專利名稱：一種在maldi-tof-ms樣品靶上快速富集、鑒定磷酸肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種富集、鑒定磷酸肽的方法。具體的說就是一種在修飾 的基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)樣品靶上快速富集、鑒定磷 酸肽的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾之一，對細(xì)胞的增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 細(xì)胞凋亡等生命過程具有重要的調(diào)控作用。近幾年來，質(zhì)譜(MS)已經(jīng)廣泛用于磷酸化蛋白 質(zhì)的鑒定。由于細(xì)胞/組織內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)的化學(xué)計(jì)量值較低，以及質(zhì)譜分析時(shí)非磷酸化肽段 對磷酸肽存在信號(hào)抑制，使得直接質(zhì)譜分析磷酸化蛋白質(zhì)或磷酸肽存在很大的困難。從大量 的蛋白質(zhì)酶解肽段中富集或選擇性的分離磷酸肽，可以促進(jìn)磷酸肽的質(zhì)譜檢測。
目前，最有效、常用的富集磷酸肽的方法是固定化金屬離子親和色譜(IMAC)。在IMAC 中，帶正電荷的金屬螯合離子與帶負(fù)電荷的磷酸肽產(chǎn)生靜電吸引，導(dǎo)致磷酸肽被保留在固定 化的金屬螯合離子上。 一些金屬氧化物和氫氧化物如Ti02， Zr02， Al(OH)3等也用于磷酸肽的 富集。使用IMAC富集磷酸肽通常采用的步驟含磷酸肽的樣品負(fù)載在IMAC柱或ZipTipMc上， 清洗除去非磷酸肽，將保留的磷酸肽洗脫下來，脫鹽后進(jìn)行ESI/MALDI-TOF-MS分析；或者 將吸附有磷酸肽的IMAC填料直接轉(zhuǎn)移到MALDI靶上進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。這些操作歩 驟非常煩瑣，容易導(dǎo)致樣品損失，不適合微量樣品的分析。最近，文獻(xiàn)報(bào)道了兩個(gè)新的方法， 即在硅片上分別鍵合Feh-氨基三乙酸和磷酸鋯，將樣品直接負(fù)載在修飾的硅片上來富集磷酸 肽，然后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。這種富集方法對靶的化學(xué)修飾過程非常復(fù)雜，不能用 于MALDI-TOF-MS分析常用的不銹鋼靶，同時(shí)處理多個(gè)樣品困難。這些缺點(diǎn)限制了其在大規(guī) ?；姿峄鞍踪|(zhì)組分析中應(yīng)用。Chen等人合成了一種Fe30/Ti02納米粒子，納米粒子在離 心管內(nèi)富集磷酸肽后，清洗除去非磷酸肽和鹽后，利用磁鐵隔離出納米粒子并轉(zhuǎn)移到樣品靶 上進(jìn)行MALDI-MS分析[Cheng-Tai Chen, Yu-Chie Chen， Fe304/Ti。2 Core/Shell nanoparticles as affinity probes for the analysis of phosphopeptides using TiO2 surface-assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry(基于Fe304/Ti02親和探針的Ti02表面輔助激光解析離子化質(zhì)譜分 析磷酸肽)，Anal. Chem, 2005, 77: 5912-5919]。由于在離心管內(nèi)手工操作，轉(zhuǎn)移過程導(dǎo)致樣品 損失， 一次最多只能處理幾個(gè)樣品，無法滿足蛋白組學(xué)大規(guī)模、高通量分析的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在MALDI靶上快速富集、鑒定磷酸肽的方法。 為實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案其包括以下步驟
(1) 使用選擇性吸附磷酸肽的材料制備具磁性的納米粒子；
(2) 將納米粒子移取到MALDI靶的樣品孔上，施加磁場吸附磁性納米粒子；
(3) 將樣品負(fù)載在上述的樣品孔上，孵育以吸附磷酸肽；
(4) 清洗MALDI靶，除去非磷酸肽和鹽；
(5) 去除磁場，加入基質(zhì)與富集的磷酸肽共結(jié)晶；
(6) 利用MALDI-TOF-MS分析磷酸肽。
該方案的原理如下
發(fā)明使用的納米粒子是一種雙功能納米顆粒，具有磁性并可選擇性吸附磷酸肽。加樣后 可直接對磷酸肽進(jìn)行富集，再利用其與磁場的相互作用，將納米粒子吸附在MALDI耙上， 防止在清洗除去非磷酸肽和鹽時(shí)納米粒子流失。清洗完成后去除磁場，磷酸肽被保留在 MALDI耙上，即可進(jìn)行正常的MALDI-TOF-MS分析。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的原理，施加磁場的操作可在步驟(4)"清洗MALDI靶，除去非磷 酸肽和鹽"前的任何時(shí)間進(jìn)行，例如在負(fù)載樣品后施加磁場；或孵育吸附磷酸肽后施加磁場； 也可在移取磁性納米粒子前施加磁場。
所述納米粒子優(yōu)選使用雙核結(jié)構(gòu)的納米顆粒，其內(nèi)核為一磁性材料，如Fe304;外層為 可選擇性吸附磷酸肽的材料，如Ti02或Zr02。在Chen的文獻(xiàn)中，即公開了該納米顆粒的制 備方法。該納米粒子也可采用將磁性材料與磷酸肽吸附材料物理連接的方式制得。
為提高操作的自動(dòng)化水平，使納米粒子均勻分布，移取時(shí)優(yōu)選采用液態(tài)形式，如制備納 米粒子懸浮液，以自動(dòng)移液器移取。
為便于操作，施加的磁場優(yōu)選采用外源的固定磁場，如在MALDI靶的背面放置一塊磁鐵 以達(dá)到吸附納米粒子的作用。
在吸附有磷酸肽的靶上直接加入基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，避免了以前的富集程序 先將吸附的磷酸肽洗脫下來再點(diǎn)靶進(jìn)行分析的缺點(diǎn)，提高了樣品的利用率。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)
l.操作快速簡便，適用范圍廣。本發(fā)明對MALDI靶的修飾是基于納米粒子對MALDI靶 的物理吸附。物理吸附不涉及化學(xué)反應(yīng)，可用于表面非常惰性的不銹鋼靶，也可以用于其它 基底材料的MALDI靶，如金靶、硅片等。吸附前不需要對MALDI靶進(jìn)行任何處理，整個(gè)修 飾過程非常簡單、快速，五分鐘可完成對192孔靶的修飾。
2. 成本低，改造方便。本發(fā)明對MALDI靶施加一個(gè)磁場，該磁場僅在清洗步驟有用，即 強(qiáng)化納米粒子與MALDI靶的相互作用，防止納米粒子在清洗時(shí)流失。清洗完成后即可去除 磁場，進(jìn)行正常的MALDI-TOF-MS分析。
3. 特別適用于大樣本的處理。本發(fā)明修飾的MALDI靶可以一次批量處理多個(gè)樣品。不同 樣品分別負(fù)載在修飾的MALDI靶的不同樣品孔內(nèi)，孵育完成后將整個(gè)靶放入清洗溶液清洗 以除去非磷酸肽和鹽。對于MALDI-TOF-MS分析常用的192孔耙，平均每個(gè)樣品的富集時(shí) 間僅為9秒鐘，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前富集磷酸肽方法需要的時(shí)間。
4. 特別適用于微量樣品處理，污染小。本發(fā)明是在修飾的MALDI耙上直接富集磷酸肽， 富集完成后即可進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。從樣品負(fù)載到MAKDI靶上到最后的MS分析， 整個(gè)過程不需要對樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)移，極大地降低了樣品損失，適合處理微量的樣品，如二維凝 膠電泳的膠內(nèi)酶解肽段。


圖1是發(fā)明技術(shù)方案的流程圖。(a)為未修飾的MALDI靶；(b)為移加納米粒子1后的 MALDI靶，2為施加的磁場，；(c)表示在靶上負(fù)載樣品3; (d)表示清洗除去非磷酸肽和鹽 后，富集的磷酸肽4。
圖2是ct-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物不富集直接MS分析 (b)酶解產(chǎn)物在修飾的MALDI靶富集后MS分析。
圖3是I3酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的MALDI-T0F-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物不富集直接MS分析； (b)酶解產(chǎn)物在修飾的MALDI靶富集后MS分析。
圖4是五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖。(a)酶解產(chǎn)物不富集直接 MS分析；(b)酶解產(chǎn)物在修飾的MALDI靶富集后MS分析。
圖5是不同量的P-酪蛋白酶解產(chǎn)物在修飾的MALDI靶同時(shí)富集后的MALDI-TOF-MS圖。 (a) lOOOfinol; (b)腦finol; (c) lOfinol; (d) 0 finol。
圖6是相當(dāng)于200 ng的a-酪蛋白質(zhì)和卵清蛋白SDS-PAGE膠內(nèi)酶解產(chǎn)物富集后的 MALDI-TOF-MS圖。(a) a-酪蛋白質(zhì)(b)卵清蛋白。
圖7是相當(dāng)于20 ng (亞皮摩爾級(jí))的a-酪蛋白質(zhì)和卵清蛋白SDS-PAGE膠內(nèi)酶解產(chǎn)物富 集后的MALDI-TOF-MS圖。(a) a-酪蛋白質(zhì)(b)卵清蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
取一定量制備的納米粒子到1.5 mL的離心管，加入0.15%的三氟乙酸溶液，超聲1分鐘， 得到0.3 mg/mL的納米粒子懸浮液。
實(shí)施例2
分別移取0.8pL (240 ng)納米離子懸浮液分布在基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜 儀(4700 proteomics Analyzer)不銹鋼靶的樣品孔上，晾干后負(fù)載2 pmol的a-酪蛋白質(zhì)酶解 產(chǎn)物，在室溫下孵育10分鐘；將靶浸入盛有4 0mL20。/。乙腈-0.1。/。三氟乙酸溶液的培養(yǎng)皿中， 在搖床上溫和清洗15分鐘，除去非磷酸肽和鹽，取出用Millpore水沖洗耙一次，晾干后加 DHB基質(zhì)(20mg/mL-DHB-%H3PO4-50%ACN)共結(jié)晶；進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。不富集 時(shí)，有很多非磷酸肽出現(xiàn)，僅檢測到3個(gè)磷酸肽，如圖2a，而在修飾的MALDI靶富集之后， 大部分非磷酸肽被除去，檢測到了9個(gè)磷酸肽，如圖2b所示。檢測到的磷酸肽用"*"標(biāo)記。
實(shí)施例3
分別移取0.8 納米離子懸浮液分布在基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀不銹鋼 耙的樣品孔上，晾千后負(fù)載2 pmol的p酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，重復(fù)實(shí)施例2的操作進(jìn)行富集、 MALDI-TOF-MS分析。不富集時(shí)，僅有1個(gè)磷酸肽檢測到，信噪比很低，而富集后，大部分 非磷酸肽消失，檢測到兩個(gè)磷酸肽，成為譜圖中兩個(gè)最強(qiáng)的峰，如圖3a-b所示。
實(shí)施例4
將相當(dāng)于60 ng牛血清白蛋白，30 ng的馬心肌紅蛋白、ot-酪蛋白、P-酪蛋白和卵清蛋白(后 面三個(gè)為磷酸化蛋白質(zhì))混合物酶解產(chǎn)物負(fù)載在修飾的MALDI靶的樣品孔上，重復(fù)上述富 集步驟，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。富集前，很多非磷酸肽出現(xiàn)，僅檢測到5個(gè)磷酸肽， 而富集之后，非磷酸肽被有效去除，共檢測到14個(gè)磷酸肽，如圖4a-b所示。"*"代表ct-酪 蛋白的磷酸肽，"#"代表P-酪蛋白的磷酸肽，"+"代表卵清蛋白的磷酸肽。
實(shí)施例5
將lpmol、 100fmo1、 10 ftnol和0 fmol的|3-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物分別滴加在修飾的MALDI 靶四個(gè)相鄰的樣品孔上，重復(fù)上述富集實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。對1 pmol和100 finoip-酪蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，分別檢測到兩個(gè)磷酸肽，當(dāng)樣品量降為lOfinol，仍然有l(wèi)個(gè)磷酸肽檢測到，產(chǎn)生ll倍的信噪比，而空白樣品沒有任何峰出現(xiàn)，如圖5a-d所示。
實(shí)施例6
將2嗎(400ng)牛血清白蛋白，lpg U00ng)的馬心肌紅蛋白、細(xì)胞色素C、 a-酪蛋白 和卵清蛋白的混合物進(jìn)行SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后，將a-酪蛋白和卵清蛋白條帶 用手術(shù)刀切下來，進(jìn)行膠內(nèi)酶解。取相當(dāng)于100ng (20ng)原始蛋白酶解產(chǎn)物分別負(fù)載到修 飾的MALDI靶上進(jìn)行富集，然后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。100 ng的a-酪蛋白和卵清蛋白 酶解產(chǎn)物富集后，分別檢測到5個(gè)和2個(gè)磷酸肽，如圖6a-b所示。對于10ng的a-酪蛋白和 卵清蛋白酶解產(chǎn)物，富集后檢測到2個(gè)和l個(gè)磷酸肽，如圖7a-b所示。
權(quán)利要求
1.一種在基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀樣品靶上快速富集、鑒定磷酸肽的方法，其特征在于包括以下步驟(1)使用選擇性吸附磷酸肽的材料制備具磁性的納米粒子；(2)將納米粒子移取到MALDI靶的樣品孔上，施加磁場吸附磁性納米粒子；(3)將樣品負(fù)載在上述的樣品孔上，孵育以吸附磷酸肽；(4)清洗MALDI靶，除去非磷酸肽和鹽；(5)去除磁場，加入基質(zhì)與富集的磷酸肽共結(jié)晶；(6)利用MALDI-TOF-MS分析磷酸肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于所述納米粒子為雙核結(jié)構(gòu)的納 米顆粒，其內(nèi)核為磁性材料；外層為可選擇性吸附磷酸肽的材料，
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于所述納米粒子的內(nèi)核為Fe304。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于所述納米粒子的外層為Ti02或 Zr02。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于納米粒子的移取采用液態(tài)形式。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于納米粒子的移取采用納米粒子 懸浮液的形式。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于所述MALDI靶為不銹鋼靶、金耙或硅片靶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于對MALDI靶施加的磁場為外源 性固定磁場。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集磷酸肽的方法，其特征在于在吸附磷酸肽的靶上直接加入基質(zhì)共結(jié)晶后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在修飾的基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)樣品靶上快速富集、鑒定磷酸肽的方法將磁性親和納米粒子物理吸附在樣品靶上，負(fù)載樣品后清洗除去非磷酸肽和鹽，加入基質(zhì)與靶上吸附的磷酸肽共結(jié)晶后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。本方法不涉及化學(xué)反應(yīng)，不需對靶進(jìn)行前處理，可對不同基底材料的MALDI靶進(jìn)行修飾；多個(gè)樣品在修飾的MALDI靶上的富集同時(shí)完成；從負(fù)載樣品到質(zhì)譜分析，整個(gè)過程無樣品轉(zhuǎn)移。該發(fā)明方法操作簡單、快速、靈敏，在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組分析中有很好的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101196527SQ200610162119
公開日2008年6月11日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者應(yīng)萬濤, 張養(yǎng)軍, 王京蘭, 耘 蔡, 峰 譚, 錢小紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所