專(zhuān)利名稱：用于細(xì)菌取樣的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌的取樣并確定樣品中細(xì)菌存在情況的技術(shù)。主要是涉及 從表面取樣，作為保持室內(nèi)環(huán)境的清潔衛(wèi)生的操作的一部分。本發(fā)明在醫(yī)院 等機(jī)構(gòu)有特別的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及可用于這種技術(shù)中的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococus, MRSA)是一種對(duì)大多數(shù)現(xiàn)代抗生素具有耐藥性的細(xì)菌變種。健康個(gè)體通常 能夠耐受MRSA菌體，但是如果它們傳給已經(jīng)得病的人，就可能引起嚴(yán)重 的感染。結(jié)果，攜帶這種菌體的健康人不會(huì)有任何問(wèn)題，但是在更易被感染 的人所在的醫(yī)院或者其它環(huán)境就有嚴(yán)重的感染風(fēng)險(xiǎn)。MRSA能夠攜帶到皮膚 和其它表面上，并能長(zhǎng)時(shí)間保留。結(jié)果，個(gè)體之間能夠直接或間接地?cái)y帶上 MRSA，并能傳給易被感染的個(gè)體?，F(xiàn)在檢測(cè)MRSA的技術(shù)有些費(fèi)事，需要實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)處理，通常要花費(fèi) 2-3天。在這樣的時(shí)間跨度內(nèi)，存在的任何MRSA都已經(jīng)能夠在其各自的環(huán) 境中進(jìn)行廣泛的傳播。發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明涉及取樣技術(shù)，其能夠大大縮短檢測(cè)細(xì)菌(特別是正在 生長(zhǎng)或潛伏的MRSA，但不排除其它細(xì)菌)存在的時(shí)間。該技術(shù)不用復(fù)雜的 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，也不需要訓(xùn)練有素的微生物學(xué)家進(jìn)行操作。本發(fā)明的技術(shù)使用 了能夠選出并結(jié)合目標(biāo)細(xì)菌的噬菌體。所使用的噬菌體包含編碼熒光蛋白的 核酸，所述蛋白質(zhì)應(yīng)答于第一波長(zhǎng)的光而發(fā)出第二波長(zhǎng)的光。所述噬菌體接 觸到目標(biāo)細(xì)菌時(shí)，噬菌體進(jìn)行繁殖。因而，繁殖的噬菌體暴露于第一波長(zhǎng)的 光下時(shí)，以第二波長(zhǎng)發(fā)射的光量就升高。這樣就能夠通過(guò)光學(xué)方法迅速檢測(cè)細(xì)菌的存在。實(shí)踐中，可以控制光學(xué)方法，這樣，通常只需檢測(cè)發(fā)出的第二 波長(zhǎng)的光而確定是否存在目標(biāo)細(xì)菌。實(shí)施本發(fā)明時(shí)，噬菌體中優(yōu)選蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白(GFP)，該蛋白質(zhì)暴露于395納米波長(zhǎng)的光下吋發(fā)射510納米波長(zhǎng)的光。無(wú)論使用何種蛋白 質(zhì)，都要選出能對(duì)一種細(xì)菌菌株具有特異性的噬菌體，并且該噬菌體能對(duì) MRSA菌株具有特異性。本發(fā)明特別涉及的MRSA強(qiáng)毒株是菌株3、 15和 16，但不排除其它菌株。實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，能將選取的噬菌體置于固相基材(substrate)上，優(yōu) 選固定在所述基材上?？梢酝ㄟ^(guò)形成共價(jià)鍵完成固定，典型地，通過(guò)加入偶 聯(lián)劑而提供固定。斯特拉斯克萊德大學(xué)(University of Strathclyde)名下的國(guó) 際專(zhuān)利出版物WO 03/093462中論述了病毒(包括噬菌體)在固相基材上的 固定和穩(wěn)定。優(yōu)選為固定噬菌體的頭部基團(tuán)(head group),使尾部基團(tuán)(tail group)游離。用于本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的特別優(yōu)選的基材為1) 尼龍或另一種具有氨基或羧基表面基團(tuán)的聚合物，偶聯(lián)劑是碳二亞 胺或戊二醛；2) 纖維素或另一種含羥基的聚合物，偶聯(lián)劑包括乙烯基磺酰乙烯醚 (vinylsulfonylethylene ether)或三嗪；3) 聚乙烯或類(lèi)似的聚合物，偶聯(lián)劑包括電暈放電或高錳酸鹽氧化。 在本發(fā)明的實(shí)際操作中，典型的疑似攜帶細(xì)菌的樣品是表面。用攜帶噬菌體的基材擦拭這樣的表面，然后將基材(或該表面)暴露于第一波長(zhǎng)的光 下以確定細(xì)菌的存在。然而，如果可疑樣品是液體，可以單獨(dú)將噬菌體或在 基材上的噬菌體浸入該液體中，然后將其暴露在如上所述的光下。無(wú)論如何， 將細(xì)菌樣品與噬菌體接觸后浸入液體中對(duì)于使細(xì)菌生長(zhǎng)有一定益處?；谶@ 種目的的合適的液體介質(zhì)是包含碳源(例如葡萄糖)的水性營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)。在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)際檢測(cè)步驟中最好能夠使用相對(duì)簡(jiǎn)單的光學(xué)技術(shù)。例 如可以使用光電二極管或者光電倍增管觀察到噬菌體的熒光或者增強(qiáng)的熒
光，沒(méi)有必要量化熒光水平，只需要與通過(guò)接觸細(xì)菌而增殖前的噬菌體相比。 由于熒光的初始水平相對(duì)較低，所以鑒定實(shí)際熒光情況顯然能夠充分確定是 否有目標(biāo)細(xì)菌的存在。取樣裝置本身也是非常簡(jiǎn)單的單元。它典型地包括一個(gè)容器，該容器上 設(shè)置有負(fù)載噬菌體的基材。該基材可以是襯墊或擦環(huán)的形式，通過(guò)選取一個(gè) 合適的結(jié)構(gòu)(例如圓盤(pán)或環(huán)面)可以方便裝配。它可以具有一個(gè)粘合層，用 于連接將它帶到疑似負(fù)載目標(biāo)細(xì)菌的樣品表面上或環(huán)境中的裝置。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種使上述取樣技術(shù)更便利的裝置。它 包括一個(gè)放置了選取的噬菌體的測(cè)試元件(例如卡片)。用擦環(huán)擦拭疑似攜 帶目標(biāo)細(xì)菌的樣品，再擦拭所述元件使得從該樣品獲得的任何細(xì)菌均與噬菌 體接合。然后將所述元件接入一個(gè)傳感器單元，該傳感器單元將確定接觸細(xì) 齒后噬菌體引起的熒光是否增強(qiáng)。該單元發(fā)送一個(gè)相應(yīng)的信號(hào)，程序完成。 如果目標(biāo)細(xì)菌存在于樣品之中或之上，將能夠立刻顯現(xiàn)。所述程序能在大約 幾分鐘之內(nèi)完成。用過(guò)的元件可以丟棄。由于任何檢測(cè)出的細(xì)菌都已經(jīng)通過(guò) 接觸噬菌體而被殺除，所以測(cè)試后處理所述元件是安全的。負(fù)載噬菌體的元件可以包括 一 個(gè)營(yíng)養(yǎng)物存儲(chǔ)池以便于接觸目標(biāo)細(xì)菌的 噬菌體的繁殖。例如，該元件可以是具有鄰近或從一邊延伸形成的與營(yíng)養(yǎng)物 存儲(chǔ)池連通的凹槽或溝道的卡片。然而，通常所述營(yíng)養(yǎng)物和噬菌體一起固定 在所述元件上。這種元件能夠形成裝有針對(duì)不同目標(biāo)細(xì)菌的不同噬菌體的多 個(gè)凹槽或溝道，不過(guò)形成凹槽或溝道不是必需的。具有或不具有營(yíng)養(yǎng)物的噬菌體都能以沉積物的形式固定于所述元件上，例如通過(guò)印刷技術(shù)(printing technique)完成。凹槽、溝道或沉積物也可以是彩色編碼的。可以成組或成套生產(chǎn)所述元件，并且可以選擇具有不同填充的凹槽或溝 道的元件或卡片用于檢測(cè)不同的菌株。傳感器可以設(shè)計(jì)成用于監(jiān)測(cè)從各溝道 或凹槽發(fā)出的熒光，由此在同一檢測(cè)程序中，不僅能確定出細(xì)菌存在的位置， 而且能鑒定出這些不同的菌株中實(shí)際存在的一種或多種菌株。這些元件也能 夠帶有不僅與它們攜帶的噬菌體有關(guān)，而且與提供待測(cè)樣品的個(gè)體或場(chǎng)所的 詳細(xì)情況有關(guān)的信息，還有其它需要的鑒定信息?；谠撃康目梢栽谒鲈?件中柒成一個(gè)磁條。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置包括接收細(xì)菌樣品的取樣介質(zhì)；禾口位于所述取樣介質(zhì)之上或之中的多個(gè)噬菌體，其中各噬菌體包含編碼能 夠以 一 種輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。便利地，所述核酸編碼熒光蛋白，該熒光蛋白應(yīng)答于輸入波長(zhǎng)的光而發(fā) 射輸出波長(zhǎng)的光。優(yōu)選地，該熒光蛋白包括綠色熒光蛋白(GFP);輸入波長(zhǎng)是395納米， 輸出波長(zhǎng)是510納米。或者，所述核酸編碼能夠在有發(fā)光底物存在的情況下以所述輸出波長(zhǎng)發(fā) 光的化學(xué)發(fā)光蛋白。優(yōu)選地，所述化學(xué)發(fā)光蛋白為螢光素酶，所述發(fā)光底物為螢光素。 便利地，所述噬菌體特異侵染和/或裂解一種菌株。所述菌株優(yōu)選為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。所述菌株更優(yōu)選為MRSA菌株3、 15或16?；蛘?，所述菌株為炭疽桿菌(Bacillus anthracis)。所述取樣介質(zhì)優(yōu)選為固相基材。便利地，所述噬菌體固定在所述基材上。所述噬菌體優(yōu)選為通過(guò)共價(jià)鍵固定在所述基材上。更好地，通過(guò)偶聯(lián)劑提供所述噬菌體和基材間的共價(jià)鍵。優(yōu)選地，所述基材包含尼龍或另一種具有氨基或羧基表面基團(tuán)的聚合 物，所述偶聯(lián)劑是碳二亞胺或戊二醛；所述基材包含纖維素或另一種含羥基 的聚合物，所述偶聯(lián)劑包含乙烯基磺酰乙烯(vinylsulfonylethylene)醚或三嗪； 或者所述基材包含聚乙烯或類(lèi)似的聚合物，所述偶聯(lián)劑包含電暈放電或高錳鹽化。便利地，固定噬菌體的頭部基團(tuán)，使尾部基團(tuán)游離。
所述基材優(yōu)選包含塑料材質(zhì)。更好地，所述裝置還包含水性營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，優(yōu)選含葡萄糖的水性營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)。 便利地，所述細(xì)菌取樣裝置還包括一個(gè)容納所述取樣介質(zhì)的容器。該容器優(yōu)選為ELISA板。更好地，所述裝置包含多種噬菌體株，各株特異侵染和/或裂解一種不 同的菌株，各株包含編碼能夠以不同的輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。便利地，所述裝置包括通過(guò)樞軸連接的兩個(gè)薄板。優(yōu)選地，其中的一個(gè) 薄板有一個(gè)用于接收細(xì)菌樣品的蓋有滑片的孔。更好地，兩個(gè)薄板都具有蓋 有滑片的孔，當(dāng)兩個(gè)薄板在樞軸處折疊到一起時(shí)，所述孔能夠?qū)?zhǔn)。便利地， 節(jié)少--個(gè)板具有用于將兩個(gè)板粘在一起的粘合劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種細(xì)菌檢測(cè)裝置，該裝置包括接收前述任一權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的插口 ；以及能夠檢測(cè)從所述插口的位置發(fā)出的具有所述輸出波長(zhǎng)的光的光檢測(cè)器。便利地，所述細(xì)菌檢測(cè)裝置還包括能夠在所述插口的位置以輸入波長(zhǎng)發(fā) 光的光源。優(yōu)選地，所述細(xì)菌檢測(cè)裝置還包括一個(gè)與所述光檢測(cè)器進(jìn)行通訊的使用 者界面，以顯示對(duì)所述輸出波長(zhǎng)的光的檢測(cè)。更好地，所述細(xì)菌檢測(cè)裝置還包括介于所述光檢測(cè)器和使用者界面之間 的處理器，該處理器用于計(jì)算檢測(cè)到的所述輸出波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度隨時(shí)間的變 化，并通過(guò)使用者界面顯示強(qiáng)度的變化。便利地，所述光檢測(cè)器能夠檢測(cè)多種不同輸出波長(zhǎng)的光。優(yōu)選地，所述細(xì)菌檢測(cè)裝置還包括上述細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置。依據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了噬菌體在細(xì)菌檢測(cè)中的用途，其中，所 述噬菌體能夠結(jié)合所述細(xì)菌，由此應(yīng)答于噬菌體和細(xì)菌的結(jié)合而產(chǎn)生信號(hào)。依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明用于檢測(cè)樣品中細(xì)菌的細(xì)菌檢測(cè) 取樣裝置或者細(xì)菌檢測(cè)裝置的用途。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種檢測(cè)樣品中細(xì)菌的方法，該方法包括歩驟a) 將所述樣品暴露于噬菌體(各噬菌體包含編碼能夠發(fā)出一種輸出波 長(zhǎng)的光的蛋白質(zhì)的核酸)，使得樣品中的細(xì)菌受到所述噬菌體的侵染并且所 述核酸在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)；和b) 檢測(cè)以所述輸出波長(zhǎng)從樣品發(fā)出的光，檢測(cè)到光表明有細(xì)菌存在。 便利地，所述核酸編碼一種熒光蛋白，該熒光蛋白應(yīng)答于輸入波長(zhǎng)的光，發(fā)出輸出波長(zhǎng)的光，其中，所述方法還包括將樣品暴露于所述輸入波長(zhǎng)的光 的歩驟?；蛘?，所述核酸編碼化學(xué)發(fā)光蛋白，所述方法還包括在樣品中提供化學(xué) 發(fā)光底物的步驟。優(yōu)選地，所述噬菌體對(duì)一種菌株具有特異性，其中，檢測(cè)到所述輸出波 長(zhǎng)的光表明有所述菌株存在。更好地，所述菌株為MRSA菌株，優(yōu)選為MRSA菌株3、5或者16。 便利地，所述噬菌體是保藏號(hào)為NCIMB 9563的噬菌體株，該噬菌體還 包含編碼能夠發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。 便利地，所述菌株為炭疽桿菌。優(yōu)選地，所述噬菌體為炭疽桿菌噬菌體Y，該噬菌體還包含編碼能夠發(fā) 光的蛋白質(zhì)的核酸。優(yōu)選地，所述噬菌體是本發(fā)明的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的一部分。 更好地，步驟a)包括以樣品擦拭所述基材的步驟。便利地，步驟a)還包括在以所述噬菌體侵染后，使所述細(xì)菌在水性營(yíng)養(yǎng) 介質(zhì)(優(yōu)選為葡萄糖)中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。更好地，步驟b)包括在噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，檢測(cè)以所述輸出波長(zhǎng)發(fā)出的 光，檢測(cè)到所述輸出波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度升高就表明有細(xì)菌存在。更好地，將所述樣品暴露于多種噬菌體株，各株對(duì)不同的菌株具有特異 性，各株噬菌體編碼一種能夠以不同的輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)，所述方法還 包括檢測(cè)從樣品中發(fā)出的各種輸出波長(zhǎng)的光的步驟，檢測(cè)出一種波長(zhǎng)的光就 表明存在相應(yīng)的菌株。便利地，所述方法還包括用噬菌體殺滅樣品中細(xì)菌的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種具有保藏號(hào)為NCIMB 9563的株的 基因組并包含編碼發(fā)光蛋白質(zhì)的核酸的噬菌體。


現(xiàn)在通過(guò)實(shí)施例并參照所附示意圖描述本發(fā)明，其中圖1是本發(fā)明的取樣裝置的部分剖面?zhèn)纫晥D； 圖2表示如何檢測(cè)多種噬菌體以確定在它們之中是否有目標(biāo)細(xì)菌； 圖3是本發(fā)明的另一實(shí)施方式的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的平面圖； 圖4是本發(fā)明的又一實(shí)施方式的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的透視圖； 圖5是與圖4所示的實(shí)施方式聯(lián)用的細(xì)菌檢測(cè)裝置的透視圖。
具體實(shí)施方式
圖1中的裝置主要由帶柱塞4的管體2組成，能夠?qū)⒃撝麎嚎康饺h(huán) 6上以逐漸推上一組用于接觸待檢測(cè)樣品的襯墊或擦環(huán)8。各擦環(huán)8可以在 其外露或待外露的表面IO上固定選取的噬菌體?；蛘?，可以在正要使用前將噬菌體加到表面10上。然后使用所述裝置 擦拭或以其它方式接觸待檢測(cè)的樣品的表面或者周?chē)?，使表面IO暴露于可 能存在于樣品之上或之中的細(xì)菌。所述噬菌體包含與啟動(dòng)子可操作地連接的 編碼熒光蛋白(一種合適的蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白(GFP))的核酸。選取 用于檢測(cè)特定細(xì)菌(例如MRSA、或者其一種或多種菌株)的噬菌體。更具 體而言，噬菌體侵染并可以裂解特定的菌株。例如，保藏在英國(guó)國(guó)家工業(yè)和 海洋細(xì)菌菌種保藏中心(National Collection of Industrial and Marine Bacteria) 的保藏號(hào)為9563的噬菌體(NCIMB 9563)可以裂解MRSA菌株2和12-17， 該噬菌體適于作為這種噬菌體的基礎(chǔ)。當(dāng)然，必需對(duì)NCIMB 9563進(jìn)行改動(dòng) 以引入連接啟動(dòng)子的GFP基因。作為另一個(gè)例子，炭疽桿菌噬菌體Y (SEQ. ID NO: l)是針對(duì)炭疽桿菌的分型噬菌體類(lèi)型，也適合作為這種噬菌體的基礎(chǔ)。 各擦環(huán)8表示為圓盤(pán)，典型地是用塑料制成并在使用前滅菌。選取的噬 菌體優(yōu)選為通過(guò)共價(jià)固定而附著在擦環(huán)上，例如就像前面參考的國(guó)際專(zhuān)利說(shuō) 明書(shū)No: WO 03/093462所論述的。固定噬菌體的優(yōu)點(diǎn)是它們的結(jié)構(gòu)因此穩(wěn) 定起來(lái)，這延長(zhǎng)了它們的壽命。也能夠用可以支持目標(biāo)細(xì)菌生長(zhǎng)的水性營(yíng)養(yǎng) 介質(zhì)包裹各擦環(huán)，或者在使用前用這種溶液進(jìn)行浸濕。 一種合適的介質(zhì)是具 有0.％葡萄糖的甲基纖維素，而在其它實(shí)施方式中，使用另一種纖維素衍 生物、半乳甘露聚糖或者其它碳水化合物凝膠。然而重要的是，這種凝膠自 身不發(fā)出熒光。也要注意的是，針對(duì)待檢測(cè)的細(xì)菌可以改進(jìn)介質(zhì)。例如，用 噬菌體Y檢測(cè)炭疽桿菌時(shí)，可以在介質(zhì)中加入肽混合物。擦環(huán)8擦拭或以其它方式接觸待檢測(cè)樣品吋，如果存在目標(biāo)細(xì)菌，那么 噬菌體會(huì)實(shí)行它們的生物學(xué)功能而侵染該細(xì)菌，它們進(jìn)行繁殖，之后通過(guò)引 起每個(gè)細(xì)菌裂解或破裂而有效地破壞細(xì)菌。每個(gè)細(xì)菌中的噬菌體在增殖階 段，包含編碼熒光蛋白的核酸的噬菌體基因組進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。這樣，每一 個(gè)受浸染的細(xì)菌在其內(nèi)合成熒光蛋白。然后，細(xì)胞裂解時(shí)，從細(xì)菌中釋放熒 光蛋白，這些蛋白質(zhì)中的一部分整合到噬菌體顆粒中。然后對(duì)所述擦環(huán)進(jìn)行 光學(xué)檢測(cè)，這一階段在圖2中進(jìn)行了圖示。如圖2所示，擦環(huán)8的表面10暴露于來(lái)自提供紫外光的LED或者其它 光源。光通過(guò)合適的濾波器傳輸?shù)讲镰h(huán)8上，使得照射到表面10的光具有 合適的波長(zhǎng)；對(duì)于GFP，波長(zhǎng)為395納米。這種照射激發(fā)了任何增殖的噬菌 體，更具體而言是表面IO上表達(dá)的熒光蛋白，以第二選擇波長(zhǎng)發(fā)光；對(duì)GFP 而言，是發(fā)出510納米波長(zhǎng)的光，這種熒光可以利用光電二極管、光電倍增 管、電荷耦合器或其它檢測(cè)器16，通過(guò)一個(gè)相應(yīng)的510納米的濾波器18， 進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器16接收到的熒光量與噬菌體未增殖前發(fā)出的熒光量進(jìn)行 比較；任何顯著的增加無(wú)疑會(huì)表明目標(biāo)細(xì)菌的存在。如果需要，檢測(cè)器可以 偶聯(lián)一個(gè)合適的處理器以顯示有無(wú)細(xì)菌存在，或者顯示沾染水平。以這種方式進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是必須有噬菌體增殖才能檢測(cè)到細(xì)菌
存在，這就耍求細(xì)菌是存活的。因此本發(fā)明避免了如果樣品中有死菌時(shí)以其 它方式檢測(cè)可能出現(xiàn)的任何假陽(yáng)性結(jié)果。上述參照?qǐng)D2的說(shuō)明是針對(duì)擦環(huán)8及其表面10進(jìn)行的，考慮到細(xì)菌和 噬菌體在擦環(huán)和樣品間會(huì)雙向轉(zhuǎn)移，應(yīng)該理解，作為一種選擇或者對(duì)檢測(cè)擦 環(huán)的補(bǔ)充，可以對(duì)所擦拭或接觸的樣品進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。根據(jù)擦環(huán)或樣品的性 質(zhì)，檢測(cè)器可以設(shè)置在其有光源的對(duì)側(cè)。也應(yīng)該理解，光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的組件 能夠容易地集成為一個(gè)手持單元，該單元可以安裝到支持圖1的裝置的同一 框架內(nèi)。可是必須注意考慮使用干涉濾波器，用來(lái)將紫外光和綠色檢測(cè)光分 離開(kāi)。光學(xué)和系統(tǒng)幾何學(xué)的精心設(shè)計(jì)也有助于分離光源光和熒光。圖3表示了上述方法中使用的合適元件。圖3顯示了卡片20，典型地具 有信用卡的大小，并且由塑料制成。在一個(gè)表面上設(shè)置了從卡片前部邊緣24 延伸并用營(yíng)養(yǎng)物固定有噬菌體的四條直槽22。四條直槽各攜帶有對(duì)不同菌株 具有特異性的噬菌體。朝著后部邊緣26具有空余區(qū)域28，用于讓使用者用 P吋握持該卡片，該區(qū)域可以帶有一些可視標(biāo)識(shí)。也以輪廓表示了記載與該 卡片的使用或者它攜帶的噬菌體相關(guān)的信息的磁條30。使用時(shí)，用擦環(huán)擦拭疑似攜帶細(xì)菌的樣品，然后用擦環(huán)在卡片20表面 上的直槽22上擦拭。凹槽中的培養(yǎng)物將會(huì)增強(qiáng)己經(jīng)接觸了目標(biāo)菌的任何噬 菌體的生長(zhǎng)或增殖，進(jìn)而在暴露于所需波長(zhǎng)的光吋熒光增強(qiáng)。然后將帶有可 能受感染的凹槽的卡片插入到進(jìn)行光學(xué)分析的傳感器單元(未顯示)中的以 適當(dāng)方式形成的槽中。由于每條直槽22關(guān)聯(lián)一種特定的菌株，因此該傳感 器能夠分別確定是否檢測(cè)出各選取菌株。在一種實(shí)施方式中，替代前面的實(shí)施方式中提供的一組擦環(huán)，提供了一 個(gè)96孔ELISA板，每個(gè)孔中都加了包含前面的實(shí)施方式中的噬菌體的營(yíng)養(yǎng) 物樣品(例如在凝膠中)。使用時(shí)，例如將擦環(huán)沿著一個(gè)表面擦拭獲得樣品， 然后將樣品加入ELISA板的孔中。能夠用擦環(huán)在一個(gè)房間或建筑中的不同 位置進(jìn)行擦拭，取到的每一種樣品加入ELISA板的不同孔中。 一旦噬菌體 有足夠的時(shí)間侵染樣品中的任何細(xì)菌并進(jìn)行繁殖，就用ELISA板讀出器進(jìn)
行檢測(cè)。該實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是ELISA板讀出器在醫(yī)院等廣泛使用，因此本發(fā)明結(jié)合了己有的硬件。在圖4和5中顯示了一個(gè)具體實(shí)施例的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置和相應(yīng)的細(xì)菌 檢測(cè)裝置。參照?qǐng)D4，細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置31包括連接于樞軸35處的第一和 第二頁(yè)片33、 34的紙本或卡本32。第一和第二頁(yè)片33、 34各具有與"信用在第--頁(yè)片33鄰近樞軸35的--端，在第一頁(yè)片內(nèi)提供了一個(gè)能用透明 滑片覆蓋的孔36。在該滑片的內(nèi)表面上提供了大量噬菌體，每一個(gè)噬菌體都 包含在合適的啟動(dòng)子調(diào)控下編碼GFP的核酸。所述噬菌體共價(jià)固定在滑片 表而。提供了一個(gè)保護(hù)使用前的噬菌體的可移動(dòng)的粘性體44，封住了滑片的在第二頁(yè)片34上與第一頁(yè)片33上的第一孔36的位置相對(duì)應(yīng)的位置上 提供了第二孔37，第一和第二頁(yè)片33、 34壓在一起時(shí)，兩個(gè)孔36、 37相對(duì) 準(zhǔn)。第二孔37也用一個(gè)透明滑片封蓋。第二頁(yè)片34的剩余內(nèi)表面是用粘合 ^!38提供的，粘合層用包裝材料(未顯示)覆蓋?，F(xiàn)在參照?qǐng)D5，細(xì)菌檢測(cè)裝置39包括外殼40，在該外殼內(nèi)具有大小適 于接受卡片32的槽41 。細(xì)菌檢測(cè)裝置39也包括一個(gè)用于從該裝置和紙張打 印機(jī)出口 43提供輸入信號(hào)和接收輸出信號(hào)的控制屏42。在外殼40內(nèi)提供了 一個(gè)紫外光源和一個(gè)熒光檢測(cè)器(未顯示)，它們以與圖2所示的裝置相同 的原理工作。可以用控制面板42控制紫外光源，可以在控制屏42內(nèi)觀察到 熒光檢測(cè)結(jié)果。使用時(shí)，例如在醫(yī)院通過(guò)在表面上擦拭擦環(huán)，在擦環(huán)上收集樣品。將粘 性體44從第一頁(yè)片33上移開(kāi)，將所述樣品加到第一孔36中滑片的內(nèi)側(cè)上。 然后移除覆蓋粘合表面38的包裝材料，將第一和第二頁(yè)片33、 34壓合在一 起，并通過(guò)粘合表面38固定。這樣防止了樣品中的任何危險(xiǎn)物質(zhì)的漏出， 也防止了能夠污染樣品的任何物質(zhì)進(jìn)入。由于第一和第二孔36、 37的定位， 可以從卡片32的任一側(cè)看到樣品。
隨后，將樣品放置一段時(shí)間，使噬菌體侵染樣品中的任何細(xì)菌并在其體 內(nèi)進(jìn)行繁殖。然后將卡片32插入細(xì)菌檢測(cè)裝置39的槽4中，使用控制面板42激活 裝置。然后將紫外光直接照射到卡片32上，更具體而言，是通過(guò)第一和第 二孔36、 37。同吋，熒光檢測(cè)器檢測(cè)樣品中發(fā)出的任何熒光，如果檢測(cè)出任 何熒光，其強(qiáng)度就報(bào)告到控制面板42上。因此控制面板42提供了樣品中是 否存在能被所述噬菌體侵染的細(xì)菌的指示。在圖1的實(shí)施方式的變化中，沒(méi)有在擦環(huán)8上提供同樣的噬菌體，而是 提供多種不同的噬菌體株型。每一種噬菌體株型對(duì)不同的菌株特異。例如， 一種噬菌體株為裂解某些MRSA菌株的NCIMB 9563，第二種噬菌體株是對(duì) 炭疽桿菌特異的炭疽桿菌噬菌體y。另外，各株包含編碼以不同波長(zhǎng)發(fā)射熒 光的蛋白質(zhì)的核酸。如上所述使用擦環(huán)8，但是在檢測(cè)中觀察到兩種發(fā)射波 長(zhǎng)，能夠通過(guò)檢測(cè)是否存在以其中一種波長(zhǎng)或以兩種波長(zhǎng)發(fā)射的光，同吋確 定任一菌株是否存在。雖然上述實(shí)施方式例舉熒光蛋白為綠色熒光蛋白，但是應(yīng)該理解可以使 用許多其它不同類(lèi)型的熒光蛋白。其中的例子是造礁珊瑚(reefcoral)熒光 蛋白，市售商品名是Living Colors。也應(yīng)該理解在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，所述噬菌體包含編碼發(fā)光類(lèi)型 與熒光蛋白不同的蛋白質(zhì)的核酸。具體而言，該蛋白質(zhì)可以化學(xué)發(fā)光 (chemiluminescent)或者發(fā)磷光(phosphorescent)。合適的化學(xué)發(fā)光蛋白的 具體例子是螢光素酶。該61 KDa的酶在存在發(fā)光底物(例如螢光素)和ATP 的情況下催化兩步氧化反應(yīng)產(chǎn)生通常在綠色到黃色光譜內(nèi)的光。在這些實(shí)施 方式中，擦環(huán)8也包含要供給的發(fā)光底物和ATP，因此如果裂解細(xì)胞釋放出 螢光素酶，也能發(fā)光?，F(xiàn)在說(shuō)明生產(chǎn)本發(fā)明的成分所需的分子生物學(xué)方法。為了生產(chǎn)包含編碼 發(fā)光蛋白的核酸的合適噬菌體，首選需要選擇合適的對(duì)所述菌株具有特異性 的噬菌體(例如NCIMB 9563或者炭疽桿菌)。從這些噬菌體中提取DNA并川氯化銫梯度離心進(jìn)行純化。將噬菌體DNA消化成合適大小的片段，然后 克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中。同樣構(gòu)建了包含位于編碼發(fā)光蛋白的核酸兩側(cè)的合 適噬菌體序列的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒整合入穿梭載體，利用雙交換，將編碼發(fā)光 蛋白的基因?qū)胧删w基因組的相應(yīng)位置。另一種可獲得合適噬菌體的方法是利用包含發(fā)光蛋白基因的轉(zhuǎn)座子，然 后這些該轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到大量的噬菌體中。然后在大腸桿菌中繁殖這些噬菌體并選取表達(dá)發(fā)光蛋白的集落。分離所述重組噬菌體DNA并整合入合適 的宿主菌中(例如如果起始的噬菌體是NCIMB 9563，那么宿主菌株就是金 黃色葡萄球菌)。然后選出包含合適噬菌體的菌斑。下而的參考文獻(xiàn)提供了綠色熒光蛋白在用于細(xì)菌檢測(cè)的噬菌體中的用 途的 一些有用的討論1. Use of bioluminescent Salmonella for assessing the efficiency of constructed phage-based biosorbent. W. Sun, L Brovko.and M Griffiths J Ind. Micro & Biotech. 2000 25 273-275.2. Rapid Detection of Escherichia coli 157:1-17 by using Green Fluorescent Protein-labeled PP01 Batei'iophage. Masahito Oda, Masatomo Morita Hajime Unno and Yasunori Tanji Appl. Environ, Micro 2004 (Jan) 527 - 534.3 Nachweis Und ldentifikation von Bakterienstammen (Detection and Identification of bacterial strains) 01/09370 A2 Miller, Stefan.4 The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein. Yang F et al Nature Biotechnology 14, 1246-1251 (1996).
權(quán)利要求
1、 一種細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置包括 接收細(xì)菌樣品的取樣介質(zhì)；禾口位于取樣介質(zhì)之上或之中的多個(gè)噬菌體，其中各噬菌體包含編碼能夠以 輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述核酸編碼熒光蛋白，該熒光蛋白應(yīng)答于輸入波長(zhǎng)的光而發(fā)射輸出波長(zhǎng)的光。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述熒光蛋白包括 綠色熒光蛋白(GFP)，輸入波長(zhǎng)是395納米，輸出波長(zhǎng)是510納米。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述核酸編碼能夠 在有發(fā)光底物存在的情況下以所述輸出波長(zhǎng)發(fā)光的化學(xué)發(fā)光蛋白。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述化學(xué)發(fā)光蛋白 為螢光素酶，所述發(fā)光底物為螢光素。
6、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述噬菌 體特異侵染和/或裂解一種菌株。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述菌株為耐甲氧 西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant iS啤/^/ococcws v4w/，s, MRSA)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述菌株為MRSA 菌株3、 15或16。
9、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述噬菌 體為保藏號(hào)NCIMB 9563的噬菌體株，所述噬菌體還包含編碼能夠發(fā)光的蛋 白質(zhì)的核酸。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述菌 株為炭疽桿菌(5ac/〃ws a"f/7racz'力。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述噬菌體為炭 疽桿菌噬菌體Y ，所述噬菌體還包含編碼能夠發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。
12、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述取樣 介質(zhì)是固相基材。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述噬菌體固定 在所述基材上。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述噬菌體通過(guò) 共價(jià)鍵固定在所述基材上。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中通過(guò)偶聯(lián)劑提供 所述噬菌體和所述基材間的共價(jià)鍵。
16、 根據(jù)權(quán)利要求15所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述基材包含尼 龍或另一種具有氨基或羧基表面基團(tuán)的聚合物，所述偶聯(lián)劑是碳二亞胺或戊 二醛；所述基材包含纖維素或另一種含羥基的聚合物，所述偶聯(lián)劑包含乙烯 基磺酰乙烯醚或三嗪；或者所述基材包含聚乙烯或類(lèi)似的聚合物，所述偶聯(lián) 劑包含電暈放電或高錳酸鹽氧化。
17、 根據(jù)權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述 噬菌體通過(guò)其頭部基團(tuán)固定，其尾部基團(tuán)游離。
18、 根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述 基材包含塑料材質(zhì)。
19、根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置還含有 水性營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，該介質(zhì)優(yōu)選含有葡萄糖。
20、 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置還含有 一個(gè)用于接收取樣介質(zhì)的容器。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，其中所述容器為ELISA板。
22、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置含有 多種噬菌體株，各株特異侵染和/或裂解一種不同的菌株，各株噬菌體包含編 碼能夠以不同的輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。
23、 一種細(xì)菌檢測(cè)裝置，該裝置包括用于接收根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的插口 ；以 及能夠檢測(cè)從所述插口的位置發(fā)出的具有所述輸出波長(zhǎng)的光的光檢測(cè)器。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置，當(dāng)其引用權(quán)利要求2或3 時(shí)，所述細(xì)菌檢測(cè)裝置還包括能夠在所述插口的位置以輸入波長(zhǎng)發(fā)光的光 源。
25、 根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置，該裝置還包括一個(gè)與 所述光檢測(cè)器進(jìn)行通訊的使用者界面，以顯示對(duì)所述輸出波長(zhǎng)的光的檢測(cè)。
26、 根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置，該裝置還包括介于所述光 檢測(cè)器和使用者界面之間的處理器，該處理器用于計(jì)算檢測(cè)到的所述輸出波 長(zhǎng)的光的強(qiáng)度隨吋間的變化，并通過(guò)所述使用者界面顯示該變化。
27、 根據(jù)權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置，其中所述光檢 測(cè)器能夠檢領(lǐng)lj多種不同輸出波長(zhǎng)的光。
28、 根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置，該裝置還包括 權(quán)利要求-22中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置。
29、 噬菌體在細(xì)菌檢測(cè)中的用途，其中，所述噬菌體能夠與所述細(xì)菌結(jié) 合，由此應(yīng)答于噬菌體和細(xì)菌的結(jié)合而產(chǎn)生信號(hào)。
30、 權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置或者權(quán)利要求 23-28中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)裝置用于檢測(cè)樣品中的細(xì)菌的用途。
31、 一種檢測(cè)樣品中細(xì)菌的方法，該方法包括步驟a) 將所述樣品暴露于噬菌體，各噬菌體包含編碼能夠發(fā)出一輸出波長(zhǎng)的 光的蛋白質(zhì)的核酸，使得樣品中的細(xì)菌受到所述噬菌體的侵染，并且所述核 酸在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)；以及b) 檢測(cè)樣品中以所述輸出波長(zhǎng)發(fā)出的光，檢測(cè)出光表明有細(xì)菌存在。
32、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述核酸編碼熒光蛋白，所述 熒光蛋白應(yīng)答于輸入波長(zhǎng)的光而以輸出波長(zhǎng)發(fā)出光，其中所述方法還包括將 所述樣品暴露于所述輸入波長(zhǎng)的光的步驟。
33、 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述核酸編碼化學(xué)發(fā)光蛋白， 所述方法還包括在樣品中提供化學(xué)發(fā)光底物的步驟。
34、 根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述噬菌體對(duì)一種 菌株具有特異性，其中檢測(cè)到所述輸出波長(zhǎng)的光表明有所述菌株存在。
35、 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述菌株為MRSA菌株，優(yōu)選 為MRSA菌株3、 15或者16。
36、 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述菌株為炭疽桿菌。
37、 根據(jù)權(quán)利要求31-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述噬菌體是權(quán)利 要求1-23中任一項(xiàng)所述的細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置的一部分。
38、 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，當(dāng)其引用權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)時(shí)， 其中步驟a)包括以樣品擦拭所述基材的步驟。
39、 根據(jù)權(quán)利要求31-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)還包括，在 以所述噬菌體侵染后，將所述細(xì)菌在水性營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)的步驟，所述 介質(zhì)優(yōu)選為葡萄糖。
40、 根據(jù)權(quán)利要求31-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟b)包括，在所 述噬菌體侵染細(xì)菌時(shí)，檢測(cè)所述輸出波長(zhǎng)的光，檢測(cè)到所述輸出波長(zhǎng)的光的 強(qiáng)度升高表明有細(xì)菌存在。
41、 根據(jù)權(quán)利要求31-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述樣品暴露于 多種噬菌體株，各噬菌體株對(duì)不同的菌株具有特異性，各噬菌體株編碼能夠 以不同的輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)，所述方法還包括檢測(cè)從樣品中發(fā)出的各種 輸出波長(zhǎng)的光的步驟，檢測(cè)出一種波長(zhǎng)的光就表明存在相應(yīng)的菌株。
42、 根據(jù)權(quán)利要求31-41中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括用所述噬菌體殺滅所述樣品中的細(xì)菌的步驟。
43、 一種噬菌體，其具有保藏號(hào)為NCIMB 9563的株的基因組并且還包含編碼發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。
全文摘要
一種細(xì)菌檢測(cè)取樣裝置，該裝置包括接收細(xì)菌樣品的取樣介質(zhì)；和多個(gè)噬菌體。這些噬菌體位于取樣介質(zhì)之上或之中。各噬菌體包含編碼能夠以輸出波長(zhǎng)發(fā)光的蛋白質(zhì)的核酸。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101147067SQ200680007038
公開(kāi)日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2006年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
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