專利名稱：穩(wěn)定在電化學(xué)生物傳感器中的pqq依賴性葡萄糖脫氫酶的活性的制作方法
穩(wěn)定在電化學(xué)生物傳感器中的PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶的活性 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)旨在用于分析生物學(xué)流體的醫(yī)學(xué)裝置的領(lǐng)域。發(fā)明背景更具體而言，本發(fā)明涉及生物傳感器，器用于測(cè)量體液中的分析 物的量，特別是測(cè)量全血樣品中的葡萄糖。光學(xué)方法通常用于進(jìn)行此 類測(cè)量，但本發(fā)明涉及電化學(xué)傳感器的改良。盡管本文將描述的本發(fā)明方法可以應(yīng)用于測(cè)量其他分析物，但測(cè) 量全血樣品中的葡萄糖是特別感興趣的。本發(fā)明還涉及電化學(xué)儀器， 其中將恒定或變化的電勢(shì)施加于接觸血液樣品的電極，并且在短時(shí)間 段后測(cè)量所得到的電流。測(cè)得的電流與樣品中的分析物的量相關(guān)。此 類儀器稱為電流計(jì)。電流測(cè)量?jī)x器中使用的葡萄糖生物傳感器可以釆用許多試劑系 統(tǒng)，所述試劑系統(tǒng)使酶與樣品中的葡萄糖反應(yīng)，并通過(guò)稱為介體的氧 化還原化合物在下列 一般步驟順序中氧化而產(chǎn)生可測(cè)量的電流 葡萄糖+ E氣化—E還原+氧化的葡萄糖(葡萄糖酸內(nèi)酯) E還原+ n Med氣化 —n Med還原+ E氣化 n Med還原 —Med氣化+ n e—其中E氣化和E還原是氧化和還原形式的酶氧化還原中心，并且Med 氣化和Med^是氧化和還原形式的介體。葡萄糖氧化酶已用作電化學(xué)生 物傳感器中的酶，但最近，已引入了葡萄糖脫氫酶。這些酶與輔酶或 輔因子，例如NAD、 FAD和PQQ—起使用。在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的
之中，介體尤其可以是鐵氰化物或四唑鎮(zhèn)鹽。將葡萄糖脫氫酶(GDH)、其輔因子以及介體組合在施加至電極對(duì) 的制劑中，所述電極對(duì)被描述為工作和反電極。當(dāng)施加電勢(shì)越過(guò)電極 時(shí)，所述酶/輔因子氧化葡萄糖(分析物)，并且當(dāng)介體再氧化該酶時(shí) 其被還原。還原的介體遷移至工作電極，在那里它被再氧化，并且在 該過(guò)程中釋放電子，所述電子移至反電極并建立電流，該電流與樣品 中存在的葡萄糖量成比例。因?yàn)槊慨?dāng)患者測(cè)試其血液葡萄糖量時(shí)使用一個(gè)新的傳感器，所以 試劑制劑應(yīng)當(dāng)在從一個(gè)生物傳感器到下一個(gè)生物傳感器之間提供一致 表現(xiàn)。很明顯，重要的是，結(jié)果是可靠的，因?yàn)橛脩魧⒏鶕?jù)其測(cè)試結(jié) 果來(lái)調(diào)整其飲食或藥物治療。因此，除了其他要求外，尤其是，酶應(yīng) 當(dāng)在其整個(gè)有用的保存期內(nèi)維持其活性。本發(fā)明特別涉及限制或防止 在電化學(xué)生物傳感器中使用的酶/輔因子系統(tǒng)[即，葡萄糖脫氫酶-吡咯 并壹啉醌(GDH-PQQ)]的活性的喪失。美國(guó)專利號(hào)6, 656, 702中提出了一種維持GDH-PQQ活性的方法， 其教導(dǎo)了向試劑制劑中添加糖，特別是含GDH-PQQ的海藻糖。在一個(gè) 例子中，將親水性聚合物，羧甲基纖維素，沉積在電極上并干燥。然 后，將包含GDH-PQQ、海藻糖和作為電子受體(介體)的鐵氰化鉀的 試劑混合物通過(guò)"滴下(dropping)"而沉積在干燥的羧甲基纖維素 層上并隨后干燥，以在電極上完成試劑層。該專利還建議，還可將親 水性聚合物加到包含試劑的層上。認(rèn)為'702專利通過(guò)提及試劑層"滴 下"來(lái)表示，它們通過(guò)將試劑小滴分配到圍繞棵露電極的孔中來(lái)進(jìn)行 沉積。另一專利(美國(guó)專利號(hào)6， 270， 637 )描述了用于電化學(xué)生物傳感 器的制劑，其包含GDH-PQQ，并且還包含羥乙基纖維素。該專利強(qiáng)調(diào) 了包含入分子量為100 - 900千道爾頓(kDa)的聚環(huán)氧乙烷的價(jià)值。 沒(méi)有詳細(xì)提供將其制劑施加于電極上的方法，但相信這可以通過(guò)用泵 系統(tǒng)分配試劑來(lái)完成。試劑層的絲網(wǎng)印刷用于在美國(guó)專利號(hào)5, 708, 247; 5，951， 836;和6, 241, 862中所描述的組合物和生物傳感器。葡萄糖氧化酶用作所述 酶，并且試劑組合物還包括羥乙基纖維素和經(jīng)處理的二氧化硅，選擇 所述經(jīng)處理的二氧化硅以具有疏水性和親水性的平衡，從而形成將紅 細(xì)胞排除在外的二維網(wǎng)絡(luò)。試劑制劑可以通過(guò)各種方法進(jìn)行沉積，包括浸漬、條紋涂覆 (stripe coating)、噴墨印刷或使用注射泵的孩史沉積，所述注射泵 可以包括添加#:型電磁閥液滴噴射裝置。絲網(wǎng)印刷是特別感興趣的方 法，因?yàn)樗怯行У牟⑶铱闪己玫剡M(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)生物傳感器的大規(guī) 模生產(chǎn)。它要求施加于電極的制劑(即，墨)具有某些物理性質(zhì)以成 功地進(jìn)行施加。特別地，通過(guò)絲網(wǎng)印刷施加的墨應(yīng)當(dāng)具有下列性質(zhì) 與基材的吸附性、內(nèi)聚性、觸變性(剪切稀化)、以及關(guān)于粘度和流 動(dòng)的最佳流變學(xué)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖氧化酶作為所述酶時(shí)用于絲網(wǎng)印刷的組 合物在所述酶變成GDH-PQQ時(shí)不能使用，因?yàn)樵撔碌拿负芸靻适Щ钚浴?研究后確定，用于提供絲網(wǎng)印刷所必需的物理性質(zhì)的組分中的某些組 分導(dǎo)致酶活性喪失。因此，必需發(fā)現(xiàn)不會(huì)導(dǎo)致GDH-PQQ過(guò)早失活且滿 足絲網(wǎng)印刷要求的組分。那些試劑制劑在下文描述。發(fā)明概述本發(fā)明在一個(gè)方面是用于施加至電化學(xué)生物傳感器中的電極的試 劑組合物。該新的組合物可以是經(jīng)絲網(wǎng)印刷的，并避免用于在葡萄糖 生物傳感器中氧化葡萄糖的酶-輔因子系統(tǒng)(GDH-PQQ)活性的過(guò)早喪 失。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在維持pH 4.5-6.5的緩沖溶液中將 GDH-PQQ與下列物質(zhì)組合親水性聚合物(優(yōu)選羥乙基纖維素)，和 無(wú)定形的親水性二氧化硅粉末，表面活性劑，以及介體(優(yōu)選鐵氰化 物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是電化學(xué)生物傳感器，其中將上述反 應(yīng)組合物絲網(wǎng)印刷在工作和反電極上。
在另一方面，本發(fā)明是用于維持在經(jīng)絲網(wǎng)印刷的試劑組合物中GDH-PQQ活性的方法。附圖簡(jiǎn)述圖la和b是典型的電化學(xué)傳感器的分解圖。 圖2是試劑本底電流對(duì)不同緩沖液的圖。圖3是直方圖，其顯示了試劑制劑中某些組分對(duì)酶活性的影響。 圖4是直方圖，其顯示了本發(fā)明的試劑組合物對(duì)酶活性的影響。 圖5是測(cè)得的葡萄糖對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的圖。 圖6是圖5的測(cè)量結(jié)果中的偏差的圖。優(yōu)選實(shí)施方案的描述測(cè)量血液葡萄糖含量血液中包含的葡萄糖可以通過(guò)各種方法進(jìn)行測(cè)量。其中特別感興 趣的是由糖尿病患者在家庭中使用的方法。這些方法包括光學(xué)和電化 學(xué)方法，這兩者都可以通過(guò)用酶氧化葡萄糖來(lái)起作用。存在的葡萄糖 量通過(guò)測(cè)量經(jīng)由指示劑顯現(xiàn)的顏色或者通過(guò)測(cè)量當(dāng)施加電勢(shì)越過(guò)電極 對(duì)時(shí)經(jīng)由氧化還原介體的氧化而產(chǎn)生的電流來(lái)測(cè)定。本發(fā)明涉及后面 一種測(cè)量全血葡萄糖含量的方法，特別是涉及采用葡萄糖脫氫酶(GDH) 和輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)的電化學(xué)生物傳感器。將GDH-PQQ與其 他組分相組合以產(chǎn)生沉積在電極對(duì)上的組合物，所述其他組分包括介 體、聚合物、表面活性劑、緩沖液和增稠劑。當(dāng)施加電壓越過(guò)所述電 極時(shí)，GDH-PQQ與葡萄糖的反應(yīng)以及介體的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生與血液 樣品中的葡萄糖量成比例的電流，所述血液樣品與反應(yīng)組合物進(jìn)行了 接觸。本發(fā)明不限于在本領(lǐng)域中已公開的許多中的特定生物傳感器設(shè) 計(jì)?？梢允褂玫纳飩鞲衅鞯囊粋€(gè)例子在美國(guó)專利號(hào)6, 531, 040中描 述，其在圖la-b中進(jìn)行了圖解說(shuō)明。

圖1中顯示了生物傳感器10的分解圖。它包括絕緣性底座12， 在其上按順序印刷了 ( 一般通過(guò)絲網(wǎng)印刷技術(shù))電導(dǎo)體圖案(pattern ) 14、電極圖案(部分16和18)、絕緣(介電)圖案20、和反應(yīng)層22。 通過(guò)添加覆蓋層28完成了生物傳感器。在覆蓋層28和試劑層22之間 形成的毛細(xì)管30為流體測(cè)試樣品提供了流動(dòng)通道。試劑層22中的試劑與流體測(cè)試樣品中的分析物(例如血液中的葡 萄糖)反應(yīng)并產(chǎn)生電流，所述電流被測(cè)量并與存在的分析物的量相關(guān) 聯(lián)。反應(yīng)層22 —般包含酶和電子受體。酶與分析物反應(yīng)從而產(chǎn)生電子， 其通過(guò)電子受體或介體被運(yùn)送至工作電極表面，所述電子受體或介體 響應(yīng)分析物和酶之間的反應(yīng)而被還原。在本發(fā)明中，所述酶是葡萄糖 脫氫酶(GDH)，和其輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)，并且介體是鐵氰 化物鹽。電極圖案的兩個(gè)部分16、18提供通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定分析物濃度 所需的分別的工作和反電極。所顯示的設(shè)計(jì)的特征是，工作和反電極 如此配置，使得反電極的主要部分位于工作電極16a的暴露部分的下 游(依照沿著流動(dòng)通道的流體流的方向)。然而，反電極子元件18a置于工作電極上部元件16a的上游，從 而使得當(dāng)不足以完全覆蓋工作電極的測(cè)試流體樣品量(例如，全血樣 品)進(jìn)入毛細(xì)管空間時(shí)，由于全血樣品的傳導(dǎo)性而在反電極子元件18a 和工作電極16a的暴露部分之間形成電連接。然而，對(duì)于被全血樣品 接觸來(lái)說(shuō)可得的反電極面積是如此小，使得只有非常弱的電流可以通 過(guò)電極之間，并且因而通過(guò)電流檢測(cè)器。通過(guò)安排電流檢測(cè)器在當(dāng)接 受到的信號(hào)低于某一預(yù)定水平時(shí)給出錯(cuò)誤信號(hào)，傳感器裝置通知用戶 不充足的血液已進(jìn)入傳感器腔，并且應(yīng)當(dāng)進(jìn)行另一測(cè)試，或應(yīng)當(dāng)添加 更多血液。盡管電極的具體尺寸不是關(guān)鍵的，但反電極子元件18a的 面積通常比工作電極的小約10% ，并且更具體而言，小約6%。這個(gè) 元件應(yīng)當(dāng)制備得盡可能小。美國(guó)專利號(hào)6, 531, 040中還考慮了通過(guò)生產(chǎn)不將試劑墨印刷在反
電極子元件18a上的絲網(wǎng)，反應(yīng)層22可以不與反電極子元件18a接觸。 這將使該子元件缺乏試劑，由此不允許其起適當(dāng)反電極的作用，從而 使得當(dāng)測(cè)試流體樣品不能接觸反電極18的主體時(shí)達(dá)到錯(cuò)誤條件。盡管 子元件18a顯示為與反電極18的部分物理連接，但18a可以與反電極 的其余部分在物理上分離，條件是其具有自己的連接器，并且傳感器 配備有與檢測(cè)器的第三個(gè)接觸器。工作和反電極一般使用電極墨進(jìn)行印刷，所述電極墨一般為約14 Him ( 0. 00055")厚，并且通常包含電化學(xué)活性炭。導(dǎo)體墨的組分可以 是炭和銀的混合物，選擇該混合物以在電極和儀表之間提供低化學(xué)電 阻途徑(chemical resistance path)，所述電極經(jīng)由在傳感器的魚 形尾端26與傳導(dǎo)圖案接觸而連接至所述儀表。反電極可以包括銀/氯 化銀，盡管炭是優(yōu)選的。為了增強(qiáng)儀表讀數(shù)的可重復(fù)性，介電圖案使 電極與流體測(cè)試樣品之間絕緣，除了在電極圖案24中心附近的限定區(qū) 域外。限定區(qū)域在這種類型的電化學(xué)測(cè)定中是重要的，因?yàn)闇y(cè)得的電 流不僅取決于分析物濃度和反應(yīng)層22的面積，還取決于暴露于包含分 析物的測(cè)試樣品的工作電極16a的面積。典型的介電層20包括UV固化的丙烯酸酯修飾的單體、寡聚物或 聚合物，并且約10jLim ( 0. 0004")厚。介電層還可以是可濕固化或可 熱固化的。調(diào)整蓋或覆蓋物28以適合于匹配底座以形成接受流體測(cè)試 樣品的空間，在所述空間中放置反電極和工作電極。蓋28提供了凹型 空間30，并且一般通過(guò)對(duì)可變形材料的平片材進(jìn)行壓紋而形成。將蓋 28穿孔以提供通氣孔32并通過(guò)密封操作與底座12連接。蓋和底座可 以通過(guò)聲波焊接而密封在一起，在所述聲波焊接中首先將底座12和蓋 28對(duì)準(zhǔn)，然后在振動(dòng)熱封部件或角和固定顎板之間壓在一起，其中只 與蓋的平坦且未壓紋的區(qū)域接觸。壓紋的蓋和底座還可通過(guò)在蓋的下 面使用粘性材料進(jìn)行連接。連接蓋和底座的方法在美國(guó)專利號(hào) 5， 798， 031中更全面地進(jìn)行了描述。用于絕緣性底座12的合適材料包括聚碳酸酯，聚對(duì)苯二甲酸乙二 酯，在空間上穩(wěn)定的烯類聚合物和丙烯酸酯類聚合物，和聚合物摻和
物例如聚碳酸酯/聚對(duì)苯二甲酸乙二酯，和金屬箔結(jié)構(gòu)(例如尼龍/鋁/ 聚氯乙稀薄片)。蓋通常由可變形的聚合片狀材料制造，例如聚碳酸 酯或可壓紋等級(jí)的聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、甘醇修飾的聚對(duì)苯二曱酸乙 二酯或金屬箔組合物(例如，鋁箔結(jié)構(gòu))。在本發(fā)明中可以使用其他電化學(xué)傳感器?？梢杂糜跍y(cè)量葡萄糖濃度的電化學(xué)傳感器的例子是在Bayer Healthcare's AscensiaTM AUT0DISC⑧和AscensiaTMELITE⑧系統(tǒng)中使用的那些。關(guān)于此類電化學(xué) 傳感器的更多細(xì)節(jié)在美國(guó)專利號(hào)5， 120， 420和5， 320， 732中可以找到。 其他電化學(xué)傳感器可從Matsushita Electric Industrial Company 獲得。可以在電流分析監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中使用的電化學(xué)傳感器的進(jìn)一步例子 在美國(guó)專利號(hào)5， 429， 735中公開。電化學(xué)傳感器可以位于裝載有多個(gè)傳感器的血糖傳感器分配儀器 中。在傳感器分配儀器中裝載的傳感器包(pack)的一個(gè)例子在美國(guó) 專利號(hào)5, 660， 791中公開。當(dāng)電化學(xué)傳感器置于合適的測(cè)量?jī)x器中并且引入血液樣品時(shí)，施 加電壓越過(guò)電極并測(cè)量與樣品的葡萄糖含量相關(guān)聯(lián)的電流，并報(bào)告給 用戶。電流分析傳感器可以施加固定電壓越過(guò)電極，并且在預(yù)定時(shí)間段 內(nèi)測(cè)量產(chǎn)生的電流，所述時(shí)間段可以非常短，比如說(shuō)5-10秒，以便 校正由于介體的過(guò)早還原而可能存在的偏差。那個(gè)時(shí)期稱為"燃燒期"。 電流升高至峰值并隨后降低，同時(shí)樣品再水化試劑層，使得氧化和還 原反應(yīng)發(fā)生。這個(gè)燃燒期后，去除所施加的電勢(shì)或至少在允許反應(yīng)發(fā) 生的靜止期內(nèi)降低。然后，再施加電勢(shì)并在預(yù)定的"閱讀"期(例如， IO秒)內(nèi)測(cè)量電流。因?yàn)橛捎诿傅陌殡S氧化而出現(xiàn)還原的介體，所以 產(chǎn)生的電流在開始時(shí)很高，但隨后漸近地降低并接近穩(wěn)定狀態(tài)。在短 "閱讀"期結(jié)束時(shí)記錄的電流用于確定血液樣品的葡萄糖含量，這通 過(guò)在閱讀期結(jié)束時(shí)的電流和包含在測(cè)試樣品中的具有已知濃度的葡萄 糖之間的以前獲得的相關(guān)性來(lái)進(jìn)行。 與電化學(xué)生物傳感器中的血液樣品反應(yīng)的組合物必須在從一個(gè)傳 感器到下一個(gè)傳感器之間提供一致的應(yīng)答。 一致的應(yīng)答對(duì)于依賴結(jié)果來(lái)調(diào)整其飲食或藥物治療的用戶來(lái)說(shuō)是重要的。它遵循這點(diǎn)在生物 傳感器的保存期內(nèi)試劑活性的改變應(yīng)盡可能小，但至少是可預(yù)知的， 從而使得可以進(jìn)行結(jié)果的調(diào)整。本發(fā)明解決了在電化學(xué)生物傳感器中 使用酶-輔因子GDH-PQQ時(shí)發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，在所述電化學(xué)生物傳感器中將 反應(yīng)組合物絲網(wǎng)印刷在傳感器的電極上。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在絲網(wǎng)印刷 中通常使用的組分中的GDH-PQQ引起GDH-PQQ喪失活性。GDH-PQQ與作為氧化還原介體的鐵氰化鉀的混合物在一系列緩沖 液中進(jìn)行制備。盡管已知GDH-PQQ優(yōu)選中性PH,但發(fā)現(xiàn)提供約4. 5-約6. 5， 更特別地，約5. 0-約6. 0的pH的緩沖液，包括乙酸鹽、檸 檬酸鹽和琥珀酸鹽緩沖液，是更理想的，因?yàn)榻轶w鐵氰化物在酸性pH 下更穩(wěn)定(參見圖2)。發(fā)現(xiàn)某些聚合材料也顯示導(dǎo)致活性喪失，即使當(dāng)使用低pH緩沖液 時(shí)。用于形成酶和氧化還原介體的載體的兩種聚合物用75 mM乙酸鈣 和75 mM琥珀酸鈉緩沖液進(jìn)行測(cè)試。不包括鐵氰化鉀。結(jié)果顯示于圖 3中，其中顯示了對(duì)酶活性的最初影響，并與在-20'C下2周后的影響 進(jìn)行了比較。可以看出，當(dāng)在包含8.8單位GDH-PQQ/毫克試劑墨(reagent ink)和10 mM CaCl2的溶液(但無(wú)鐵氰化物)中只存在琥 珀酸鹽和乙酸鹽緩沖液時(shí)，在-20iC下2周后所述緩沖液并不導(dǎo)致活性 明顯喪失。使用Beckman SYNCHRON CX 4 Delta儀器通過(guò)在560 nm 處測(cè)量用汾嚷硫酸曱酯(phenazine methosulfate, PMS )于37"C還 原硝基四氮峻藍(lán)(nitrotetrazolium blue, NBT )而形成的二甲(diformazan)形成速率來(lái)測(cè)定酶活性。然而，當(dāng)包括以前用于制備 絲網(wǎng)印刷墨的添加劑時(shí)，看到活性明顯喪失。將由RHEOX， Inc.供應(yīng) 的膨潤(rùn)土 (一種粘土增稠劑)以1.3重量％包括在緩沖溶液中。圖3 中顯示的結(jié)果表明，在乙酸鹽緩沖液中，膨潤(rùn)土導(dǎo)致酶活性喪失約10 %，而在琥珀酸鹽緩沖液中，從新鮮試劑中并且還從在-20X:貯存2
周的試劑中喪失約90%的酶活性。當(dāng)將7.4重量％的聚環(huán)氧乙烷加入 緩沖溶液中時(shí)，活性同樣喪失，盡管緩沖液的效果的差異是顯著的。 可以得出這樣的結(jié)論，包含與膨潤(rùn)土或聚環(huán)氧乙烷相組合的GDH-PQQ 的試劑制劑顯示出較低的酶活性，并且因此是可絲網(wǎng)印刷的試劑墨中 較不理想的增稠組分?？赡苓m合替代膨潤(rùn)土和聚環(huán)氧乙烷的其他增稠劑的影響的研究導(dǎo) 致發(fā)現(xiàn)，某些材料產(chǎn)生出適合于絲網(wǎng)印刷且不引起GDH-PQQ活性喪失 的試劑墨。改善的結(jié)果在圖4中圖解說(shuō)明。在圖4中報(bào)告的測(cè)試中， 向乙酸鹽緩沖溶液中加入4 - 8 u/mg GDH-PQQ、 1.6重量％ CAB-0-SIL 1^5@未處理的火成二氧化硅、4. 5-6. 5重量％羥乙基纖維素(HEC)和 幾種表面活性劑。使用PMS/NBT酶測(cè)定法在Beckman分析儀上于37。C 測(cè)量酶活性。CAB-0-SILM5⑧適合與HEC組合。很明顯，CAB-0-SILM5 與HEC的組合在測(cè)試期內(nèi)并不導(dǎo)致酶活性喪失。如已顯示的，羥乙基纖維素在使用GDH-PQQ的電化學(xué)生物傳感器 中可以用作試劑層中的基質(zhì)組分，而不導(dǎo)致酶活性的不適當(dāng)喪失。還 可使用其他相關(guān)的親水性聚合物以使得組合物的粘度適合于絲網(wǎng)印 刷。其他纖維素衍生物包括，但不限于，羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖 維素、羥乙基纖維素或羥丙基甲基纖維素?？赡苡杏玫钠渌苄跃?合物包括黃原膠、瓜耳膠、刺槐豆膠、角叉菜膠、瓊脂糖和合成聚合 物，所述合成聚合物包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。CAB-0-SILM5⑧是無(wú)定形的未處理的火成二氧化硅，其已顯示出向 在本發(fā)明試劑層的絲網(wǎng)印刷中使用的墨提供了所需的物理性質(zhì)。這種 未處理的親水性二氧化硅不同于在幾個(gè)早期專利中教導(dǎo)的用于平衡疏 水和親水性質(zhì)的經(jīng)處理的二氧化硅。備選的水不溶性增稠劑包括，但不限于，滑石、云母、硅藻土、天然和變性粘土，例如皂土(bentonite clays)、鋰蒙脫土 (hectorite clays)(例如，來(lái)自IMV Nevada 的Optigel sH)、海泡石(例如來(lái)自IMV Nevada的Sepiogel F)、 蒙脫石(例如來(lái)自IMV Nevada的IGB粘土 )、鬼石(saponite)(例 如，來(lái)自IMV Nevada的Sepiogel F和IMVITE 1016，以及來(lái)自Southernte )， 等等。如圖4中所示，表面活性劑的選擇也可影響GDH-PQQ的活性。由 Sigma供應(yīng)的Triton x-100 (—種烷基芳基聚醚醇)是非常合適的。 然而，認(rèn)為其他表面活性劑，包括FC 170C( 3M的產(chǎn)品)、Surfynol 485 (Air Products and Chemicals, Inc.的產(chǎn)品)和Pluronic L62 D (BASF的產(chǎn)品)，可用于本發(fā)明的制劑中。根據(jù)本發(fā)明用于對(duì)生物傳感器進(jìn)行絲網(wǎng)印刷的優(yōu)選試劑組合物包括 約30-約200 mM，并且更特別地，約50 -約150 raM的緩沖液， 優(yōu)選乙酸鉤； 約5-約50 mM CaCl2; 基于組合物總重量計(jì)直到約0. 5重量％的表面活性劑； 參基于組合物總重量計(jì)約2-約10重量％的纖維素衍生物，優(yōu)選 羥乙基纖維素；參基于組合物總重量計(jì)約1-約6重量o/。的無(wú)定形的未處理的二 氧化硅；參基于組合物總重量計(jì)約10-約20重量％的作為介體的鐵氰化鉀； 對(duì)于每毫克組合物總重量來(lái)說(shuō)約1 -約8個(gè)單位的GDH-PQQ酶-輔因子； 約60， 000 -約180， 000 cps ( mPa.s )的粘度。實(shí)施例1通過(guò)加入乙酸4丐和冰乙酸來(lái)制備pH5. 3的75 mM乙酸釣緩沖液。 向緩沖溶液中加入下列化合物10 mM CaCl2、 0.05重量％ Triton X-100表面活性劑、1-3重量％ Cabosil M5無(wú)定形的未處理的火成 二氧化硅粉末、和4-8重量％羥乙基纖維素。在讓二氧化硅和纖維素
水合16小時(shí)后，向每亳克試劑墨中加入15-20重量％的鐵氰化鉀和 3-8個(gè)單位的GDH-PQQ。試劑墨在600 rpm下用葉片式混合器混合約 10-20分鐘，從而產(chǎn)生粘度為約80， 000 - 140， 000 cps的試劑組合物。 將該試劑組合物絲網(wǎng)印刷在包含電極的基材上，并于45 - 50。C干 燥5分鐘。實(shí)施例2使用實(shí)施例1的試劑組合物制備葡萄糖傳感器，并用包含已知葡 萄糖含量且具有40%血細(xì)胞比容的血液樣品進(jìn)行測(cè)試。對(duì)電極施加 200 - 400毫伏的電勢(shì)，并將在施加電勢(shì)后IO秒測(cè)量的電流用于確定 樣品的葡萄糖含量。這些測(cè)試的結(jié)果顯示于圖5中，其中將計(jì)劃在10 秒測(cè)試時(shí)間中的Ascensia AUTODISC⑧葡萄糖計(jì)的應(yīng)答針對(duì)通過(guò)工業(yè) 標(biāo)準(zhǔn)YSI葡萄糖儀器測(cè)得的葡萄糖含量進(jìn)行作圖?？梢钥闯霁@得了線 性應(yīng)答，其對(duì)所研究的范圍內(nèi)的酶-輔因子濃度相對(duì)不敏感。當(dāng)與從YSI儀器(工業(yè)標(biāo)準(zhǔn))獲得的結(jié)果相比較時(shí)，該傳感器同 樣展現(xiàn)了良好的劑量應(yīng)答。相對(duì)于YSI儀器結(jié)果的偏差顯示于圖6中。 對(duì)于含< 400 mg/dL葡萄糖的樣品，偏差在± 5 %內(nèi)，對(duì)于含680 mg/dL 葡萄糖的樣品，偏差在±10%內(nèi)。備選的實(shí)施方案A用于絲網(wǎng)印刷電化學(xué)生物傳感器的試劑組合物，其包括 (a)用于氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔 因子吡咯并會(huì)啉醌(PQQ);(b )選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚合物 的親水性聚合物；(c) 選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅藻土 以及天然和改良粘土的增稠劑；(d) 足以維持約4.5-約6. 5到6. 0的pH的緩沖液； (e) 表面活性劑；和(f) 介體。 備選的實(shí)施方案B備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述緩沖液是乙酸鹽、檸 檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液。 備選的實(shí)施方案C備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述表面活性劑是烷基芳 基聚醚醇。備選的實(shí)施方案D備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述介體是鐵氰化鉀。 備選的實(shí)施方案E備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述緩沖液為5.0-6.0。 備選的實(shí)施方案F備選的實(shí)施方案E的試劑組合物，其中所述組合物具有約60, 000 -約180, 000 cps (mPa*s )的粘度。 備選的實(shí)施方案G備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述親水性聚合物是纖維 素衍生物，選自羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥 丙基甲基纖維素。備選的實(shí)施方案H備選的實(shí)施方案G的試劑組合物，其中所述親水性聚合物是羥乙基纖維素。備選的實(shí)施方案I備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中所述增稠劑是無(wú)定形的未 處理的二氧化硅粉末。 備選的實(shí)施方案J備選的實(shí)施方案I的試劑組合物，其中所述無(wú)定形的未處理的二 氧化硅粉末是親水性的。 備選的實(shí)施方案K
備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其中對(duì)于每毫克組合物總重量 來(lái)說(shuō)存在1 - 8個(gè)單位的所述GDH-PQQ。 備選的實(shí)施方案L備選的實(shí)施方案B的試劑組合物，其中所述緩沖液以約30-約200 mM存在。備選的實(shí)施方案M備選的實(shí)施方案C的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在直到約0. 5重量％的所述聚醚醇。 備選的實(shí)施方案N備選的實(shí)施方案D的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約10-約20重量％的所述鐵氰化鉀。 備選的實(shí)施方案0備選的實(shí)施方案G的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約2-約10重量％的所述纖維素衍生物。 備選的實(shí)施方案P備選的實(shí)施方案I的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約1-約6重量％的所述無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末。 備選的實(shí)施方案Q備選的實(shí)施方案A的試劑組合物，其進(jìn)一步包括約5-約50 mM 的氯化鈣。備選的實(shí)施方案R 電化學(xué)生物傳感器，其包括(a) 非多孔性基材；(b) 安置在所述基材上的工作和反電極；(c) 絲網(wǎng)印刷在所述電極上的試劑組合物，所述組合物包括(1) 對(duì)于每毫克組合物總重量來(lái)說(shuō)，約1-8個(gè)單位的用于 氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH )和輔因子吡 咯并會(huì)啉醌(PQQ );(2) 選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚
合物的親水性聚合物；(3) 選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅 藻土以及天然和改良粘土的增稠劑；(4) 足以維持約4. 5-約6. 5的pH的緩沖液；(5) 表面活性劑；和(6) 介體；以及(d)用于所述電極和所述試劑組合物的防護(hù)罩。 備選的實(shí)施方案S 備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述緩沖液是約30 -約200 mM的乙酸鹽、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液。 備選的實(shí)施方案T備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述表面活性劑是 基于所述組合物總重量計(jì)直到約0. 5重量％的烷基芳基聚醚醇。 備選的實(shí)施方案U備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述介體是基于所 述組合物總重量計(jì)約10-約20重量％的鐵氰化鉀。 備選的實(shí)施方案V備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中包括足夠量的組分 (c) (2)和(c) (3)，以提供適合用于絲網(wǎng)印刷的組合物。 備選的實(shí)施方案W備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述組合物具有約 60， 000 -約180， 000 cps ( mPa.s )的粘度。 備選的實(shí)施方案X備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述親水性聚合物 是基于所述組合物總重量計(jì)約2-約10重量％的纖維素衍生物，選自 羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。備選的實(shí)施方案Y備選的實(shí)施方案X的電化學(xué)生物傳感器，其中所述親水性聚合物 是羥乙基纖維素。備選的實(shí)施方案z備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述增稠劑是基于 所述組合物總重量計(jì)約1-約6重量％的無(wú)定形的未處理的二氧化硅 粉末。備選的實(shí)施方案AA備選的實(shí)施方案Z的電化學(xué)生物傳感器，其中所述無(wú)定形的未處 理的二氧化硅粉末是親水性的。 備選的實(shí)施方案BB備選的實(shí)施方案R的電化學(xué)生物傳感器，其中所述試劑組合物包 括約5-約50 mM的氯化鈣。 備選的過(guò)程CC維持在用于電化學(xué)生物傳感器中的經(jīng)絲網(wǎng)印刷的試劑組合物之中 葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)活性的方法，包 括將試劑組合物進(jìn)行絲網(wǎng)印刷，所述方法包括下列物質(zhì)的作用(a)用于氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔 因子吡咯并壹啉醌(PQQ);(b )選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚合物 的親水性聚合物；(c) 選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅藻土 以及天然和改良粘土的增稠劑；(d) 足以維持約4. 5-約6.5的pH的緩沖液；(e) 表面活性劑；和 (f )介體。備選的過(guò)程DD備選的過(guò)程CC的方法，其中所述親水性聚合物是纖維素衍生物， 選自羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基曱基纖 維素。備選的過(guò)程EE備選的過(guò)程CC的方法，其中所述增稠劑是無(wú)定形的未處理的二氧 化硅粉末。備選的過(guò)程FF備選的過(guò)程CC的方法，其中所述pH維持在5. 0-6. 0。盡管本發(fā)明容許各種修飾和備選的形式，但具體實(shí)施方案舉例顯 示在附圖中，并詳細(xì)描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，并不希望將本發(fā)明限制 于所公開的具體形式，相反地，本發(fā)明將涵蓋落入在所附權(quán)利要求中 限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所有修飾、等價(jià)方案和備選方案。
權(quán)利要求
1.用于絲網(wǎng)印刷電化學(xué)生物傳感器的試劑組合物，其包括(a)用于氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)；(b)選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚合物的親水性聚合物；(c)選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅藻土以及天然和改良粘土的增稠劑；(d)足以維持約4.5-約6.5到6.0的pH的緩沖液；(e)表面活性劑；和(f)介體。
2. 權(quán)利要求1的試劑組合物，其中所述緩沖液是乙酸鹽、檸檬酸 鹽或琥珀酸鹽緩沖液。
3. 權(quán)利要求1的試劑組合物，其中所述表面活性劑是烷基芳基聚 醚醇。
4. 權(quán)利要求l的試劑組合物，其中所述介體是鐵氰化鉀。
5. 權(quán)利要求l的試劑組合物，其中所述緩沖液為5.0-6. 0。
6. 權(quán)利要求5的試劑組合物，其中所述組合物具有約60， 000 -約180， 000 cps (mPa.s )的粘度。
7. 權(quán)利要求1的試劑組合物，其中所述親水性聚合物是纖維素衍 生物，選自羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基 甲基纖維素。
8. 權(quán)利要求7的試劑組合物，其中所述親水性聚合物是羥乙基纖 維素。
9. 權(quán)利要求1的試劑組合物，其中所述增稠劑是無(wú)定形的未處理 的二氧化硅粉末。
10. 權(quán)利要求9的試劑組合物，其中所述無(wú)定形的未處理的二氧 化硅粉末是親水性的。
11. 權(quán)利要求l的試劑組合物，其中對(duì)于每毫克組合物總重量來(lái)說(shuō)存在1 - 8個(gè)單位的所述GDH-PQQ。
12. 權(quán)利要求2的試劑組合物，其中所述緩沖液以約30-約200 mM 存在。
13. 權(quán)利要求3的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在直到約0. 5重量％的所述聚醚醇。
14. 權(quán)利要求4的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約10 -約20重量％的所述鐵氰化鉀。
15. 權(quán)利要求7的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約2-約10重量％的所述纖維素衍生物。
16. 權(quán)利要求9的試劑組合物，其中基于所述組合物的總重量， 存在約1-約6重量％的所述無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末。
17. 權(quán)利要求1的試劑組合物，其進(jìn)一步包括約5-約50 mM的 氯化鈣。
18. 電化學(xué)生物傳感器，其包括(a) 非多孔性基材；(b) 安置在所述基材上的工作和反電極；(c) 絲網(wǎng)印刷在所述電極上的試劑組合物，所述組合物包括(1) 對(duì)于每毫克組合物總重量來(lái)說(shuō)，約1-8個(gè)單位的用于 氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH )和輔因子吡 咯并壹啉醌(PQQ );(2) 選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚 合物的親水性聚合物；(3) 選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅 藻土以及天然和改良粘土的增稠劑；(4 )足以維持約4. 5 -約6. 5的pH的緩沖液；(5) 表面活性劑；和(6) 介體；以及(d) 用于所述電極和所述試劑組合物的防護(hù)罩。
19. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述緩沖液是約30 -約200 mM的乙酸鹽、檸檬酸鹽或琥珀酸鹽緩沖液。
20. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述表面活性劑是基 于所述組合物總重量計(jì)直到約0. 5重量％的烷基芳基聚醚醇。
21. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述介體是基于所述 組合物總重量計(jì)約10-約20重量％的鐵氰化鉀。
22. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中包括足夠量的組分(c) (2)和(c) (3)，以提供適合用于絲網(wǎng)印刷的組合物。
23. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述組合物具有約 60， 000 -約180， 000 cps ( mPa's )的粘度。
24. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述親水性聚合物是 基于所述組合物總重量計(jì)約2-約10重量％的纖維素衍生物，選自羧 甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素。
25. 權(quán)利要求24的電化學(xué)生物傳感器，其中所述親水性聚合物是 羥乙基纖維素。
26. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述增稠劑是基于所 述組合物總重量計(jì)約1-約6重量％的無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉 末。
27. 權(quán)利要求26的電化學(xué)生物傳感器，其中所述無(wú)定形的未處理 的二氧化硅粉末是親水性的。
28. 權(quán)利要求18的電化學(xué)生物傳感器，其中所述試劑組合物包括 約5-約50 mM的氯化鉤。
29. 維持在用于電化學(xué)生物傳感器中的經(jīng)絲網(wǎng)印刷的試劑組合物 之中葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔因子吡咯并喹啉醌(PQQ)活性的方法， 包括將試劑組合物進(jìn)行絲網(wǎng)印刷，所述方法包括下列物質(zhì)的作用(a)用于氧化生物樣品中的葡萄糖的葡萄糖脫氫酶(GDH)和輔 因子吡咯并會(huì)啉醌(PQQ);(b )選自纖維素衍生物、天然樹膠和凝膠以及水溶性合成聚合物 的親水性聚合物；(C)選自無(wú)定形的未處理的二氧化硅粉末、滑石、云母、硅藻土以及天然和改良粘土的增稠劑；(d) 足以維持約4. 5-約6. 5的pH的緩沖液；(e) 表面活性劑；和 (f )介體。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述親水性聚合物是纖維素衍生物， 選自羧甲基纖維素鈉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羥丙基曱基纖 維素。
31. 權(quán)利要求29的方法，其中所述增稠劑是無(wú)定形的未處理的二 氧化硅粉末。
32. 權(quán)利要求29的方法，其中所述pH維持在5. 0-6. 0。
全文摘要
包含GDH-PQQ作為酶-輔因子并且絲網(wǎng)印刷在電化學(xué)生物傳感器的工作和反電極上的試劑組合物，通過(guò)正確選擇組分來(lái)維持酶試劑的活性。優(yōu)選的組合物包括親水性聚合物、無(wú)定形的未處理的二氧化硅、緩沖液、表面活性劑和介體。例如，該生物傳感器可用于葡萄糖的電流測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/487GK101133162SQ200680007118
公開日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
發(fā)明者A·H·查, H·G·斯普拉德林 申請(qǐng)人:拜爾保健有限公司