專利名稱：吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光儀器及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生命科學及醫(yī)學檢測領域，更具體涉及一種吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光儀器及檢測方法。
背景技術：
吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物的化學發(fā)光反應不需要催化劑，在有H2O2和NaOH存在下即能發(fā)光，具有許多優(yōu)越性，特別是無須一個催化過程，也不需要增強劑，從而降低了背景發(fā)光，提高了信噪比，干擾作用少，且有很高的發(fā)光效率，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可高達0.05[MayerA，etc.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1994，33(10)1044]。該類化合物作為化學發(fā)光免疫分析(CLIA)的發(fā)光標記物，還具有其它方面的優(yōu)點，如光釋放快速集中、發(fā)光效率高、發(fā)光強度大，易于與蛋白質聯(lián)結且聯(lián)結后光子產(chǎn)率不減少、標記物穩(wěn)定，在2～8℃下可保存數(shù)月之久，因此吖啶酯或吖啶磺酰胺在化學發(fā)光免疫分析中得到了廣泛的應用，是一個非常有效的化學發(fā)光標記物。國外有多種商業(yè)化的CLIA系統(tǒng)使用吖啶酯或吖啶磺酰胺作為其化學發(fā)光標記試劑，如Ciba Coring公司的Magic Lite System和Behring公司的Berilux System，前者用吖啶酯，后者用吖啶磺酰胺作發(fā)光物質標記抗體或抗原，用HNO3與H2O2的混合溶液和NaOH作發(fā)光啟動試劑。
與CLIA相比，毛細管泳電泳化學發(fā)光分析方法有以下幾個方面的優(yōu)點1)只需用發(fā)光標記試劑直接對被分析對象進行衍生，通過分析對象的標記產(chǎn)物間的毛細管電泳性質上的差異實現(xiàn)分離并依次檢測，而無需涉及抗原抗體反應，因而也不用擔心抗原抗體的失活問題。
2)CLIA使用的一種抗原或抗體只能檢測一個分析對象，當體系中有多個目標物需要檢測時，就必須分別進行標記和檢測，操作繁瑣且分析速度慢。而毛細管電泳化學發(fā)光檢測只需用同一個發(fā)光標記物對多個分析對象進行標記即可實現(xiàn)分析對象的依次檢出。方法簡單且分析速度快。
3)毛細管電泳化學發(fā)光分析方法樣品用量少，無需用到昂貴的免疫分析試劑，且一次電泳可以同時檢測多個目標物，分析成本要比CLIA低得多。
從以上的比較可以看出，毛細管電泳化學發(fā)光分析與化學發(fā)光免疫分析相比有明顯的優(yōu)勢，也正是基于此，Michael A.等人償試使用毛細管電泳化學發(fā)光檢測吖啶酯及其標記物并取得了成功(Michael A.，etc..Anal.Chem，1992，84，2758；Michael A.etc.，Journalof Microcolumn Separations，6，(6)545)。但他們設計的檢測體系只能在電泳緩沖液pH＜3時實現(xiàn)對分析對象的檢測，而在可用毛細管電泳分離與檢測的實際樣品中，絕大部份被分析物都要求在pH＞3的情況下才能實現(xiàn)較好的分離，因而Michael A.等人的上述儀器并沒有得到廣泛的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光儀器及檢測方法，該方法結合毛細管電泳的高分離能力和化學發(fā)光的高靈敏度，方法簡單易行，儀器結構簡單，操作方便，成本較低，適用于pH≤11的電泳緩沖體系，可滿足絕大部分分析對象的要求，可用于氨基酸、多肽、蛋白質、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰標記物的分離與檢測。
本發(fā)明的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光儀器，包括毛細管電泳緩沖液儲液池，用以傳送緩沖液的高壓泵，高壓電源，其特征在于所述高壓泵輸出的緩沖液經(jīng)分離毛細管進入接口裝置，所述分離毛細管進樣端設有進樣器接入口，所述接口裝置包括酸化毛細管，所述酸化毛細管的進液端設有酸化反應液注入泵，酸化毛細管的出樣端接入化學發(fā)光檢測池，所述化學發(fā)光檢測池上分別設有發(fā)光底液注入泵和廢液出口，所述化學發(fā)光檢測池正下方放置有用于采集待測物光信號的光電倍增管，所述光電倍增管的輸出端經(jīng)微弱光檢測器與計算機連接；所述高壓電源兩端分別施加于毛細管電泳緩沖液儲液池和酸化毛細管出樣端。
本發(fā)明的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測方法步驟為1)待測物的標記將待測樣品與吖啶酯或吖啶磺酰胺在0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液中室溫避光反應10～20分鐘，所述待測樣品與吖啶酯或吖啶磺酰胺的摩爾比為1∶2～1∶20；所述吖啶酯或吖啶磺酰胺與磷酸緩沖溶液的摩爾比為≤1∶5；2)毛細管電泳分離待測樣品根據(jù)待測樣品的性質選取相應的分離緩沖體系及分離電壓進行毛細管電泳分離；3)分離毛細管流出液的酸化由分離毛細管出樣端的酸化反應液注入泵注入酸化反應液將毛細管流出液酸化至pH＜2，使吖啶酯或吖啶磺酰胺轉化成能夠產(chǎn)生化學發(fā)光的酸式結構；所述酸化反應液為0.04mol/L的硝酸和0.2％的H2O2水溶液按體積比1∶2～2∶1的混合溶液；4)檢測化學發(fā)光酸化后的溶液流入化學檢測池中，由連接檢測池的發(fā)光底液注入泵注入1mol/L的NaOH溶液保持檢測池中溶液pH＞13，由檢測池正下方的光電倍增管記錄化學發(fā)光信號；5)定性與定量通過電泳的保留時間進行待測樣品的定性分析，通過標準加入法或繪制工作曲線的方法進行待測樣品的定量分析。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點是通過自組裝的檢測系統(tǒng)解決了前人報導的毛細管電泳化學發(fā)光檢測系統(tǒng)只能在電泳緩沖液pH值小于3情況下檢測吖啶酯及其標記物的缺點，實現(xiàn)了在各種pH值條件下用毛細管電泳化學發(fā)光檢測吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的目的，從而極大的擴展了其應用范圍。該方法儀器裝置簡單，檢測靈敏度高，可用于氨基酸、多肽、蛋白質、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰標記物的分離與檢測，有望在生命科學及醫(yī)學檢測領域發(fā)揮較大的作用。


圖1為本發(fā)明吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測儀器構造示意圖，其中1高壓電源；2毛細管電泳緩沖液儲液池；3分離毛細管；4酸化毛細管；5酸化反應液注入泵；6發(fā)光底液注入泵；7化學發(fā)光檢測池；8光電倍增管；9微弱光檢測器；10計算機；11廢液池；12接口；13進樣器接入口。
圖2為本發(fā)明吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測接口裝置設計圖，其中17酸化反應液注入口；14發(fā)光底液注入口；15高壓電源接入端；16廢液出口。
圖3為應用本發(fā)明裝置檢測吖啶酯[4-(2-羥琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽]的化學發(fā)光圖。
圖4為應用本發(fā)明裝置檢測吖啶酯[4-(2-羥琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽]的工作曲線。
圖5為應用本發(fā)明裝置檢測丙氨酸與賴氨酸的化學發(fā)光圖，其中a為溶液中過量的AE-NHS的化學發(fā)光信號峰，b為賴氨酸的化學發(fā)光信號峰，c丙氨酸的化學發(fā)光信號峰。
圖6，a為應用本發(fā)明裝置檢測丙氨酸的工作曲線，圖6，b為應用本發(fā)明裝置檢測賴氨酸的工作曲線。
具體實施例方式
具體步驟如以上所述，在步驟4)注入NaOH溶液時同時還可以加入表面活性劑TritonX-100以增強發(fā)光，所述表面活性劑的加入量為發(fā)光底液體積的2％。
該儀器的具體工作原理及流程如下首先是用毛細管電泳系統(tǒng)分離待測樣品，然后在分離毛細管出樣端的酸化反應液注入泵將分離毛細管流出液酸化至指定酸度，毛細管高壓電極一端設在酸化毛細管的出樣端，這樣可以保證被分離樣品在酸化階段不會產(chǎn)生譜帶的展寬。經(jīng)酸化毛細管酸化后的待測樣品流入化學發(fā)光反應池中，與發(fā)光底液注入泵注入的發(fā)光底液反應產(chǎn)生發(fā)光，由放置于發(fā)光池底部的光電倍增管檢測發(fā)光信號并由微弱光檢測系統(tǒng)處理后傳至計算機。
儀器的操作步驟開啟儀器電源，用0.1mol/L NaOH和分離緩沖液分別沖洗分離毛細管10min，同時將酸化反應液注入泵和發(fā)光底液注入泵的流速調至適當位置，進樣，計算機自動記錄發(fā)光信號，計算待測樣品含量。
實施例11、4-(2-羥琥珀酰胺基羰基乙基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽(AE-NHS)的檢測1)電泳條件分離毛細管總長度為550mm，內徑為75μm；運行緩沖液為5mmol/L，pH＝8.0的磷酸緩沖液；新毛細管用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH和水依次沖洗20min活化柱表面，每天開始工作前用0.1mol/L的NaOH和水分別沖洗10min，再用運行緩沖液沖洗5min。運行電壓15kV。分離溫度20℃。進樣電動進樣20s。
2)樣品檢測用1)所述電泳緩沖液配制濃度分別為1.0×10-11mol/L，1.0×10-10mol/L，1.0×10-9mol/L，1.0×10-8mol/L，1.0×10-7mol/L，1.0×10-6mol/L，的AE-NHS標準溶液各1ml，按1)步所述電泳條件進行毛細管電泳分離，控制酸化泵與發(fā)光底液泵的流速為0.5μl/s，微弱光檢測器光電倍增管電壓為950V，記錄發(fā)光信號，以AE-NHS的摩爾濃度值的對數(shù)為橫坐標，以相對發(fā)光強度值的對數(shù)為縱坐標，繪制檢測AE-NHS的工作曲線(如圖4所示)，由圖可求得檢測AE-NHS的線性方程為y＝0.4342x+6.9366(R2＝0.9963)，線性范圍可達五個數(shù)量級，檢測限低至1.05×10-13mol/L。
實施例2丙氨酸與賴氨酸的定性與定量測定1)電泳條件分離毛細管總長度為550mm，內徑為75μm；運行緩沖液為20mmol/L，pH＝5.8的醋酸緩沖液(其中加入體積分數(shù)為28％的乙腈作為添加劑)；新毛細管用1mol/L的HCl、1mol/L的NaOH和水依次沖洗20min活化柱表面，每天開始工作前用0.1mol/L的NaOH和水分別沖洗10min，再用運行緩沖液沖洗5min。運行電壓15kV。分離溫度20℃。進樣電動進樣15s。
2)丙氨酸與賴氨酸標準品的發(fā)光標記分別稱取4.0nmol丙氨酸與賴氨酸與2.0mmol/L的AE-NHS 2μl在98μl濃度為0.05mol/L的磷酸緩沖溶液(pH＝8.0)中室溫避光反應10-20分鐘。
3)樣品定性檢測a.標準物質的保留時間用1)所述電泳緩沖液將2)步標記好的氨基酸稀釋至濃度為1.0×10-8mol/L，按1)步所述電泳條件進行毛細管電泳分離，控制酸化泵與發(fā)光底液泵的流速為0.5μl/s，微弱光檢測器光電倍增管電壓為950V，記錄發(fā)光信號(如圖5所示)圖示兩個發(fā)光信號峰值對應的出峰時間即為兩個標準物質的保留時間。
b.樣品測定按步驟2)所述方法標記待測樣品，按3)a.所述方法檢測待測樣品的保留時間，所測得的保留時間與上述標準物質的保留時間相比，保留時間相同者即判為同一物質。
4)樣品定量檢測a.標準加入法定量用3)所述方法分別標記標準物質與待測樣品，取兩份等體積(V)標記好的待測樣品，往其中一份中加入體積為V標(其中V標＜＜V)濃度為C標的標準物質，分別測定其發(fā)光信號，按以下公式計算未知樣品的濃度CxCx＝Hx·C標/(Hx+標-Hx)Cx-未知樣品的濃度C標-標準物質的濃度Hx-待測樣品發(fā)光信號的峰高Hx+標-加入標準物質后待測樣品的峰高b.工作曲線法定量用3)所述方法標記丙氨酸標準物質，用電泳緩沖液配制濃度分別為1.0×10-11mol/L，1.0×10-10mol/L，1.0×10-9mol/L，1.0×10-8mol/L，1.0×10-7mol/L，1.0×10-6mol/L的丙氨酸標準溶液各1ml，按1)步所述電泳條件進行毛細管電泳分離，控制酸化泵與發(fā)光底液泵的流速為0.5μl/s，微弱光檢測器光電倍增管電壓為950V，記錄發(fā)光信號，以標記丙氨酸標準溶液的摩爾濃度值的對數(shù)為橫坐標，以相對發(fā)光強度值的對數(shù)為縱坐標，繪制檢測丙氨酸的工作曲線(如圖6，b所示)，由圖可求得檢測丙氨酸的線性方程為y＝0.4292x+6.9094(R2＝0.9929)，檢測限為0.87×10-13mol/L。用相同方法標記待測樣品，按1)步所述電泳條件進行毛細管電泳分離，控制酸化泵與發(fā)光底液泵的流速為0.5μl/s，微弱光檢測器光電倍增管電壓為950V，記錄發(fā)光信號強度，代入上述線性方程即可求得待測樣品中丙氨酸的濃度。用同樣方法可以求得測定賴氨酸的工作曲線(如圖6，a所示)，線性方程為y＝0.4511x+7.3048(R2＝0.9919)，檢測限為0.49×10-13mol/L。用同樣方法可求得待測樣品中賴氨酸的濃度。
權利要求
1.一種吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測儀器，包括毛細管電泳緩沖液儲液池，用以傳送緩沖液的高壓泵，高壓電源，其特征在于所述高壓泵輸出的緩沖液經(jīng)分離毛細管進入接口裝置，所述分離毛細管進樣端設有進樣器接入口，所述接口裝置包括酸化毛細管，所述酸化毛細管的進液端設有酸化反應液注入泵，酸化毛細管的出樣端接入化學發(fā)光檢測池，所述化學發(fā)光檢測池上分別設有發(fā)光底液注入泵和廢液出口，所述化學發(fā)光檢測池正下方放置有用于采集待測物光信號的光電倍增管，所述光電倍增管的輸出端經(jīng)微弱光檢測器與計算機連接；所述高壓電源兩端分別施加于毛細管電泳緩沖液儲液池和酸化毛細管出樣端。
2.一種如權利要求1的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)待測物的標記將待測樣品與吖啶酯或吖啶磺酰胺在0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸緩沖溶液中室溫避光反應10～20分鐘，所述待測樣品與吖啶酯或吖啶磺酰胺的摩爾比為1∶2～1∶20；所述吖啶酯或吖啶磺酰胺與磷酸緩沖溶液的摩爾比≤1∶5；2)毛細管電泳分離待測樣品根據(jù)待測樣品的性質選取相應的分離緩沖體系及分離電壓進行毛細管電泳分離；3)分離毛細管流出液的酸化由分離毛細管出樣端的酸化反應液注入泵注入酸化反應液將毛細管流出液酸化至pH＜2，使吖啶酯或吖啶磺酰胺轉化成能夠產(chǎn)生化學發(fā)光的酸式結構；所述酸化反應液為0.04mol/L的硝酸和0.2％的H2O2水溶液按體積比2∶1～1∶2的混合溶液；4)檢測化學發(fā)光酸化后的溶液流入化學檢測池中，由連接檢測池的發(fā)光底液注入泵注入1mol/L的NaOH溶液保持檢測池中溶液pH＞13，由檢測池正下方的光電倍增管記錄化學發(fā)光信號；5)定性與定量通過電泳的保留時間進行待測樣品的定性分析，通過標準加入法或繪制工作曲線的方法進行待測樣品的定量分析。
3.根據(jù)權利要求2的吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測方法，其特征在于所述步驟4)注入NaOH溶液時同時加入表面活性劑Triton X-100以增強發(fā)光，所述表面活性劑的加入量為發(fā)光底液體積的2％。
全文摘要
本發(fā)明提供一種吖啶酯、吖啶磺酰胺及其標記物的毛細管電泳化學發(fā)光檢測儀器及方法，本發(fā)明儀器包括毛細管電泳緩沖液儲液池、高壓泵、高壓電源、分離毛細管進樣器接入口、接口裝置、光電倍增管、微弱光檢測器和計算機，其中接口裝置包括酸化毛細管、酸化反應液注入泵、化學發(fā)光檢測池、發(fā)光底液注入泵；本發(fā)明的檢測方法為待測物的標記；毛細管電泳分離待測樣品；分離毛細管流出液的酸化；檢測化學發(fā)光；定性與定量分析。本發(fā)明的方法簡單易行，儀器結構簡單，操作方便，成本較低，適用于pH≤11的電泳緩沖體系，可滿足絕大部分分析對象的要求，可用于氨基酸、多肽、蛋白質、核酸及其它吖啶酯、吖啶磺酰標記物的分離與檢測。
文檔編號G01N27/447GK101038255SQ200710008800
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權日2007年4月6日
發(fā)明者陳國南, 邱彬, 郭隆華, 姜鷹雁 申請人:福州大學