專利名稱：一種乳粉蛋白氮含量分析方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測技術，尤其是利用乳粉蛋白質(zhì)測定軟件自動繪制標準曲線進行圖像分析和雙縮脲反應后溶液的顯色相結合而完成的一種乳粉蛋白氮含量分析方法。
背景技術：
目前可行的蛋白質(zhì)測定的方法有多種。既有利用其物理性質(zhì)，如折射率、比重、紫外線吸收等性質(zhì)來推知；也有利用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、福林-酚試劑反應、染料結合反應的方法來計算。
通過測定總氮量，再由總氮量折算蛋白質(zhì)的含量是目前最為基本的和最為常用的檢測方法。其中凱氏定氮法被認為是測定總有機氮的最準確和最簡便的方法之一，其原理為將被測樣品與硫酸和催化劑一起加熱消化時，蛋白質(zhì)分解為氨后與硫酸結合生成硫酸銨，在堿性條件下蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再用鹽酸標準溶液滴定。根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量。從該方法的原理可知，由于在消化時，樣品中部分或全部的非蛋白氮同樣會轉化成銨鹽，使得測定結果較真實值偏高。因此，凱氏定氮法的測定值為樣品中粗蛋白的含量。
正常情況下，乳粉中的非蛋白氮含量在總氮中所占比例是基本穩(wěn)定的，因此，凱氏定氮法的測定結果基本能反映樣品蛋白質(zhì)含量的水平。該方法可用于所有的動植物食品的分析，具有應用范圍廣、靈敏度高、回收率較好等顯著特點，為國內(nèi)外普遍應用。我國乳粉標準GB10765-1997《嬰兒配方奶粉I》、GB10766-1997《嬰兒配方乳粉II、III》、GB10767-1997《嬰兒配方粉及嬰幼兒補充粉通用技術條件》中所規(guī)定的蛋白質(zhì)的測定方法要求采用GB/T5413.1-1997《嬰兒配方食品和乳粉蛋白質(zhì)的測定方法》，所用的方法也是凱氏定氮法。不過一旦樣品中添加了大量非蛋白氮，該方法會顯現(xiàn)出一定的局限性，而且這種方法不僅步驟繁瑣、耗時，更無法在流通環(huán)節(jié)方便、有效地應用。
此外，雙縮脲和酚試劑法等也是常用的方法。雙縮脲法是一種常見的蛋白質(zhì)含量的測定方法，其原理為蛋白質(zhì)的肽鍵在堿性溶液中與二價銅離子形成藍紫色的絡合物，在一定的范圍內(nèi)其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比。利用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量，操作快速簡便、需用儀器設備少、對測定的環(huán)境要求低，但此類方法多是對樣品進行特定化學反應處理后，通過測定澄清后的樣品溶液的吸光度值來計算蛋白質(zhì)含量的。樣品溶液的澄清度直接影響到溶液吸光度值的測定，從而影響到蛋白質(zhì)含量的測定。因此，對于某些樣品(如乳制品)，由于必須經(jīng)過繁瑣而費時的樣品前處理以保證樣品溶液的高度澄清，而嚴重限制了該類方法的適用范圍。
三氯乙酸作為蛋白質(zhì)變性劑可使蛋白質(zhì)構象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水基團，使之聚集沉淀。
本申請的乳粉的蛋白氮含量分析方法是在對乳粉中的蛋白氮含量進行測定時，毋需經(jīng)過繁瑣費時的前處理，且具有高度的自動化程度，本申請內(nèi)容未見他人文章發(fā)表。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，該方法是基于計算機根據(jù)色度學原理，結合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在堿性條件下與雙縮脲試劑形成深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白氮含量高低呈線性相關的方法，再用計算機軟件自動分析獲得樣品色度值，然后計算蛋白氮含量；具體步驟如下步驟1配制顯色反應所用的雙縮脲試劑配制顯色反應所用的雙縮脲試劑的具體過程為(1)配制1～10mol/L的堿性溶液；按m/v濃度配制15～35％的酒石酸鉀鈉溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸餾水中按體積比，堿性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配制雙縮脲試劑，先分別加入步驟(1)中堿性溶液、酒石酸鉀鈉溶液和硫酸銅溶液，混合，后添加蒸餾水，使配制成的雙縮脲試劑總量為堿性溶液體積的100倍定容，其中，酒石酸鉀鈉為穩(wěn)定劑，用于使雙縮脲試劑性狀穩(wěn)定；步驟2分別稱取已知蛋白氮含量的乳粉的6個標樣和1-6個待測樣；步驟3制備標樣與待測樣品的顯色液，具體過程為將所稱取的樣品放入離心管中，加入水和三氯乙酸，使三氯乙酸最終濃度為5％~50％，放置使蛋白充分沉淀，離心后棄去上清液，向離心管中加入四氯化碳和雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置使之穩(wěn)定顯色，移取適量的顯色液體至離心管中離心，其中四氯化碳∶雙縮脲試劑＝1∶15~40；步驟4采集圖像離心后的標樣和試樣各取等量澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像。
步驟5讀取蛋白氮含量，利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息；點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，根據(jù)提示輸入標樣的標號和標樣的蛋白質(zhì)含量；根據(jù)標樣的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白質(zhì)測定軟件自動繪制標準曲線和采集到的待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品蛋白氮的含量。初始參數(shù)確定后點擊“結果”，比較后確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出；所述堿性溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液。
所述配制雙縮脲試劑在蒸餾水中按體積比，堿性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL的比例配制雙縮脲試劑本發(fā)明的有益效果是改良了測定中標準曲線的制備，使本發(fā)明在測定精度、測定時間、測定成本與操作步驟上得以進一步的優(yōu)化；利用普通的辦公用計算機與掃描儀代替了實驗室專用的精密儀器—分光光度計，省去了雙縮脲法中人工繪制標準曲線和計算蛋白質(zhì)含量的步驟，尤其適合乳粉大批量的檢測，自動化程度高，測量精度高，操作快速簡便，需要的儀器設備少，成本低，對測定的環(huán)境條件要求低，無污染。適用于乳粉蛋白氮的快速定量測定。較傳統(tǒng)方法具有明顯的優(yōu)勢。


圖1為利用乳粉蛋白氮測定軟件自動繪制標準曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明的目的是提供一種乳粉蛋白氮含量分析方法，該方法是根據(jù)色度學原理，結合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在堿性條件下與雙縮脲試劑形成深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白氮含量高低呈線性相關的方法，用計算機軟件自動分析獲得樣品色度值，然后計算蛋白氮含量。
以下通過具體的實例對本發(fā)明進行詳細的說明。
實施例1(1)分別配制10M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，25％(m/v)的酒石酸鉀溶液和4％(m/v)的五水硫酸銅溶液。
(2)配制雙縮脲試劑。在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸餾水，再加入上述濃度的10mL氫氧化鉀溶液或氫氧化納溶液和25％的酒石酸鉀鈉溶液20mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30mL，然后添加蒸餾水至1000mL定容，即配制成雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應密封貯存，若有沉淀出現(xiàn)，則應重新配制。
(3)按m/v濃度配制10％三氯乙酸溶液。
(4)制備標準樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為各稱取6種已知蛋白氮含量的乳粉作為標樣，并與待測樣品分別稱取0.1g，置于50mL離心管中。向50mL離心管中加入5mL水和5mL 10％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液。再向離心管中加入1mL四氯化碳和20mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液約15mL液體至離心管中，離心20min(10000r/min)，得到標樣與待測樣品的澄清液。
(5)采集圖像各取離心后的標樣和待測試樣4mL澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像，并將樣品圖片信息保存在計算機中
(6)讀取蛋白氮含量利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息。點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，根據(jù)提示輸入標樣的標號和標樣的蛋白氮含量；根據(jù)標樣的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白氮測定軟件自動繪制標準曲線(如圖1所示的斜線)和采集待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品的蛋白氮含量(如表1所示及如圖1上所示的1#、2#、3#)。初始參數(shù)確定后點擊“結果”，比較后確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出。
表1樣品蛋白氮含量測定結果

實施例2(1)分別配制5M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，15％(m/v)的酒石酸鉀溶液和2％(m/v)的CuSO4·5H2O溶液(2)配制雙縮脲試劑在500mL容量瓶中，先加入400mL蒸餾水，再加入上述濃度的5mL氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液和上述酒石酸鉀鈉溶液10mL，劇烈攪拌下逐滴加入上述CuSO4·5H2O溶液15mL，然后添加蒸餾水至500mL定容，即配制成雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應密封貯存，若有沉淀出現(xiàn)，則應重新配制。
(3)按m/v濃度配制10％三氯乙酸溶液。
(4)制備標準樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為各稱取6種已知蛋白氮含量的乳粉作為標樣，并與待測樣品分別稱取0.05g，置于50mL離心管中。向50mL離心管中加入3mL水和3mL 10％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液。再向離心管中加入0.5mL四氯化碳和10mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液約8～9mL液體至離心管中，離心20min(10000r/min)，得到標樣與待測樣品的澄清液。
其余同實施例1實施例3(1)分別配制10M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液，25％(m/v)的酒石酸鉀溶液和4％(m/v)的無水硫酸銅溶液。
(2)配制雙縮脲試劑。在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸餾水，再加入上述濃度的10mL氫氧化鉀溶液或氫氧化納溶液和25％的酒石酸鉀鈉溶液20mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30mL，然后添加蒸餾水至1000mL定容，即配制成雙縮脲試劑。此試劑可長期使用，但應密封貯存，若有沉淀出現(xiàn)，則應重新配制。
(3)按m/v濃度配制40％三氯乙酸溶液。
(4)制備標準樣品和待測樣品的顯色液，具體過程為各稱取6種已知蛋白氮含量的乳粉作為標樣，并與待測樣品分別稱取0.2g，置于50mL離心管中。向50mL離心管中加入5mL水和5mL 40％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液。再向離心管中加入1mL四氯化碳和40mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液25~35mL液體至離心管中，離心25min(10000r/min)，得到標樣與待測樣品的澄清液。
其余同實施例1最后應該說明的是以上實例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照了上述實例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或者局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.一種乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，該方法是根據(jù)色度學原理，結合三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，不同含量的蛋白氮在堿性條件下與雙縮脲試劑形成深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白氮含量高低呈線性相關的方法，用計算機軟件自動分析獲得樣品色度值，然后計算蛋白氮含量，具體步驟如下步驟1配制顯色反應所用的雙縮脲試劑(1)配制1～10mol/L的堿性溶液；按m/v濃度配制15～35％的酒石酸鉀鈉溶液和2～6％的CuSO4·5H2O溶液；(2)在蒸餾水中按體積比，堿性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝1∶1.5～3∶3～5∶100的比例配制雙縮脲試劑，先分別加入步驟(1)中堿性溶液、酒石酸鉀鈉溶液和硫酸銅溶液，混合，后添加蒸餾水，使配制成的雙縮脲試劑總量為堿性溶液體積的100倍定容，其中，酒石酸鉀鈉為穩(wěn)定劑，用于使雙縮脲試劑性狀穩(wěn)定；步驟2分別稱取已知蛋白質(zhì)含量的乳粉標樣和待測樣；步驟3制備標樣與待測樣品的顯色液將所稱取的樣品放入離心管中，加入水和三氯乙酸，使三氯乙酸最終濃度為5％～50％，放置使蛋白充分沉淀，離心后棄去上清液，向離心管中加入四氯化碳和雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置使之穩(wěn)定顯色，移取適量的顯色液體至離心管中離心；步驟4采集圖像離心后的標樣和試樣各取等量澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像；步驟5讀取蛋白氮含量，利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息；點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，根據(jù)提示輸入標樣的標號和標樣的蛋白質(zhì)含量；根據(jù)標樣的色度值和蛋白氮含量，利用乳粉蛋白質(zhì)測定軟件自動繪制標準曲線和采集待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品蛋白氮的含量，初始參數(shù)確定后點擊“結果”，比較后確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出。
2.根據(jù)權利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述四氯化碳∶雙縮脲試劑＝1∶15～40(v/v)。
3.根據(jù)權利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述堿性溶液為氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液。
4.根據(jù)權利要求1所述乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，所述配制雙縮脲試劑的常用比例是按堿性溶液∶酒石酸鉀鈉溶液∶硫酸銅溶液和雙縮脲試劑總量＝10mL∶20mL∶30mL∶1000mL。
5.一種乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸餾水，再加入10M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液上述濃度的10mL，25％的酒石酸鉀鈉溶液20mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30mL，然后添加蒸餾水至1000mL定容，即配制成雙縮脲試劑；各稱取6種待測樣品0.1g，分別置于50mL離心管中，向50mL離心管中加入5mL水和5mL10％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液。再向離心管中加入1mL四氯化碳和20mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液15mL液體至離心管中，離心20min(10000r/min)，得到待測樣品的澄清液，然后各取離心后的待測試樣4mL澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像，并將樣品圖片信息保存在計算機中，利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息，點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，采集待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品的蛋白氮含量，與標準曲線比較后，確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出。
6.一種乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在500mL容量瓶中，先加入400mL蒸餾水，再加入5M的氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液5mL，和15％(m/v)的酒石酸鉀溶液10mL，劇烈攪拌下逐滴加入2％(m/v)CuSO4·5H2O溶液15mL，然后添加蒸餾水至500mL定容，即配制成雙縮脲試劑；稱取6種待測樣品各0.05g，分別置于50mL離心管中，向50mL離心管中加入3mL水和3mL 10％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液，再向離心管中加入0.5mL四氯化碳和10mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液8～9mL液體至離心管中，離心20min(10000r/min)，得到待測樣品的澄清液；然后各取離心后的待測試樣4mL澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像，并將樣品圖片信息保存在計算機中，利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息，點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，采集待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品的蛋白氮含量，與標準曲線比較后，確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出。
7.一種乳粉蛋白氮含量分析方法，其特征在于，在1000mL容量瓶中，先加入800mL蒸餾水，再加入10M的度的10mL氫氧化鉀溶液或氫氧化納溶液和25％的酒石酸鉀鈉溶液20mL，劇烈攪拌下逐滴加入4％的CuSO4·5H2O溶液約30mL，然后添加蒸餾水至1000mL定容，即配制成雙縮脲試劑，稱取6種待測樣品各0.2g，分別置于50mL離心管中，向50mL離心管中加入5mL水和5mL40％三氯乙酸溶液，靜置10min，離心10min(10000r/min)，棄去上清液，再向離心管中加入1mL四氯化碳和40mL雙縮脲試劑，振蕩使沉淀充分溶解，避免結塊，靜置3分鐘，分別取各樣品的顯色液25～35mL液體至離心管中，離心25min(10000r/min)，得到待測樣品的澄清液；然后各取離心后的待測試樣4mL澄清液體至比色池中，將比色池置于掃描儀上，啟動掃描儀采集圖像，并將樣品圖片信息保存在計算機中，利用計算機系統(tǒng)讀取圖像采集器采集到的原始圖像信息，點擊“檢測”菜單中的“參數(shù)設置”，采集待測樣品的色度值，采用回歸方程計算待測樣品的蛋白氮含量，與標準曲線比較后，確定檢測樣品的蛋白氮含量，并根據(jù)需要打印輸出。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于蛋白質(zhì)檢測技術的一種乳粉蛋白氮含量分析方法。是根據(jù)色度學原理結合三氯乙酸可使蛋白質(zhì)沉淀以及雙縮脲試劑與蛋白質(zhì)形成紫色絡合物，即不同蛋白質(zhì)含量的樣品經(jīng)三氯乙酸使蛋白氮沉淀后，蛋白氮在堿性條件下與雙縮脲試劑形成深淺不同的藍紫色的絡合物，其色度值與蛋白質(zhì)含量高低呈線性相關，用計算機軟件自動分析獲得與通過分光光度計測定吸光度值比較，然后計算蛋白質(zhì)含量。使本發(fā)明利用普通的辦公用計算機與掃描儀代替了實驗室專用的精密儀器一分光光度計，在測定精度、時間、成本與操作步驟上省去了人工繪制標準曲線的步驟，操作快速簡便，需要的儀器設備少，成本低，對測定的環(huán)境條件要求低，無污染尤其適合乳粉大批量的檢測。
文檔編號G01N21/17GK101059447SQ20071009962
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權日2007年5月25日
發(fā)明者侯彩云, 陳婧, 祝曉芳, 牛巍, 孫建平, 石文貞, 傅澤田, 張健 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學