專(zhuān)利名稱(chēng)：：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的制作方法神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?9808289.9、申請(qǐng)日為1999年7月5日、發(fā)明名稱(chēng)為"神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，，的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多肽，編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多肽的核酸和特異性結(jié)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的抗體。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是天然蛋白質(zhì)，它可促使神經(jīng)元細(xì)胞和組織的存活，維持其表型分化，防止其退化并增強(qiáng)其活性。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分離自神經(jīng)組織和由神經(jīng)系統(tǒng)支配的非-神經(jīng)組織，并被分為功能和結(jié)構(gòu)相關(guān)的組，也稱(chēng)家族，超家族或亞族。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子超家族包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P(TGF-P)超家族。可根據(jù)其物理結(jié)構(gòu)，與其復(fù)合受體的相互作用及其對(duì)多種類(lèi)型神經(jīng)細(xì)胞的影響來(lái)區(qū)分各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。被分在TGF-P超家族(Massague等，TrendsinCellBiology,1994，4172-178)的是得自膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子配體("GDNF";WO93/06116,列入本文作為參考)，其包括GDNF，persephin("PSP，，；Milbrandt等，神經(jīng)元，199820245-253，列入本文作為參考)和neurturin("NTN";WO97/08196,列入本文作為參考)。GDNF亞族的配體都能通過(guò)RET受體酪氨酸激酶誘導(dǎo)信號(hào)傳遞。GDNF亞族的這三種配體對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體家族，GFR受體的相對(duì)親和性有所不同。鑒于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)元組織的影響，仍需要鑒定和表征其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以用于診斷和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，本文稱(chēng)之為"neuWastin",或"NBN"。neublastin屬于GDNF亞族的成員，因?yàn)樗c其它GDNF配體共享同源性區(qū)域(見(jiàn)下文表3和4),并能與RET相互作用(例見(jiàn)Airaksinen等，Mol，Cell.Neuroscience,199913313-325)，neublastin是新的，獨(dú)特的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。與其它GDNF配體不同的是，neublastin表現(xiàn)出與GFRa3-RET受體復(fù)合物的高親和性，而且，其氨基酸序列中具有獨(dú)特的亞區(qū)。本文所用"neublastin多肽"是具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的多肽(如實(shí)施例6，7,8和9所述)，其包括具有與人"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述人"neublastin"多肽示于SEQIDNO:2的AA—95-AA10S,SEQIDNO:2的AArAA105,SEQIDNO:4的AA_97-AA140,SEQIDNO:4的AA_41-AA14。(pro)，SEQIDNO:4的AArAA14o，SEQIDNO:9的AA_8o-AA14o("野生型"prepro)，SEQIDNO:9的AA_4i-AA140(pro),SEQIDNO:5的AArAA!4q(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA廣AAu6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AA纊AAn3(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAA"o(成熟的140AA),SEQIDNO:ll的AA纊AAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AA纊AAu3(成熟的113AA)。另夕卜，本發(fā)明還包括具有與鼠"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽，所述鼠"neublastin"多肽示于SEQIDNO:16的AAi-AA^,上文所鑒定的neublastin多肽的C-末端序列優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA72-AAkj5(即SEQIDNO:9的AAn)7-AAM。)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA41-AA節(jié)(即SEQIDNO:9的AA76-AA劇)所示的氨基酸序列，或SEQIDNO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。另外，優(yōu)選neublastin多肽保留7個(gè)保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-P超家族所特有的殘基。優(yōu)選neublastin多肽具有與上述序列和SEQIDNO:16的AArAAm4的同源性大于85%，最優(yōu)選大于95%的氨基酸序列，上述序列即為SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AAi-AA105，SEQIDNO:4的AA_9rAA140，SEQIDNO:4的AA_41-AA140，SEQIDNO:4的AArAA14o，SEQIDNO:9的AA-8o誦AAjl4o("野生型"prepro)，SEQIDNO:9的AA_41-AA14()(pro)，SEQIDNO:5的AArAA^(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AArAAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AArAAu3(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAA"o(成熟的140AA),SEQIDNO:ll的AArAAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:12的AArAAu3(成熟的113AA)。本文所用"neublastin核酸"是編碼neublastin多肽的多核苷酸。因此，分離的neublastin核酸是具有核苷酸密碼子開(kāi)放閱讀框的多核苷酸分子，當(dāng)其暴露于翻譯所需的適當(dāng)組分中時(shí)可編碼neublastin多肽。本發(fā)明的neublastin核酸可以是RNA或DNA,例如基因組DNA,或與neublastinmRNA互補(bǔ)和/或由其轉(zhuǎn)錄的DNA("cDNA，，)。因此，本發(fā)明的neublastin核酸還包括在高度嚴(yán)緊的雜交條件下與編碼neublastin多肽的多核苷酸特異性雜交的多核苷酸分子。本發(fā)明還涉及核酸引物或其片段，所述引物可用于鑒定，分離和擴(kuò)增編碼neublastin多肽的多核苷酸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，某些引物是neublastin-特異性的探針，所述探針可用于與neublastin核酸雜交，而不與編碼GDNF家族其它成員的核酸雜交。"特異的"，"特異性"或"特異地"指的是能與neublastin核酸雜交，而不能與非-neublastin核酸雜交，包括不能與編碼GDNFS己體(例如GDNF，persephin和neurturin)的獨(dú)特核酸雜交。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)具有互補(bǔ)核酸序列，或闡明它能在高度嚴(yán)緊的雜交條件下與編碼neublastin的多核苷酸特異性雜交，而將本發(fā)明的neublastin核酸鑒定為與編碼neublastin多肽的多核苷酸互補(bǔ)的核酸。特定的neublastin核酸包括但不限于本文所示的核酸序列和SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:8，SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:29和SEQIDNO:30以及引物SEQIDNO:17-28，31和32所示的核酸序列。本發(fā)明的neublastin核酸還包括neublastin核酸獨(dú)特的亞區(qū)域或片段，包括但不限于圖8所示的核酸片段?？墒褂帽景l(fā)明的neublastin核酸表達(dá)neublastin多肽，例如通過(guò)體外表達(dá)neublastin多肽，或通過(guò)給動(dòng)物施用neublastin核酸以在體內(nèi)表達(dá)。neublastin核酸可包含在諸如表達(dá)載體或克隆栽體的核酸載體中。neublastin核酸可以，但不是必須作為核酸載體的一部分被維持，復(fù)制，轉(zhuǎn)移或表達(dá)?？蓪⒑衝eublastin多核苷酸序列的重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞和/或在所述細(xì)胞中維持。neublastin載體的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞。或者，可將neublastin核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞，例如含有適當(dāng)元件的真核細(xì)胞，所述元件負(fù)責(zé)在翻譯后將多肽加工成成熟的蛋白質(zhì)和/或負(fù)責(zé)將多肽分泌至細(xì)胞的胞外環(huán)境中。本發(fā)明還涉及neublastin類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子"neublastin"。neublastin可以是多肽的形式，也可以是兩個(gè)或多個(gè)neublastin多肽的多聚體，例如neublastin二聚體。neublastin多肽通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的分子間結(jié)構(gòu)連鍵連接成多聚體，所述連鍵包括但不限于半胱氨酸-半胱氨酸相互作用，sulfhydryl鍵和非-共價(jià)相互作用。特定neublastin多肽包括但不限于本文所公開(kāi)的氨基酸序列和SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12和SEQIDNO:16所示的氨基酸序列.本發(fā)明的neublastin多肽可用于治療神經(jīng)元缺陷，包括但不限于受損害的神經(jīng)元和受外傷的神經(jīng)元。受外傷的外周神經(jīng)包括但不限于髓神經(jīng)或脊髓神經(jīng)。neublastin多肽可用于治療神經(jīng)變性疾病，例如大腦局部缺血性神經(jīng)元損傷；神經(jīng)病，例如外周神經(jīng)病，阿爾茨海默氏病，亨廷頓氏病，帕金森氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。neublastin多肽還可用于治療記憶減退，例如與癡呆有關(guān)的記憶減退。附圖筒述圖1是與"P-標(biāo)記的neublastincDNA雜交的2個(gè)Northern印跡的照片，照片中比較了neublastin基因在多種成人組織類(lèi)型(A系列)和多個(gè)成人腦區(qū)(B系列)中的相對(duì)表達(dá)水平。圖2是與"P-標(biāo)記的neublastincDNA雜交的Northern印跡照片，照片中比較了neublastincDNA在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系HiB5，經(jīng)neublastincDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系和經(jīng)GDNF-cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中的表達(dá)量。圖3是與neublastin-特異性抗體Ab-2(左印跡；A序列)或與neublastin-特異性抗體Ab-l(右印跡；B序列)雜交的2個(gè)Western印跡的照片，照片中比較了neublastin蛋白在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞(泳道l)和經(jīng)neublastincDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞系(泳道2)中的表達(dá)水平。圖4圖示了neublastin在無(wú)血清培養(yǎng)基中對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的大鼠胚胎神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，前側(cè)中腦神經(jīng)元的存活，和對(duì)膽堿能顱神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ChAT活性的影響。尤其是，圖4A闡明了重組GDNF對(duì)ChAT活性(dpm/小時(shí))之影響的劑量-反應(yīng)曲線。圖4B使用經(jīng)稀釋的得自生產(chǎn)neublastin或生產(chǎn)GDNF之細(xì)胞的條件培養(yǎng)基闡明了ChAT活性(dpm/小時(shí))。圖4C闡明了每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目。圖5闡明了HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞分泌的neublastin對(duì)與HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞(neublastin)或HiB5細(xì)胞(對(duì)照)共培養(yǎng)的豬胚胎多巴胺能前側(cè)中腦神經(jīng)元之切片培養(yǎng)物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了于DIV1多巴胺(pmol/ml)-第12天和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天釋放至培養(yǎng)基中的多巴胺。圖5C闡明了于DIV21切片培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目[TH-ir細(xì)胞/培養(yǎng)物。圖6闡明了由慢病毒產(chǎn)生的neublastin在體內(nèi)對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的影響。圖7圖示了neublastin基因的基因組結(jié)構(gòu)，包括可用于鑒定全長(zhǎng)neublastin基因的核酸引物及其相對(duì)于編碼neublastin的基因組序列(即基因)的空間定向。圖8闡明了用于鑒定編碼人neublastin多肽之cDNA克隆的neublastin特異性引物，該引物能與編碼neublastin多肽的核酸雜交，但不能與編碼其它已知的GDNF家族成員(即GDNF，persephin和neurturin)的核酸雜交。圖9闡明了與已知神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相比，本發(fā)明的多肽對(duì)得自不同發(fā)育階段的經(jīng)解離的大鼠側(cè)根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性[O:對(duì)照實(shí)驗(yàn)(缺乏因子)；1:存在GDNF;2:存在neurturin;3:存在本發(fā)明的neublastin;E12:胚胎第12天；E16:胚胎第16天；P0:出生的當(dāng)天；P7:出生后第7天；P15:出生后15天。圖10顯示了CHO細(xì)胞系的neublastin生產(chǎn)情況。圖11比較了neublastin和GDNF與GFRct-l和GFRa-3受體的結(jié)合。圖12是Western印跡照片，顯示出R30抗-肽抗體和R31抗-肽抗體與neublastin的結(jié)合。圖13是凝膠照片，顯示出通過(guò)親和結(jié)合于RETL3-Ig來(lái)提取neublastin。圖14是pET19b-Neublastin的質(zhì)粒圖譜以及Neublastin合成基因的序列。圖15是pMJB164-HisNeublastin的質(zhì)粒圖譜以及HisNeublastin合成基因的序列。發(fā)明詳述申請(qǐng)人已鑒定出編碼新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(本文稱(chēng)之為"neublastin"或"NBN")的核酸。neublastin屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P(TGF-P)超家族，并且是其中得自膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)亞類(lèi)的成員。編碼neublastin的cDNA最初是按下述鑒定的。使用TBLASTN1.4.11算法規(guī)則(Atschul等，核酸研究，1997，253389-3402)，對(duì)人persephin(GenBank登記號(hào)AF(M(^62)表示懷疑，首先在2個(gè)人細(xì)菌人工染色體(BAQ的高通量基因組序列(HGTS)中鑒定出290bp的片段，這2個(gè)BAC的GenBank登記號(hào)為AC005038和AC005051。AC005038由約l卯，000bp的5個(gè)非順序序列重疊群組成，AC005051由約132，000bp的12個(gè)非順序序列重疊群組成。經(jīng)證實(shí)，在2個(gè)BAC克隆中鑒定的290bp片段具有與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，人persephin的cDNA編碼區(qū)同源但不相同的區(qū)域。由該290bp序列合成2個(gè)Neublastin-特異性PCR引物(上鏈引物[SEQIDNO:17和下鏈引物[SEQIDNO:18)。篩選人胎腦cDNA文庫(kù)，最初的篩選包括使用2個(gè)PCR引物[SEQIDNO:17和18，基于96孔PCR篩選cDNA文庫(kù)"主平板"，所述主平板由含有約5,000個(gè)克隆/孔的500,000個(gè)cDNA克隆組成。對(duì)人胎腦cDNA文庫(kù)"次平板"進(jìn)行第二次基于PCR的篩選，所述"次平板"每孔含有約5，000個(gè)克隆的大腸桿菌甘油原種。在基于PCR篩選主平板和次平板時(shí)鑒定出102bp的片段[SEQIDNO:13，選擇陽(yáng)性cDNA克隆(具有102bp片段)，鋪于2個(gè)含有LB/抗生素的平板，培養(yǎng)過(guò)夜。從這些平板中總共選擇出96個(gè)細(xì)菌菌落，將它們各自置于新的96孔PCR板的孔中，每個(gè)孔中含有兩種PCR引物[SEQIDNO:17和18和必需的PCR擴(kuò)增試劑。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。然后鑒定具有含102bp片段之克隆的陽(yáng)性菌落。由含有102bp片段的陽(yáng)性菌落得到質(zhì)粒DNA并測(cè)序。隨后的測(cè)序分析揭示出861bp的全長(zhǎng)cDNA[SEQIDNO:8的存在。在SEQIDNO:8中鑒定的663bp開(kāi)放閱讀框(ORF)或編碼區(qū)(CDS)編碼前-多肽原(稱(chēng)為"前-Neublastin原")，其示于SEQIDNO:9。根據(jù)SEQIDNO:9，鑒定出3個(gè)Neublastin多肽變體，這些變體包括(i)本文稱(chēng)之為NBN140的140AA多肽，其具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列；(ii)本文稱(chēng)之為NBN116的116AA多肽，其具有SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列；和(iii)本文稱(chēng)之為NBN113的113AA多肽，其具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。含有782bp5'非翻譯DNA，663bp編碼DNA和447bp3，非翻譯DNA(總共為1992bp)的完整cDNA序列已被呈送至GenBank，登記號(hào)為AF120274。按下述鑒定基因組中的Neublastin編碼序列為了克隆基因組中的neublastin編碼序列，制備了另一套引物，具體包括1號(hào)引物對(duì)[有義=SEQIDNO:23,反義=SEQIDNO:24和2號(hào)引物對(duì)[有義-SEQIDNO:25，反義=SEQIDNO:26。使用2號(hào)引物對(duì)，通過(guò)PCR由人基因組DNA制品擴(kuò)增887bpDNA片段，并克隆至pCRII載體(Invitrogen)，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，推測(cè)出861bp的推定cDNA序列(編碼在本文中被稱(chēng)為neublastin的蛋白質(zhì))(如SEQIDNO:3所示)。類(lèi)似地，使用1號(hào)引物對(duì)，通過(guò)對(duì)人基因組DNA進(jìn)行PCR而得到870bp的DNA片段。在此片段中發(fā)現(xiàn)了位于開(kāi)放閱讀框(ORF)3，末端的42bp區(qū)域，相對(duì)于887bp序列而言，該區(qū)域是額外的。通過(guò)將neublastin基因與其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸序列相比較，并作圖外顯子-內(nèi)含子邊界序列即可推測(cè)出該基因的基因組結(jié)構(gòu)。此分析闡明neublastin基因具有至少兩個(gè)被70bp內(nèi)含子分開(kāi)的外顯子。另外，使用此序列篩選GenBank中的neublastinEST序列。鑒定出3個(gè)這樣的序列，它們的GenBank登記號(hào)為AA844072,AA931637和AA533512,這表明neublastin核酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA。將所得的完整cDNA序列(AF120274)和GenBank登記號(hào)為AC005038和AC005051的基因組序列相比較，結(jié)果表明neublastin基因由至少5個(gè)被4個(gè)內(nèi)含子分開(kāi)的外顯子(包括3個(gè)編碼外顯子)組成(例見(jiàn)圖8)?？傊?，外顯子具有全長(zhǎng)Neublastin多肽的推測(cè)氨基酸序列。還應(yīng)說(shuō)明的是，我們發(fā)現(xiàn)887bp的片段含有完整的neublastin原編碼區(qū)。推測(cè)的cDNA[SEQIDNO:3含有編碼neublastin原的開(kāi)放閱讀框(ORF)(181個(gè)氨基酸殘基)，其顯示出與3個(gè)已知的人蛋白質(zhì)-Persephin，Neurturin和GDNF的同源性。本發(fā)明的neublastin核酸另一方面，本發(fā)明提供了能表達(dá)本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列以及反義序列，并包括天然的，合成的和經(jīng)人為改造的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸還包括因遺傳密碼所致的簡(jiǎn)并序列，但該序列仍編碼neublastin多肽。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"指的是長(zhǎng)度至少為IO個(gè)堿基，優(yōu)選長(zhǎng)度至少為15個(gè)堿基的核苷酸聚合物形式。"分離的多核苷酸"指的是不與兩個(gè)編碼序列緊鄰的多核苷酸，而在分離得到該多核苷酸之生物體的天然基因組中，該多核苷酸與上述兩個(gè)編碼序列(一個(gè)在5，端，一個(gè)在3，端)緊鄰。因此，該術(shù)語(yǔ)包括重組DNA，它可摻入表達(dá)載體，自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《?，或原核生物或真核生物的基因組DNA中，它也可以是獨(dú)立的分子，例如不依賴于其它序列的cDNA。本發(fā)明的多核苷酸還包括等位基因變體和"突變的多核苷酸"，其具有的核苷酸序列與本文所提供的核苷酸序列在一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置處有所不同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核普酸具有的核酸(DNA)序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴(yán)緊的條件下，與SEQIDNO:l所示的多核普酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其亞序列雜交。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸具有的核酸(DNA)序列與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%同源。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的DNA序列，SEQIDNO:3所示的DNA序列，SEQIDNO:8所示的DNA序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了新的引物和DNA序列，它們可用于鑒定，分離和擴(kuò)增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。所述引物包括SEQIDNO:17-28和31-32所示的多核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了由這些引物產(chǎn)生的neublastinDNA序列，包括SEQIDNO:13和14所示的序列。另外，本發(fā)明還提供了得自基因組DNA中的3，或5，非翻譯區(qū)域("UTR，，)的DNA序列，該序列側(cè)翼于neublastin外顯子；該序列可用于鑒定，分離和擴(kuò)增編碼neublastin多肽或其片段的neublastin多核苷酸。本發(fā)明的3，UTR序列包括下列序列SEQIDNO:l的核苷酸721-865，SEQIDNO:3的核苷酸718-861，SEQIDNO:8的核苷酸718-861,SEQIDNO:15的核苷酸1647-2136,和得自(即包含于)上述序列中的長(zhǎng)度為10至25個(gè)核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。本發(fā)明的5，UTR序列包括下列序列SEQIDNO:l的核苷酸1-10，SEQIDNO:8的核苷酸1-57,SEQIDNO:15的核苷酸1-974，和得自(即包含于)上述序列中的長(zhǎng)度為10至25個(gè)核苷酸的鄰接序列(可用作引物)。優(yōu)選通過(guò)克隆方法得到本發(fā)明的多核苷酸，所述方法例見(jiàn)"最新分子生物學(xué)方法"[JohnWiley&Sons公司I。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可由人腦的人基因組DNA或cDNA文庫(kù)克隆多核苷酸，或者在所述文庫(kù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生多核苷酸。DNA序列的同源性可將上文所提及的DNA序列同源性測(cè)定為兩個(gè)序列之間的同一性程度，示出第一個(gè)序列與第二個(gè)序列的差異。利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序可適當(dāng)?shù)販y(cè)定同源性，所述程序包括例如GCG程序包中提供的GAP[Needleman，S.B和WunschC.D.，分子生物學(xué)雜志1970，48:443-453。使用具有下列設(shè)置的GAP進(jìn)行DNA序列比較GAP產(chǎn)生罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3，上文所提及的類(lèi)似DNA序列編碼區(qū)與SEQIDNO:l所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:3所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:8所示DNA序列的CDS(編碼)部分，或SEQIDNO:15所示DNA序列的CDS(編碼)部分的同一性程度優(yōu)選至少為70%,更優(yōu)選至少為80%，更優(yōu)選至少為90%,更優(yōu)選至少為95%。術(shù)語(yǔ)"序列同一性"指的是在特定的比較區(qū)域內(nèi)，兩個(gè)多核苷酸序列在核苷酸-緊接著-核苷酸的基礎(chǔ)上的相同程度。術(shù)語(yǔ)"序列同一性的百分比"是通過(guò)下列方法計(jì)算的，即比較兩個(gè)在比較區(qū)域內(nèi)排列得最令人滿意的序列，測(cè)定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如A，T，C，G，U或I)的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，用匹配位置數(shù)除以比較區(qū)域內(nèi)的位置總數(shù)(即窗口大小)，將結(jié)果乘以100即產(chǎn)生序列同一性的百分比。本文所用術(shù)語(yǔ)"基本上相同"表示多核苷酸序列的特征，其中，多核苷酸含有的序列在比較區(qū)域內(nèi)與參照序列相比具有至少80%的序列同一性，優(yōu)選為至少85%的同一性，經(jīng)常為90至95%的序列同一性，更通常為至少99%的序列同一性。雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的多核苷酸所具有的核酸序列能在如下文詳述的至少中度，中度/高度，或高度嚴(yán)緊的條件下，與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，或SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，或其互補(bǔ)鏈，或其亞序列雜交。測(cè)定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件包括預(yù)先在5xsSC氯化鈉/檸檬酸鈉；參見(jiàn)Sambrook等；分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約1989j中將含有待雜交的DNA片段或RNA的濾膜浸泡10分鐘，在5xSSC，5xDenhardt，s溶液[參見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上，0.5%SDS和100pg/ml變性的經(jīng)超聲處理的鮭精DNA[參見(jiàn)Sambrook等，文獻(xiàn)同上I中預(yù)雜交濾膜，接著于約45X:，在含有10ng/ml探針的相同溶液中雜交12小時(shí)，所述探針為隨機(jī)-引發(fā)的[FeinbergAP&VogelsteinB;分析生物化學(xué)，1983,132,6-13，并經(jīng)32p-dCTP-標(biāo)記(比活〉1x1()9cpm/ng)的探針。然后在溫度至少為60TC(中度嚴(yán)緊條件)，優(yōu)選至少為65C(中度/高度嚴(yán)緊條件)，更優(yōu)選至少為70"C(高度嚴(yán)緊條件)，甚至更優(yōu)選至少為75"(很高的嚴(yán)緊條件)時(shí)，在O.lxSSC，0.5%SDS中將濾膜洗滌2次，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30分鐘。使用X-射線膠片可檢測(cè)到在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子?？寺〉亩嗪塑账嵊绕涫?，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以為克隆的多核苷酸。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"克隆的多核苷酸"指的是根據(jù)基因工程領(lǐng)域最新使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法克隆的多核苷酸或DNA序列，所述克隆方法可以將DNA區(qū)段，尤其是cDNA,即通過(guò)酶的作用由RNA產(chǎn)生的cDNA從其天然位置移位至不同位點(diǎn)，在所述位點(diǎn)處，該DNA區(qū)段可以再生。通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩蕉伎梢酝瓿煽寺?，包括例如逆轉(zhuǎn)錄酶技術(shù)，PCR技術(shù)等，以及切下和分離所需的DNA區(qū)段。本發(fā)明的克隆的多核苷酸也可被稱(chēng)為"DNA構(gòu)建體"或"分離的DNA序列"，尤其可以是互補(bǔ)DNA(cDNA)。生物來(lái)源本發(fā)明的分離的多核苷酸可以得自任何適當(dāng)?shù)膩?lái)源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸克隆自下列cDNA文庫(kù)，或在這些文庫(kù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，所述文庫(kù)包括得自下列的cDNA文庫(kù)，例如胎兒或成人腦，尤其是前腦，后腦，皮質(zhì)，紋狀體，扁桃體，小腦，尾狀核，胼胝體，海馬，丘腦核，丘腦下核，溴核，豆?fàn)詈耍谫|(zhì)，側(cè)根神經(jīng)節(jié)，三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)，腸系膜上動(dòng)脈或丘腦；脊髓；心臟；胎盤(pán)；肺；肝臟；骨骼肌；腎臟；胰腺；腸；眼；視網(wǎng)膜；牙髓；毛嚢；前列腺；垂體；或氣管。可商購(gòu)的多種人和非人組織的cDNA文庫(kù)得自例如Stratagene和Clontech?？赏ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如工作實(shí)施例中所述的那些方法得到本發(fā)明的分離的多核苷酸。本發(fā)明的neublastin多肽如上文所述，本文所用"neublastin多肽"是具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性的多肽(如實(shí)施例6，7，8和9所述)，其包括具有與"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽及其變體和衍生物，所述"neublastin"多肽示于SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AArAA廳，SEQIDNO:4的AA_97-AA140，SEQIDNO:4的AA"-AA14。，SEQIDNO:4的AArAA兩，SEQIDNO:9的AA—8o國(guó)AA!4o("野生型"prepro)，SEQIDNO:9的AA—41-AA140(pro)，SEQIDNO:5的AArAA劇(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA纊AAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AArAAu"成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAA兩(成熟的140AA),SEQIDNO:11的AA廣AAn6(成熟的116AA)，SEQIDNO:12的AA纊AAn3(成熟的113AA),SEQIDNO:16的AArAA224(鼠prepro)。上文所鑒定的neublastin多肽的C-末端序列優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA72-AAk)5(即SEQIDNO:9的AAno7-AA南)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA"-AAk)s(即SEQIDNO:9的AA76-AA糊)所示的氨基酸序列。另外，優(yōu)選neublastin多肽保留7個(gè)保守的Cys殘基，所述殘基是GDNF家族和TGF-P超家族所特有的殘基。優(yōu)選neublastin多肽具有與上述序列的同源性大于85%,最優(yōu)選大于95°/。的氨基酸序列，上述序列即為SEQIDNO:2的AA_95-AA105，SEQIDNO:2的AAi-AA105,SEQIDNO:4的AA.97-AA140，SEQIDNO:4的AA—41-AA140,SEQIDNO:4的AA廣AA"o，SEQIDNO:9的AA—80-AAmo("野生型，，prepro),SEQIDNO:9的AA-41-AA14o(pro)，SEQIDNO:5的AArAA攝(成熟的140AA),SEQIDNO:6的AA匸AAn6(成熟的116AA),SEQIDNO:7的AA纊AAu3(成熟的113AA),SEQIDNO:IO的AArAA據(jù)(成熟的140AA),SEQIDNO:ll的AA廣AAn6(成熟的116AA)，SEQIDNO:12的AArAAm(成熟的113AA),SEQIDNO:16的AArAA224(鼠prepro)，具有上文所鑒定的neublastin多肽之C-末端序列的上述任一多肽優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA72-AA105(^pSEQIDNO:9的AAw7-AAwo)所示的氨基酸序列，更優(yōu)選具有SEQIDNO:2的AA"-AA網(wǎng)(即SEQIDNO:9的AA76-AA揚(yáng))或SEQIDNO:16的AA191-AA224所示的氨基酸序列。另外，本發(fā)明包括具有與鼠"neublastin"多肽的同源性至少為70%的氨基酸序列的多肽，所述鼠"neublastin"多肽示于SEQIDNO:16的AArAA224。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的多肽為neublastin的前序列原(分別示于SEQIDNO:2，4，9和16),序列原(分別示于SEQIDNO:2的AA_75-AA1()5,或SEQIDNO:4和9的AA-化AAwg)和成熟序列(示于SEQIDNO:5，6，7，10，11或12，優(yōu)選為SEQIDNO:IO，11，12)。本發(fā)明的多肽包括變體多肽。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"變體多肽"指的是多肽(或蛋白質(zhì))具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:IO，SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12或SEQIDNO:16所示的序列在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處有所不同。這種變體多肽包括上文所述的經(jīng)修飾多肽，以及保守取代，剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態(tài)性。本文所定義的術(shù)語(yǔ)"保守取代"表示某個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)生物特性相似的殘基所取代。例如，人們希望保守的氨基酸取代僅對(duì)生物活性有很小的影響或沒(méi)有影響，當(dāng)保守取代占多肽或蛋白質(zhì)殘基總數(shù)的10%以下時(shí)，更希望如此。保守的氨基酸取代優(yōu)選為低于5%的多肽或蛋白質(zhì)中的變化，最優(yōu)選為低于2%的多肽或蛋白質(zhì)中的變化(例如當(dāng)根據(jù)NBN113進(jìn)行計(jì)算時(shí)，最優(yōu)選的保守取代為野生型成熟氨基酸序列中少于3個(gè)的氨基酸取代)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，成熟序列中僅有單個(gè)氨基酸取代，其中被取代的和取代的氨基酸都是非-環(huán)形的。其它特別保守的取代例子包括用一個(gè)諸如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸的疏水殘基取代另一個(gè)疏水殘基，或用一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基，如用精氨酸取代賴氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺等。術(shù)語(yǔ)保守取代也包括使用經(jīng)取代的氨基酸殘基取代未經(jīng)取代的親代氨基酸殘基，只要針對(duì)經(jīng)取代多肽而產(chǎn)生的抗體也能與未經(jīng)取代的多肽發(fā)生免疫反應(yīng)即可。修飾該原始氨基酸序列可產(chǎn)生活性與未經(jīng)修飾的相應(yīng)多肽基本上相同的蛋白質(zhì)，因此，可認(rèn)為該蛋白質(zhì)是親代蛋白質(zhì)的功能類(lèi)似物。所述修飾可以是有意的，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或者可以自發(fā)產(chǎn)生，所述修飾包括剪接變體，同種型，得自其它物種的同系物和多態(tài)性。本發(fā)明還包括上述功能類(lèi)似物。此外，修飾原始氨基酸序列可產(chǎn)生未保留親代蛋白質(zhì)之生物活性的蛋白質(zhì)，包括顯性失活形式等。顯性失活蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合，或要不然螯合通常與多肽發(fā)生功能性相互作用的調(diào)節(jié)劑(如上游或下游組分)來(lái)干擾野生型蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括這種顯性失活形式。"信號(hào)肽"是肽序列，它可使新合成的與信號(hào)肽結(jié)合的多肽定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)以進(jìn)行進(jìn)一步的翻譯后加工和分布。對(duì)neublastin而言，本文所用"異源信號(hào)肽"指的是非人neublasUn信號(hào)肽，一般指的是一些除neublastin之外的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。熟練技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為可使用人neublastinDNA序列(cDNA或基因組DNA)，或使用因沉默密碼子變化或產(chǎn)生保守氨基酸取代的密碼子變化而與人neublastinDNA有所不同的序列對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的人細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，以使所述細(xì)胞能過(guò)量表達(dá)和分泌酶。本發(fā)明的多肽還包括嵌合多肽或可裂解的融合多肽，所述融合多肽中的另一種多肽與多肽或其片段的N末端或C末端融合。通過(guò)將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合即可產(chǎn)生嵌合多肽。產(chǎn)生嵌合多肽的技術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。所述技術(shù)通常需要以一定的方式連接序列以使兩個(gè)序列位于相同的閱讀框中，并且，融合多肽的表達(dá)處于相同啟動(dòng)子和終止子的控制之下。本發(fā)明的多肽還包括全長(zhǎng)neublastin分子的截短形式。在該截短分子中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸從N末端或C末端，優(yōu)選從N末端缺失。氨基酸序列同源性候選多肽與本發(fā)明的neublastin多肽的同源性程度被測(cè)定為兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度。高水平的序列同一性表示第一個(gè)序列很可能得自第二個(gè)序列。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析可測(cè)定同源性，所述程序例如但不限于ClustalX計(jì)算機(jī)序列對(duì)比程序[ThompsonJD，GibsonTJ，PlewniakF，JeanmouginF，&HigginsDG:ClustaIXwindows界面借助于質(zhì)量分析工具進(jìn)行多個(gè)序列對(duì)比的靈活策略；核酸研究，1997，25(24):4876-821，本文建議了其缺省參數(shù)值。使用該程序，由本發(fā)明的類(lèi)似DNA序列所編碼多肽的成熟部分與本文SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:ll，SEQIDNO:12或SEQIDNO:16所示氨基酸序列的同一性程度至少為90%，更優(yōu)選至少為95%，最優(yōu)選至少為98%。根據(jù)同源性的檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)屬于TGF-P超家族的本發(fā)明多肽與GDNF亞族相關(guān)，但本發(fā)明的多肽是該亞族中的一個(gè)與眾不同的成員。生物活性多肽可以任何生物活性形式提供本發(fā)明的多肽，包括前-蛋白質(zhì)原，蛋白質(zhì)原，成熟蛋白質(zhì)，糖基化蛋白質(zhì)，褲酸化蛋白質(zhì)或任何其它經(jīng)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽尤其可以是N-糖基化多肽，優(yōu)選該多肽在序列表所示的N-殘基處糖基化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:9所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺殘基；SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，在第122位具有糖基化的天冬酰胺殘基；SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列，在第98位具有糖基化的天冬酰胺殘基；或SEQIDNO:12所示的氨基酸序列，在第95位具有糖基化的天冬酰胺殘基。本發(fā)明還包括neublastin融合蛋白，例如Ig-融合蛋白，例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，434，131(列入本文作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:2所示序列至少約85%,優(yōu)選至少約卯％,更優(yōu)選至少約98%，最優(yōu)選至少約99%同源之氨基酸序列的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:4所示序列至少約卯％,優(yōu)選至少約95%，更優(yōu)選至少約98°/0,最優(yōu)選至少約99%同源之氨基酸序列的多肽。在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:5所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:6所示序列至少約90%,更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第五個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:7所示序列至少約卯％，更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的neublastin多肽包括等位基因變體，例如SEQIDNO:5-7的多肽氨基酸序列，其中Xaa表示Asn或Thr，Yaa表示Ala或Pro。在第六個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:9所示序列至少約卯％，更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第七個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:10所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:10所示序列至少約90%，更優(yōu)選至少約95%，最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第八個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:ll所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:ll所示序列至少約90%，更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第九個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:12所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:12所示序列至少約90。/。，更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽。在第十個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有SEQIDNO:16所示氨基酸序列的多肽，或具有與SEQIDNO:16所示序列至少約卯％，更優(yōu)選至少約95%,最優(yōu)選至少約98%同源之氨基酸序列的多肽，所述多肽是鼠源前-neublastin原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有GDNF亞族指紋，即表3中的下劃線氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴(yán)緊的條件下與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴(yán)緊的條件下與SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴(yán)緊的條件下與SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:8所示的多核苷酸序列所編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由下述多核苷酸序列編碼的新多肽，所述多核苷酸序列能在高度嚴(yán)緊的條件下與SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列，其互補(bǔ)鏈，或其亞-序列雜交。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由下述多核苷酸序列所編碼，所述多核苷酸序列與SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列至少70%同源。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQIDNO:15所示的多核苷酸序列所編碼。生物來(lái)源本發(fā)明的多肽可分離自哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選分離自人細(xì)胞或鼠源細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可分離自人的心臟組織，人骨骼肌，人胰腺，人腦組織，尤其可分離自尾狀核或丘腦，或者可得自哺乳動(dòng)物源的DNA,這一點(diǎn)將在下文詳細(xì)討論。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性本發(fā)明的neublastin多肽可用于緩和神經(jīng)或神經(jīng)元細(xì)胞的代謝，生長(zhǎng)，分化或存活。特別是，neublastin多肽可用于治療或緩解活動(dòng)物，例如人的失調(diào)或疾病，所述失調(diào)或疾病對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑的活性有反應(yīng).下文將更詳細(xì)地描述這種治療和方法?？贵w可使用本發(fā)明的neublastin多肽或多肽片段產(chǎn)生neublastin-特異性抗體。本文所用"neublastin-特異性抗體"是抗體，例如多克隆抗體或單克隆抗體，所述抗體能與neublastin多肽或多肽片段發(fā)生免疫反應(yīng)，或者與neublastin多肽的表位特異性結(jié)合。多克隆和單克隆抗體的制備是本領(lǐng)域眾所周知的。尤其是，可按以下文獻(xiàn)所述得到多克隆抗體例如Green等"產(chǎn)生多克隆的抗血清"，免疫化學(xué)方法(Manson編);Humana出版社，1992，pl-5;Coligan等"在兔，大鼠，小鼠和倉(cāng)鼠中產(chǎn)生多克隆抗血清"，最新免疫學(xué)方法，1992,第2.4.1節(jié)；EdHarlow和DavidLane(編)"抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1988;這些方法都列入本文作為參考。尤其是，可按以下文獻(xiàn)所述得到單克隆抗體Kohler&Milstein，自然，1975，256:495;Coligan等，聶新免疫學(xué)方法，1992，第2.5.1-2.6.7節(jié)；和Harlow等，"抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，l988，p726;這些方法都列入本文作為參考。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可通過(guò)下述方法得到單克隆抗體，即用含有抗原的組合物注射例如小鼠，通過(guò)取出血清樣品證實(shí)抗體的產(chǎn)生，取出脾臟，得到B淋巴細(xì)胞，使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇產(chǎn)生針對(duì)抗原之抗體的陽(yáng)性克隆，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體?？赏ㄟ^(guò)多種已成熟建立的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體，所述技術(shù)包括用A蛋白S印harose進(jìn)行親和層析，大小排阻層析和離子交換層析，例見(jiàn)Coligan等，聶新免疫學(xué)方法，l992，第2.7.1-2.7.12節(jié)和第2.9.1-2.9.3節(jié)；和Barnes等"免疫球蛋白G(IgG)的純化"，分子生物學(xué)方法;Humana出版社，1992，VoUO,p79-104。任選通過(guò)與基質(zhì)結(jié)合并從基質(zhì)上洗脫下來(lái)以進(jìn)一步純化多克隆或單克隆抗體，所述基質(zhì)上結(jié)合有產(chǎn)生抗體的多肽。使用含有所需小肽(作為免疫抗原)的完整多肽或片段可制備出與本發(fā)明的neublastin多肽結(jié)合的抗體。通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)化學(xué)合成可得到用于免疫動(dòng)物的多肽，任選將所述多肽與載體蛋白綴合。常用的與肽化學(xué)偶聯(lián)的載體蛋白包括匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH),甲狀腺球蛋白，牛血清白蛋白(BSA)和破傷風(fēng)類(lèi)毒素。然后可使用偶聯(lián)的肽免疫動(dòng)物，所述動(dòng)物尤其可以是小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠或兔。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用下列肽產(chǎn)生抗體肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的氨基酸108-124);或肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸93-107)。實(shí)施例10中描述了使用這些多肽產(chǎn)生抗體的方法。我們還針對(duì)下列肽產(chǎn)生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的氨基酸30-43);肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的氨基酸57-70);肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的氨基酸74-85);肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸94-107);肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的氨基酸123-136)。在該組肽中，只有相對(duì)靠近于C末端的肽R30和R31才能識(shí)別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質(zhì)。如下文所詳述，我們還鑒定了其它得自成熟蛋白質(zhì)的neublastin-衍生肽，根據(jù)已知的GDNF結(jié)構(gòu)(Eigenbrot和Gerber，Nat.Struct.Biol..19974435-438)，推測(cè)它們是暴露于表面的環(huán)，因此可用于產(chǎn)生抗體區(qū)域1:CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的AA43-70);區(qū)域2:CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA74-107);區(qū)域3:CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的AA108-136)。在本發(fā)明的另一方面，與neublastin或neublastin-衍生肽特異性結(jié)合的抗體可用于檢測(cè)多種介質(zhì)中所述neublastin神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存在，尤其可用于診斷與本發(fā)明的neublastin分子相關(guān)的病癥或疾病。包括ELISA，RIA和FACS的多種檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明的抗體也可用于阻斷神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用，尤其可以是中和抗體。產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法如下文所詳述，在允許產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼本發(fā)明neublastin多肽的DNA序列，接著從培養(yǎng)基中回收多肽。當(dāng)為了產(chǎn)生neublastin多肽需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾時(shí)，可通過(guò)常規(guī)方法或通過(guò)基因激活修飾細(xì)胞。根據(jù)常規(guī)方法，可將含有neublastincDNA或基因組DNA序列的DNA分子包含在表達(dá)構(gòu)建體中，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)染方法包括但不限于脂質(zhì)體-,Polybrene-或DEAE葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，磷酸鈣沉淀，微量注射或速度驅(qū)動(dòng)的微粒轟擊("biolistics")?；蛘撸部墒褂猛ㄟ^(guò)病毒載體傳遞DNA的系統(tǒng)。已知可用于基因轉(zhuǎn)移的病毒包括腺病毒，腺-相關(guān)病毒，慢病毒，皰疹病毒，腮腺炎病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，新培斯病毒和痘苗病毒，如金絲雀痘病毒，以及昆蟲(chóng)細(xì)胞(尤其是SfP9昆蟲(chóng)細(xì)胞)的桿狀病毒感染。或者，可使用基因激活("GA")法修飾細(xì)胞，所迷方法描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5，733，761和5，750，376(皆列入本文作為參考)。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)"經(jīng)基因修飾的細(xì)胞"包括在導(dǎo)入DNA分子之后能表達(dá)特定基因產(chǎn)物的細(xì)胞，所述DNA分子編碼所述基因產(chǎn)物和/或控制該基因產(chǎn)物編碼序列之表達(dá)的調(diào)節(jié)元件?？赏ㄟ^(guò)基因靶向?qū)隓NA分子，使DNA分子摻入特定的基因組位點(diǎn)。重組表達(dá)載體在本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體。優(yōu)選的重組表達(dá)載體是含有遍在蛋白啟動(dòng)子的栽體pTEJ-8(JohansenTE，SchoellerMS,TolstoyS，SchwartzT;Lett.19卯267289-294)，及其衍生物，例如pUbilZ。優(yōu)選的商購(gòu)真核表達(dá)載體是例如含有病毒啟動(dòng)子的載體pcDNA-3(可得自Invitrogen)。另一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)載體使用SV40早期啟動(dòng)子和腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(衍生自質(zhì)粒pAD2p;Norton和Coffin,分子細(xì)胞生物學(xué)，1985，5，281)。本發(fā)明還提供了原核表達(dá)載體和合成基因(syngene)，所述合成基因的密碼子經(jīng)最優(yōu)化后適于原核表達(dá)。用較低的GC含量和偏好的細(xì)菌(例如大腸桿菌)密碼子構(gòu)建合成基因。將合成基因克隆至兩個(gè)栽體，pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構(gòu)建示于圖14。在此構(gòu)建體中，編碼neublastin成熟結(jié)構(gòu)域的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構(gòu)建示于圖15。生產(chǎn)細(xì)胞在本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)細(xì)胞，所述細(xì)胞經(jīng)基因操作后含有本發(fā)明的分離的多核苷酸序列，和/或本發(fā)明的重組表達(dá)栽體。特別是，可對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞進(jìn)行基因操作以瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)，過(guò)量表達(dá)或共表達(dá)本發(fā)明的多肽。產(chǎn)生瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的可將本發(fā)明的多核苷酸插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒，病毒或其它表達(dá)栽體，所述多核苷酸與表達(dá)控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達(dá)控制序列相容的條件下進(jìn)行表達(dá)。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子，內(nèi)含子的剪接信號(hào)和終止密碼子，它們都維持于本發(fā)明的多核苷酸的正確讀碼框內(nèi)，從而能適當(dāng)翻譯mRNA。表達(dá)控制序列還包括其它組分，例如前導(dǎo)序列和融合配對(duì)物序列。啟動(dòng)子尤其可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。當(dāng)克隆至細(xì)菌系統(tǒng)時(shí)，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如噬菌體X的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)。當(dāng)克隆至哺乳動(dòng)物系統(tǒng)時(shí)，可使用得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子，例如遍在蛋白啟動(dòng)子，TK啟動(dòng)子，或金屬硫蛋白啟動(dòng)子，或得自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)的末端重復(fù)，腺病毒晚期啟動(dòng)子或痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子。也可使用通過(guò)重組DNA或合成技術(shù)得到的啟動(dòng)子以提供本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體一般含有表達(dá)起點(diǎn)，啟動(dòng)子以及能用表型選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特定基因，所述載體包括在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體[Rosenberg等，基因，1987，56，125,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pTEJ-8，pUbilZ，pcDNA-3和pMSXND表達(dá)載體[Lee和Nathans，生物化學(xué)雜志，198826335211,在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的衍生自桿狀病毒的載體，和卵母細(xì)胞表達(dá)載體PTLN[LorenzC，PuschM&JentschTJ:具有新特性的異多亞基CLC氯通道；Proc.Natl.Acad.Sci.USA19969313362畫(huà)13366J。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞，卵母細(xì)胞或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞包括但不限于人胚腎(HEK)細(xì)胞，例如HEK293細(xì)胞，BHK21細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，Xen叩uslaevis卵母細(xì)胞(XLO)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞是真菌細(xì)胞，例如絲狀真菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是昆蟲(chóng)細(xì)胞，最優(yōu)選為Sf9細(xì)胞。本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是PC12，HiB5，RN33b細(xì)胞系和人神經(jīng)祖細(xì)胞。最優(yōu)選的是人細(xì)胞。原代或繼代細(xì)胞的例子包括成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞(包括乳房和腸上皮細(xì)胞)，內(nèi)皮細(xì)胞，血液的組成成分(包括淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞)，膠質(zhì)細(xì)胞，肝細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或這些細(xì)胞類(lèi)型的前體細(xì)胞。用于本發(fā)明方法的無(wú)限增殖化人細(xì)胞系的例子包括但不限于Bowes黑素瘤細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CRL9607)，Daudi細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL213)，HeLa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的衍生物(ATCC登記號(hào)為CCL2，CCL2.1和CCL2.2)，HL-60細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL240),HT-1080細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL121)，Jurkat細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為T(mén)IB152)，KB癌細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL17),K-562白血病細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL243)，MCF-7乳腺癌細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為BTH22)，MOLT-4細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為1582)，Namalwa細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CRL1432)，Raji細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL86)，RPMI8226細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CCL155),U-937細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CRL1593)，WI-38VA13亞系2R4細(xì)胞(ATCC登記號(hào)為CLL75.1)和2780AD卵巢癌細(xì)胞(VanderBlick等，癌癥研究，1988，48，5927-5932),以及通過(guò)融合人細(xì)胞和另一物種的細(xì)胞而產(chǎn)生的異雜交瘤細(xì)胞。也可使用繼代人成纖維細(xì)胞系，如WI-38(ATCC登記號(hào)為CCL75)和MRC-5(ATCC登記號(hào)為CCL171)。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞是真核細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的異源多核苷酸的摻入可特別地通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，即感染(利用病毒載體)，轉(zhuǎn)染(利用質(zhì)粒載體)，使用磷酸鈣沉淀，微量注射，電穿孔，脂轉(zhuǎn)染法，或其它本領(lǐng)域已知的物理-化學(xué)方法。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將本發(fā)明的分離的多核苷酸序列和/或本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，神經(jīng)祖細(xì)胞，星形細(xì)胞，T-細(xì)胞，造血干細(xì)胞，非-分裂細(xì)胞，或腦內(nèi)皮細(xì)胞，所述細(xì)胞含有至少一種能介導(dǎo)細(xì)胞無(wú)限增殖化和/或轉(zhuǎn)化的DNA分子。通過(guò)導(dǎo)入調(diào)節(jié)元件，尤其是導(dǎo)入啟動(dòng)子可以激活宿主細(xì)胞中的內(nèi)源性基因，所述啟動(dòng)子能導(dǎo)致編碼本發(fā)明之neublastin多肽的內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄。藥物組合物在本發(fā)明的另一方面，提供了新的藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明多肽。為了用于治療，可以任何方便的形式施用本發(fā)明的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽與一種或多種佐劑，賦形劑，載體和/或稀釋劑混合于藥物組合物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法即可制備藥物組合物。這種藥物組合物可含有本發(fā)明的多肽或其抗體。可以單獨(dú)施用該組合物，也可與一種或多種其它藥劑，藥物或激素一起施用該組合物?？赏ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩绞┯帽景l(fā)明的藥物組合物，包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，動(dòng)脈間，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，室內(nèi)，經(jīng)皮，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，anteral,局部，舌下或直腸給藥，頰內(nèi)，陰道內(nèi)，眶內(nèi)，腦內(nèi)，顱內(nèi)，脊柱內(nèi)，室內(nèi)，池內(nèi)，嚢內(nèi)，肺內(nèi)，經(jīng)粘膜，或經(jīng)由吸入。肺內(nèi)傳遞方法，裝置和藥物制品描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5，785，049,5,780,019和5,775,320(皆列入本文作為參考)?？赏ㄟ^(guò)周期性注射藥物制品的巨丸劑進(jìn)行給藥；也可通過(guò)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)途徑更連續(xù)地給藥，所述藥物得自外部(例如IV袋)或內(nèi)部(例如生物可腐蝕的植入物，生物人工器官，或植入的neublastin生產(chǎn)細(xì)胞集落)藥物庫(kù)。例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4，407，957，5，798，113和5，800，828(皆列入本文作為參考)。肺內(nèi)傳遞方法和裝置描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,654,007，5，780，014和5，814，607(皆列入本文作為參考)。尤其是，使用任何適當(dāng)?shù)膫鬟f方式都可施用本發(fā)明的neublastin，所述方式包括(a)泵(例見(jiàn)藥物治療年鑒,27:912(1993);癌癥,41:1270(1993);瘞癥研究，44:1698(1984),列入本文作為參考)，(b)微嚢化(例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,352,883;4，353，888和5,084,350,列入本文作為參考)，(c)持續(xù)釋放的聚合植入物(例見(jiàn)Sabel，美國(guó)專(zhuān)利4，883，666，列入本文作為參考)，(d)巨嚢化(例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，284，761，5，158，881，4,976,859和4,968,733和公開(kāi)的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)W092/19195,WO95/05452,皆列入本文作為參考)，(e)移植至CNS的棵露的或未嚢化的細(xì)胞移植物(例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，082，670和5，618，531，皆列入本文作為參考)，(f)皮下，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肌內(nèi)注射或注射至其它適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)；(g)以膠嚢，液體，片劑，丸劑或延長(zhǎng)釋放的制劑口服給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，直接將neublastin傳遞至CNS,優(yōu)選傳遞至腦室，腦實(shí)質(zhì)，鞘內(nèi)間隙或其它適當(dāng)?shù)腃NS位置，最優(yōu)選傳遞至鞘內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，我們希望通過(guò)皮下注射，靜脈內(nèi)給藥或靜脈內(nèi)灌注全身性傳遞給藥。其它有用的非腸道傳遞系統(tǒng)包括乙烯-乙烯基醋酸酯共聚物顆粒，滲透泵，可植入的灌注系統(tǒng)，泵傳遞，膠嚢化細(xì)胞傳遞，脂質(zhì)體傳遞，針頭-傳遞的注射，無(wú)針頭注射，噴霧器，煙霧劑，電穿孔和經(jīng)皮貼片。有關(guān)配制和給藥技術(shù)的其它詳情可參見(jiàn)Remington's藥物科學(xué)(Maack出版公司，Easton，PA)的最新版本。每天以一個(gè)或幾個(gè)劑量施用活性成分。本發(fā)明所希望的適當(dāng)劑量為每次給藥0.5ngneublastin/kg體重至約50ng/kg,每天給藥約1.0ng/kg至約100|_ig/kg。neublastin藥物組合物應(yīng)該提供局部濃度為約5ng/ml腦脊髓液("CSF，，)至25ng/mlCSF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)根據(jù)年齡，體重和接受治療的個(gè)體的身體狀況以及給藥途徑，劑量形式和制度，所需結(jié)果小心地調(diào)整給藥的劑量，醫(yī)生應(yīng)當(dāng)可以確定精確的劑量。在其它實(shí)施方案中，可使用下文"治療方法"一節(jié)中所迷的細(xì)胞系和載體，通過(guò)基因傳遞施用本發(fā)明的neublastin多肽。為了產(chǎn)生這種治療性的細(xì)胞系，可將本發(fā)明的多核苷酸插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒，病毒或其它表達(dá)載體，所述多核苷酸與表達(dá)控制序列以特定的連接方式可操作相連，從而使編碼序列能在與表達(dá)控制序列相容的條件下進(jìn)行表達(dá)。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄終止子，起始密碼子，內(nèi)含子的剪接信號(hào)和終止密碼子，它們都維持于本發(fā)明的多核苷酸的正確讀碼框內(nèi)，從而能適當(dāng)翻譯mRNA。表達(dá)控制序列還包括其它組分，例如前導(dǎo)序列和融合配對(duì)物序列。啟動(dòng)子尤其可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子可以是合成的，病毒的或得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子，例如人遍在蛋白啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性的細(xì)胞系是表達(dá)本發(fā)明多肽的人無(wú)限增殖化神經(jīng)細(xì)胞系。為了進(jìn)行植入，我們希望植入約105至101Q個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選植入106至約108個(gè)細(xì)胞。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多核苷酸和蛋白質(zhì)，多肽，肽片段或由它們產(chǎn)生的衍生物，以及針對(duì)所述蛋白質(zhì)，肽或衍生物的抗體，本發(fā)明可用于治療或緩解活動(dòng)物體，包括人的失調(diào)或疾病，所述失調(diào)或疾病對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑的活性有反應(yīng)?？山?jīng)由例如注射入，植入或食入的藥物組合物，直接使用本發(fā)明的多肽來(lái)治療對(duì)neublastin多肽有所反應(yīng)的病理過(guò)程?？墒褂帽景l(fā)明的多核苷酸，包括其互補(bǔ)序列來(lái)表達(dá)本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。通過(guò)表達(dá)本發(fā)明的這種蛋白質(zhì)，肽或衍生物的細(xì)胞系，或通過(guò)編碼本發(fā)明的這種蛋白質(zhì)，肽或衍生物的病毒載體，或通過(guò)表達(dá)這種蛋白質(zhì)，肽或衍生物的宿主細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)這一目的。可在治療的靶區(qū)域施用這些細(xì)胞，載體和組合物以影響對(duì)neublastin多肽有所反應(yīng)的疾病過(guò)程。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體可衍生自慢病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，皰奢病毒或痘苗病毒，或衍生自多種由細(xì)菌產(chǎn)生的質(zhì)粒，可在體內(nèi)使用這些表達(dá)載體將核苷酸序列傳遞至整個(gè)生物體或靶器官，組織或細(xì)胞群體。其它方法包括但不限于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，用含有核或其它定位信號(hào)的載體肽轉(zhuǎn)染，和經(jīng)由緩釋系統(tǒng)進(jìn)行基因傳遞。在本發(fā)明的另一方面，可使用與neublastin基因或其部分互補(bǔ)的"反義"核苷酸序列抑制或增強(qiáng)neublastin表達(dá)。本發(fā)明的另一方面涉及治療或緩解活動(dòng)物體，包括人的失調(diào)或疾病的方法，所述失調(diào)或疾病對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑的活性有反應(yīng)。失調(diào)或疾病尤其可以是由創(chuàng)傷，外科手術(shù)，局部缺血，感染，代謝疾病，營(yíng)養(yǎng)缺陷，惡性腫瘤或毒性劑和遺傳或自發(fā)過(guò)程導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。損傷尤其可發(fā)生在感覺(jué)神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，包括側(cè)根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元或下列任何組織中的神經(jīng)元膝狀，巖部和結(jié)節(jié)狀神經(jīng)節(jié)；第VIII根顱神經(jīng)的耳前庭復(fù)合體；三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)之上下頜葉的腹外側(cè)極；和中腦三叉神經(jīng)核。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，疾病或失調(diào)是涉及受損和受傷的神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病，例如外周神經(jīng)，髓質(zhì)和/或脊髓的外傷性損害，大腦局部缺血性神經(jīng)元損害，神經(jīng)病(尤其是外周神經(jīng)病)，外周神經(jīng)創(chuàng)傷或外傷，局部缺血性中風(fēng)，急性腦損傷，急性脊髓損傷，神經(jīng)系統(tǒng)肺瘤，多發(fā)性硬化，暴露于神經(jīng)毒素，代謝疾病(例如糖尿病或腎功能異常)和由感染因子導(dǎo)致的損傷，神經(jīng)變性失調(diào)，包括早老性癡呆，杭廷頓氏病，帕金森氏病，Parkinson-Plus綜合征，進(jìn)行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征)，橄欖體腦橋小腦萎縮(OPCA)，Shy-Drager綜合征(多系統(tǒng)萎縮)，Guamanian帕金森氏綜合征癡呆復(fù)征，肌萎縮性側(cè)硬化，或任何其它先天的或神經(jīng)變性疾病，和與癡呆相關(guān)聯(lián)的記憶損傷。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，我們希望治療感覺(jué)和/或自主系統(tǒng)的神經(jīng)元。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，我們希望治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，例如肌萎縮性側(cè)硬化("ALS，，)和脊柱肌萎縮。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，我們希望使用本發(fā)明的neublastin分子增強(qiáng)外傷后的神經(jīng)恢復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，我們希望使用神經(jīng)引導(dǎo)通道，該通道具有含neublastin多肽的基質(zhì)。這種神經(jīng)引導(dǎo)通道公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利5，834，029(列入本文作為參考)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)治療外周神經(jīng)病。在外周神經(jīng)病中，有望用本發(fā)明的分子進(jìn)行治療的是外傷-誘導(dǎo)的神經(jīng)病，例如由物理?yè)p傷或疾病狀態(tài)，對(duì)腦的物理?yè)p傷，對(duì)脊髓的物理?yè)p傷，與腦損傷相關(guān)的中風(fēng)和與神經(jīng)變性相關(guān)的神經(jīng)失調(diào)所致的神經(jīng)病。我們還希望治療由化學(xué)治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病(例如由諸如紅豆杉醇或順式鉑氨的化學(xué)治療劑的傳遞所導(dǎo)致的神經(jīng)病)；毒素-誘導(dǎo)的神經(jīng)病，藥物-誘導(dǎo)的神經(jīng)病，維生素-缺乏-誘導(dǎo)的神經(jīng)?。蛔园l(fā)性的神經(jīng)病和糖尿病性神經(jīng)病，例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，496，804和5，916，555(皆列入本文作為參考)。我們還希望使用本發(fā)明的neublastm核苷酸和多肽治療非-神經(jīng)病，單-多重神經(jīng)病和多-神經(jīng)病，包括軸索和脫髓鞘神經(jīng)病。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和核酸(和含有它們的藥物組合物)可用于治療多種眼病，包括受斑變性，色素性視網(wǎng)膜炎，青光眼和類(lèi)似疾病困擾的患者的視網(wǎng)膜光受體損失。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供預(yù)防與上述疾病和失調(diào)相關(guān)聯(lián)的變性變化的方法，所述方法包括將人載體或細(xì)胞植入哺乳動(dòng)物的腦，所述載體或細(xì)胞能產(chǎn)生neublastin的生物活性形式或neublastin前體，即易于通過(guò)哺乳動(dòng)物體轉(zhuǎn)變?yōu)閚eublastin的生物活性形式的分子，或者，另外可將分泌neublastin的細(xì)胞包裹于例如半透膜內(nèi)?？稍隗w外培養(yǎng)細(xì)胞以用于移植至或植入哺乳動(dòng)物(包括人)的腦。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用例如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W098/32869中所述的表達(dá)栽體，將編碼本發(fā)明多肽的基因轉(zhuǎn)染至適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，例如無(wú)限增殖化的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞系，如HiB5和RN33b，或轉(zhuǎn)染至人無(wú)限增殖化的神經(jīng)祖細(xì)胞系，再將所得的細(xì)胞系植入活體(包括人)的腦中，以在CNS中分泌本發(fā)明的治療性多肽。診斷和篩選方法可使用neublastin核酸測(cè)定個(gè)體是否因neublastin基因缺損，如neublastin等位基因的缺損而先傾向于患有神經(jīng)失調(diào)癥，所述缺損是通過(guò)例如基因遺傳，異常胚胎發(fā)育，或獲得性DNA損傷而獲得的。所述分析包括例如檢測(cè)neublastin基因內(nèi)的缺損或點(diǎn)突變，或檢測(cè)具有特異性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的基因缺損誘因的遺傳性，通過(guò)使患者的核酸樣品與neublastin基因特異性的核酸探針雜交來(lái)檢測(cè)是否存在正常的neublastin基因，并且測(cè)定探針與核酸雜交的能力?？商貏e地將neublastin核酸用作雜交探針?？墒褂眠@種雜交分析檢測(cè)，預(yù)測(cè)，診斷或監(jiān)測(cè)與編碼neublastin蛋白之mRNA的異常水平相關(guān)的病癥，失調(diào)或疾病?？蓪eublastin核酸當(dāng)作neublastin神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-依賴型生理過(guò)程的"標(biāo)記"。這些過(guò)程包括但不限于"正常的"生理過(guò)程(如神經(jīng)元功能)和病理過(guò)程(如神經(jīng)變性疾病)。neublastin蛋白和/或編碼neublastin的mRNA水平異常(即升高或降低)的特定患者亞群的鑒定導(dǎo)致新的疾病分類(lèi)。本文所定義的"異常水平"指的是經(jīng)定量或定性方法測(cè)定，上述水平相對(duì)于對(duì)照樣品或未患病的個(gè)體而言有所增加或降低。也可使用本發(fā)明的neublastin核酸和多肽篩選和鑒定neublastm類(lèi)似物，包括neublastin的小分子模擬物。在一個(gè)經(jīng)深思熟慮的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定候選化合物的方法，所述化合物可誘導(dǎo)neublastin-介導(dǎo)的生物學(xué)作用，所述方法包括以下步驟提供受試細(xì)胞，當(dāng)其與neublastin接觸時(shí)可被誘導(dǎo)表達(dá)可測(cè)的產(chǎn)物，將細(xì)胞暴露于候選化合物，并檢測(cè)可測(cè)產(chǎn)物?？蓽y(cè)產(chǎn)物的表達(dá)是候選化合物能誘導(dǎo)neublastin-介導(dǎo)的生物學(xué)作用的標(biāo)志。此外，本發(fā)明的neublastin核酸和多肽可用于DNA芯片或蛋白質(zhì)芯片，或用于計(jì)算機(jī)程序以鑒定相關(guān)的新基因序列和由其編碼的蛋白質(zhì)，包括等位基因變體和單核苷酸多態(tài)性("SNP")。所述方法描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5,795,716;5,754,524;5，733，729;5,800,992;5,445,934;5,525，464(皆列入本文作為參考)。實(shí)施例實(shí)施例1:分離neublastin核酸的方法方法1:快速篩選人胎腦cDNA中的neublastin基因通過(guò)與人persephin的同源性，在兩個(gè)提交至GenBank的高通量基因組序列(HGTS)(登記號(hào)為AC005038和AC005051)中鑒定出2卯bp片段。由290bp片段的核酸序列合成兩個(gè)neublastin特異性引物。neublastin上鏈引物("NBNmt.sence，，)具有序列5，-CCTGGCCAGCCTACTGGG-3，[SEQIDNO:17。neublastin下鏈引物("NBNint.antisence")具有序列5，-AAGGAGACCGCTTCGTAGCG-3'[SEQIDNO:181。用這些引物進(jìn)行96孔PCR反應(yīng)。96孔主平板含有500,000個(gè)cDNA克隆的質(zhì)粒DNA，每孔上樣約5000個(gè)克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌DH10B甘油原種，每孔含有50個(gè)克隆。使用聚合酶鏈反應(yīng)("PCR")技術(shù)通過(guò)3輪擴(kuò)增鑒定出neublastin核酸；擴(kuò)增增加了樣品中的核酸拷貝數(shù)。主平板篩選使用上述96-孔PCR篩選技術(shù)，用基因-特異性引物篩選人胎腦cDNA主平板以分離人neublastincDNA。從主平板的相應(yīng)孔中得到30納克(30ng)人胎腦cDNA(6ng/fil;OrigeneTechnologies),將其置于總體積為25^1的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即NBNint.sence和NBNintan他ence)，lx標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK),0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia),0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/pl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用下列方案和條件進(jìn)行PCR熱循環(huán)反應(yīng)。起初使DNA于94"變性3分鐘，然后按下述進(jìn)行35輪循環(huán)94t:變性l分鐘，55X:退火l分鐘，72t:第一次延伸卯秒；72C最終延伸5分鐘。使用含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠經(jīng)凝膠電泳分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)產(chǎn)物。由一個(gè)孔中得到的102bp陽(yáng)性PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于獨(dú)特的96孔次平板。102bp核酸片段具有下列序列[SEQIDNO:135'-CCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTT-3'次平板篩選將得自相應(yīng)次平板孔的甘油原種置于總體積為25nl的溶液中，經(jīng)PCR-介導(dǎo)的擴(kuò)增篩選96孔人胎腦次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia),0.1MGC-Melt(aontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，鑒定出給出102bpPCR片段的陽(yáng)性孔。菌落PCR:用Luria肉湯(LB)將1ml得自陽(yáng)性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然后將1ml和10ml上述稀釋液鋪于2個(gè)含有Luria肉湯(LB)和100ng/ml羧千青霉素的獨(dú)立瓊脂平板上，于30t:將LB平板保溫過(guò)夜。從這些平板中挑選出96個(gè)菌落，置于新的96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25^1，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK),0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia)，0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nl;AdvancedBiotechnologies,UK)使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，隨后鑒定出含有102bp片段的陽(yáng)性菌落。對(duì)由該陽(yáng)性菌落制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，顯示出861bp的全長(zhǎng)cDNA[SEQIDNO:8。該cDNA編碼前-neublastin原[SEQIDNO:9。使用BigDye⑧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(PEAppliedBiosystems，USA)進(jìn)行自動(dòng)化的DNA測(cè)序。在ABIPrism377(PEAppliedBiosystems,USA)上電泳測(cè)序凝膠。方法2:從人腦中克隆neublastincDNA:通過(guò)聯(lián)合使用RACE(快速擴(kuò)增cDNA末端)，上文所述的neublastin-特異性引物NBNint.sence和NBNmtantisence，以及載體畫(huà)特異性或銜接子-特異性引物，例如通過(guò)使用MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒(CkmtechLaboratories,USA，Cat.No.K1802-l),可實(shí)施擴(kuò)增全長(zhǎng)neublastincDNA或cDNA片段的另一種方法。使用整個(gè)人腦Marathon-ReadycDNA(ClontechLaboratories,USA,Cat.No.7400-1)擴(kuò)增全長(zhǎng)neublastincDNA。擴(kuò)增所用的引物包括neublastin上鏈引物5，-ATGGAACTTGGACTTGG-3，[SEQIDNO:19("NBNextsence")，和neublastin下鏈引物5，-TCCATCACCCACCGGC畫(huà)3，[SEQIDNO:20("NBNext.antisence"),以及包含在Marathon-ReadycDNA中的銜接子引物AP1。也可使用另一種上鏈引物，5，-CTAGGAGCCCATGCCC-3，[SEQIDNO:28。也可使用另一種下鏈引物5，-GAGCGAGCCCTCAGCC-3，[SEQIDNO:33。類(lèi)似地，也可使用另一種下鏈引物SEQIDNO:24和26。方法3:從人腦中克隆neublastincDNA:克隆neublastincDNA的另一種方法是通過(guò)用本文所述的一種或多種neublastin探針篩選成人或胎兒的腦文庫(kù)(如圖1所例舉)。這些文庫(kù)包括入gtll人腦(ClontechLaboratories,USA，Cat,No.HL3002b);或入gtll人胎腦(ClontechLaboratories,USA,Cat.No.HL3002b)。方法4:快速篩選小鼠胎cDNA中的neublastin基因按下迷方法進(jìn)行快速篩選neublastin基因的方案。96孔主平板含有500,000個(gè)cDNA克隆的質(zhì)粒DNA，每孔上樣約5000個(gè)克隆。96孔次平板使用的是大腸桿菌甘油原種，每孔含有50個(gè)克隆，進(jìn)行3輪PCR-介導(dǎo)的擴(kuò)增以鑒定出感興趣的基因(即neublastin)。主平板篩選使用基因-特異性引物，通過(guò)96-孔PCR篩選小鼠胎cDNA主平板以分離小鼠neublastincDNA。合成下列兩個(gè)引物(l)neublastinC2引物(NBMnt.sence):5，-GGCCACCGCTCCGACGAG-3，[SEQIDNO:21；和(2)neublastinC2as引物(NBNint.antisence):5，-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3，[SEQIDNO:22。通過(guò)使用這兩個(gè)基因-特異性引物，鑒定出220bp的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物。220bp核酸具有下列序列[SEQIDNO:145'-GGCCACCGCTCCGACGAGCTGATACGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCGTGCCGCCGAGCACGCTCCCAGCACGATCTCAGTCTGGCCAGCCTACTGGGCGCTGGGGCCCTACGGTCGCCTCCCGGGTCCCGGCCGATCAGCCAGCCCTGCTGCCGGCCCACTCGCTATGAGGCCGTCTCCTTCATGGACGTGAAGAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCC-3'然后按下列方法進(jìn)行96孔PCR反應(yīng)。從主平板的相應(yīng)孔中得到30納克小鼠胎腦cDNA(6ng/nl;OrigeneTechnologies),將其置于總體積為25nl的溶液中，所述溶液含有下列試劑0.2mM上述兩種基因-特異性引物(即C2引物(NBNint.sence)和neublastinC2as引物(NBNint.antisence)),1x標(biāo)準(zhǔn)的pcr緩沖液(Bufferv，AdvancedBiotechnologies,UK),0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia)，0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nl;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用下列PCR熱循環(huán)條件起初使DNA于94*C變性3分鐘，然后按下述進(jìn)行35輪循環(huán)94t:變性l分鐘，55"C退火1分鐘，72€延伸90秒；72X:最終延伸5分鐘。在含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠上分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。由一個(gè)孔中得到的220bp陽(yáng)性PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于獨(dú)特的96孔次平板。在含有溴化乙錠染料的2%瓊脂糖凝膠上分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)。鑒定出的220bp陽(yáng)性PCR產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于96孔次平板特有的孔。次平板篩選將得自相應(yīng)次平板孔的甘油原種置于最終總體積為25nl的溶液中，經(jīng)PCR-介導(dǎo)的擴(kuò)增篩選96孔小鼠胎次平板，所述溶液含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham一Pharmacia),0.1MGC漏Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/nl;AdvancedBiotechnologies,UK).使用的PCR熱循環(huán)條件與上文所述的主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，鑒定出產(chǎn)生220bp片段的陽(yáng)性孔。菌落PCR:用Luria肉湯(LB)將lml得自陽(yáng)性次平板孔的甘油原種稀釋100倍，然后將lml和10ml上述稀釋液鋪于2個(gè)含有100ng/ml羧千青霉素的獨(dú)立LB平板上，于30"C保溫過(guò)夜。總共分離出96個(gè)菌落，將這些菌落轉(zhuǎn)移至96孔PCR板的孔中，每孔的終體積為25^1，其中含有0.2mM上述兩種基因-特異性引物，lx標(biāo)準(zhǔn)的PCR緩沖液(BufferV，AdvancedBiotechnologies,UK)，0.2mMdNTP(Amersham-Pharmacia),0.1MGC-Melt(ClontechLaboratories,USA)和0.5單位TaqDNA聚合酶(5U/fil;AdvancedBiotechnologies,UK)。使用的PCR熱循環(huán)條件與主平板篩選所用的條件相同。在含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上通過(guò)凝膠電泳分析96個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，通過(guò)220bp片段的存在鑒定出陽(yáng)性菌落。由該陽(yáng)性菌落制備質(zhì)粒DNA，使用具有AmpliTaqDNA聚合酶的BigDye⑧終止循環(huán)測(cè)序試劑盒對(duì)克隆進(jìn)行自動(dòng)化的DNA測(cè)序。在ABIPrism377(PEAppliedBiosystems，USA)上電泳測(cè)序凝膠。所得克隆序列顯示出2136bp的全長(zhǎng)cDNA[SEQIDNO:15。此cDNA包括具有SEQIDNO:16所示的推測(cè)氨基酸序列的開(kāi)放閱讀框，其編碼小鼠前-neublastin原多敗。實(shí)施例2:克隆基因組neublastin如上文所討論，申請(qǐng)人在兩個(gè)登錄至GenBank的人BAC克隆(登記號(hào)為AC005038和AC005051)中鑒定出2卯bp的核酸片段，該片段具有與persephin和persephin的側(cè)翼序列同源的區(qū)域。申請(qǐng)人使用上文所述的861bp推測(cè)序列設(shè)計(jì)出其它引物，目的是使用LasergeneSoftware(DNAStar公司)克隆出編碼其它neublastin核酸的核酸。通過(guò)對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用兩對(duì)引物克隆neublastin基因。這兩對(duì)引物如下。l號(hào)引物對(duì)5，CCAAgCCCACCTgggTgCCCTCTTTCTCC3，(有義)[SEQIDNO:235，CATCACCCACcggCAggggCCTCTCag3，(反義)SEQIDNO:24。2號(hào)引物對(duì)5，gAgCCCAtgCCCggCCTgATCTCAgCCCgAggACA3，(有義)[SEQIDNO:255，CCCTggCTgAggCCgCTggCTAgTgggACTCTgC3，(反義)SEQIDNO:26。使用1號(hào)引物對(duì)，由購(gòu)自ClontechLaboratories(CatNo.6550-1)的人基因組DNA制品擴(kuò)增887bpDNA片段。PCR方案使用具有緩沖液1的ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)進(jìn)行PCR。總體積為50^1的PCR反應(yīng)混合物中添加有5%二甲基亞砜(DMSO)和17.5pmol各種dNTP。熱循環(huán)反應(yīng)為94t;預(yù)-變性2分鐘，接著進(jìn)行35輪94t:10秒和68"Cl分鐘的兩_步循環(huán)。通過(guò)于68€保溫5分鐘終止熱循環(huán)。在PTC-225DNAEngineTetrad熱循環(huán)儀(MJResearch,MA)中進(jìn)行熱循環(huán)。通過(guò)在2%瓊脂糖(FMC)上進(jìn)行凝膠電泳來(lái)分析PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行照相。將用l號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增自人基因組DNA的887bp片段克隆至pCRII載體(Invitrogen)，并轉(zhuǎn)化至XL1-Blue感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene)。所得質(zhì)粒被稱(chēng)為neublastin-2,使用熱測(cè)序酵(AmershamPharmaciaBiotech)對(duì)該質(zhì)粒測(cè)序。通過(guò)在ALFExpress自動(dòng)測(cè)序儀(Amer-shamPharmaciaBiotech)上電泳來(lái)分析測(cè)序產(chǎn)物。對(duì)用第二對(duì)引物(上述l號(hào)引物對(duì))PCR擴(kuò)增人基因組DNA得到的片段進(jìn)行測(cè)序，顯示出位于開(kāi)放閱讀框3'引物末端的額外的42bp區(qū)域。通過(guò)將此全長(zhǎng)序列與其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的核酸序列相比較，以及使用尋找基因的軟件程序作圖外顯子-內(nèi)含子邊界序列來(lái)分析此全長(zhǎng)序列，所述程序可使用Netgene和GeneMark軟件(Bnmak等，分子生物學(xué)雜志，1991，22049-65;Borodovsky等，核酸研究，1995，23，3554-62)鑒定適當(dāng)?shù)募艚咏宇^和具有高編碼潛力的區(qū)域。通過(guò)得自上述快速篩選的cDNA進(jìn)一步證實(shí)外顯子-內(nèi)含子邊界序列。如圖7所示，所得neublastin基因具有兩個(gè)被70bp內(nèi)含子分開(kāi)的外顯子?？傊怙@子具有全長(zhǎng)Neublastin多肽的推測(cè)氨基酸序列。推測(cè)的cDNA[SEQIDNO:3含有編碼238個(gè)氨基酸殘基[SEQIDNO:4的開(kāi)放閱讀框(ORF)。Neublastin-2克隆含有neublastin原的完整編碼序列。由此基因編碼的氨基酸序列顯示出與3個(gè)蛋白質(zhì)，presephin，neublastin和GDNF具有高同源性。實(shí)施例3:表達(dá)neublastin核酸使用下述技術(shù)檢測(cè)嚙齒類(lèi)動(dòng)物和人的神經(jīng)和非-神經(jīng)組織，以及多個(gè)發(fā)育不成熟和成年階段的neublastinRNA表達(dá)。使用RT-PCR檢測(cè)NeublastinRNA表達(dá)的方法根據(jù)SEQIDNO:l所鑒定的neublastinDNA序列，合成了下列引物(l)廳blastinC2引物5，-GGCCACCGCTCCGACGAG-3，[SEQIDNO:21；和(2)neublastinC2as引物5，-GGCGGTCCACGGTTCTCCAG-3，[SEQIDNO:22。使用該套引物由成人和胎兒全腦mRNART-PCR擴(kuò)增DNA片段，通過(guò)此反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片段中有一個(gè)為220bp。鑒定該220bpDNA片段，結(jié)果表明成人和胎兒腦組織中表達(dá)了neublastin基因。使用這些引物從基因組DNA中也擴(kuò)增到220bpDNA片段。通過(guò)Northern印跡雜交檢測(cè)NeublastinRNA表達(dá)的方法具有成人組織的poIyA+RNA的Northern印跡購(gòu)自廠商(ClontechLaboratories,USA)，并用"P-標(biāo)記的neublastincDNA作探針與其雜交。根據(jù)上文實(shí)施例1所述的方法制備經(jīng)標(biāo)記的neublastincDNA。制備探針按照廠商的說(shuō)明，使用RediprimeII標(biāo)記試劑盒(Amersham;Cat.No.RPN1633)標(biāo)記neublastin核酸DNA片段(SEQIDNO:8的核苷酸296-819)以用作雜交探針。筒單地說(shuō)，用lOmMTE緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，ImMEDTA)稀釋DNA樣品至濃度為2.5-25ng/45nl。然后在開(kāi)水浴中將樣品加熱至95-lOOt:達(dá)5分鐘，將其置于水上放5分鐘以快速冷卻樣品，簡(jiǎn)單離心使內(nèi)容物沉至反應(yīng)管底部，從而使DNA變性。在反應(yīng)管中加入上述所有變性的DNA以及5|ilRedivue[32PjdCTP(AmershamPharmaciaBiotechLtd),該反應(yīng)管中還同時(shí)含有dATP，dGTP，dTTP的緩沖溶液，干燥的穩(wěn)定化形式的無(wú)外切核酸酶的KIenow酶和隨機(jī)引物。通過(guò)用移液管上下抽吸2次，用移液管攪動(dòng)溶液以混合溶液，于37X:將反應(yīng)混合物保溫10分鐘。通過(guò)加入5nl0.2MEDTA終止標(biāo)記反應(yīng)。為了用作雜交探針，通過(guò)將DNA樣品加熱至95-100X:達(dá)5分鐘，然后將其置于冰上放5分鐘以快速冷卻DNA樣品，從而使經(jīng)標(biāo)記的DNA變性為單鏈。離心試管，充分混合其內(nèi)容物。最后，使用NucleotideRemoval試劑盒(Qiagen)純化單鏈DNA探針。雜交技術(shù)制備的Northern印跡購(gòu)自廠商("多組織Northern印跡"，ClontechLaboratories,USA，Cat.No.7760國(guó)l和7769-1),根據(jù)廠商說(shuō)明，使用上文所制備的neublastin"P-標(biāo)記的探針與所述印跡雜交。為了進(jìn)行雜交，使用了ExpressHyb溶液(ClontechLaboratories,USA)和濃度約為3ng/ml的經(jīng)標(biāo)記探針。將ExpressHyb溶液加熱至68C，然后攪拌以溶解任何沉淀物。根據(jù)廠商說(shuō)明，于68"C，在Hybaid雜交烘箱中的至少5mlExpressHyb溶液中將每個(gè)Northern印跡膜(10xl0cm)預(yù)-雜交30分鐘。于95-100匸放置2分鐘使neublastin32P-標(biāo)記的探針變性，然后在冰上快速冷卻。在5ml新鮮的ExpressHyb中加入14^1經(jīng)標(biāo)記的探針并徹底混合。預(yù)-雜交中所用的ExpressHyb溶液被5ml均勻分布于印跡膜的含有經(jīng)標(biāo)記探針的新鮮ExpressHyb溶液所替代。于68r，在Hybaid雜交烘箱中將印跡保溫1小時(shí)。保溫后，在低嚴(yán)緊度(含有0.05。/oSDS的2xSSC緩沖液，室溫)下將印跡沖洗和洗滌幾次，接著在高嚴(yán)緊度(含有0.1%SDS的O.lxSSC，50匸)〖20xSSC是0.3MNaCI/0.3M檸檬酸鈉，pH7.0下洗滌。于-80t:，使用增感屏將印跡暴露于HyperfilmMP(AmershamPharmaciaBiotechLtd.)。Northern印跡雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1圖1A(左)和圖1B(右)是按實(shí)施例3所述與"P-標(biāo)記的neublastincDNA探針雜交的polyA+RNANorthern印跡。標(biāo)記物表示大小為1.35千堿基對(duì)("kb，，)，2.4kb，4.4kb，7.5kb和9.5kb的多核苷酸。用提取自多種成人組織的mRNA制備圖1A的膜。由Northern印跡雜交分析的結(jié)果，申請(qǐng)人得出結(jié)論很多成人組織中都表達(dá)neublastinmRNA。在心臟，骨骼肌和胰腺中檢測(cè)到最高水平的neublastin表達(dá)。用提取自成人腦的多個(gè)區(qū)域的RNA制備圖1B的膜。在成人腦中，尾狀核和丘腦中的表達(dá)水平最高。在腦中，約5kb的mRNA轉(zhuǎn)錄物是主要表達(dá)的neublastinmRNA形式。使用原位雜交檢測(cè)組織中的neublastinRNA表達(dá)的方法使用以下技術(shù)，用neublastin反義探針測(cè)定動(dòng)物組織，例如嚙齒動(dòng)物組織中的neublastinRNA表達(dá)。在小鼠中的表達(dá)制備組織樣品在懷孕第13.5或18.5天，通過(guò)頸脫位處死懷孕小鼠(B&KUniversal,Stockholm,Sweden)。在無(wú)菌條件下解剖，取出胚胎，立即浸入含有4。/。低聚甲醛("PFA，，)的0.1M磷酸鹽緩沖液(PB)中達(dá)24至30小時(shí)，然后從PFA中取出并儲(chǔ)存于PBS中。通過(guò)將組織浸入30%蔗糖溶液，然后在TissueTech(O.C,T.Compound,SakuraFinetekUSA,Torrance,CA)中包埋該組織即可制備出切片用的組織。在低溫恒溫器上切下6個(gè)冠狀或矢狀切片(各為12nm)系列，并融化固定在帶正電的玻片上。在實(shí)施與胚胎階段相同的方案之后，固定新生兒的頭/腦(Pl，P7)，解剖成年腦組織，立即在干冰中凍干，無(wú)需包埋即可在低溫恒溫器上進(jìn)行切片。制備neublastinRiboprobe:按下述制備反義neublastinRNA探針(下文稱(chēng)之為neublastinriboprobe)。將小鼠neublastincDNA序列的核苷酸1109-1863〖SEQIDNO:15亞克隆至BlueScript載體(Stratagene)。使用EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶將所得質(zhì)粒切割成線性DNA。根據(jù)廠商(BoehringerMannheim)說(shuō)明，使用T3RNA聚合酶和地高辛配基("DIG")RNA標(biāo)記試劑盒體外轉(zhuǎn)錄EcoRIDNA片段。雜交在4。/oPFA中將低溫恒溫器切片固定10分鐘，用10mg/ml蛋白酶K處理5分鐘，依次分別用70%和95%乙醇脫水5和2分鐘，然后風(fēng)干。將含有l(wèi)ng/mlDIG-標(biāo)記探針的雜交緩沖液(50Q/()去離子化的甲酰胺，50%葡聚糖硫酸酷溶液中的10%,1%Denhardt溶液，250嗎/ml酵母tRNA，0.3MNaCl，20mMTris國(guó)HCl(pH8)，5mMEDTA，10mMNaPO4，1%十二烷基肌氨酸鈉)加熱至80X:達(dá)2分鐘，并應(yīng)用于切片上，然后用石蠟?zāi)じ采w切片，于55"C保溫16至18小時(shí)。第二天，于55X:,在高嚴(yán)緊度(含有50。/。甲跣胺的2xSSC)下洗滌切片30分鐘，然后用RNA酶緩沖液洗滌，并于37"C與20ng/mlRNA酶A保溫30分鐘。為了檢測(cè)DIG-標(biāo)記的探針，在封閉溶液(含有0.1%吐溫-20和10%熱-滅活的山羊血清的PBS)中將切片預(yù)保溫1小時(shí)，然后于4C與按1:5000稀釋的堿性磷酸酶-偶聯(lián)的抗-DIG抗體(BoehringerMaimheim)保溫過(guò)夜。第二天，用含有0.1%吐溫-20的PBS將每個(gè)切片洗滌4次，每次2小時(shí)，然后用NTMT緩沖液(100mMNaCl，100mMTris-HCl(pH9.5)，50mMMgCl2，0.1%吐溫-20)洗滌2次，每次10分鐘。然后在含有0.5mg/mllevamisole的BM-紫色底物中將切片保溫48小時(shí)。通過(guò)用PBS洗滌以終止顏色反應(yīng)，風(fēng)干切片，用具有DPX的封套(KEBO-lab，Sweden)覆蓋切片。原位雜交反應(yīng)的結(jié)果示于表1。表l:在小鼠中表達(dá)neublastin_<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如表1所示，在第13.5天胚胎期("E13.5"),脊髓和后腦中表達(dá)了neublastin,前腦中僅有微弱表達(dá)。在發(fā)育中的視網(wǎng)膜和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)(側(cè)根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)(V))中也檢測(cè)到neublastin表達(dá)。除神經(jīng)系統(tǒng)外，在腎，肺和腸中發(fā)現(xiàn)了微弱信號(hào)，這表明這些組織中也表達(dá)neublastin.在第18.5天胚胎期("E18.5")，三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)中的neublastin表達(dá)最為顯著，也在視網(wǎng)膜，紋狀體和皮質(zhì)中檢測(cè)到neublastin表達(dá)。另外，還在牙髓中觀察到表達(dá)。參照表1，在皮質(zhì)，紋狀體和三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)中，由E18.5時(shí)間點(diǎn)至出生后第1和7天，neublastin的表達(dá)逐步增加。皮質(zhì)外層的neublastin表達(dá)比皮質(zhì)內(nèi)層更加顯著。在P7天，有表達(dá)的結(jié)構(gòu)與Pl天的相同，但另外還在海馬，尤其是齒狀回和小腦中發(fā)現(xiàn)了neublastin表達(dá)。在成年的鼠腦中，neublastin在齒狀回中大量表達(dá)，而在受試的其它組織中僅檢測(cè)到很低或不可測(cè)水平的neublastin表達(dá)。在大鼠中表達(dá)下列實(shí)驗(yàn)描述了大鼠組織與堿性磷酸酶-標(biāo)記的寡脫氧核苷酸neublastin反義探針的雜交。制備組織樣品用戊巴比妥麻醉之后，由懷孕的Wistar大鼠(MollegaardBreeding,Denmark)得到大鼠胚胎(E14)。通過(guò)斷頭殺死出生后的大鼠(P0，P7，成年)。立即將解剖的腦和整個(gè)頭浸入冷的0.9%NaCl中，新鮮冷凍并在低溫恒溫器上切片成20jim(冠狀或矢狀切片，10個(gè)系列)。原位雜交使用反義堿性磷酸酶(AP)綴合的寡脫氧核苷酸探針(5，-NCAGGTGGTCCGTGGGGGGCGCCAAGACCGG-3，[SEQIDNO:27J，Oligo.No.l64675，DNATechnology,Denmark)雜交兩個(gè)切片系列。所述探針與SEQIDNO:15所示小鼠neublastincDNA的堿基1140至1169互補(bǔ)。在雜交之前，室溫風(fēng)干切片，加熱至55t:io分鐘，然后于4t:用96%乙醇處理過(guò)夜。然后風(fēng)干切片，于39t:在雜交介質(zhì)(5.0pmol探針/ml)中保溫過(guò)夜(Finsen等，神經(jīng)科學(xué)，1992，47，105-113;West等，J.Comp.Neurol，1996，370，11-22)。雜交后的處理包括于55t:用1xSSC(0.15MNaCl，0.015M檸檬酸鈉)沖洗4次，每次30分鐘，接著在室溫下用Tris-HCl，pH9.5沖洗3次，每次10分鐘，然后使用AP顯色劑。AP顯色劑即用即制，其含有氮藍(lán)四唑(NBT，Sigma)，5-溴，4-氯，3-吲哚磷酸(BCIP，Sigma)和Tris-HCl-Mga2緩沖液，pH9.5(Finsen等，神經(jīng)科學(xué)，1992，47，105-113)。室溫下，在黑暗中進(jìn)行AP顯色48小時(shí)。通過(guò)用蒸餾水沖洗切片來(lái)終止顏色反應(yīng)。在梯度丙酮中使切片脫水，用二甲笨-笨酚木溜油(AHchem，UK)使其軟化，用二甲笨清洗，并使用Eukitt(Bie&Berntsen，Denmark)覆蓋一層封套。對(duì)照反應(yīng)包括(l)在雜交前用RNA酶A(50ng/ml，Pharmacia,Sweden)預(yù)-處理切片；(2)用過(guò)量100倍的未經(jīng)標(biāo)記的探針與切片雜交；和(3)僅用雜交緩沖液與切片雜交。雜交反應(yīng)的結(jié)果示于表2。表2:在大鼠中表達(dá)neublastin<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>在第14天胚胎期(E14)，neublastin在大鼠胚胎的前腦，后腦和脊髓中微弱表達(dá)。在眼(視網(wǎng)膜)，側(cè)根神經(jīng)節(jié)，三叉神經(jīng)神經(jīng)節(jié)(V)和腎，肺，心臟，肝臟和腸中也檢測(cè)到neublastinmRNA。在新生(P0)大鼠中，皮質(zhì)和紋狀體中的neublastin表達(dá)顯著。在嗅球和海馬中也檢測(cè)到neublastin表達(dá)。在7天齡(P7)大鼠中，皮質(zhì)，紋狀體，嗅球和小腦表達(dá)了neublastin。在海馬中發(fā)現(xiàn)了顯著的信號(hào)。在成年大鼠中，在腦的大多數(shù)區(qū)域檢測(cè)到很低或不可測(cè)的neublastin表達(dá)水平。在丘腦核中檢測(cè)到微弱信號(hào)，在海馬中檢測(cè)到顯著的neublastin表達(dá)。實(shí)施例4:neublastin多肽在SEQIDNO:8中鑒定的開(kāi)放閱讀框或編碼區(qū)(CDS)編碼前-多肽原(稱(chēng)為"前neublastin原")。由此開(kāi)放閱讀框推測(cè)的氨基酸序列示于SEQIDNO:9，鑒定了3個(gè)neublastin多肽變體，這些變體包括(i)本文稱(chēng)為NBN140的多肽，其具有SEQIDNO:10所示的氨基酸序列；(ii)本文稱(chēng)為NBN116的多肽，其具有SEQIDNO:ll所示的氨基酸序列；和(iii)本文稱(chēng)為NBN113的多肽，其具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。類(lèi)似地，根據(jù)SEQIDNO:3中鑒定的編碼區(qū)(CDS)編碼具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的前-多肽原，鑒定了3個(gè)neublastin變體，這些變體包括(i)具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；和(iii)具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽。根據(jù)基于ClustalW(1.75)的多序列對(duì)比，將SEQIDNO:9與GDNF，persephin和neurturin的氨基酸序列相比較。對(duì)比結(jié)果示于表3。表3:neublastin與persephin，neurturin和GDNF的氨基酸序列比較Neurturin-full--------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGUiLSHRLGPANeublastinMELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-full---------------------------------------------------------GDNF—HUMAN-full-----MKLWDWAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-fullLVPLHRLPRTLDAR工ARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRRNeublastinVLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGKAARAGGPGPersephin-full-MAVGKF1>LGS1<LLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTORPLGDNF一HUMAN-fullNMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-fullRARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCACSACEA-AARVYDLGLRRNeublastinSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRTCSGSCRR-ARSPHDLSIASPersephin-fullARLRRALSGPCQIiWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGIALARGtWF-HUMAN-fullRRGQRGKHRGCVLTAIHLMVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDK工IiKNNeurturin-fullLRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDEVSFLDAHSRYHTVHEI/SARECACV-NeublastinLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCKPTRYE-AVSFMDVMSTWRTVDRLSATACGCLGP虹S印hin-fullLQGOGRAHGG--------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF—HUMAN-ful1IiSRNRRLVSD----KV鄰ACCRFIAFDDDLSFLDIttJLVYHILEKHSAKRCGCI-*表示具有單個(gè)完全保守殘基的位置；:表示下列"強(qiáng)(strong)"組之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，F(xiàn)YW;.表示下列"較弱(weaker)"組之一是完全保守的-CSA，ATV，SAG,STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK,NEQHRK，VLIM，HFY。由表3所示的氨基酸序列對(duì)比可以看出neublastin有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基，它們位于TGF-P超家族保守的位置處。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的neublastin多肽含有(7個(gè))保守的半胱氨酸，在SEQIDNO:2中，保守位置為第8，35，39，72,73，101和103位，而在SEQIDNO:4和9中，保守位置為第43，70，74，107，108，136和138。已知這7個(gè)保守的半胱氨酸殘基在TGF-(3超家族形成3個(gè)單體內(nèi)二硫鍵(例如，在SEQIDNO:2中為半胱氨酸殘基8-73，35-101和39-103之間的二硫鍵，而在SEQIDNO:4和9中為半胱氨酸殘基43-108，70-136和74-138之間的二硫鍵)和l個(gè)單體間二硫鍵(在SEQIDNO:2中為半胱氨酸殘基72-72之間的二硫鍵，而在SEQIDNO:4和9中為半胱氨酸殘基107-107之間的二硫鍵)，它們與延伸的p鏈區(qū)域一起構(gòu)成了TGF-p超家族保守的結(jié)構(gòu)基元，例見(jiàn)Daopin等，蛋白質(zhì)，1993，17，176-192。根據(jù)此序列對(duì)比，表明neublastin是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF亞族的成員(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，表3中下劃線的GDNF亞族指紋)。計(jì)算neublastin與GDNF家族其它成員的同源性，結(jié)果示于下表4'表4:neublastin多肽與GDNF家族其它成員的同源性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>%GDNF=得自膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NTN=NeurturinPSP=PersephinIHA=抑制素-aTF-P2=轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-|32強(qiáng)同源性表明下列"強(qiáng)(strong)"組之一是保守的STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，F(xiàn)YW。實(shí)施例5:生產(chǎn)neublastin如下文所述，我們?cè)谡婧撕驮思?xì)胞中生產(chǎn)出neublastin。表達(dá)載體將編碼neublastin的全長(zhǎng)cDNA插入真核表達(dá)載體pUbilZ。該載體是通過(guò)將人UbC啟動(dòng)子克隆至pcDNA3.1/Zeo的經(jīng)修飾形式而產(chǎn)生的。未經(jīng)修飾的pcDNA3.1/Zeo可以商購(gòu)(Invitrogen)。經(jīng)修飾的pcDNA3.1/Zeo比原始載體小，因?yàn)槌チ税逼S青霉素基因(第3933至5015位)和第2838至3134位的序列。在pcDNA3.1/Zeo的經(jīng)修飾形式中，CMV啟動(dòng)子被得自pTEJ-8的UbC啟動(dòng)子(Johansen等，F(xiàn)EBSLett,19卯，267，289誦294)取代，產(chǎn)生pUbilZ。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)然后用含有neublastin編碼序列的pUbilZ載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系HiB5，該細(xì)胞系是無(wú)限增殖化的大鼠神經(jīng)細(xì)胞系(Renfranz等，細(xì)胞，1991，66，713-729)。已建立了幾抹能穩(wěn)定表達(dá)neublastin(通過(guò)RT-PCR測(cè)定)的HiB5細(xì)胞系。在一個(gè)這樣的穩(wěn)定細(xì)胞系中，通過(guò)在Northern印跡上使總RNA與"P-標(biāo)記的neublastin探針雜交，證實(shí)了HiB5pUbilzNBN22的表達(dá)。這些研究的結(jié)果示于圖2。然后將HiB5pUbilzNBN22用作neublastin的來(lái)源以研究neublastin的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。圖2顯示了HiB5pUbilzNBN22克隆中的neublastincDNA表達(dá)(即按上文所述用本發(fā)明的"P-標(biāo)記的neublastincDNA與Northern印跡雜交)。通過(guò)分別從未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞，HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞和HiB5pUWlzGDNF14中提取總RNA來(lái)制備印跡。如印跡上所示，28S和18SrRNA帶的位置分別相當(dāng)于4.1kb和1.9kb。如圖3所示，針對(duì)neublastin-衍生多肽產(chǎn)生的抗體還識(shí)別HiB5pUbilzNBN22克隆而不是未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中約13kD的蛋白質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例6)。經(jīng)測(cè)定，未經(jīng)修飾(即未經(jīng)翻譯后修飾)的neublastin多肽NB腸0[SEQIDNO:IO，NBN116[SEQIDNO:ll和NBN113[SEQIDNO:12的推測(cè)分子量分別為14.7kD，12.4kD和12.1kD。方法在0.8%甲醛瓊脂糖凝膠上電泳得自未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞和HiB5pUbilzNBN22克隆的總RNA(10嗎)，將其印跡至尼龍膜(Duralone，Stratagene)上，從而制備出Northern印跡。按實(shí)施例3所述，使印跡與1.3kb"P-標(biāo)記的探針雜交并洗滌，所述探針是通過(guò)隨機(jī)標(biāo)記覆蓋SEQIDNO:8和得自neublastincDNA之5，UTR和3，UTR的另一些核苷酸而制備的。于-80t:，使用增感屏將印跡暴露于HyperfilmMP(Amersham)。在添加有N2補(bǔ)充物(LifeTechnologies;Cat.No.17502-048)的無(wú)血清培養(yǎng)基中將得自HiB5pUbilzNBN22或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基保溫過(guò)夜，濃縮該條件培養(yǎng)基，在15%聚丙烯酰胺凝膠(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.80-1262-01)上進(jìn)行分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF國(guó)膜(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN畫(huà)303F)上，用含有0.1%吐溫20和5%脫脂奶的PBS封閉非-特異性蛋白質(zhì)-結(jié)合位點(diǎn)。將膜與多克隆的neublastin抗體(l:1000)保溫過(guò)夜，接著與抗-兔IgG第二抗體(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.NA934)(l:2000)保溫，所述第二抗體上綴合有辣根過(guò)氧化物酶。根據(jù)廠商說(shuō)明(Amersham),使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN2109)或ECL+(AmershamPharmaciaBiotech;Cat.No.RPN2132)觀察免疫染色。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3。圖3A和3B顯示了經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞中的neublastin蛋白表達(dá)。按上文所述濃縮得自未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞[泳道1，或被neublastincDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HiB5克隆[泳道2的過(guò)夜培養(yǎng)基。然后使用實(shí)施例10中所述的兩個(gè)特異于neublastin的不同多克隆抗體Ab-l和Ab-2,經(jīng)Western印跡分析培養(yǎng)基。在源自經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基中，這兩種抗體都能識(shí)別分子量約為15kDa的蛋白質(zhì)，而在未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)。也可將編碼neublastin的克隆cDNA插入其它真核表達(dá)載體，例如真核表達(dá)載體TEJ-8(Johansen等，F(xiàn)EBSLett.1990，267，289-294)或pcDNA-3(Invitrogen)，將所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至下述任一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，HEK293，COS,PC12或RN33b細(xì)胞系或人神經(jīng)干細(xì)胞系。使用表達(dá)neublastin的穩(wěn)定細(xì)胞系產(chǎn)生neublastin蛋白。在CHO細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒dJC070.14為了在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)NeublastincDNA,將編碼人前Neublastin原形式的cDNA片段插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pEAG347以產(chǎn)生質(zhì)粒pJC070.14。pEAG347含有串聯(lián)的SV40早期和腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(衍生自質(zhì)粒pAD2(3;Norton和Coffin，分子細(xì)胞生物學(xué)，1985,5,281)，唯一的NotI克隆位點(diǎn)，緊接著的是SV40晚期轉(zhuǎn)錄終止子和polyA信號(hào)(得自質(zhì)粒pCMV(5;MacGregor和Caskey，核酸研究，1989，17，2365)。另外，pEAG347含有源自pUC19的質(zhì)粒骨架和源自pSV2dhfr的dhfr供MTX選擇和在經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中擴(kuò)增。分兩步產(chǎn)生質(zhì)粒pJC070.14。首先，用寡核苷酸KD2-8245'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCATGGAACTTGGACTTGGAGG3'[SEQIDNO:31，KD2-8255，TTTTTTCCTTGGCGGCCGCTCAGCCCAGGCAGCCGCAGG3，[SEQIDNO:32和PFU聚合酶，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)從質(zhì)粒pUbilZ-NBN中分離出編碼人前Neublastin原形式的片段。將該片段克隆至pPCR-ScriptAmpSK(+)的Srf-l位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pJC069。在第二步中，對(duì)質(zhì)粒pJC069進(jìn)行部分Not-I消化，產(chǎn)生685bp片段(含有neublastin基因)，將其克隆至質(zhì)粒pEAG347的Not-I位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pJC070.14。質(zhì)粒pJC070.14中的neublastin基因轉(zhuǎn)錄受腺病毒主要晚期啟動(dòng)子的控制。產(chǎn)生表達(dá)neublastin的CHO細(xì)胞系通過(guò)用限制性內(nèi)切核酸酶Mlu-I消化使200微克pJC070.14線性化。用笨酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取DNA，并用乙醇沉淀。將線性化的DNA重新懸浮于20mMHepespH7.05,137mMNaCl，5mMKC1，0.7mMNa2HP04，6mM葡萄糖(HEBS)中，通過(guò)電穿孔(280V和960pF)導(dǎo)入4E7CHOdukxBl(dhfr)細(xì)胞(p23)。電穿孔之后，將細(xì)胞返回添加有10。/o胎牛血清(FBS)的oc十經(jīng)改良的Eagle氏培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)2天。然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新鋪于100mm平m(100，000個(gè)細(xì)胞/亞)內(nèi)的a-MEM(缺乏核糖和脫氧核糖核苷)中培養(yǎng)5天，所述培養(yǎng)基中添加有10%經(jīng)透析的FBS。隨后，以100，000個(gè)細(xì)胞/100mm平皿的密度使細(xì)胞分開(kāi)，并在200nM氨甲蝶呤中選擇。挑選抗性集落，刮至6孔培養(yǎng)板；使用下文所述的專(zhuān)用于neublastin的試驗(yàn)篩選得自各個(gè)克隆的條件培養(yǎng)基。將neublastin表達(dá)水平最高的12個(gè)克隆刮至T162培養(yǎng)瓶中，隨后再進(jìn)行分析。如圖10所示，CHO細(xì)胞系產(chǎn)生25至50ng/mlneublastin。neublastin的三元復(fù)合物試驗(yàn)我們使用Sanicola等(ProcNatlAcadSciUSA1997946238)所述的三元復(fù)合物試驗(yàn)的經(jīng)改良形式分析CHO細(xì)胞系培養(yǎng)物的上清液中是否存在neublastin。在此試驗(yàn)中，可評(píng)價(jià)GDNF-樣分子介導(dǎo)RET之胞外結(jié)構(gòu)域與多個(gè)共同-受體，GFRal，GFRa2和GFRa3之間的結(jié)合的能力。RET的可溶性形式和共同受體以融合蛋白的形式產(chǎn)生。已有人描述了大鼠RET之胞外結(jié)構(gòu)域和胎盤(pán)堿性磷酸酶(RET-AP)之間的融合蛋白，以及大鼠GFRal(W09744356;1997年11月27曰，列入本文作為參考)的胞外結(jié)構(gòu)域和人IgGl(rGFRal-Ig)之Fc結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白(Sanicola等，ProcNatlAcadSciUSA1997946238)。為了產(chǎn)生鼠GFRa3之胞外結(jié)構(gòu)域和人IgGl(mGFRa3-Ig)之Fc結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白，將編碼鼠RETL3之氨基酸1-359的DNA片段與含有人IgGl之Fc結(jié)構(gòu)域的片段連接，克隆至表達(dá)載體pEAG347以產(chǎn)生質(zhì)粒pGJ144。將質(zhì)粒pGJ144轉(zhuǎn)染至中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，產(chǎn)生能生產(chǎn)融合蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系，使用標(biāo)準(zhǔn)方法在A蛋白Sepharose免疫親和柱上純化該融合蛋白。簡(jiǎn)而言之，如果GDNF-樣分子能在此試驗(yàn)中介導(dǎo)共同受體與RET的結(jié)合，那么，RET-AP融合蛋白可保留在平板上，使用堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物可測(cè)定保留量。用含有l(wèi)叫/ml特異于人Fc的山羊抗體的50mM碳酸氫鹽/碳酸鹽，pH9.6將DynexMicrolite-1ELISA板(DynexTechnologies)包被16小時(shí)。將ELISA板清空，加入300^1含有1%I-block(Tropix)的TBS/0.5%吐溫-20(TBST)放置1小時(shí)。用TBST洗滌3次之后，在孔中加入lOO^il用條件培養(yǎng)基稀釋過(guò)的lug/mlrGFRal-Ig或mGFRa3-Ig,所述條件培養(yǎng)基得自表達(dá)RET-AP融合基因的293EBNA細(xì)胞。然后在豎行孔的上孔中加入lO(Hil得自CHOneublastin克隆的條件培養(yǎng)基，每排孔往下進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋?zhuān)覝叵卤?.5小時(shí)。然后用TBST將ELISA板洗滌3次，用200mMTrispH9.8，10mMMgCl2(CSPD緩沖液)洗滌2次。然后用含有425nMCSPD(Tropix)和lmg/mlSapphire化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Tropix)的CSPD緩沖液替代洗滌溶液，室溫下保溫30分鐘。使用Dynatech發(fā)光計(jì)測(cè)定化學(xué)發(fā)光輸出量。在最初的實(shí)驗(yàn)中，我們研究了CHO細(xì)胞系所產(chǎn)生的neublastin是否能介導(dǎo)GFRal或GFRa3與RET之胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。如圖11所示，當(dāng)包括mGFRa3-Ig融合蛋白時(shí)，得自CHO細(xì)胞克隆#53的條件培養(yǎng)基在三元復(fù)合物試驗(yàn)中產(chǎn)生了強(qiáng)烈信號(hào)，但是，當(dāng)包括rGFRal-Ig融合蛋白時(shí)未觀察到信號(hào)，這表明neublastin與GFRa3而不是GFRal結(jié)合。這一行為將neublastin與GDNF清楚地區(qū)分開(kāi)來(lái)；如圖11所示，GDNF結(jié)合GFRal而不是GFRa3。當(dāng)檢測(cè)得自胎盤(pán)CHO細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基或純粹的培養(yǎng)基時(shí)，用任一種共同受體融合蛋白都未觀察到信號(hào)。為了定量CHO細(xì)胞系中的neublastin表達(dá)水平，使用rGFRal-Ig和濃度始于lng/ml的GDNF繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同CHO細(xì)胞系的neublastin濃度；由5個(gè)CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的水平示于圖10。由于這一估計(jì)的根據(jù)是未經(jīng)測(cè)試的假設(shè)，即GDNF和GFRal之間的結(jié)合親和性類(lèi)似于neublastin和GFRa3之間的結(jié)合親和性，因此這些水平僅是大致的數(shù)值。分析得自CHO細(xì)胞系上清液的neublastin為了進(jìn)一步分析由CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的neublastin,使用GFRot3-Ig融合蛋白從培養(yǎng)基中提取蛋白質(zhì)，并通過(guò)用針對(duì)neublastin肽的多克隆抗體進(jìn)行Western印跡以分析這些蛋白質(zhì)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用結(jié)合于Sepharose珠上的mGFRa3-Ig提取neublastin。使用廠商(Pharmacia公司)建議的條件使mGFRa3-Ig與Sepharose珠結(jié)合。在l.Oml得自陰性對(duì)照CHO細(xì)胞系或得自生產(chǎn)neublastin的CHO細(xì)胞系#16的條件培養(yǎng)基樣品中加入lOOplmGFRa3-Ig-Sepharose。在搖動(dòng)的平臺(tái)上將懸浮液保溫2小時(shí)，離心各懸浮液，除去上清液，然后用1.0ml10mMHEPES，100mMNaCl，pH7.5洗滌3次。將各樹(shù)脂重新懸浮于lOOpl2x還原樣品緩沖液中，加熱至100r達(dá)5分鐘。將20W樣品緩沖液上清液和10pl分子量標(biāo)準(zhǔn)(FMC)上樣于10-20%SDS-PAGE預(yù)制凝膠(OwlScientific)的各孔中。以40mA的恒電流電泳凝膠72分鐘。為了進(jìn)行Western印跡分析，在HoferScientific裝置中，在10mMCAPS,10%甲醇，0.05%SDS，pH11.2的緩沖液系統(tǒng)內(nèi)將蛋白質(zhì)電印跡至硝酸纖維素濾膜(Schleicher和Schuell)(400mA恒電流，45分鐘)。轉(zhuǎn)移之后，從盒中取出硝酸纖維素濾膜，通過(guò)用含有0.1%PonceauS的1%醋酸溶液染色60秒以用肉眼觀察分子量標(biāo)記。將膜切成兩節(jié)，通過(guò)在蒸餾水中輕輕攪動(dòng)以除去過(guò)量的染料。4X:，用含有2%脫脂奶的TBS將膜封閉過(guò)夜。將兩片膜各與兩個(gè)經(jīng)親和純化的抗-neublastin肽抗體(R30和R31)保溫，所述抗體的濃度為1.0ng/ml，并且溶于含2%脫脂奶的TBS中。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次10分鐘，然后與經(jīng)1:5000稀釋的山羊抗-兔IgG-HRP綴合物(Biorad)保溫30分鐘。用TBS-吐溫將膜洗滌3次，每次10分鐘，用ECL底物(Amersham)顯色。如圖12所示，相對(duì)于用上述兩種抗體在提取自陰性對(duì)照細(xì)胞系的蛋白質(zhì)中所觀察到的帶(泳道1和3)而言，在提取自生產(chǎn)neublastin的CHO細(xì)胞系的蛋白質(zhì)中檢測(cè)到特異性的帶(泳道2和4)。較低的帶的分子量約為13kD，可能表示neublastin的成熟結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是在裂解原-結(jié)構(gòu)域之后產(chǎn)生的。所述裂解可以在前neublastin原蛋白的3個(gè)Arg-—(如-RXXR氺-)殘基中的任一個(gè)之后發(fā)生，從而分別產(chǎn)生SEQIDNO:IO，11或12所示的140AA，116AA或113AA形式。經(jīng)測(cè)定，未經(jīng)修飾(即未經(jīng)翻譯后修飾)的neublastin多肽NBN140[SEQIDNO:IO，NBN116[SEQIDNO:ll和NBN113[SEQIDNO:12的推測(cè)分子量分別為14.7kD，12.4kD和12.1kD.需要進(jìn)一步的分析以證實(shí)這些帶的結(jié)構(gòu)以及其它neublastin特異性帶。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用ELISA板所捕獲的hGFRa3-Ig提取neublastin'為了產(chǎn)生人GFRcc3(W097/44356;1997年11月27日，列入本文作為參考)的胞外結(jié)構(gòu)域和人IgGl(hGFRct3-Ig)之Fc結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白，將編碼人GFRa3之氨基酸1-364的DNA片段與含有人IgGl之Fc結(jié)構(gòu)域的片段連接，克隆至表達(dá)載體CH269(Sanicola等，ProcNatlAcadSciUSA1997946238)。由此質(zhì)粒編碼的融合蛋白在293-Epstdn-Barr病毒所編碼的核抗原(EBNA)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，使用標(biāo)準(zhǔn)方法在A蛋白Sepharose免疫親和柱上純化該融合蛋白。4"，用含有25mg/ml山羊抗人IgG(Fcy片段特異性的；JacksonImmimulogics)的PBS(300ml/孔)將96孔培養(yǎng)板的6個(gè)孔包被過(guò)夜。室溫下，用400ml含1%BSA的PBS將孔封閉1小時(shí)。用PBST(PBS+0.05。/o吐溫20)洗滌3次，在每孔中加入300mlhGFRa3-Ig(10mg/ml，溶于含0.1%BSA的PBS中)。室溫下將培養(yǎng)板保溫1小時(shí)，輕輕振蕩(每分鐘振蕩200下)以進(jìn)行最大程度的結(jié)合。然后清空孔，用PBST再洗滌3次。在3個(gè)孔中各自加入250ml得自陰性對(duì)照CHO細(xì)胞系或得自生產(chǎn)neublastin的CHO細(xì)胞系#25的條件培養(yǎng)基。室溫下將培養(yǎng)板保溫3小時(shí)，輕輕振蕩(每分鐘振蕩300下)，用PBST將孔再洗滌2次。在第一個(gè)孔中加入25ml非-還原性的Laemli上樣緩沖液，將培養(yǎng)板快速振蕩5分鐘以洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)(每分鐘振蕩1300下)。將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至下一個(gè)孔中，重復(fù)上述方法以洗脫第二和第三個(gè)孔中結(jié)合的蛋白質(zhì)。加入b-巰基乙醇(終濃度為5%)之后，將樣品煮沸5分鐘，在10-20%聚丙埽酰胺凝膠上通過(guò)SDS-PAGE分析樣品。為了進(jìn)行Western印跡，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。用含有5%脫脂奶的PBST封閉和探測(cè)膜，并用PBST洗滌膜。與針對(duì)兩個(gè)neublastin肽產(chǎn)生的多克隆抗體(R30和R31)(lug/ml)反應(yīng)，接著與HRP-綴合的山羊抗兔抗體(BioRad)反應(yīng)之后，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)neublastin。如圖13所示，在提取自生產(chǎn)neublastin的CHO細(xì)胞系的蛋白質(zhì)中檢測(cè)到5條neublastin特異性帶(泳道2)。較下方的兩條帶與在圖12中所觀察到的帶非常相似；較下方的帶可能也表示neublastin的成熟結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是在裂解原-結(jié)構(gòu)域之后產(chǎn)生的。隨后，對(duì)圖13中的帶進(jìn)行分析(數(shù)據(jù)未顯示)，結(jié)果表明用PGNaseF使約為18kD的帶去糖基化后，該帶的大小等同于圖13凝膠中最下方的那條帶。這表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可產(chǎn)生糖基化形式的neublastin蛋白。在大腸桿菌中表達(dá)neublastin為了在大腸桿菌中表達(dá)neublastin基因，用較低的GC含量和偏好的大腸桿菌密碼子構(gòu)建合成基因。將合成基因克隆至兩個(gè)載體pET19b和pMJB164(pET19b的衍生物)。pET19b的構(gòu)建示于圖14。在此構(gòu)建體中，編碼neublastin之成熟結(jié)構(gòu)域(NBN113)的序列直接與起始甲硫氨酸融合。pMJB164的構(gòu)建示于圖15。在此構(gòu)建體中，neublastin的成熟結(jié)構(gòu)域與被腸激酶裂解位點(diǎn)分開(kāi)的組氨酸標(biāo)記(即10個(gè)組氨酸)融合。組氨酸標(biāo)記的前面是起始甲硫氨酸。編碼圖14中的neublastin的核苷酸序列ATGGCTGGAGGACCGGGATCTCGTGCTCGTGCAGCAGGAGCACGTGGCTGTCGTCTGCGTTCTCAACTAGTGCCGGTGCGTGCACTCGGACTGGGACACCGTTCCGACGAACTAGTACGT7TTCGIIHIGTTCAGGATCTTGTCGTCGTGCACGTTCTCCGGGATCTAGACCTGTATCTCAACC丌GTTGTAGACCTACTAGATACGAAGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG[SEQIDNO:29〗編碼圖15中的his-標(biāo)記的neublastin的核苷酸序列CGTTCCGACGAACTAGTACGTTTTCG7TTTTG丌CAGGATCTTGTCGTCGTGCACGCAGTATCTTTCATGGACGTAAACTCTACATGGAGAACCGTAGATAGACTATCTGCAACCGCATGTGGCTGTCTAGGATGATAATAG[SEQIDNO:30實(shí)施例6:neublastin對(duì)大鼠胚胎多巴胺能神經(jīng)元的存活和ChAT活性的影響在此實(shí)驗(yàn)系列中，評(píng)估了得自上文所述的生產(chǎn)neublastin的pUbilzNBN22細(xì)胞的條件培養(yǎng)基所發(fā)揮的作用。制備培養(yǎng)物:在冷的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)中，解剖得到大鼠E14胚胎的前側(cè)中腦或脊髓。于37X:，在含有經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的0.1%胰蛋白酶(Worthington)和0.05%DNA酶(Sigma)的HBSS中將組織塊保溫20分鐘。然后用HBSS+0.05%DNA酶將組織塊沖洗4次，使用lml自動(dòng)移液管解離。將懸浮液以600卬m離心5分鐘，將沉淀物重新懸浮于血清條件培養(yǎng)基(SCM;含10%胎牛血清的DMEM)中。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染料排除法評(píng)估細(xì)胞總數(shù)，以100,000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度鋪于用聚-L-賴氨酸包被的8孔槽載玻片(Nimc)上，評(píng)估多巴胺能神經(jīng)元的存活；或者以200,000個(gè)細(xì)胞/112的密度鋪于48孔培養(yǎng)板(Nimc)上以測(cè)定ChAT活性。于37匸，在SCM中，在5%C02/95%02和95%濕度的氛圍下將細(xì)胞保溫24至48小時(shí)，然后用添加有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)更換原培養(yǎng)基。將評(píng)估多巴胺能神經(jīng)元存活所用的細(xì)胞在SFM+營(yíng)養(yǎng)因子中放置5天，然后用4%PFA固定5分鐘，通過(guò)免疫組化染色酪氨酸羥化酶。將測(cè)定ChAT活性的細(xì)胞在SFM中放置3天，然后用HBSS+0.1%TritonX-100裂解，立即在干冰中冷凍直至測(cè)定ChAT活性。加入營(yíng)養(yǎng)因子由未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5對(duì)照或生產(chǎn)neublastin(ffiB5pUbilzNBN22)或GDNF(HiB5pUbilzGDNF-L17)的HiB5收集條件培養(yǎng)基。通過(guò)對(duì)收集自細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行GDNF-ELISA測(cè)定，證實(shí)HiB5pUbilzNBN22產(chǎn)生約20ng的GDNF/24小時(shí)/105個(gè)細(xì)胞。將各個(gè)細(xì)胞系與DMEM+1%FCS保溫過(guò)夜，取出上清液，儲(chǔ)存于-20X:待用。當(dāng)加入細(xì)胞中時(shí)，用SFM將上清液稀釋50倍。用扭85對(duì)照上清液(1:50)+純化的重組大鼠GDNF(0.03-10ng/ml)處理各個(gè)孔。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4。如上文實(shí)施例5.1所述，圖4A-4C顯示出HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞分泌的neublastin在無(wú)血清培養(yǎng)基中對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的大鼠胚胎神經(jīng)元，多巴胺能神經(jīng)元，前側(cè)中腦神經(jīng)元存活的影響和對(duì)膽堿能顱神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的ChAT活性的影響。圖4A闡明了重組GDNF對(duì)ChAT活性(dpm/小時(shí))之影響的劑量-反應(yīng)曲線，所述活性是于DIV5在無(wú)血清培養(yǎng)物中測(cè)定的，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側(cè)中腦建立的[即HiB5;GDNF0.03ng/ml;GDNFO.lng/ml;GDNF0.3ng/ml;GDNFlng/ml;GDNF10ng/ml;GDNF100ng/ml。圖4B闡明了于DIV5在無(wú)血清培養(yǎng)物中測(cè)定的ChAT活性(dpm/小時(shí))，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側(cè)中腦建立的。如圖中所示，加入了經(jīng)稀釋的得自生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞(neublastin)或生產(chǎn)GDNF的HiB5GDNF-L17(GDNFL-17)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基[即neublastin1:10;眼blastin1:50;GDNFL-171:50。圖4C闡明了于DIV7在無(wú)血清培養(yǎng)物中測(cè)定的每孔中的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目[TH+細(xì)胞數(shù)目/孔]，所述培養(yǎng)物最初是由E14前側(cè)中腦建立的。如圖中所示，加入了經(jīng)稀釋的得自未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞(HiB5)或生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞(neublastin)的條件培養(yǎng)基，或多種濃度的重組GDNF[即HiB51:10;HiB51:40;GDNFO.lng/ml;GDNF10ng/ml;GDNF100ng/ml和neublastin1:40。與相同和較低稀釋度(I:IO和l:40)的對(duì)照(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的)HiB5細(xì)胞相比，按1:40稀釋的得自經(jīng)neublastin轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能顯著增加每孔中的TH免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目(例見(jiàn)圖4B)。TH-免疫反應(yīng)細(xì)胞的增加與GDNF濃度最大(10ng/ml)時(shí)觀察到的增加差不多。這表明分泌至培養(yǎng)基中的neublastin對(duì)得自大鼠胚胎前側(cè)中腦的多巴胺能神經(jīng)元群體的存活有影響。相反，與經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞分泌的GDNF不同的是，得自經(jīng)neublastin轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)相同培養(yǎng)物中的另一個(gè)神經(jīng)元群體，即膽堿能神經(jīng)元沒(méi)有影響(例見(jiàn)圖4A)。實(shí)施例7:neublastin對(duì)豬胚胎多巴胺能前側(cè)中腦神經(jīng)元的薄切片培養(yǎng)物存活的影響在此實(shí)驗(yàn)中，研究了共培養(yǎng)的生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞對(duì)豬胚胎前側(cè)中腦之薄切片培養(yǎng)物的影響。制備培養(yǎng)物:在無(wú)菌條件下由豬胚胎(E28;n-12)分離前側(cè)中腦(VM)，切成400[im的薄切片，置于冷的含葡萄糖(6.5mg/ml)的Gey氏平衡鹽溶液(GIBCO)。通過(guò)界面培養(yǎng)法培養(yǎng)組織切片，所述方法最初是由Stoppini等[L.Stoppini，P.A.Buchs，D.Muller，神經(jīng)科學(xué)方法雜志，1991，37，173-1821發(fā)展起來(lái)的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將組織切片置于半透膜(Millipore，0.3fim;對(duì)應(yīng)于一個(gè)VM，每張膜上放8個(gè)切片)上，將膜插入6孔板(Costar)中的含血清培養(yǎng)基(GibcoBRL)中。每孔含有l(wèi)ml培養(yǎng)基(50%Optimem，25%馬血清，25%Hank氏平衡鹽溶液(都得自GIBCO))，其中添加有終濃度為25mM的D-葡萄糖。第0天，在每個(gè)組織切片上接種7000個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5pUbilzNBN22(neublastin)或7000個(gè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞(對(duì)照)。首先在33"的溫箱中共培養(yǎng)48小時(shí)，使得因具有溫度敏感型癌基因而無(wú)限增殖化的HiB5細(xì)胞得以增殖，然后轉(zhuǎn)移至37C的溫箱使HiB5細(xì)胞分化。每周換2次培養(yǎng)基。在任何階段都不使用抗有絲分裂劑和抗生素。通過(guò)HPLC測(cè)定多巴胺:在體外第12和21天，收集培養(yǎng)基，使用具有電化學(xué)檢測(cè)的HPLC分析多巴胺(W.N.Slooth，J.B.P.Gramsbergen，神經(jīng)科學(xué)方法雜志，1995，60，141-49)。組織處理和免疫組化:在第21天，在含4%低聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中將培養(yǎng)物固定60分鐘。在20%蔗糖溶液中脫水24小時(shí)，冷凍，在低溫恒溫器上切下20nm的切片(4個(gè)系列)，將切片置于包被有明膠的顯微鏡載玻片上。對(duì)一個(gè)切片系列中的酪氨酸羥化酶(TH)進(jìn)行免疫染色。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用含有1%TritonX-lOO的0.05MTris-緩沖鹽水(TBS，pH7，4)將切片洗滌3x15分鐘，并與含有10。/o胎牛血清(FBS，LifeTeclmologies)的TBS保溫30分鐘。然后于4"C將組織與用含10%FBS的TBS稀釋600倍的小鼠抗TH單克隆抗體(BoehringerMannheim)保溫24小時(shí)。用含1%TritonX-100的TBS洗滌3x15分鐘之后，將切片與用含10%FBS的TBS稀釋200倍的生物素化抗小鼠IgG抗體(Amersham)保溫60分鐘。然后用含1%TritonX-100的TBS洗滌切片(3xl5分鐘)，并與用含10%FBS的TBS稀釋200倍的鏈霉抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(Dako)保溫60分鐘。用TBS洗滌(3xl5分鐘)之后，通過(guò)用含有0.05%3，3-二氨基聯(lián)笨胺(Sigma)和0.01%11202的TBS處理以觀察結(jié)合的抗體。最后，用乙醇使切片脫水，用二甲苯清洗切片，并在Eukitt中覆蓋封套。細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)測(cè)量分析:使用亮視野顯微鏡(Olympus)對(duì)免疫反應(yīng)性的TH-ir神經(jīng)元進(jìn)行定量測(cè)定。僅計(jì)數(shù)顯示出強(qiáng)染色的，且細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完好，細(xì)胞核清晰可辨的細(xì)胞。使用x20倍的物鏡對(duì)每4個(gè)培養(yǎng)物切片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行估計(jì)。根據(jù)Abercrombie，s公式(M.Abercrombie，Anat.Rec.194694239-47)，使用TH-ir神經(jīng)元的核平均直徑(6.6土0.2nm，11=30)校正兩次計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目。使用神經(jīng)元示蹤系統(tǒng)(Neurolucida，Micro-BrightField乂>司)估計(jì)核的大小。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖5。圖5A-5C闡明了HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞分泌的neublastin對(duì)與HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞(neublastin)或HiB5細(xì)胞(對(duì)照)共培養(yǎng)的豬胚胎多巴胺能前側(cè)中腦神經(jīng)元之切片培養(yǎng)物的功能和存活的影響。圖5A和圖5B分別闡明了于DIV12[多巴胺(pmol/ml)-第12天和DIV21[多巴胺(pmol/ml)-第21天釋放至培養(yǎng)基中的多巴胺。圖5C闡明了于DIV21,每個(gè)切片培養(yǎng)物中的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目[TH-ir細(xì)胞/培養(yǎng)物。在第12天，HPLC分析表明得自HiB5-neublastin共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基所含有的多巴胺比得自HiB5-C共培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的多巴胺多84%(圖5A)。在第21天，差異是78%(圖5B)，細(xì)胞計(jì)數(shù)表明HiB5-neublastin共培養(yǎng)物含有的酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)神經(jīng)元比HiB5-C共培養(yǎng)物的多66。/。(p〈0.05)(圖5C)。這表明HiB5pUbilzNBN22克隆分泌的neublastin對(duì)豬胚胎多巴胺能神經(jīng)元的存活具有潛在的影響。實(shí)施例8:無(wú)血清培養(yǎng)基中側(cè)根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活本實(shí)施例顯示出neublastin多肽與已知神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相比較的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。通過(guò)頸脫位處死懷孕的雌性小鼠，按下述處理胚胎以進(jìn)行培養(yǎng)。使用經(jīng)電解削尖的鵪針頭，由所示階段的C57/B16小鼠(MollegaardBreeding,Denmark)解剖得到側(cè)根神經(jīng)節(jié)。于37C,將胚胎神經(jīng)節(jié)與含有0.05o/o胰蛋白酶(Gibco/BRL)的無(wú)鉤和鎂的Hanks平衡鹽溶液保溫5分鐘。用膠原酶/分散酶(lmg/ml)將神經(jīng)節(jié)處理30至45分鐘，然后用胰蛋白酶/DNA酶(0.25o/。)處理15分鐘。除去胰蛋白酶溶液之后，用10ml含有10%熱滅活馬血清的DMEM將神經(jīng)節(jié)洗滌1次，用經(jīng)燒邊處理的Pasteur移液管將神經(jīng)節(jié)輕輕搗碎以得到單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞鋪于預(yù)先用聚鳥(niǎo)氨酸(0.5mg/ml，過(guò)夜)和層粘連蛋白(20mg/ml，4小時(shí)；Gibco/BRL)包被的24孔培養(yǎng)板(Nunc)上，于37€，在潮濕的5%C02溫箱內(nèi)的確定培養(yǎng)基中保溫神經(jīng)元，所述培養(yǎng)基由添加有2mM谷氨跣胺，0.35%牛血清白蛋白，60ng/ml孕酮，16mg/ml腐胺，400ng/mlL-甲狀腺素，Mng/ml硒酸鈉，340ng/ml三碘代-甲狀腺原氨酸，60mg/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的HamsF14組成。保溫48小時(shí)之后，在相差光學(xué)顯微鏡下，因神經(jīng)元的兩極形態(tài)而能清楚地識(shí)別該神經(jīng)元。通過(guò)在第48小時(shí)時(shí)計(jì)數(shù)孔中的神經(jīng)元來(lái)評(píng)估神經(jīng)元在缺乏或存在營(yíng)養(yǎng)因子(在接種神經(jīng)元之前加入培養(yǎng)基中，濃度為10ng/ml)時(shí)的存活百分比，或在得自生產(chǎn)neublastin的HiB5pUbilzNBN22細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的存活百分比。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖9，其中O表示對(duì)照實(shí)驗(yàn)(缺乏營(yíng)養(yǎng)因子)；1表示存在GDNF時(shí)的實(shí)驗(yàn)；2表示存在Neurturin時(shí)的實(shí)驗(yàn)；3表示存在本發(fā)明的Neublastin時(shí)的實(shí)驗(yàn)；E12表示對(duì)分離自12天-胚胎的DRG細(xì)胞所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)；E16表示對(duì)分離自16天-胚胎的DRG細(xì)胞所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)；P0表示對(duì)分離自出生當(dāng)天的DRG細(xì)胞所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)；P7表示對(duì)分離自出生后7天的DRG細(xì)胞所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)；和P15表示對(duì)分離自出生后15天的DRG細(xì)胞所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。這些結(jié)果清楚地表明本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子顯示出相當(dāng)于或甚至優(yōu)于已知神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的活性。實(shí)施例9:neublasthi對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的體內(nèi)影響為了檢測(cè)neublasthi是否能夠保護(hù)成熟黑質(zhì)多巴胺(DA)神經(jīng)元免受6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的降解，我們利用了患帕金森氏病的大鼠模型(Sauer和Oertel，神經(jīng)科學(xué)，1994，59，401-415)以及neublastin的慢病毒基因轉(zhuǎn)移。慢病毒的產(chǎn)生:為了產(chǎn)生編碼neublastin的慢病毒轉(zhuǎn)移載體pHR，-neublastin,將得自neublastincDNA的1331bpBamHI片斷亞克隆至pSL301(Invitrogen)的BamHI/Bg111位點(diǎn)。從此構(gòu)建體上切下1519bp的BamHI/Xho1片斷，連接至pHR，的BamHI/XhoI位點(diǎn)，所述pHR，攜有土撥鼠肝炎病毒翻譯后片斷(ZuffereyR，DonelloJE,TronoD，H叩eTJ:土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)元件能增強(qiáng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)；病毒學(xué)雜志，199973(4):2886-2892)。為了產(chǎn)生pHR-GDNF,將得自pUbilz-GDNF的701bpBamHI/XhoI片斷連接至pHR，的BamHI/XhoI位點(diǎn)。Zufferey等人描述了慢病毒載體的產(chǎn)生(ZuffereyR，NagyD，MandelRJ，NaldiniL，TronoD:多重減毒的慢病毒載體能在體內(nèi)進(jìn)行有效的基因傳遞；Nat.Biotechnol，1997，15(9)871-875)。筒單地說(shuō)，用轉(zhuǎn)移構(gòu)建體和輔助質(zhì)粒pR8.91和pMDG共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收集釋放至培養(yǎng)基中的毒粒。為了濃縮病毒，以141000g將培養(yǎng)基離心1.5小時(shí)，并將沉淀物溶解于DMEM中。通過(guò)GFP熒光，測(cè)定出283T細(xì)胞中的攜有綠色熒光蛋白(GFP)基因的對(duì)照的滴度為1()S個(gè)轉(zhuǎn)化單位(TU)/ml。使用RNA狹線印跡技術(shù)(vonSchwedlerU，SongJ，AikenC，TronoD:Vif對(duì)感染細(xì)胞中的人I型免疫缺損病毒原病毒DNA合成至關(guān)重要，病毒學(xué)雜志，1993，67(8)4945-4955)測(cè)定病毒顆粒的滴度。在GDNF上清液和neublastin上清液中，病毒顆粒比GFP上清液中的少10倍外科手術(shù)方案:所有涉及動(dòng)物的工作都按照Lund大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用倫理委員會(huì)所制訂的細(xì)則執(zhí)行。總共使用21只剛成年的雌性Sprague-Dawley大鼠(B&KUniversal,Stockholm,Sweden),在12小時(shí)光照黑暗周期中圏養(yǎng)這些大鼠，圏養(yǎng)過(guò)程中不給大鼠進(jìn)食和喂水。在損害前3周，根據(jù)Sauer和Oertel(Sauer和Oertel，神經(jīng)科學(xué)，1994，59，401-415)所述進(jìn)行逆行標(biāo)記和6-OHDA損害。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在Equithesin麻醉(0.3ml/100g)下，給大鼠兩側(cè)注射0.2jil2%逆行示蹤Fluoro-Gold(FG;Fluorochrome公司，Englewood，CO)溶液(溶解于0.9%NaCl中)。使用2jdHamilton注射器在以下坐標(biāo)處進(jìn)行注射AP=+0.5mm;ML-離前囟門(mén)士3.4mm;DV-離硬腦膜-5.0mm，切齒線被設(shè)置于0.0mm。另外，在抽出針頭之前，以0.05nl/min的速度再注射5分鐘。在FG注射之后14天，動(dòng)物總共接受5個(gè)慢病毒載體沉積物(ln1/沉積物)，所述載體攜有綠色熒光蛋白(GFP),neublastin或GDNF的基因。在下列坐標(biāo)處，沿著兩條針道將4個(gè)沉積物注射至紋狀體AP=+1.0mm，ML=-2'6mm，DV尸-5.0mm，DV2=-4.5mm和AP=0.0mm，ML=-3.7mm，DV產(chǎn)-5.0mm，DV2=-4.5mm。在AP=-5.2mm，ML=-2.0mm，DV尸-6.3mm處將沉積物注射至黑質(zhì)上。切齒線被設(shè)置于-2.3mm。逆行標(biāo)記21天之后，和注射慢病毒7天之后，重新麻醉動(dòng)物，用lOplHamilton注射器將單個(gè)沉積物，即20嗎6-OHDA(Sigma;計(jì)算為游離堿基并溶解于3^1冰冷的添加有0.02%抗壞血酸的鹽水中)注射至與FG沉積物位置相同的右紋狀體。注射速率為lfil/min，在抽出針頭之前再保留3分鐘。組織處理:在注射6-OHDA之后21天，用水合氯醛深度麻醉動(dòng)物，經(jīng)賁門(mén)灌流鹽水(pH7.4;室溫)達(dá)l分鐘，接著灌流200ml冰冷的甲醛溶液(含4%低聚甲醛的O.IM磷酸緩沖液，pH7.4)。解剖取腦，在相同的固定劑中固定3至4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至25%蔗糖/0.1]\1磷酸鹽緩沖液中放置48小時(shí)。在冰冷的切片機(jī)上切下穿過(guò)紋狀體和黑質(zhì)(SN)的5個(gè)40nm切片系列。定量評(píng)估SN中的多巴胺能神經(jīng)元:如前人所述(Sauer和Oertel，神經(jīng)科學(xué)，1994，59，401-415)，通過(guò)不透光的觀察儀評(píng)估SN雙致密層中經(jīng)FG標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目。筒單地說(shuō)，使用了3個(gè)連串切片，這些切片集中于輔助視束的中間末端核水平線周?chē)?MTN;Paxinos和Watson(1997)圖片-5.3)，以40倍的放大倍數(shù)計(jì)數(shù)MTN側(cè)向的所有經(jīng)標(biāo)記/染色的神經(jīng)元(n-6-7/組)。如果FG-標(biāo)記的神經(jīng)元在波長(zhǎng)為330nm的表面照射下能發(fā)出明亮的熒光，顯示出神經(jīng)元分布圖并延伸至少一個(gè)神經(jīng)過(guò)程，即將這些神經(jīng)元包括在內(nèi)。在接受攜有GFP之慢病毒注射的動(dòng)物的受損害的一側(cè)，F(xiàn)G-陽(yáng)性黑質(zhì)神經(jīng)元的數(shù)目降低為完好的一側(cè)的18%。相反，用慢病毒-neublastin注射的動(dòng)物顯示出對(duì)FG-陽(yáng)性黑質(zhì)神經(jīng)元數(shù)目近乎完全的保護(hù)(89%)。這與用慢病毒-GDNF處理的動(dòng)物同樣有效，其中87%逆行標(biāo)記的神經(jīng)元保留在受損的一側(cè)。這表明neublastin對(duì)受損的成年黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元而言是強(qiáng)有力的存活因子，并且象GDNF—樣有效。圖6闡明了慢病毒產(chǎn)生的neublastin對(duì)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的體內(nèi)影響。用Flurogold(FG)逆行標(biāo)記雌性SpragueDawley大鼠的SN雙致密層中的神經(jīng)元，3周后用6-羥基多巴胺(6-OHDA)單次注射右紋狀體。在注射6-OHDA之前1周，如圖所示，使動(dòng)物接受表達(dá)neuWastin[neublastin，GDNF[GDNF或綠色熒光蛋白[GFP的慢病毒載體注射。注射6-OHDA21天之后，測(cè)定紋狀體兩側(cè)經(jīng)FG標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目。圖中顯示出3組動(dòng)物紋狀體的損害(右)側(cè)對(duì)完好(左)側(cè)中經(jīng)FG標(biāo)記的神經(jīng)元的百分比[。/。FG損害/完好I。實(shí)施例10:產(chǎn)生抗體為了制備抗neublastm的抗體，以3周為間隔，用肽1:CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的氨基酸108-124)或肽2:ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸93-107)免疫2只兔子，所述肽與載體蛋白綴合。在第0，3，6和10周用每種肽免疫2只兔子，在第7和11周收集血液。經(jīng)由肽親和柱親和純化第二次采的血液。根據(jù)肽的不同，將抗體稱(chēng)為Ab-l和Ab-2。Western印跡在含有N2添加物(GIBCO)的無(wú)血清培養(yǎng)基中將2乂106個(gè)被neublastincDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞(HiB5pUbilzNBN22)或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HiB5細(xì)胞保溫過(guò)夜。在具有5kDa截留膜(Millipore，Bedford,MA)的小濃縮器上濃縮培養(yǎng)基，在濃縮的樣品中加入5xLaemmli樣品緩沖液，加熱至951C5分鐘，在15%丙烯酰胺凝膠上通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，并轉(zhuǎn)移至PVDF-膜，用含有5%脫脂奶和0.1%吐溫-20的PBS封閉殘留的蛋白質(zhì)-結(jié)合位點(diǎn)。將膜與neublastin抗體(l:1000)保溫過(guò)夜，接著與同辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗兔或抗小鼠IgG第二抗體(l:2000)保溫。根據(jù)廠商(Amersham)說(shuō)明，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光Plus(ECL+)觀察免疫染色。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3和實(shí)施例5。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，我們還針對(duì)下列肽產(chǎn)生了兔多克隆抗體肽R27:GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的氨基酸30-43);肽R28:LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的氨基酸57-70);肽R29:CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的氨基酸74-85);肽R30:LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的氨基酸94-107);和肽R31:STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的氨基酸123-136)。在該組肽中，只有相對(duì)靠近于C末端的肽R30和R31才能識(shí)別Western印跡上的在還原條件下變性的蛋白質(zhì)。序列表<160>33<170>PatentlnVer.2.0<210>1<211>865<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>CDS<222>(120)--(719)<220><221>5'UTR<222>(1)…(119)<220><221>3'UTR<222>(721)..(865)<220><221>sig一肽<222>(120).,(179)<220><221>roat—肽<222>(405)..(719)<220><221>misc一結(jié)構(gòu)<222>(661)..(663)<223>CARBOHYD:在Asn87處的糖基化天冬醜胺<220><221>misc一結(jié)構(gòu)<222>(426).-(623)<223>D工SULFID一Cys8-Cys73二硫橋<220><221>misc—結(jié)構(gòu)<222>(507).(707)<223>DISULFID:Cys35-Cys101二硫橋<220><221>misc一結(jié)構(gòu)<222>(519丁..(713)<223>DISULFID:Cys39-Cys103二硫橋<220:><221>misc一結(jié)構(gòu)<222>(616)..(619)<223>DISULFID:Cys72-Cys72鏈間二疏橋<400>1ctaggagcccatgcccggcctgatctcagcccgaggacagcccctccttgaggtccttcc60tccccaagcccacctgggtgccctctttctccctgaggctccacttggtctctccgcgc119atgcctgccctgtggcccaccctggccgetctggetctgctgageageMetProAlaLeuTrpProThrLeuAlaAlaLeuAlaLeuLeuSerSer—95-90-85-80167gtcgcagaggcctecctgggctecgcgccccgcagecctgccccccgcValAlaGluAlaSerLeuGlySerAlaProArgSerProAlaProArg一75-70-65215GluggcGlycccccgProPro一60cctgtcctggcgProValLieuAlatecSer-55cccProgccAlaggcGlyca>cHisctg—50ccgProgggGly263ggacgcacggcccgctggtgcagtggaagagcceggeggccgcgccgcGlyArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArgAlaArgArgProArgArg一45-40-35311agacacttcteggcccgcgcccccgccgcctgcacccccatetgctctArgHisPheSerAj_aArgAlaProAlaAlaCysThrPro工leCysSer—30—25—20359tecccgegggtccgcgcggcgeggctggggggcegggcagcgcgctegSerProArgValArgAlaAlaArgLeuGlyGlyArgAlaAlaArgSer-15-10-5-l1術(shù)ggcagegggggcgcggggtgccgcctgcgctegcagctggtgccggtgGlySeirGlyGlyAlaGlyCysArgLeuArgSerGinLeuValProVal51015455cgcgcgetcggcctgggccaccgctecgacgagctggtgcgtttccgcArgAlaLeuGlyLeuGlyHisArgSerAspGluLeuValArgPheArg202530503ttctgcaccggctectgcccgcgcgcgcgctctccacacgacetcage551PheCysThrGlySerCysProArgAlaArgSerProHisAspLeuSer354045ctggccageetactgggcgccggggccctgcgaccgcccccgggctecLeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGlyAlaLeuArgProProProGlySer50556065599eggcccgtcagecagccctgctgccgacccacgcgctacgaagcggtcArgProValSerGinProCysCysArgProThrArgTyrGluAlaVal707580647tecSerttcPheatggacMetAsp85gtcsacageaccValAsnSerThrtggTrp90ArgsecThrgtgValgacAspcgcArg95etcIjeutecSer695gccaccgcctgcggctgcctgggctgagggctcgctccagggctttgcagactgAlaThrAlaCysGlyCysLeuGly100105749gacccttacccctcagccag<210>2<211>200<212>PRT<213>Homo<綱>2MetProggtggctcttcctgcctgggaccctcccgcggacgaaggcctcaaagctgagaggcccctagagtcccactagccagcgg809gccggtgggtgatgga865sapiens-95ValGluGlyArgSer-15GlyArgPheAlaLeuTrpAlaGluAlaGlyHis—30ProPro-60ThrAla一45Ser-75ProArgPheSerAlaProArgValSerAlaGlyGly5LieuGly20ArgAlaljeuCys35ThrGlySerAlaSerLeuLeuArgProValSerLeu50SerPheAlaThrMetAsp85AlaCys100Gin70ValGlyProThrLeu-90LeuGlySerValLeuAlaTrpCysSer-40ArgAlaPro-25AlaAlaArg-IOGlyCysArgGlyHisArg25CysProArg40GlyAlaGly55ProCysCysAsnSerThr<210><211><212><213><220>3DNAHomosapiensAlaAlaLeuAlaLeuLeuSer一85AlaSer一55Pro-70ProArgAlaSerProAlaGlyArgAlaAlaCysGlyArgAlaGlyArgThr一20HisLeu一50Pro-65ProSer-80ArgGlyProArgArgPro工leCysSerArg-35GlyArgAlaAlaArgSerIjeu10SerGinLeuValProVal15SerAspGluLeuValArgPheArg30AlaArgSerPro45HisAspLeuSerAlaLeuArgProProProGlySer6065ArgProThr75Trp90ArgThrArgValTyrAspGluAlaVal80Arg95LeuSerCysLeuGly105<221>CDS<222>(7).(717)<220><221><222>5'UTR("..(6)<220><221>3'UTR<222>(718).(861)<220><221>sig_肽<222>(7)"(174)<220><221>mat—肽<222>(298)--(717)<220><221>mat一欣<222>(375)"(717)<220><221>mat一欣<222>(379)"(717)<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223>misc—結(jié)構(gòu)(661)-(663)CARBOHYD:在Asn122處的糖基化天冬跣胺misc—結(jié)構(gòu)(424丁..(621)DISULFID:Cys43-Cys108二硫橋misc—結(jié)構(gòu)(505)..(705)DISUIi!F工D:Cys70-Cys136二硫橋misc一結(jié)構(gòu)(517)..(711)DISULFID:Cys74-Cysl38二疏橋misc—結(jié)構(gòu)(616)..(618)DISULFID:Cysl07-Cys107鏈間二硫橋<400>3gagcccatgcccggcctgateteagcccgaggacagcccetccttgag48MetProGlyLeulieSerAlaArgGlyGinProLeuLeuGlu一95-90-85gtcValcttLeucctProcccPro—80GingccAlaHisctgLeuggtGly-75gccAlaetcLeutttPheetcLeucctPro一70gagGlugetAla96CC3ProcttLeuggtGly—65etcLeutecSergcgAlaGincctPro—60gccAlactgljeutggTrpcccProsecThr一55ctgLeugccAlagetAla144ctgLeugetAla—50ctgljeuctgLeuSerageSergtcVal一45Alag&gGlugccAlatecSerctgLeu一40ggcGlytecSei:gcgAlacccPro192cgcArg—35ageSercctProgccAlacccProcgcArg-30GluggcGlycccProccgProcctPro一25gtcValctgLeugcgAlatecSercccPrx)—20240gccggccacctgccggggggacgcacggcccgctggtgcagtggaagaAlaGlyHisLeuProGlyGlyArgThrAlaArgTrpCysSerGlyArg一15-IO—5288gccAlaeggArgeggArgccgProccgProccgProGincctP;rotctSereggArgcccProgcgAlacccPro10ccgProccgProcctPro336gcaAlacccPro15ProtctSergetAlacttcccPro20cgcArggggGlyGlycgcArggcgAla25gcgAlaeggArggetAlagggGly384ggcccgggcaaccgcgetegggcagcgggggcgeggggctgccgcctgGlyProGlyAsnArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCysArgLeu30354045432cgctegSerca>gGinctggtgVal50ccgProgtgValcgcArggcgAlaetclieu55ggcGlyctgGlycacHiscgcArg60tecSer權(quán)gacgagctggtgcgtttccgcttctgcageggctectgccgccgcgcgAspGJLuLeuValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArgArgAla657075528cgctctccacacgacetcagectggccageetactgggcgccggggccArgSerProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeuL§uGlyAlaGlyAla8085_90576ctgcgaccgcccccgggcteceggcccgtcagecagccctgctgccgaLeuArgProProProGlySerArgProValSerGinProCysCysArg95100105624ccc110ThrcgcArgTyrgaaGlugcgAla115gtcValtecSerttcPheatgMetAsp120gtcValAsnageSersecThrtggTrp125672Arga_ccThrgtgValgacAspcgcArg130etcLeutecSergccAlaAsncccPro135tgcCysggctgcCysctgljeuggcGly140717tgagggctcgctccagggctttgcagactggacccttaccggtggctcttcctgcctggg777accctcccgcagagtcccactagccagcggcctcagccagggacgaaggcctcaaagctg837agaggcccctgccggtgggtgatg861<210>4.<211>237<212>PRT<213>Homosapisns<400>4MetProGlyLeulieSerAlaArg-95-90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40ValArgAlaLeuGlyLeuGlyHisArg5560ArgPheCysSerGlySerCysArgArg7075SerLeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGly8590SerArgProValSerGinProCysCys100105ValSerPheMetAspValAsnSerThr120SerAlaThrAlaCysGlyCysLeuGly135140HisCysProAlaI/euAla—50Trp-65LieuProArg-35SerProPro一20AlaGlyHisArgAlaArgArgProAlaProPro15GlyGly30ProGlyArgSerGinSerAspGluLeuLeu45AlaArgSerAlaLeuArgTrp125Pro110Arg95ThrArgThrPro80ProArgVal<210><211><212><213><220><221><222>10140PRTHomosapiensCARBOHYD(122}<223>糖基化天冬酰胺<400>10ProProProGinProSerAlsSerArgLeuVal50ValArg65HisAspProProTyrGluAspArg130LeuProArg20AlaArgAla35ProValArgPheArgPheSerArgGlyGlyAlaGlyAla_I/eu55CysSer70ProAlaProPro10ArgAlaAla25Ala40GlyGlyArgLeuSerGlyGlyCysArgCysHisArg75LeuSerlieu85GlySerArg100AlaValSer115LeuSerAlaAlaSerLeuLeuGlyAla90ProValSerGinProCys105■PheMetAspValAsnSer120ThrAls135CysGlyCysLeuP;roProAlaProPro15AlaGlyGlyProGly30ArgLeuArgSerGin45ArgSerAspGluLeu60ArgAlaArgSerPro80GlyAlaLeuArgPro95CysArgProThrArg110ThrTrpArgThrVal.125Gly140<210>11<211>116<212>PUT<213>Homosapiens<220><221>CARBOHYD<222>(98)<223>糖基化天冬酰胺<400>11AlaAlaArgAlaGlyGlyProGlySerArgAlaArgAlaAlaGlyAla151015ArgGlyCysArgLeuArgSerGinLeuValProValArgAlaLeuGly202530LeuGlyHisArgSerAspGluLeuValArgPheArgPheCysSerGly354045SerCysArgArgAlaArgSerProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeu505560LeuGlyAlaGlyAlaLeuArgProProProGlySerArgProValSer65707580GinProCysCysArgProThrArgTyrGluAlaValSerPheMetAsp859095ValAsnSerThrTrpArgThrValAspArgLeuSerAlaThrAlaCys100105110GlyCysLeuGly115<210>12<211>113<212>PRT<213>Homosapiens<220><221>CARBOHYD<222>(95)<223>糖基化天冬酰胺<400>12AlaGlyGlyPro1ArgL>euArgSer20ArgSerAspGlu35ArgAlaArgSer50GlyAlaLeuArg65CysArgProThrThrTrpArgThr100Gly<210>13<211>102<212>DNA<213>Homo<400>13sapienscctggccagcctactgggcgccggggccctgcgaccgcccccgggctcccggcccgtcag60ccagccctgctgccgacccacgcgctacgaagcggtctcctt102<210>14<211>220<212>DNA<213>Muriiiaegen.sp.GlySerArgAlaArgAlaAlaGlyAlaArgGlyCys51015GinLeuValProValArgAlaLeuGlyLeuGlyHis2530LeuValArgPheArgPheCysSerGlySerCysArg4045ProHisAspLeuSerLeuAlaSerLeuLeuGlyAla5560ProProProGlySerArgProValSerGinProCys707580ArgTyrGluAlaValSerPheMetAspValAsnSer859095ValAspArgLeuSerAlaThrAlaCysGlyCysLeu105110<400>14ggccaccgctccgacgagctgatacgtttccgcttctgcagcggctcgtgccgccgagca60cgctcccagcacgatctcagtctggccagcctactgggcgctggggccctacggtcgcct120cccgggtcccggccgatcagccagccctgctgccggcccactcgctatgaggccgtctcc180ttcatggacgtgaacagcacctggagaaccgtggaccgcc220<210>15<211>2136<212>DNA<213>Murinaegen.sp.<220><221>CDS<222>(975)-.(1646)<400>15gcggccgcgsattcggcacgagggcgtctcgctgcagcccgcgstctctsctctgcctcc60tggggtcttctagcccccacctagagggacctagcctagccageggggae120cggstccggagggtggagcggccaggtgagccctgaaaggtggggcggggegggggeget180ctgggccccaccccgggatctggtgacgccggggctggaatttgacaccggscggcggcg240ggcaggaggctgctgagggstggagttgggctcggcccccagatgcggcccgcgggctct300gccsgcaax:aagtccctcgggccccagccctcgctgcgactggggcttggagccctgcac360ccaagggcacagaccggctgccaaggcccc5LCttttaSLCtaaaagaggcgctgccaggtg420cacaactctgggcatgatccacttgagcttcccagcsctggtcccaggag480aggcgcctagaaggacacggaccaggacccctttggtatggagtgaacgctgagcatgga540gtggaaggaactcsagttsctsctttctccaaccaccctggtaccttcagccctgaagta600cagagcagaagggtcttagsagacaggaccacagctgtgtgagtctcccccctgaggcct660tagacgatctctgagctceigctgagctttgtttgccceLtctggagaeigtgagccattg4t720tgaccttgtggcatcgcgaaggaacaggtcctgccaagca780tctccatcgcsgctaccgctgctgagttgactctagctactccaacctcctgggtcgett840cgagagactggagtggaaggsggaatacccct站ctcatctttcagtttg900caagctgccgcaggaagagggtggggaaacgggtccacgaaggcttctgatgggagcttc960tggagccgaaagctatggaactgggacttgcagagMetGluLeuGlyLeuAlaGlucctactgcsittgtecProThrAlaL<euSer10101510.cactgcetceggcctaggtggcagteagectggtggccaaccetaget1058HisCysLeuArgProArgTrpGinSerAlaTrpTrpProThrLeuAla152025gttValcta30gccAlactgctgagetgcgtcacagaagettecctggacccaatgLeuLeuSerCysValThrGluAlaSerLeuAspProMet35401106tec45cgcArgSercccgccAlagetAla50cgcgacggtcccArgAspGlyProSer55ccgProgtcValttgLieugcgAlacccPro601154cccacggaccacctgcctgggggacacactgcgcatttgtgcagegaaProThrAspHisLeuProGlyGlyHisThrAlaHisLeuCysSerGlu6570751202agaArga_ccThrctgLeucga_Arg80cccProccgProcctProcsgtctcctGinSerPro85cagGincccProAlacccPro30ccgProccgPro1250cctProggtGlycccPro95gcgAlaetcLieucagGintctSercctPro100cccProgetAlagcgAlaetcLeucgcArg105gggGlygc3AlacgcArg1298gcgAlaAla110cgtArgAlaGlysecThreggArg115ageSerageSercgcArgAlaeggArg120secThr2LC3ThrgsitAspAla1346cgcArg125ggcGlytgcCyscgcArgctgcgcArg130tegSercagGinctglieugtgValccgPro135gtgValageSergcgAlaetcLeuggcGly1401394cta_LeuggcGlyC6LCHisagetecSer145gacAspgagGluctgLeuliecgtArg150ttcPhecgcArgttctgcCysSer155ggcGly1442tegSertgcCyscgcArgcga_Arg160gcaAlacgctecSerca_gGinHis165gatAspetcIjeuagtSerctgLeugccAla170的cSerCt3Leu1490ctgLeuggcGlygetAla175gggGlygccAlaCt3IjeueggArgtegSer180cctProcccProgggGlytecSereggArg185ccgProa_tclieageSer1538cagGincccPro190tgcCystgcCyseggArgcccProactThr195cgcArgGlugccAlagtcVal200tecSerttcPhea~tgMetgacAsp1586gtgVal205SeraccThrtggTrpArg210secThrgtgValAspC￡LCHisetcLieu215tecSergccAlaactThrgccAlatgcCys2201634ggcGly'tgtCysctgggcGlytgaggatgatctatctccaagcctttgcacactagaccca1686tgtgttgccctacctggaacagctccatccgggcctcacta3cc3gg3gcctcaactcagc1746aggatatggaggctgcagagctcaggccccaggccggtgagtgacagacgtcgtcggcat1806gtgaaagatgtcggaaccactgaccaacagtcccaagttgttcatggatc1866ccagctctacaacctcagctcctctgggagaeLtccagaaa1926tggccctctgtcctggggaatgaattttgaagagatatat3tacatata_teicattgtagt1986cgcgttgctggaccsigcctgtgetgaaaceagtcccgtgttceicttgtggaagecgaage2046ccta±ttstttatttatttadtttga站aagtcggcctcc2106ctttagtgagggttaatttgtgatcccggg<210>16<211>224<212>PRT<213>Muriiiaegen*sp.2136<■>16MetGluLeuGlyLeuAla15ProArgLeuSe:rAlaAla50LeuPro65ProProLeuGinGlyThrlieuArg130SerAsp145AlaArgTrpGinSerAla20CysValThrGlu35ArgAspGlyProGlyGlyHisThr70ProGinSerPro85SerProProAla100ArgSerSerArg115SerGinLeuValAlaLeuArgPiroTrpArg210GluLeu工leArg150SerGinHisAsp165ArgSerProPro180ThrArgTyrGlu195ThrValAspHisThrAlaLeuSerHisCysLeuArg.1015ProThrLeuAlaValLeuAlaLeu2530LeuAspProMetSerArgSerPro45ValLeuAlaParoP2r0ThrAspHis60LeuCysSerGluArgThrLeuArg7580AlaProProProProGlyProAla9095ArgGlyAlaArgAlaAlaArgAla105110ThrThrAspAlaArgGlyCysArg125SerAlaLeuGlyLeuGlyHisSer140PheCysSerGlySerCysArgArg155160LeuAlaSerLeuLeuGlyAlaGly170175ArgPro工leSerGinProCysCys185190AlaValSerPheMetAspValAsnSerThr200205LeuSerAlaThrAlaCysGlyCysLeuGly215220GluProTrpTrpAlaSer40SerPro55AlaHisGinProAlaLeuAlaArg120ProVal135PheArgLeuSerGlySer<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>17cctggccagcctactggg18<210><211><212><213>1820DNA人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>18aaggagaccgcttcgtagcg20<210><211><212><213>1917DNA人工序列<220><223>人工序列的描迷PCR引物<400>19atggaacttggacttgg17<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>20tccatcacccaccggc16<210>21<211>18.<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>21ggccaccgctccgacgag18<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>22ggcggtccacggttctccag20<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序歹'1<220><223>人工序列的描述PCR引物<糊>23ccaagcccacctgggtgccctctttctcc29<210>24<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>24catcacccaccggcaggggcctctcag27<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>25gagcccatgcccggcctgatctcagcccgaggaca35<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>26ccctggctgaggccgctggctagtgggactctgc34<210>27<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述雜交<權(quán)>27ncaggtggtccgtggggggcgccaagaccgg31.<210>28<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>28ctaggagcccatgccc16<210>29<211>351<212>DNA<213>Homo<400>29atggctggaggaccgggatctcgtgctcgtgcagcaggagcacgtggctgtcgtctgcgt60tctca^ctagtgccggtgcgtgcactcggactgggacaccgttccgacgaactagtacgt120tttcgtttttgttcaggatcttgtcg仁cgtgcacgttctccgcatgatctstctctagcs180tctctactaggagccggsgcactaagaccgccgccgggatctagacctgtatctcaacct240tgttgtagacctactagstacgssgcagtatctttcatgg300accgtagatagactatctgcaaccgcatgtggctgtctaggatgataata351<210>30<211>414<212>DNA<213>Homosapisns<400>30atgggccatcatC3tcatcatcstcatcatcatcactcgagcggccatatcgacgacgac60gacaaggctggaggaccgggatctcgtgctcgtgcagcaggagcacgtggctgtcgtctg120cgttctcaactagtgccggtgcgtgcactcggactgggacaccgttccgacgaactagta180cgttttcgtttttgttcaggatcttgtcgtcgtgcacgttctccgcatgatctstctcta240gcatctctactaggagccggagcacta^gaccgccgccgggatctsgscctgtatctcaa300ccttgttgtagacctactagatacgaagcsgtatctttcatggacgt3站ctctacatgg360agaaccgtagatagactatctgcaaccgcatgtggctgtctaggatgata414<210>31'<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>31saggaaaaaagcggccgccatggaacttggacttggagg39<210>32<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>32ttttttccttggcggccgctcagcccaggcagccgcagg39<210>33<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>33gagcgagccctcagcc1權(quán)利要求1.分離的Neublastin核酸，所述核酸含有選自下列的序列a)SEQIDNO12的核苷酸序列；b)核酸序列，其含有編碼表達(dá)包含SEQIDNO12的Neublastin多肽或由其衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽的開(kāi)放閱讀框，其中，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽通過(guò)在所述Neublastin多肽的序列中添加、缺失和/或替代少于10.5個(gè)氨基酸或通過(guò)對(duì)該序列中少于10％的殘基進(jìn)行保守替代而衍生自所述Neublastin多肽，其中，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽具有在SEQIDNO12的第16、43、47、80、81、109和111位保守的7個(gè)半胱氨酸殘基；c)核酸，其在高度嚴(yán)緊的溶液雜交條件下能與具有SEQIDNO12核苷酸序列的核酸或其互補(bǔ)鏈特異性雜交，并編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽。2.權(quán)利要求l的核酸，其編碼的多肽包含SEQIDNO:10。3.權(quán)利要求l的核酸，其編碼的多肽包含SEQIDNO:11。4.權(quán)利要求l的核酸，其中所述編碼的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽包含GDNF亞族基序LGLG國(guó)FRxCxGxC國(guó)xxCCRP-SAxxCxC。5.權(quán)利要求l的核酸，所述編碼的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的GDNF亞族成員。6.含有權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)的核酸的表達(dá)載體。7.以權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)的核酸和/或權(quán)利要求6的表達(dá)栽體體外轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。9.權(quán)利要求8的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞和包括酵母細(xì)胞的真菌細(xì)胞。10.權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b和人神經(jīng)干細(xì)胞。11.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽，所述多肽含有由SEQIDNO:12組成的氨基酸序列、或者通過(guò)添加、缺失和/或替代少于10.5個(gè)氨基酸而從該序列衍生的序列、或者通過(guò)對(duì)由SEQIDNO:12組成的氨基酸序列中少于10%的殘基進(jìn)行保守替代而由該序列衍生的序列，或者所述多肽由能夠在高度嚴(yán)緊的溶液雜交條件下與具有SEQIDNO:12的核苷酸序列的核酸或其互補(bǔ)鏈特異性雜交的核酸編碼，其中所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽具有在SEQIDNO:12的第16、43、47、80、81、109和lll位保守的7個(gè)半胱氨酸殘基。12.權(quán)利要求11的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽，其包含GDNF亞族基序LGLG陽(yáng)FRxCxGxC畫(huà)xxCCRP-SAxxCxC。13.權(quán)利要求11的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽，其中所述多肽是GDNF亞族成員。14.權(quán)利要求11的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)多肽，其含有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是糖基化的。16.權(quán)利要求ll的多肽，其中所述多肽由權(quán)利要求1至4之任一項(xiàng)的核酸所編碼。17.制備權(quán)利要求11至16之任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法包括由所述多肽的編碼核酸表達(dá)所述多肽的步驟。18.權(quán)利要求17的方法，所述方法包括在允許生產(chǎn)所述多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有所述Neublastin神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子核酸的細(xì)胞的步驟。19.權(quán)利要求18的方法，其進(jìn)一步包括從所述培養(yǎng)基中回收所述多肽的步驟。20.組合物，其含有權(quán)利要求11-16之任一項(xiàng)的多肽和藥物可接受的載體。21.權(quán)利要求11-16之任一項(xiàng)的多肽在制備藥物中的用途，其中所述藥物用于治療涉及受損傷的和受創(chuàng)傷的神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病。22.權(quán)利要求21的用途，其中所述疾病是外周神經(jīng)的創(chuàng)傷、髓質(zhì)和/或脊髓神經(jīng)的創(chuàng)傷、腦缺血神經(jīng)元損傷、神經(jīng)病及尤其是外周神經(jīng)病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化或任何其他神經(jīng)變性疾病，和與癡呆有關(guān)的記憶損壞。23.生產(chǎn)權(quán)利要求11-16之任一項(xiàng)的Neublastin多肽的方法，所述方法包括(a)將編碼表達(dá)權(quán)利要求11-16之任一項(xiàng)的Neublastin多肽的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞或通過(guò)同源重組將調(diào)節(jié)序列導(dǎo)入細(xì)胞，以使該調(diào)節(jié)序列能調(diào)節(jié)內(nèi)源性Neublastin基因的表達(dá)，從而制備N(xiāo)eublastin生產(chǎn)細(xì)胞；(b)在導(dǎo)致Neublastin多肽表達(dá)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)Neublastin生產(chǎn)細(xì)胞。24.編碼Neublastin多肽的合成基因，所述合成基因包含SEQIDNO:29或30所示序列。25.由下列任一序列構(gòu)成的Neublastin多肽GPGSRARAAGARGC(SEQIDNO:9的AA30-43);LGHRSDELVRFRFC(SEQIDNO:9的AA57-70);CRRARSPHDLSL(SEQIDNO:9的AA74-85);LRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA94-107);STWRTVDRLSATAC(SEQIDNO:9的AA123國(guó)136)。CRPTRYEAVSFMDVNST(SEQIDNO:9的AA108-124);或ALRPPPGSRPVSQPC(SEQIDNO:9的AA93-107)。26.針對(duì)權(quán)利要求25所述任何肽產(chǎn)生的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及neublastin神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多肽，編碼neublastin多肽的核酸和特異性結(jié)合neublastin多肽的抗體，及其制備和使用方法。文檔編號(hào)G01N33/50GK101113450SQ20071013680公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期1999年7月5日優(yōu)先權(quán)日1998年7月6日發(fā)明者C·漢森,N·布洛姆,T·E·約翰森申請(qǐng)人:恩斯吉恩有限公司