2、王漿蛋白5的肽序列及匹配結(jié)果(注加粗標(biāo)識部分為與NCBI數(shù)據(jù)庫中所示肽段相匹配的部分)。1MTKWLLLVVCLGIACQDVTSAAVNHQRKSANNLAHSMKVIYEWKHIDFDF51GSDERRDAAIKSGEFDHTKNYPFDVDRWRDKTFVTIERNNGVPSSLNVVT101NKKGKGGPLLRPYPDWSFAKYEDCSGIVSAFKIAVDKFDRLWVLDSGLVN151刪QPMCSPKJ丄TFDLKTSKLVKQVEIPHNIAVNATTGMGELVSLAVQATD201RTNTMVYIADEKGEGLIMYQNSDDSFHRLTSNTFDYDPRYTKLTVAGESF251TVKNGIYGIALSPVTNNLYYSPLLSHGLYYVDTEQFSNPQYEE麗VQYEG301SQDILNTQSFGKVVSKNGVLFLGLVGNSGIACVNEHQVLQRESFDVVAQN351EETLQMIVSMK1MENLP(JSGRINDPEGNEYMLALSNRMQKITNNDFNFND401VNF肌GANVDDLMRNTRCGRYHNQNAGNQNADNQNADNQNA畫QNADNQ451NANKQNGNRQNDNRQNDNKQNG雨QNDNKQNGNRQNDNKQNGNRQNGNKQ501NDNKQNGNRQNDNKRNGNRQNDNQ應(yīng)QNDNNRNDNQVHHSSKLH3、葡萄糖氧化酶的肽序列及匹配結(jié)果(注加粗標(biāo)識部分為與NCBI數(shù)據(jù)庫中所示肽段相匹配的部分)。1MAILNSMYNNVSPLQCTSPFLGGPQLTDVCSASNGELFLALLNFFVATSP51VIGEPC(JRVHSSRIPDLSYDF1VVGGGAARAVVAGRLSEVSNWKVLLLEA101GPDEPAGAEIPSNLQLYLGGDLDWKYYTTN,ESHACLSTGGSCYWPRGKNL151GGTTLHHGMAYHRGHRKDYERWVQQGAFGWSWDEVMPYYLKSE麗TELSR201VGTKYHRSGGL畫VERFPYQPPFAWKILKAAEEAGFGVSEDLSGDRINGF251TVAQTISRNGVRLSSARAFITPFENRSNLHy畫ATVTKVRTLNKRATGV301NVLINGRRRIIFARREVILSAGSVNTPQLLMLSGIGPKEHLRSLGIPVVV351DLPGVGENLHNHQSFGMDFSLNEDFYPTFNQTNVDQYLYNQTGPLSSTGL401AQVTGIWHSNLTTPDDPDIQIFFAGYQAICKPKLKIADLSAHDKQAVRMS451ALNVQPTSKGRITLNSKDPLDPPVIWSNDLATEHDRSVMIQAIRVVQKLV501NTTVMRDLGVEFQK正LKQCDEFVEDSDDYWNCVIQYNTRAENHQTGTAK551MGPSYDPMAVVSPRLKVHGIRGLRVADASV,VISGNPVASVNMVGERA601ADFIKEDWGELLQLL4、王漿蛋白4核酸序列,61218243036424854606672788490%102108gtcacttgtaaaatatttgtaatatcctagaaaaaaaatgacaaaatggttgctgttgatggtatgccttggcatagcttgtcaaaatattagaggtggcgttgttcgagaaaattcctcgggaaaaaacttgacaaatacgttgaacgtgattcacaaatggaagtatctcgattatgatttcgataacgacgaaaggaggcaagctgcgattcaatctggcgaatatgatcgtacaaaaaattatcctcttgacgtcgatcaatggcacaacaagacttttctcgctgtaataagatacaatggtgtgccttcctctttgaacgtggtatctgacaaaactggcaacggtggacgacttctacaaccgtatcctgattggtcatttgccaagtacgaagattgctctggaatcgtgagcgctcataaaattgctatcgacgaatatgagagattgtgggttctggattcgggtctcgtcaataatacgcaacccatgtgttctccaaaactgttCgcttttgatcttaatacctcgcaattgctcaagcaagtcgagataccgcacgatgttgccaccacaggaaagggcgaattagtatctttaactgttcaagctatggattcgacaaatactatggtgtacatggtagacaacaaaaatactttgatcatctaccaaaatgccgatgattc加catcgattgtcttcccacactttgaatcacaactctgacaaaatgtcagatcaacaagaaaatctcaccttgaaagaagtagacaacaaagtttatggaatggcacttagtcccgtgacgcataatctttattacaattctccgtcttctgagaatttgtattatgttaacacagaatcgttaatgaaatcggaaaatcaaggaaatgacgtgcaatatgaaagagtccaagaCgttttcgacagtcaattaaccgttaaagcagtatcgaaaaatggcgtactccttttcggactcgcgaataatactcttagttgctggaacgagcatcagtcacttgacagacaaaatatcgatgtcgtagctcgaaatgaggacacgcttcaaatggtcgttagtatgaagattaagcaaaacgttccacaatctggcagagttaa<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>王漿蛋白5核酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6、王漿葡萄糖氧化酶核酸序列。.1ccggttttcattctctgagcgtaactcgacatggcgatcttaaactcaatgtacaacaac61gtatccccgctgcagtgcacgtcgccgttccttggcgggccgcagctgaccgacgtgtgc121tcggcgagcaacggcgagctgrtcctcgccctcctcaacttcttcgttgccacgagcccg181gtgatcggcgagccgtgccagcgcgtccactcctcgaggatacccgacctcagctacgac241ttcatcgtggtcggcggcggagccgcgcgggc鵬gtcgctggaaggctgagcgaggtt301tcgaattggaaggttctgcttctggaggcaggcccggacgagccggccggcgccgagata361cctagcaaccttcagctttatctaggcggggatctggactggaagtattacactacgaac421gagtcgcacgcctgcctaagcactggcggcagttgctactggcctcgaggcaagaatctc481gggggaacgacccttcaccacggcatggcgtaccaccgtggccatcgcaaggattacgag541agatgggtccagcagggcgcctttggctggagctgggacgaggttatgccgtattacctg601aaatcggagaacaacaccgagctgagcagagtcgggacaaagtaccatcgaagcggtgga661ctgatgaacgtggaaaggttcccataccagccacctttcgcttggaagatcctgaaagcg721gcggaggaggcgggtttcggcgtttcggaggacttgtcgg鵬atcggataaacggtttc781acggtggcgcagacgataagcaggaacggcgtgcgtttgagcagcgcgagagcgttcatc841acgccgttcgagaaccgaagtaacctccacgtg欲agtgaacgcgaccgtgacgaaagtg901agaacgttgaacaagagggcgacgggcgtgaacgtgttgatcaac鵬aggaggaggatc961atattcgcgagacgggaggtgatcctgtccgcaggctcggtgaacactcctcaactgctc1021atgttgtcgggcatagggccgaaggaacaccttcgatccctgggaatcccggtggtggtt1081gatctgcctggagttggcgagaaccttcacaatcaccaatcgttcggcatggatttctcg1141ttgaacgaggac加acccgaccttcaaccagaccaacgtcgaccagtacctgtacaat1201cagacgggccctctatccagcaccgggttggctcaggtgaccggtatatggcactcgaat1261ctcaccacccccgacgaccccgacatacagatattcttcgccggttaccaggcaatttgc1321aagccaaaattgaagatcgcagatctatcggcccacgacaaacaggcggtgagaatgtcc1381gcgttgaacgttcagccgacgagcaaaggtcgcatcacgttgaacagcaaagaccccctc1441gacccgcccgtcatctggagcaacgatctggccaccgagcacgaccgcagcgtcatgata1501caggcgatccgagtcgtgcaaaaattggtgaacactaccgtcatgagggatctgggggtc1561gagtttcaaaagatcgaactgaagcaatgcgacghgttcgtcgaggacagcgacgattac1621tggaactgcgtgatacagtacaacacgagggcggaaaatcatcagaccggcacggcgaag1681atgggacccagttacgatcctatggcggtcgtctqtccccggctcaaggtgcacggcatc1741aggggactgagagtggcagacgcctccgttcagccgcaggtgatctcgggtaatcctgtc1801gcctctgtcaatatggtcggcgagagggctgcagactttatcaaggaggattggggagaa1861ttacttcaattactgtaatcatttgttggagttaactgtactcgtgttttaaagctacgt1921atatatatataattattctg具體實(shí)施例方式實(shí)施例1蜂王漿蛋白雙向電泳分離與質(zhì)譜分析將不同儲存條件下的王漿分別經(jīng)磷酸抽提緩沖液(PB)和蛋白樣品溶解緩沖液(LB)提取，提取液加入三氯乙酸使蛋白沉淀，得到不同儲存條件下的王漿全蛋白。將蛋白重新溶解并檢測濃度，然后按一定的上樣量作雙向電泳(固相pH梯度，17cm膠條，pH3-10),所得電泳圖譜(圖1)用專業(yè)分析軟件分析。對表達(dá)豐度較高的目標(biāo)蛋白點(diǎn)經(jīng)酶切作質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果提交專業(yè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對進(jìn)行蛋白鑒定(圖2)。分析結(jié)果表明隨著儲存溫度的升高，王漿蛋白4、王槳蛋白5和葡萄糖氧化酶的降解越來越嚴(yán)重(圖l)，說明這三種蛋白對儲存溫度比較敏感。,實(shí)施例2蜂王漿蛋白色譜分離與質(zhì)譜分析不同貯存條件保存的蜂王漿分別經(jīng)丙酮沉淀，堿性緩沖液(pH8.2)復(fù)溶，獲得新鮮蜂王漿、-20"貯存一年蜂王漿、4'C貯存一年蜂王漿、室溫貯存一年蜂王漿的總蛋白，將上述蛋白樣品進(jìn)行分子篩色譜分離(圖3)，確定在分子量10K至U100K的組分存在明顯差異。選取其中第四組分(Re^7.34min)經(jīng)胰酶消化，鈉升級色譜分離和質(zhì)譜序列分析(NanoLCMS/MS，表1)，確定王漿蛋白5僅能在鮮蜂王漿和-20。C貯存的蜂王漿中檢測到。實(shí)施例3檢測目標(biāo)蛋白基因克隆表達(dá)根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的王漿蛋白4、王漿蛋白5和葡萄糖氧化酶的序列合成各自的正向和反向引物，以蜜蜂工蜂頭部的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的目的片段與適當(dāng)?shù)妮d體(T質(zhì)粒，試劑盒)連接組成重組體，然后導(dǎo)入受體菌(大腸桿菌toplO菌株，雙抗)，菌落PCR篩選重組陽性克隆，對目標(biāo)克隆一物進(jìn)行核苷酸序列分析。將經(jīng)測序證實(shí)無誤的重組體重組入表達(dá)載體中，誘導(dǎo)使其表達(dá)。對表達(dá)產(chǎn)物分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜分析檢測。實(shí)施例4檢測目標(biāo)蛋白表位氨基酸分析和多肽合成葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5序列如圖4所示，利用多種軟件分析目標(biāo)蛋白的親疏水性并預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，每個(gè)目標(biāo)蛋白選擇1-2個(gè)抗原表位氨基酸序列，利用化學(xué)方法分別合成抗原表位多肽并與載體蛋白交聯(lián)后用于單克隆或多克隆抗體體制備。實(shí)施例5蜂王漿中檢測目標(biāo)蛋白分離制備根據(jù)葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5的主要理化性質(zhì)，對利用丙酮沉淀所得的-201:|￡存的蜂王漿總蛋白進(jìn)行液相分離，具體方法是首先利用分子篩色譜技術(shù)將分子量不同的組分分離開，隨后對上述各組分進(jìn)行禽子交換色譜分離、疏水色譜分離和反相色譜分離，再輔以SDS電泳及正F進(jìn)行純度檢驗(yàn)。對色譜分離到的純蛋白組分進(jìn)行胰酶消化和肽指紋圖譜分析，確定可用于抗體制備的葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5后，將上述三種蛋白組分脫鹽，冷凍真空干燥。實(shí)施例6檢測目標(biāo)蛋白單克隆抗體體制備通過免疫小鼠和雜交瘤細(xì)胞制備檢測目標(biāo)蛋白單克隆抗體，具體方法是免疫與骨髓瘤細(xì)胞同源的健康小鼠后，分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合并培養(yǎng)，篩選出高分泌特異性的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中制備單克隆抗體，或小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，從腹水中制備單克隆抗體抗體，最后用親和色譜方法分離獲得各種檢測目標(biāo)蛋白單克隆抗體。'實(shí)施例7檢測目標(biāo)蛋白多克隆抗體制備通過免疫新西蘭大白兔制備檢測目標(biāo)蛋白多克隆抗體，具體方法是在第0、28、42、56天皮內(nèi)多點(diǎn)注射新西蘭大白兔，每次注射lmg目標(biāo)蛋白或多肽合成物，70天后收集血清，利用親和色譜方法分離獲得各種檢測目標(biāo)蛋白多克隆抗體。實(shí)施例8納米膠體金-抗體結(jié)合物制備采用檸檬酸三鈉還原方法制備納米直徑的膠體金，調(diào)節(jié)pH至9.09.2，加入純化的檢測目標(biāo)蛋白單克隆抗體或多克隆抗體后加入含穩(wěn)定劑的BSA溶液，完成標(biāo)記后先低速離心棄去沉淀，再將上清液高速離心后將得到的沉淀物溶于pH8.2的TBS溶液中，完成納米膠體金-抗體結(jié)合物制備。，,實(shí)施例9納米膠體金-抗體結(jié)合物釋放墊制備將保存于TBS溶液中的納米膠體金-抗體結(jié)合物進(jìn)行適度稀釋后，取吸水玻璃纖維素膜均勻等量浸于其中，隨后冷凍真空干燥，剪切成所需大小，完成納米膠體金-抗體結(jié)合物釋放墊制備。實(shí)施例10硝酸纖維膜檢測線和二抗控制線制備將純化的檢測目標(biāo)蛋白單克隆抗體或多克隆，以及相應(yīng)的二抗分別包被或噴涂硝酸纖維膜，具體說，用不同抗體分別包被不同的硝酸纖維膜，自然晾干或冷凍真空干燥后剪切成所需大小的細(xì)條，固定于吸水玻璃纖維素臆或經(jīng)封閉液封閉過的涂硝酸纖維膜上，用作檢測線和控制線；或者在硝酸纖維膜不同位置上噴涂出檢測線和二抗控制線，自然晾干后用封閉液進(jìn)行封閉。檢測線可用葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5抗體中的一種或幾種，也可用其他易受貯存溫度影響的蜂王漿蛋白質(zhì)的抗體。實(shí)施例U蜂王漿新鮮度納米膠體金檢測試紙組裝在白色塑料墊板上固定一層吸水玻璃纖維素膜作為襯板，從下至上依次粘貼用于吸附樣品的濾紙、納米膠體金-抗體結(jié)合物釋放墊、檢測線和二抗質(zhì)控線、吸水濾紙，檢測線和質(zhì)控線區(qū)域可為封閉過的硝酸纖維膜(圖5)。實(shí)施例12單克隆抗體納米膠體金蜂王漿新鮮度測試紙制備單克隆抗體納米膠體金蜂王漿新鮮度測試紙制備方法參考實(shí)施例1-11，其檢測線為單克隆抗體納米膠體金，檢測線可為一條至多條，含易受貯存溫度影響的蜂王漿蛋白質(zhì)抗體中的一種或幾種，二抗質(zhì)控線采用可市購的抗鼠Ig抗體。實(shí)施例13多克隆抗體納米膠體金蜂王漿新鮮度測試紙制備多克隆抗體納米膠體金蜂王漿新鮮度測試紙制備方法參考實(shí)施例1-11，其檢測線為多克隆抗體納米膠體金，檢測線可為一條至多條，含易受貯存溫度影響的蜂王漿蛋白質(zhì)抗體中的一種或幾種，二抗質(zhì)控線采用可市購的抗兔Ig抗體。實(shí)施例14利用蜂王槳新鮮度納米膠體金檢測試紙檢測蜂王漿新鮮度取鮮蜂王漿、-201:貯存一年蜂王漿、4。C貯存一年蜂王漿、室溫貯存一年蜂王漿，分別按一定比例加水稀釋后，加于蜂王槳新鮮度納米膠體金檢測試紙下端吸附樣品濾紙上，僅鮮蜂王漿和-2(TC貯存一年蜂王漿能使檢測線和質(zhì)控線顯現(xiàn)膠體金的紅色；短期4'C貯存和室溫貯存的蜂王漿能使同一抗體的前一條或兩條檢測線和質(zhì)控線顯現(xiàn)膠體金的紅色，但不能使同一抗體的后幾條檢測線顯現(xiàn)膠體金的紅色；而長期4"C貯存和室溫貯存的蜂王漿僅能使質(zhì)控線顯現(xiàn)膠體金的紅色。'權(quán)利要求1.一種蜂王漿新鮮度檢測試紙，其特征在于以蜂王漿中易受貯存溫度影響的蛋白質(zhì)為檢測目標(biāo)評價(jià)蜂王漿新鮮度和品質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于其檢測目標(biāo)為蜂王漿中最易受貯存溫度影響的葡萄糖氧化酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于其檢測目標(biāo)為蜂王漿中最易受貯存溫度影響的王漿蛋白4。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于其檢測目標(biāo)為蜂王漿中易受貯存溫度影響的王漿蛋白5。5.根據(jù)權(quán)利要求1一4中所述檢測試紙，其特征在于其中檢測目標(biāo)蛋白在室溫貯存下易降解。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其，征在于制備檢測目標(biāo)蛋白或特異肽片段的單克隆抗體或多克隆抗體。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于在蛋白質(zhì)組分析比較結(jié)果基礎(chǔ)上，利用多肽合成、基因克隆表達(dá)和蜂王漿中天然蛋白分離技術(shù)獲得檢測目標(biāo)蛋白及特異肽片段。8.根據(jù)權(quán)利要求1一7中所述檢測試紙的方法，其特征在于獲得葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5或特異肽片段的單抗或多抗，用抗體標(biāo)記膠體金制作釋放墊，用抗體作為檢測線，用相應(yīng)的二抗作為質(zhì)控線，檢測蜂王漿新鮮度和含量。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于檢測蜂王漿中的蛋白降解情況指示蜂王漿新鮮度和品質(zhì)。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于用于蜂王槳品質(zhì)的快速、低成本和高靈敏度檢測。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于用于蜂王槳生產(chǎn)、銷售和使用過程中的原料品質(zhì)鑒定、產(chǎn)品質(zhì)量控制和活性價(jià)值測定等方面。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙，其特征在于用于其他相關(guān)產(chǎn)品中蜂王漿含量檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種蜂王漿新鮮度檢測試紙產(chǎn)品、其制備及應(yīng)用方法，屬于醫(yī)藥、食品及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。我們最近通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)證明蜂王漿中的葡萄糖氧化酶、王漿蛋白4和王漿蛋白5可做為新鮮度蛋白標(biāo)記。本發(fā)明通過制備檢測上述蛋白質(zhì)的納米膠體金檢測試紙，實(shí)現(xiàn)了蜂王漿品質(zhì)的快速度、低成本和高靈敏度檢測。本檢測試紙可用于生產(chǎn)、銷售和使用過程中的蜂王漿原料品質(zhì)鑒定、產(chǎn)品質(zhì)量控制和活性價(jià)值測定等方面，也可用于其他相關(guān)產(chǎn)品中蜂王漿含量檢測。全世界90％以上的蜂王漿產(chǎn)自我國，蜂王漿的年產(chǎn)值在20多億元，隨著人們生活水平的提高，蜂王漿正逐漸成為重要的天然保健品，因此，研制快速、簡潔的品種檢測方法勢在必行。文檔編號G01N33/68GK101206226SQ20071017632公開日2008年6月25日申請日期2007年10月25日優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日發(fā)明者毛馮,國占寶,張朝暉,李建科,潘映紅申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所