專利名稱：建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測建蘭花葉病毒的試劑盒及其制備和檢測方法，特別是涉及建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒及制備該試劑盒的方法與應(yīng)用該試劑盒進(jìn)行建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測的檢測方法。
背景技術(shù)：
建蘭花葉病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，是危害蘭科植物的兩種主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齒蘭、建蘭等。蘭花一旦感染ORSV，其葉片常產(chǎn)生黃化條紋或不規(guī)則褪綠色斑塊，病株花部甚至出現(xiàn)畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯，對(duì)蘭花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值造成嚴(yán)重影響。我國蘭花資源豐富，但研究表明，無論是盆栽的地生蘭花還是組培的蘭花，該病毒病均相當(dāng)普遍.鑒于ORSV對(duì)我國蘭花產(chǎn)業(yè)的危害性，研究其檢測技術(shù)已十分重要。
植物病毒檢測常用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結(jié)合的特異性與酶的高效催化性相結(jié)合的技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但操作步驟多，耗時(shí)長，且需要相對(duì)昂貴的酶標(biāo)抗體和96孔酶標(biāo)板。
雙抗夾心酶聯(lián)檢測是在酶聯(lián)免疫吸附測定方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測方法，適于檢測大量樣品的較為靈敏、可靠和操作簡便的檢測技術(shù)，但目前尚未見有關(guān)雙抗夾心酶聯(lián)用于檢測建蘭花葉病毒的文獻(xiàn)報(bào)道以及用于檢測該病毒的雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測的試劑盒。
本發(fā)明的另一目的，在于提供制備建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的方法。
本發(fā)明的再一目的，在于提供利用制備的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)檢測建蘭花葉病毒的檢測方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液和酶標(biāo)板組成，各種用液主要包括高效價(jià)抗血清、標(biāo)記抗體、陽性樣品和陰性樣品，各種緩沖液和顯色劑。
所述的陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒。
所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
所述的緩沖液包括包被緩沖液20-80mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；終止液1-5mol/L硫酸溶液；所述的顯色劑為0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的制備方法，它主要包括下列步驟1、建蘭花葉病毒的提取和純化取100g曼陀羅病葉加入100ml0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)勻漿后，加入100ml氯仿攪拌30分鐘。在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘。取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，攪拌后靜置1小時(shí)。在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，棄上清，用0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)充分溶解沉淀后重復(fù)一次PEG沉淀。第二次取沉淀后用5mM硼酸緩沖液懸浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，取上清于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)。取沉淀用0.01MPB(pH7.0)重新懸浮，再進(jìn)行一次差速離心，最后取沉淀用適量0.01MPB(pH7.0)溶解。若雜質(zhì)太多，再進(jìn)行一次差速離心。取粗提純病毒置于10％-40％蔗糖墊梯度，于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)。收集病毒條帶，再次于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)沉淀病毒，最后溶解于0.01MPB(pH7.0)中，置于-40℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測定效價(jià)；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的建蘭花葉病毒多克隆抗體。
3抗體標(biāo)記通過戊二醛二步法將堿性磷酸酶標(biāo)記到純化抗體。每1mg抗體加0.1％戊二醛0.05ml，靜置1小時(shí)，置于透析袋中除去多余戊二醛。加入0.5mg堿性磷酸酶，混勻后置于4℃?zhèn)溆谩?br> 4、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
5、各種用液的制備包被緩沖液20-80mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；終止液1-5mol/L硫酸溶液；顯色劑為0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的檢測方法為雙抗夾心酶聯(lián)檢測法，它包括以下步驟1)包被用碳酸鹽包被緩沖液，將ORSV多克隆標(biāo)記抗體抗體稀釋至1～10ug/ul，在酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中，每孔100ul，37℃，孵育2小時(shí)；2)封閉傾去包被液，脫脂奶粉的封閉液，每孔100ul，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；3)加樣加入待檢測的樣品，每孔100ul，并設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；4)標(biāo)記示蹤加入酶標(biāo)抗體，每孔100ul，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；5)顯色加入用5-20％pH9.8二乙醇胺底物緩沖液配制的顯色液，每孔100u l，37℃孵育30分鐘；6)終止反應(yīng)與檢測判定加入1-5mol/L硫酸的終止液，每孔50ul，在酶標(biāo)儀上測定OD405值。
采用上述方案后，本發(fā)明由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液、酶標(biāo)板組裝成經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測試劑盒。試劑盒的制備方法簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。樣品用量少，在較短的時(shí)間內(nèi)就可以完成檢測，且結(jié)果易于保存，應(yīng)用該檢測試劑盒進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)聯(lián)檢測的方法與其他血清學(xué)檢驗(yàn)方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等更多的優(yōu)點(diǎn)，所以便于在基層單位推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用的主要試劑建蘭花葉病毒多克隆抗體為廈門華僑亞熱帶植物引種園制備；PEG6000、2-巰基乙醇、Triton-100、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；堿性磷酸酶、PNPP-Na、DEAE離子交換填充物、IgG親合層析填充物購自Pierce公司；試驗(yàn)中所使用的其他常規(guī)藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 一、試劑盒建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液和酶標(biāo)板組成，各種用液主要包括高效價(jià)抗血清、標(biāo)記抗體、陽性樣品和陰性樣品，各種緩沖液和顯色劑。
陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒。
陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
緩沖液包括包被緩沖液50mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液50mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液100mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液10％ pH9.8二乙醇胺溶液；終止液2mol/L硫酸溶液；顯色劑為0.1mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
二、制備方法本發(fā)明建蘭花葉病毒檢測試劑盒的制備方法，它包括下列步驟1、建蘭花葉病毒的提取和純化取100g曼陀羅病葉加入100ml0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)勻漿后，加入100ml氯仿攪拌30分鐘。在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘。取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，攪拌后靜置1小時(shí)。在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，棄上清，用0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)充分溶解沉淀后重復(fù)一次PEG沉淀。第二次取沉淀后用5mM硼酸緩沖液懸浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，取上清于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)。取沉淀用0.01MPB(pH7.0)重新懸浮，再進(jìn)行一次差速離心，最后取沉淀用適量0.01MPB(pH7.0)溶解。若雜質(zhì)太多，再進(jìn)行一次差速離心。取粗提純病毒置于10％-40％蔗糖墊梯度，于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)。收集病毒條帶，再次于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)沉淀病毒，最后溶解于0.01MPB(pH7.0)中，置于-40℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測定效價(jià)；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的建蘭花葉病毒多克隆抗體。
3、抗體標(biāo)記通過戊二醛二步法將堿性磷酸酶標(biāo)記到純化抗體。每1mg抗體加0.1％戊二醛0.05ml，靜置1小時(shí)，置于透析袋中除去多余戊二醛。加入0.5mg堿性磷酸酶，混勻后置于4℃?zhèn)溆谩?br> 4、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
5、各種用液的制備包被緩沖液50mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液50mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液100mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液10％ pH9.8二乙醇胺溶液；終止液2mol/L硫酸溶液；顯色劑為0.1mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
三、檢測方法實(shí)施例建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的檢測方法為雙抗夾心酶聯(lián)檢測法，它包括以下步驟1)包被用50mmol/L pH9.6碳酸鹽包被緩沖液，將ORSV多克隆標(biāo)記抗體抗體稀釋至10ug/ul，在酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中，每孔100ul，37℃，孵育2h；2)封閉傾去包被液，加入50mmol/L pH7.4 PBS+1％脫脂奶粉的封閉液，每孔100ul，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗滌緩沖液洗滌三次；3)加樣加入待檢測的樣品，每孔100ul，并設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗滌緩沖液洗滌三次；4)標(biāo)記示蹤加入酶標(biāo)抗體，每孔100ul，37℃孵育1h，而后用100mmol/L pH7.4 PBS+0.1％Tween20的洗滌緩沖液洗滌三次；5)顯色加入用10％pH9.8二乙醇胺底物緩沖液配制的顯色液，每孔100ul，37℃孵育30min；6)終止反應(yīng)與檢測判定加入2mol/L硫酸的終止液，每孔50ul，在酶標(biāo)儀上測定OD405值。
雙抗夾心酶聯(lián)檢測判定標(biāo)準(zhǔn)待測樣品按OD405/陰性O(shè)D405＞2判定為陽性，OD405/陰性O(shè)D405＜2判定為陰性。
待測樣品按以上標(biāo)準(zhǔn)，定性判斷待測樣品檢測結(jié)果的陰、陽；為檢驗(yàn)雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒效果，用該法檢測了40份蘭花樣品。
檢測結(jié)果如下

注“+”代表陽性；“-”代表陰性31份由RT-PCR檢測陽性的樣品，DIBA檢測陽性樣品30份，1份陰性；9份由RT-PCR檢測陰性的樣品，DIBA檢測陰性樣品份，陽性樣品1份；由檢測結(jié)果可知DIBA的敏感性為96.77％；特異性88.89％；檢測準(zhǔn)確性為95％。
權(quán)利要求
1.建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液和酶標(biāo)板組成，各種用液主要包括高效價(jià)抗血清、標(biāo)記抗體、陽性樣品和陰性樣品，各種緩沖液和顯色劑，其特征在于所述的陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒；所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒，其特征在于所述的緩沖液包括包被緩沖液20-80mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液5-20％pH9.8二乙醇胺溶液；終止液1-5mol/L硫酸溶液；所述的顯色劑為0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述的制備方法主要包括下列制備過程1)、建蘭花葉病毒的提取和純化取100g曼陀羅病葉加入100ml0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)勻漿后，加入100ml氯仿攪拌30分鐘，在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，攪拌后靜置1小時(shí)，在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，棄上清，用0.5M檸檬酸緩沖液(pH6.5)充分溶解沉淀后重復(fù)一次PEG沉淀，第二次取沉淀后用5mM硼酸緩沖液懸浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)離心20分鐘，取上清于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)，取沉淀用0.01M PB(pH7.0)重新懸浮，再進(jìn)行一次差速離心，最后取沉淀用適量0.01M PB(pH7.0)溶解，若雜質(zhì)太多，再進(jìn)行一次差速離心，取粗提純病毒置于10％-40％蔗糖墊梯度，于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)，收集病毒條帶，再次于超速離心機(jī)使用P42A轉(zhuǎn)頭40,000rpm離心2小時(shí)沉淀病毒，最后溶解于0.01M PB(pH7.0)中，置于-40℃保存?zhèn)溆茫?)、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測定效價(jià)；通過辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體，用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過夜，透析除鹽，取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的建蘭花葉病毒多克隆抗體；3)、抗體標(biāo)記通過戊二醛二步法將堿性磷酸酶標(biāo)記到純化抗體，每1mg抗體加0.1％戊二醛0.05ml，靜置1小時(shí)，置于透析袋中除去多余戊二醛，加入0.5mg堿性磷酸酶，混勻后置于4℃?zhèn)溆茫?)、陽性、陰性樣品的制備陽性樣品為純化的建蘭花葉病毒病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液；5)、各種用液的制備包被緩沖液20-80mmol/L pH9.6碳酸鹽溶液；封閉緩沖液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉；洗滌緩沖液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物緩沖液5-20％pH9.8二乙醇胺溶液；終止液1-5mol/L硫酸溶液；顯色劑為0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于所述的檢測方法為雙抗夾心酶聯(lián)檢測法，包括以下步驟1)包被用碳酸鹽包被緩沖液，將ORSV多克隆標(biāo)記抗體抗體稀釋至1～10ug/ul，在酶標(biāo)板各反應(yīng)孔中，每孔100ul，37℃，孵育2小時(shí)；2)封閉傾去包被液，脫脂奶粉的封閉液，每孔100ul，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；3)加樣加入待檢測的樣品，每孔100ul，并設(shè)立陰性、陽性和空白對(duì)照，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；4)標(biāo)記示蹤加入酶標(biāo)抗體，每孔100ul，37℃孵育1小時(shí)，而后用洗滌緩沖液洗滌三次；5)顯色加入用5-20％pH9.8二乙醇胺底物緩沖液配制的顯色液，每孔100ul，37℃孵育30分鐘；6)終止反應(yīng)與檢測判定加入1-5mol/L硫酸的終止液，每孔50ul，在酶標(biāo)儀上測定OD405值。
全文摘要
本發(fā)明公開了建蘭花葉病毒雙抗夾心酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法，試劑盒由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液和酶標(biāo)板組裝成經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測試劑盒。試劑盒的制備方法簡便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。樣品用量少，在較短的時(shí)間內(nèi)就可以完成檢測，且結(jié)果易于保存，應(yīng)用該檢測試劑盒進(jìn)行雙抗夾心酶聯(lián)檢測的方法與其他血清學(xué)檢驗(yàn)方法相比具有簡單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等更多的優(yōu)點(diǎn)，所以便于在基層單位推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1975427SQ20061016443
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者明艷林, 鄭國華, 童慶宣, 李梅, 陳良華 申請(qǐng)人:廈門華僑亞熱帶植物引種園