專利名稱：載玻片沉積小室的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將生物材料沉積到顯微鏡載玻片上。更具體地，本發(fā) 明涉及使用沉積小室(deposition chamber)來將各種材料沉積到顯微 鏡載玻片上的設(shè)備和方法。小室可以是一次性的，或非一次性的即可 再用的，如在本發(fā)明的實(shí)施例中所公開的。
背景技術(shù)：
在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的診斷過程一般首先從患者身上收集生物材料樣 本。樣本可包括但不限于血液、唾液、尿、上皮涂片、精液等。存在 多種從懸浮液中以固定的細(xì)胞或細(xì)胞核的形式將這些樣本沉積在顯微 鏡載玻片上的方法，以便免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光染色或FISH (熒光原位雜交)染色和隨后的顯微分析。沉積方法根據(jù)用途而改變。
例如，涂抹方法可用于在載玻片上沉積血液樣品以用于顯微分析。 涂抹可能需要將一滴幾微升抗凝劑處理的血液放置在載玻片的一端 上，且使用另一個(gè)干凈的載玻片以一個(gè)動作涂抹血液。被正確執(zhí)行后， 涂抹形成了覆蓋大部分載玻片表面的相對均勻的單層血細(xì)胞。然后， 使載玻片在環(huán)境條件下變干燥。干燥過程主要是將細(xì)胞附著到玻璃載 玻片上。制備血液涂片是與使用者密切相關(guān)的一個(gè)過程。涂抹可用于 制備全血載玻片。使該過程自動化的嘗試是極其不成功的。
另一種方法涉及"滴落(dropping)"方法。滴落是由各種來源的 細(xì)胞制備用于FISH分析的固定核的普通方法，這些來源包括羊水、 血液和骨髓吸出物。這些細(xì)胞可以是來自樣品的原發(fā)細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞。
5樣品可懸浮在有機(jī)溶劑中，例如卡諾(Carnoy)固定液(3: 1，甲醇 乙酸)。
固定核懸浮液可從預(yù)定高度(通常為15-20cm)以單滴的形式滴 在玻璃載玻片上。由于液滴在載玻片上撞擊的結(jié)果，懸浮液可按同心 方式擴(kuò)展以覆蓋載玻片的寬度，取決于懸浮液被滴落的高度。然后， 允許溶液揮發(fā)，如果玻璃是干凈的且被適當(dāng)處理，這導(dǎo)致細(xì)胞核附著 到載玻片上。然而，沉積的模式和位置是不可預(yù)測的，且只可部分地 控制所沉積的樣品的數(shù)量。載玻片上細(xì)胞的分布和最后得到的密度通 常是不可預(yù)測的。然而，如果不要求細(xì)胞核的量化和系統(tǒng)化的掃描， 那么這種方法在大多數(shù)情況下是適當(dāng)?shù)摹?br> 為了獲得對沉積模式的更好控制且使樣品沉積過程自動化，開發(fā) 了使用離心力將細(xì)胞或細(xì)胞核放置在載玻片上的方法。通過使用可調(diào) 節(jié)的力在載玻片上放置細(xì)胞的離心法還允許附著一些不能附著到載玻 片表面的樣品類型。設(shè)計(jì)成在專用離心機(jī)中的顯微鏡載玻片上沉積材 料的被稱為細(xì)胞離心機(jī)(Cytospin)的離心裝置由Shandon公司制造 并顯示在圖1中。
細(xì)胞離心機(jī)IO包括小室20，小室20接納載玻片30且可安裝到 保持架/托架40上，如圖1所示。小室的位置設(shè)置成使載玻片稍微傾 斜且樣品懸浮液借助于吸液管60穿過開口或端口 50被裝入(圖2a)。 懸浮液70包含懸浮細(xì)胞75。懸浮細(xì)胞以可通過著名的斯托克(Stoke) 方程的變形預(yù)測的沉淀速度立即開始沉淀。因此，如圖2a所示，包括 細(xì)胞75的初始顆粒在細(xì)胞離心機(jī)小室的底部形成，初始顆粒的尺寸與 裝入小室和開始離心動作之間的時(shí)間成比例。整個(gè)細(xì)胞離心機(jī)組件10 (小室20-載玻片30-保持架40)緊接著置于離心機(jī)中(未顯示)。當(dāng)離 心機(jī)加速且在離心力80的作用下時(shí)，液體70逐漸升高到如圖2b所示 豎直位置。在離心期間，懸浮液對著載玻片30被壓縮且細(xì)胞被壓到載 玻片上，如圖2c所示。然后，當(dāng)離心機(jī)停止時(shí)，細(xì)胞75被留下來附 著到載玻片30上，剩余的浮于上層的懸浮液70流回其在小室20內(nèi)的 原始位置，如圖2d所示。W. J. Hayes在美國專利5，942，129中描述了一種設(shè)備和方法，其 使用離心機(jī)將處理液如固定劑施加到進(jìn)行離心分析的樣本上。該專利 提供了帶有與顯微鏡載玻片接合的安裝凸緣的離心機(jī)樣品小室，以便 樣本材料被離心到載玻片用于檢驗(yàn)。樣品小室具有由流體通道連接的
上部空腔和下部樣本保持部分。樣本保持部分包括下部空腔，下部支 腿從下部空腔向下延伸，以在離心之前保持樣本。與上部空腔連通的 上部中空支腿保持處理液，同時(shí)小室在離心之前處于靜止?fàn)顟B(tài)。離心 機(jī)的啟動使小室傾斜以傾斜上部支腿和下部支腿，以便處理液流入上 部空腔且由離心力保持在其中。離心力同時(shí)使樣本流出下部支腿，穿 過下部空腔并穿過排放口，到達(dá)顯微鏡載玻片。當(dāng)離心機(jī)停止時(shí)，重 力使小室傾斜而回到靜止位置，使處理液通過重力從上部空腔落下穿 過通道并進(jìn)入下部支腿。離心機(jī)的重新啟動使小室再次傾斜以傾斜下 部支腿，且離心力致使處理液流出下部支腿，并穿過排放口以離心施 加到顯微鏡載玻片上的樣本中。
用于在離心力的作用下將固體物質(zhì)放置在載玻片玻璃上的另一裝 置由M.Toya在美國專利4,853,188中提供。該裝置在離心分離器中旋 轉(zhuǎn)。根據(jù)該專利，離心分離器因此通過易于處理的合成樹脂的模壓成 形來整體地形成。形成該裝置的一部分的基板具有彈力，以便與設(shè)置 在保持架上的套環(huán)接合，基板固定在保持架中。
在一種不同方法中，A. E. Lorincz在美國專利6，567，214中描述了 為生物流體和組織樣品中細(xì)胞的現(xiàn)場搜集、染色和觀察設(shè)計(jì)的顯微鏡 載玻片。根據(jù)該專利，載玻片允許在大約數(shù)分鐘內(nèi)現(xiàn)場檢驗(yàn)(point-of care screening)任何生物流體或組織樣品中傳染病原體的存在，其后， 載玻片可被運(yùn)送到中心實(shí)驗(yàn)室用于培養(yǎng)和/或最后的鑒定。
在本說明書中引用的所有參考文獻(xiàn)中所教給的適當(dāng)?shù)母郊踊蚩蛇x 的細(xì)節(jié)、特征、和/或技術(shù)背景，在這里通過引用被并入?？梢岳斫猓?用于將材料樣本沉積到顯微鏡載玻片上的各種現(xiàn)有方法都存在缺陷。 盡管涂片方法常用于臨床血液學(xué)中的細(xì)胞化學(xué)染色和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)， 但是很難使其自動化。對于大多數(shù)普通滴落方法而言，載玻片上細(xì)胞
7的分布和最后得到的密度是不可預(yù)測的。使用以上所描述的細(xì)胞離心
機(jī)技術(shù)，載玻片30上沉積物周圍的上清液(圖2a-2d的70)的初始 沉淀和運(yùn)動可阻礙同質(zhì)層的形成，這是不希望有的。此外，上清液70 的運(yùn)動可從載玻片表面沖走附著不牢固的細(xì)胞。
為了避免細(xì)胞離心機(jī)的不規(guī)則沉淀問題，還有一種Cytobucket 技術(shù)。Cytobucket技術(shù)通常僅僅用于在載玻片上沉積固定細(xì)胞或細(xì)胞 核的研究環(huán)境中(例如，見Krider等人的美國專利5，985，595)。它由 離心載體(centrifuge carrier)組成，離心載體制造成配合特別的通 用離心機(jī)和可再用的小室。使用者選擇的規(guī)則載玻片完成組裝且形成 小室的底部。載體安裝有擺動(Swing-out)式轉(zhuǎn)子。樣品裝入在水平 位置的組件中(小室-載玻片-保持架)，且細(xì)胞懸浮液直接分配在載玻 片上的沉積區(qū)域上。細(xì)胞開始的沉淀模式可反映出在離心作用開始之 前在零參考重力時(shí)細(xì)胞在分配的懸浮液中的分布。如果初始懸浮液分 布通過適當(dāng)?shù)幕旌隙孰S機(jī)分布，則在載玻片上可實(shí)現(xiàn)隨機(jī)的細(xì)胞分 布。當(dāng)組件被加速時(shí)，由于離心力的原因，栽體逐漸旋轉(zhuǎn)成豎直狀。 只要橫向加速度不高，細(xì)胞就通常保持附著到它們最初到達(dá)的地方。 此外，只要載體液體的彎月面不大，那么當(dāng)離心機(jī)減速時(shí)，彎月面不 會攪動和移除細(xì)胞。因此，Cytobucket技術(shù)有可能最佳地沉積細(xì)胞用 于自動掃描；然而，其具有補(bǔ)救的缺陷，如在本發(fā)明的實(shí)施例中進(jìn)一 步描述的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種用于在定制的顯微鏡載玻片上沉積材料的裝置。 該裝置包括沉積小室，其可密封地粘附著到載玻片并從載玻片移去， 且可以是一次性的或可再使用的。該裝置可用在體外診斷檢測環(huán)境下， 且適合于離心作用。
一個(gè)實(shí)施例涉及用于在顯微鏡載玻片上沉積生物樣品(包括細(xì)胞、 細(xì)胞器、細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)材料、混合物)的裝置或設(shè)備。顯微鏡載玻 片具有用于生物樣品的接納區(qū)域。小室具有頂部、中部和底部。底部 具有設(shè)置成在顯微鏡載玻片的接納區(qū)域上配合的覆蓋區(qū)(footprint )。中部可包括截頭多面體，截頭多面體包括四個(gè)平坦表面。頂部具有圓 柱狀開口或端口 ，以允許生物樣品被引入到載玻片表面的所有區(qū)域上 且從載玻片表面的所有區(qū)域吸出。本發(fā)明提供了包括但不限制于用于 封閉和密封口的擋板材料或檔塊材料的裝置，以及包括但不限制于用 于將小室的底部附著到載玻片的粘合劑材料或固定結(jié)構(gòu)上的不同裝 置。
在一個(gè)實(shí)施例中，小室可通過使用粘合劑可拆卸地固定到顯微鏡 載玻片上。在另一實(shí)施例中，小室配備有套筒狀凸緣，套筒狀凸緣被 壓到顯微鏡載玻片的接納區(qū)域上，以可拆卸地將小室密封在栽玻片上。
在一個(gè)實(shí)施例中，小室通過裝配在小室上的外殼被壓到顯微鏡載
玻片上。包封住小室和顯微鏡載玻片的外殼卡入離心桶(centrifuge bucket)中。在另一方面，壓縮板設(shè)置在細(xì)胞沉積小室上，其又由離 心桶中彈簧加載的杠桿手柄操縱。
更具體地， 一個(gè)實(shí)施例涉及一種設(shè)備，其包括小室和封閉結(jié)構(gòu)， 所述小室具有設(shè)置成配合在顯微鏡載玻片上的接納區(qū)域上的覆蓋區(qū)， 所述小室具有頂部、中部和底部，所述小室的所述頂部限定設(shè)置成允 許生物樣品沉積到顯微鏡載玻片表面上的開口 ，所述封閉結(jié)構(gòu)用于封 閉和密封所述開口 。 一個(gè)方面進(jìn)一步涉及用粘合劑材料處理的接納區(qū) 域，所述粘合劑材料使所述小室附著到顯微鏡載玻片上和從其上移去。 另一方面進(jìn)一步包括與所述小室的內(nèi)壁形狀相符且裝配到其上的襯 里；可拆卸地附著到所述小室的開口的襯里頸部；可拆卸地附著到所 述小室的底部邊緣的襯里凸緣部分；與所述小室的外壁形狀相符且裝 配到其上的外殼；以及固定裝置，通過在外殼上施壓以將所述凸緣部 分密封在所述接納區(qū)域上，所述固定裝置將所述小室固定到顯微鏡載 玻片上。
另一實(shí)施例提供了用于在細(xì)胞沉積小室中沉積生物材料的方法。 該方法涉及提供一種具有用于沉積生物樣品的接納區(qū)域的顯微鏡載玻 片，和帶有適合于裝配到接納區(qū)域上的覆蓋區(qū)的細(xì)胞沉積小室。顯微 鏡載玻片用包括疏水性物質(zhì)的化學(xué)背襯層處理。在一個(gè)方面，實(shí)施例提供了具有生物樣品的接納區(qū)域的顯微鏡載 玻片和具有適合于裝配到接納區(qū)域上的覆蓋區(qū)的細(xì)胞沉積小室，所述
小室具有開口 ，以及提供了用化學(xué)背襯層來處理顯微鏡載玻片的方法； 給小室裝配上襯里，所述襯里具有裝配到小室開口上的頸部，以及裝 配到小室底部邊緣上的凸緣；將小室放置到接納區(qū)域上且將小室固定 到顯微鏡載玻片上；將生物材料經(jīng)由沉積小室上的開口引入到顯微鏡 載玻片上；封閉且密封在小室頂部的端口；執(zhí)行生物樣品的體外診斷 檢測；打開端口；以及穿過端口吸出生物樣品的上清液。
在另一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括步驟在吸出上清液之后封 閉且密封在小室頂部的端口；將壓縮板放置到小室上；操縱手柄向壓 縮板施加，以將小室密封到顯微鏡載玻片上的接納區(qū)域上。


圖l是細(xì)胞離心機(jī)裝置的透視圖，其顯示了根據(jù)已有技術(shù)在離心 作用期間用于在載玻片上沉積樣本的小室、載玻片和保持架托架的組 件。
圖2a是圖1的細(xì)胞離心機(jī)的側(cè)視圖，其顯示了根據(jù)已有技術(shù)使樣 品樣本進(jìn)入細(xì)胞離心機(jī)的小室中。
圖2b是根據(jù)已有技術(shù)的圖2a的細(xì)胞離心機(jī)在離心作用期間的側(cè) 視圖。
圖2c是根據(jù)已有技術(shù)的圖2b細(xì)胞離心機(jī)在離心作用期間的側(cè)視 圖，顯示了細(xì)胞從浮于上層液體樣本中分離。
圖2d是圖2c的細(xì)胞離心機(jī)的側(cè)視圖，其顯示了根據(jù)已有技術(shù)在 離心作用下細(xì)胞沉積到載玻片上。
圖3a是根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡栽玻片的頂視圖和側(cè)視圖，所述顯微 鏡載玻片具有用于在體外診斷檢測中放置樣品樣本的正方形接納和封 閉區(qū)域。
圖3b是根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡載玻片的頂視圖和側(cè)視圖，所述顯微 鏡載玻片具有用于在體外診斷檢測中放置樣品樣本的矩形接納和封閉 區(qū)域。
10圖4a是本發(fā)明的實(shí)施例的 一方面的頂視圖和側(cè)視圖，其根據(jù)本發(fā) 明顯示了具有附著到本發(fā)明的顯微鏡載玻片的正方形覆蓋區(qū)的細(xì)胞沉 積小室。
圖4b是本發(fā)明的實(shí)施例的另一方面的頂視圖和側(cè)視圖，其根據(jù)本 發(fā)明顯示了具有附著到本發(fā)明的顯微鏡栽玻片的矩形覆蓋區(qū)的細(xì)胞沉 積小室。
圖5a是圖4a的細(xì)胞沉積小室的透視圖，其根據(jù)本發(fā)明示出了將 具有正方形覆蓋區(qū)的小室組裝到顯微鏡載玻片上。
圖5b是圖4b的細(xì)胞沉積小室的透視圖，其根據(jù)本發(fā)明示出了將 具有矩形覆蓋區(qū)的小室組裝到顯微鏡載玻片上。
圖6是根據(jù)本發(fā)明當(dāng)小室中浮于上層的流體被吸液管吸出時(shí)，本 發(fā)明的細(xì)胞沉積小室和顯微鏡載玻片的組件的視圖。
圖7是顯示本發(fā)明的多個(gè)細(xì)胞沉積小室組件的視圖，所述組件根 據(jù)本發(fā)明將裝載到栽體上以便運(yùn)送和/或受離心作用。
圖8a和8b是顯示本發(fā)明的一次性套筒狀襯里的實(shí)施例的視圖， 所述襯里與細(xì)胞沉積小室一起使用，其中借助于裝配到小室上的外殼 通過將小室壓到載玻片表面，襯里的凸緣被密封到顯微鏡載玻片上。
圖9是另一實(shí)施例的視圖，其顯示了通過使用壓縮板來將本發(fā)明 的細(xì)胞沉積小室安裝到顯微鏡載玻片上，壓縮板借助于彈簧加載的杠 桿或手柄將小室壓到栽玻片上。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在參考附圖，圖3a顯示了具有總體標(biāo)記100的顯微鏡載玻片。 盡管如圖3a所示的載玻片是矩形形狀，它可以是不同的形狀，取決于 應(yīng)用。它可由塑料或玻璃制成。載玻片具有常規(guī)長度、寬度和厚度， 如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。圖4a和4b顯示了本發(fā)明的細(xì)胞 沉積小室，其可密封地分別安裝在圖3a和3b的載玻片上。小室可膠 粘或通過單獨(dú)的機(jī)械裝置來安裝，本發(fā)明的實(shí)施例中對此將要進(jìn)一步 描述。此外，根據(jù)應(yīng)用，在將小室安裝在載玻片上之后或之前，樣本 可被引入到載玻片上。在通常使用中，包括含水或不含水液體、液體試劑、生物流體和/ 或生物組織切片的樣品樣本被引入到載玻片的一部分上。在使用顯微 術(shù)或其他技術(shù)對樣品樣本進(jìn)行分析以前，栽玻片或板上的樣品在處理 之前可被干燥、放置在固定劑中或保持新鮮，以通過光、電子或熒光 顯微術(shù)來增加可視性和/或包括使用人眼大致分析。樣品可在其自然狀
態(tài)下被分析或需要用一次或更多次的液體染色來處理以增強(qiáng)可視性。 例如，用分子生物技術(shù)的進(jìn)一步處理可包括通過單克隆、多克隆抗體、 通過分子探針的原位雜交、和/或它們的液體檢測試劑的處理。在載玻 片的常規(guī)分析或操作中，如果載玻片接觸到另一物體，樣品或液體試 劑可從載玻片溢出、流動或移動到載玻片的其他部分、和/或"通過毛 細(xì)作用被傳送走"，從而導(dǎo)致?lián)p失所有或部分液體樣品或試劑。希望避 免不同樣品或液體試劑的這樣的不經(jīng)意的溢出或不希望有的混合或污
域(containment area )以阻止液體或液體樣品在其上的移動，而且也 提供了固定到封閉邊界上的小室，以便當(dāng)轉(zhuǎn)移載玻片時(shí)或當(dāng)載玻片受 到離心作用以將樣品中的細(xì)胞沉積到載玻片上時(shí)避免溢出樣品。例如 本發(fā)明的小室可以是一次性的或不是一次性的，取決于應(yīng)用，如以下 實(shí)施例所描述的。
在圖3a所示實(shí)施例中，載玻片100具有上表面110和下表面120， 如在相同的圖3a中載玻片的側(cè)視圖中所看到的。液體封閉邊界130 設(shè)置在上表面110的一部分上，液體封閉邊界130具有正方形形狀， 盡管它可以是任何其他形狀，例如矩形、圓形、三角形、梯形等。例 如，圖3b顯示了用矩形液體封閉邊界130，制備的相同栽玻片100。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，用于接納樣品樣本的封閉區(qū)域的形狀可不 只限于此處圖形中所示那些形狀。例如，形狀可以是圓形或多邊形。 相應(yīng)的小室具有與封閉邊界匹配的覆蓋區(qū)。小室可用來將樣本的樣品 沉積到載玻片上，或引入其他試劑以對已經(jīng)被放置在載玻片上的樣本 起作用。
圖3a或圖3b中的封閉邊界130或130，分別包圍載玻片100的上
12表面110的各自的接納和封閉區(qū)域140或140，。封閉邊界130 ( 130，) 形成了圍繞封閉區(qū)域140 ( 140，)的液體屏障。當(dāng)液體或液體樣品(未 顯示)被引入到載玻片100的封閉區(qū)域140 ( 140，)用于分析時(shí)，封 閉邊界130 ( 130，)防止液體或液體樣品從封閉區(qū)域140 ( 140，)擴(kuò)散、 滲漏或移動，從而致使樣品保留在載玻片IOO上的獨(dú)立的和受限制的 特定區(qū)域內(nèi)。此處所用的術(shù)語"液體，，或"液體樣品"指被希望放置 在栽玻片上的液體材料或液體生物樣品(例如，血液、尿、血漿或腦 脊髓液)。
在圖3a和圖3b所示實(shí)施例的一個(gè)方面中，載玻片IOO進(jìn)一步具 有不同的標(biāo)記區(qū)域150，以在上面做記錄或用于將標(biāo)簽貼到其上。栽 玻片的形成標(biāo)記區(qū)域的部分可以是"磨砂的，，，即蝕刻的或磨蝕的，或 在可選方案中可以是不透明的環(huán)氧樹脂涂層或上了涂料的涂層。形成 標(biāo)記表面的其他方法對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
形成封閉邊界130的材料可以是這樣一種成分，其包括在揮發(fā)性 溶齊寸中溶解的、液體防護(hù)齊'H匕合物(liquid repellant compound )。例:i口， 這種組合物可以是按本領(lǐng)域熟知的方式與溶劑混合的烷基聚硅氧烷和 無機(jī)酸?？墒褂每捎谰玫鼗蛑辽倩旧嫌谰玫亟Y(jié)合到玻璃表面并根據(jù) 本發(fā)明起作用的其他聚硅氧烷、珪酮和硅流體(silicon fluids )。
此外，封閉邊界材料具有厚度t和寬度w，其提供在穩(wěn)態(tài)下以及 動態(tài)下例如在離心作用期間的最佳細(xì)胞沉積特性。優(yōu)選地，邊界的厚 度從約O.Olmm至約0.2mm，以及寬度從約lmm至約2.5mm。本領(lǐng) 域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)懸浮液置于封閉區(qū)域內(nèi)時(shí)，在一些應(yīng)用中 希望有最大密度的細(xì)胞沉淀到載玻片上。為了獲得這種結(jié)果，懸浮液 應(yīng)當(dāng)具有盡可能接近于單層細(xì)胞的厚度。過量懸浮液將導(dǎo)致細(xì)胞的聚 集成團(tuán)(conglomeration),這些細(xì)胞可能在豎直地沉淀到載玻片上時(shí) 相互干擾。實(shí)施例的一個(gè)方面涉及栽玻片上懸浮液中樣品的被測量的 振動，以幫助細(xì)胞相互通過而沒有在沉淀到載玻片上時(shí)形成團(tuán)。同時(shí)， 封閉區(qū)域中的懸浮液具有這樣的預(yù)定體積，以便不流過封閉邊界的厚 度所提供的壩的高度。應(yīng)當(dāng)理解，懸浮液的體積取決于封閉區(qū)域的面積和封閉邊界的厚度。
盡管本發(fā)明的顯微鏡載玻片可用于穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞的原位分析， 如不再施加g力(人造重力)沉積到載玻片上的情況，這種人造重力 例如通過附加振動或離心作用來實(shí)現(xiàn)。如果要求較高的細(xì)胞密度，那 么還是希望能夠?qū)⑤d玻片安裝在分離機(jī)上。為了此目的，且也為了在 操作載玻片時(shí)提供防溢罩的總體目的，實(shí)施例的一個(gè)方面涉及可密封
地安裝到載玻片上以及可被拆卸的小室。圖4a和4b顯示了兩個(gè)不同 的小室。圖4a中所示小室具有正方形覆蓋區(qū)，而圖4b所示小室具有 矩形覆蓋區(qū)，其分別對應(yīng)于圖3a和3b中兩個(gè)載玻片上的封閉區(qū)域。 然而，應(yīng)當(dāng)理解，小室的覆蓋區(qū)可根據(jù)設(shè)計(jì)的封閉區(qū)域的形狀而變化。
圖4a中所示基于正方形的小室160以及圖4中所示基于矩形的小 室160，都具有頂部(170、 170，)、中部(180、 180，)和底部(190、 190，)。頂部包括圓柱形狀的開口或端口。中部包括具有四個(gè)平坦表面 的截頭多面體。底部具有粘合劑以將小室粘合到它們各自的載玻片上。 在樣本被引入到載玻片的封閉區(qū)域之前或之后，小室膠粘或通過單獨(dú) 的機(jī)械裝置安裝到它們各自的載玻片上。在初始測試和分析結(jié)束之后， 移走小室內(nèi)部的上清液。實(shí)施例的一個(gè)方面為所配置的每個(gè)小室提供 了開口 ，所述開口構(gòu)建成使小室下面封閉區(qū)域的所有區(qū)域都可通過巴 斯德(Pasteur)吸液管或類似的吸出器裝置被吸出。此外，本發(fā)明提 供了封閉所述開口的機(jī)械裝置，例如包括帽或塞子的擋塊，以便使裝 置防漏，即使當(dāng)包括載玻片和小室的裝置被倒置時(shí)。
在圖4a和4b所示細(xì)胞沉積裝置的示意圖中，使用了具有磨砂標(biāo) 記區(qū)域150的標(biāo)準(zhǔn)玻璃載玻片100 (76x25.5xlmm)。與這種類型的標(biāo) 準(zhǔn)玻璃相一致，圖4a中的正方形小室的尺寸可包括例如從約20mm 至約23mm的邊a。小室到擋塊頂部(未顯示)的高度b可在例如約 15mm至約20mm之間。圖4b中所示實(shí)施例的相應(yīng)尺寸c、 d和e可 分別例如從約24mm至約25mm、從約55mm至約58mm和從約18mm 至約20mm。然而，應(yīng)當(dāng)理解，以上提到的替換方案并不是用來將本 發(fā)明限制到這些實(shí)施例。相反，本發(fā)明旨在覆蓋可包括在如所附權(quán)利
14要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的替換、修改和等效形式。
如圖5a和5b所示，其中示出了本發(fā)明的細(xì)胞沉積裝置的三維再 現(xiàn)。正方形小室200和矩形小室300都可適合于標(biāo)準(zhǔn)玻璃載玻片。該 裝置用于從含水懸浮液沉積羊水或其他細(xì)胞到定制的標(biāo)準(zhǔn)玻璃載玻片 100上。該裝置可以是一次性的，只使用一次，且可用在體外診斷檢 測中。每一個(gè)小室都可密封地安裝到接納器/封閉區(qū)域上或從其上拆卸 下來，如以上所描述的。在實(shí)施例的一個(gè)方面中，生物相容的丙烯酸 粘合劑用來將小室附著到它們各自的載玻片上。在小室中含水介質(zhì)具 有最大液體體積時(shí)，粘合劑具有能抵抗660g擺動料桶(Swing bucket) 離心作用的強(qiáng)度。同時(shí)，粘合劑允許在離心作用之后用手或者通過使 用雙叉(two-pronged)楔型拆移工具來從載玻片移走小室。具有與小 室的覆蓋區(qū)相應(yīng)形狀的疏水性化學(xué)背襯層在邊界(250、 350)處附著 到載玻片上，以促進(jìn)粘合作用并形成試劑壩以使試劑耗損減至最小。 施加的背襯材料的厚度使得當(dāng)移走小室之后蓋玻片(coverslip )(未顯 示)附在載玻片上時(shí)，蓋玻片和載玻片表面之間的間隙不超過0.2mm。 此外，圖5a和5b中所示每一個(gè)小室頂部的開口設(shè)置成使得載玻片表 面的所有區(qū)域可通過優(yōu)選地具有從約2mm至約2.5mm外徑的巴斯德 吸液管或類似的吸出器裝置來吸取。圖6顯示了離心作用之后被打開 以前的小室300中的吸出器400。圖7顯示了裝到載體500上以運(yùn)送 到離心站的多個(gè)小室300。
在操作過程中，如圖3a和3b所示帶有或沒有特殊涂層的載玻片 100制備有適當(dāng)?shù)姆忾]區(qū)域(140、 140，)，封閉區(qū)域(140、 140，)具 有包括疏水性背襯層的封閉邊界(130、 130，)。接著，具有與接納封 閉邊界相同形狀的覆蓋區(qū)的沉積小室被降落到載玻片表面上，且用生 物相容性丙烯酸粘合劑附著到邊界。然后，包括細(xì)胞或細(xì)胞中具有特 定功能的細(xì)胞器(organelles)的顯微結(jié)構(gòu)例如線粒體和細(xì)胞核懸浮液 的樣品通過從小室頂部(圖4a和4b中170、 170，)中的開口用吸液 管引入小室中。如果在懸浮液最初沉積(和敲打出或振動)到載玻片 上期間細(xì)胞充分沉淀到載玻片表面上，那么通過吸液管400可將小室內(nèi)此刻浮于上層的液體吸出，如圖6所示。隨后，在小室頂部示出的 圓柱狀開口可用檔塊例如帽或塞子來封閉，且如果需要，組件裝置可 運(yùn)送到別處，以進(jìn)一步分析載玻片上的樣本。例如，這樣組裝的裝置 可準(zhǔn)備用于在任何標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)上的離心作用。在將要分析時(shí)，可用手 或工具將小室移去，以暴露載玻片上的細(xì)胞，用于例如在顯微鏡下的 進(jìn)一步分析。
如前面所描述的，細(xì)胞沉積小室將在分離機(jī)外殼中向外擺動，直 到在離心力的作用下達(dá)到豎直位置為止。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很 明顯的是，由于離心力垂直于封閉區(qū)域作用在此刻豎直的載玻片上， 懸浮液中的細(xì)胞將在封閉區(qū)域上相對均勻地?cái)U(kuò)散且沉積到載玻片表面 上。在預(yù)定的一段離心作用時(shí)間之后，將裝置從離心機(jī)中移走。然后， 去掉小室上開口的檔塊，且借助于吸液管將任何浮于上層的流體從載 玻片表面吸出。本領(lǐng)域的工作人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的細(xì)胞沉積小室 允許吸液管到達(dá)小室的所有角落，以便完全吸取封閉邊界內(nèi)的所有區(qū) 域。還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施例提供了最高可能的細(xì)胞密度2400 細(xì)胞/mm2，而同時(shí)還提供了在顯微鏡下清晰的細(xì)胞視圖。這是可能的， 因?yàn)榉忾]區(qū)域被很好地限定，且懸浮液體積可精確地制備成與所用的 具體樣本相同，從而改進(jìn)了細(xì)胞的密度和清晰的視圖，因?yàn)閷?shí)現(xiàn)了真 正的單層沉積。
一方面，圖4a-7所示可拆卸的小室是一次性的，即不可以再使用， 因?yàn)樾∈业膬?nèi)壁由于樣品樣本的引入而受到污染，且很難清洗它們。 另一方面，本發(fā)明提供了另外的可拆卸的結(jié)構(gòu)或襯里，其襯住所公開 的小室的內(nèi)壁，以便在載玻片與襯里及其小室分離以后，每次使用之 后可處理襯里。
在圖8a和8b所示實(shí)施例中，提供了這樣的襯里600。襯里制成 與小室300的內(nèi)輪廓一致且具有套環(huán)650以鉤到小室的頸部325上， 如圖8a所顯示。此外，襯里600具有凸緣邊緣675，凸緣邊緣675鉤 到小室300的下部邊緣375上，以便當(dāng)套環(huán)650和凸緣675接合到其 在小室上的對應(yīng)部分時(shí)，襯里沿小室的內(nèi)壁緊密地配合。襯里可由一
16次性材料制成，例如彈性體或包括聚丙烯或聚苯乙烯的塑料。當(dāng)凸緣
675被降落到載玻片100上時(shí)，凸緣675與載玻片100上的邊界350 (還是見圖5b)匹配以提供對著載玻片的壓力密封。壓力可由外殼700 提供，外殼700保形地包封小室300，其中外殼可以多種方式與圖7 中所示載體500接合，以提供保持小室襯里子組件密封地貼著載玻片 IOO的必要的力。例如，部分地從外殼700側(cè)面上的空腔中伸出的彈 簧加載的球形支承725可制造成卡入載體500的側(cè)壁上的棘爪550中， 從而在載體中將小室襯里子組件保持在載玻片上。外殼可由足夠剛性 的金屬或塑料制成，以為組件提供穩(wěn)定性且也提供對載玻片的保持動 力。
圖9顯示了組件的另一實(shí)施例，其包括在具有彈簧加載手柄875 的載體800中的載玻片100上的細(xì)胞沉積小室300。載體800設(shè)置成 接納小室300和其相關(guān)的載玻片100，如圖9所描述。小室300被降 低以與具有中間襯墊315的載玻片100匹配。襯墊315包括彈性體材 料，其在小室和載玻片之間提供緩沖，而同時(shí)維持小室和載玻片之間 可密封的和可拆卸的連接。密封壓力由具有曲面850的壓縮板825來 提供，曲面850通過彈簧加載的手柄875被壓縮到襯墊315的周界上， 從而將組件接合到載體800中。應(yīng)當(dāng)注意的是，圖8a和8b所示兩個(gè) 實(shí)施例都設(shè)置成提供在組裝之后通過開口 325在載玻片上的細(xì)胞沉 積，然后可按前面所述的任何方式來覆蓋開口 325。在圖8a和8b中， 通過外殼700中的另一開口 750提供了到開口 325的通道，開口 750 又可由檔塊775來封蓋。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，除了具有如以上實(shí)施例所公開的可 再使用的小室的優(yōu)點(diǎn)以外，本發(fā)明還有在將小室組裝到載玻片上時(shí)沒 有粘合劑的附加優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)沒有粘合劑時(shí)，細(xì)胞沉積小室可容納可能與 基于粘合劑的單元不相容的各種溶劑中的樣本的樣品。還可在一定范 圍內(nèi)容納由使用者指定的載玻片，因?yàn)檩d玻片不需要有接納小室的粘 合劑邊界?？蓪Τ练e表面進(jìn)行修改，不存在來自粘合劑邊界的任何干 擾，因?yàn)椴淮嬖谡澈蟿┻吔?。進(jìn)一步地，在載玻片已經(jīng)沉積有固體組織樣品(例如，顆粒、細(xì) 胞混合物、細(xì)胞外產(chǎn)物、細(xì)胞內(nèi)成分、非同質(zhì)的群體)情況下，樣品 可在本發(fā)明的小室中被分散和分裂而不必將它們轉(zhuǎn)移到另一容器中。
這可通過使用圖8b的外殼700技術(shù)或圖9中的手柄機(jī)械裝置875來將 沉積小室300組裝到栽玻片上且在小室中進(jìn)行組織處理來實(shí)現(xiàn)。例如， 這種處理可通過在小室中加入分解試劑(例如蛋白酶溶液，如膠原酶) 來實(shí)現(xiàn)。在培育分解混合物且最終中和分解試劑之后，最后得到的懸 浮液可接著通過離心作用而直接沉積到載玻片上。然后，移去上層清 液且拆掉小室。
本發(fā)明的一次性細(xì)胞沉積小室可用作基于細(xì)胞的化驗(yàn)的平臺。這 些化驗(yàn)至少包括以下類型的化驗(yàn)
1. 載玻片小室用于獲得具有從包圍細(xì)胞的液體介質(zhì)中獲取分析 物的能力的細(xì)胞。這種化驗(yàn)通過用待分析的溶液培育活的或固定細(xì)胞 來執(zhí)行。細(xì)胞在培育之后附著到載玻片或者被離心地沉積。然后，在 免疫染色或使分析物出現(xiàn)熒光之后，通過熒光顯微術(shù)或其他方法對細(xì) 胞進(jìn)行分析物含量的分析。
2. 載玻片小室用于獲得可與周圍介質(zhì)中存在的分析物相互作用 的細(xì)胞。相互作用在細(xì)胞中產(chǎn)生響應(yīng)?？稍谳d玻片上或沉積在載玻片 上之后使用顯微技術(shù)即免疫熒光顯微術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行上述響應(yīng)的分析。
3. 細(xì)胞沉積小室可用于淘洗工藝(panning )中，例如，根據(jù)細(xì) 胞表面存在的生化結(jié)構(gòu)，載玻片被涂有專用于結(jié)合到特定類別的細(xì)胞 的試劑。這種試劑可以是抗體或凝集素(lectin )。在這種情形下，將 細(xì)胞懸浮液加到包含涂有試劑的載玻片的小室。允許細(xì)胞懸浮液在小 室中沉淀，同時(shí)攪動小室，以便阻止通過特定的相互作用沒有附著到 載玻片的那些細(xì)胞不特定地(non-specifically )粘附著到載玻片。在 預(yù)定時(shí)間之后，包含沒有粘附細(xì)胞的上層清液將被移走。然后，小室 組件受到離心作用(如果需要)且被拆卸。
4. 沉積小室可用于由環(huán)境樣品制備載玻片。分析物可由微粒物質(zhì) 例如土壤顆?；蛭廴疚镱w粒而不是細(xì)胞組成。5.細(xì)胞沉積小室可用于法醫(yī)用樣品的制備，以分析微粒樣品。 盡管在此闡述了所公開的設(shè)備和方法的這些許多細(xì)節(jié)以提供對本 發(fā)明的理解，然而，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，很顯然不需要全部 使用這些具體細(xì)節(jié)來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。同時(shí)，很明顯，相似的部件可用在 很多而無法列舉的其他相似設(shè)備中，例如用在臨床常規(guī)診斷中的公知 的Cytospin裝置中。圖8a和8b的外殼700適合于使本發(fā)明的細(xì)胞沉 積小室適用于細(xì)胞桶(Cytobucket )。
盡管參考具體實(shí)施例具體示出和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人
員應(yīng)當(dāng)理解，可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種改變而不偏離本發(fā)明的精神 和范圍。
權(quán)利要求
1. 一種設(shè)備，其包括小室，其限定一個(gè)空腔且具有覆蓋區(qū)，所述覆蓋區(qū)設(shè)置成裝配到顯微鏡載玻片上的接納區(qū)域上，所述小室具有頂部、中部和底部，所述頂部限定所述小室的開口，以允許生物樣品沉積到所述顯微鏡載玻片的表面；用于封閉和密封所述開口的裝置；以及用于將所述小室附著到所述顯微鏡載玻片上的所述接納區(qū)域上的裝置。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述小室具有帶有多邊形覆 蓋區(qū)的開口底部。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述覆蓋區(qū)是圓形。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述小室的所述頂部包括圓 柱形狀。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述用于封閉和密封所述開 口的裝置是帽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述用于封閉和密封所述開 口的裝置是塞子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中所述小室的所述中部包括截 頭多面體，以允許從所述載玻片表面的所有區(qū)域吸出所述生物樣品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的設(shè)備，其中所述多面體包括四個(gè)平坦表面。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其進(jìn)一步包括 接納區(qū)域，其用粘合劑材料處理，所述粘合劑材料允許所述小室附著到所述顯微鏡載玻片上和從其 上去除。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其中所述粘合劑包括可生物相 容的丙烯酸材料。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其中所述接納區(qū)域用疏水性背 襯層處理，以促進(jìn)粘合功能。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其中所述接納區(qū)域用疏水性背 襯層處理，以形成試劑壩。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其進(jìn)一步包括襯里，所述襯里設(shè)置成配合所述小室的內(nèi)壁且具有頸部以及凸緣 部分，所述頸部可拆卸地附著到所述小室的所述開口，所述凸緣部分 可拆卸地附著到所述小室的所述底部的邊緣；以及外殼，所述外殼與所述小室的外壁形狀相符并裝配到其上。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中所述襯里包括一次性聚乙烯。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其中所述外殼包括聚乙烯。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的設(shè)備，其進(jìn)一步包括固定裝置，通過 在所述外殼上施壓以將所述凸緣部分密封在所述接納區(qū)域上，所述固 定裝置將所述小室固定到所述顯微鏡載玻片上的所述接納區(qū)域。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的設(shè)備，其中所述用于固定所述小室的 固定裝置包括手柄，所述手柄接合設(shè)置在所述小室上的壓縮板。
18. —種用于在細(xì)胞沉積小室中沉積生物材料的方法，包括以下 步驟提供細(xì)胞沉積小室，所述細(xì)胞沉積小室在所述小室的底部具有覆 蓋區(qū)且在所述小室的頂部限定一開口；提供顯微鏡載玻片，所述顯微鏡載玻片具有用于生物樣品的接納 區(qū)域，所述接納區(qū)域適合于匹配所述細(xì)胞沉積小室的所述覆蓋區(qū)；用化學(xué)背襯層來處理所述顯微鏡載玻片；將襯里裝配到所述小室中，所述襯里具有裝配到所述小室的所述 開口上的頸部，以及裝配到所述小室的所述底部邊緣上的凸緣；將所述小室的所迷覆蓋區(qū)設(shè)置在所述接納區(qū)域上，且在所述顯微 鏡載玻片上固定所述小室；將生物材料經(jīng)由所述沉積小室的所述開口引入到所述顯微鏡載玻片上；封閉且密封所述開口。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述生物樣品包括在懸浮 液中的細(xì)胞。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述生物樣品包括在懸浮 液中的細(xì)胞器。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟 執(zhí)行所述生物樣品的體外診斷檢測；打開所述端口；以及通過所述端口吸出所述生物樣品的上清液。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟 在吸出所述上清液之后，封閉且密封在所述小室頂部的所述端口； 將壓縮板放置到所述小室上；操縱手柄向所述壓縮板施壓，以將所述小室密封到所述顯微鏡載 玻片上的所述接納區(qū)域上。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述手柄將所述小室密封 到細(xì)胞離心桶中的所述載玻片上。
全文摘要
一種細(xì)胞沉積小室和一種使用該小室將生物樣品沉積到顯微鏡載玻片上的方法。小室可拆卸地密封到載玻片上的樣品接納區(qū)域，且具有可密封的開口以允許從載玻片表面吸出樣品。小室設(shè)置成能夠通過吸液管吸取載玻片表面的所有區(qū)域，且當(dāng)?shù)怪脮r(shí)小室完全排空。小室可裝配有一次性襯里以使小室可再使用。
文檔編號G01N9/30GK101511481SQ200680024844
公開日2009年8月19日 申請日期2006年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者安迪·塞波, 特里安塔菲洛斯·P·塔法斯, 邁克爾·W·基爾帕特里克 申請人:艾可尼西斯公司