專利名稱：：土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及土壤碳水化合物的測定，具體地說是一種土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法。技術(shù)背景土壤碳水化合物占土壤有機質(zhì)的5-25。/()W(Murataetal.1999.SeasonalvariationsinsoilmicrobialbiomasscontentandsoilneutralsugarcompositioningrasslandintheJapaneseTemperateZone.AppliedSoilEcology11,253-259.)，是土壤有機質(zhì)易變庫的重要組成部分，而且是土壤中微生物過程的主要能量來源m(MartensandLoeffelmann.2002.Improvedaccountingofcarbohydratecarbonfromplantsandsoils.SoilBiology&Biochemistry34,1393-1399)。中性糖是土壤碳水化合物的一種，它們對土壤團聚有重要作用[3](Pugetetal.1999.Natureofcarbohydratesassociatedwithwater-stableaggregatesoftwocultivatedsoils.SoilBiology&Biochemistry31,55~63)。土壤中性糖能夠被微生物快速代謝，但是它們的降解與它們的存在形式和土壤礦物的性質(zhì)有關(guān)。土壤中性糖與土壤團聚體的結(jié)合是以多糖形式存在的f4](RumpelandDignac2006.Gaschromatographicanalysisofmonosaccharidesinforestsoilprofile:Analysisbygaschromatographyaftertrifluoroaceticacidhydrolysisandreduction-acetylation.SoilBiology&Biochemistry38，1478-1481)，因此，了解土壤中性糖的定性和定量組成非常重要。毛細管氣相色譜法是分析土壤中性糖的一種常見方法。因為中性糖是非揮發(fā)性組分，因此在進行氣相色譜測定之前，須將它們衍生為易揮發(fā)組分。糖醇乙酰酯衍生法是一種常見的測定土壤中性糖的方法W(Cheshireetal.1990.Labelledandnativesugarsinparticle-sizefractionsfromsoilsincubatedwith"Cstrawfor6—18years.JournalofSoilScience41，29—39)。但此法需大量的準備步驟，尤其是去除還原步驟所用的過量硼酸鹽，操作繁瑣，消耗時間，不利于日常分析和檢測。最近，RumpelandDignae(2006f]將上述方法進行改進，即不用移走過多的硼酸鹽，但是，核糖的回收率非常低(只有35%)，且某些糖的變異系數(shù)很高。三甲基硅醚衍生法也能用來測定土壤中性糖，Larr6-LarrouyandFeller1997.Determinationofcarbohydratesintwoferralliticsoils:Analysisbycapillarygaschromatographyafterderivatizationbysilylation.SoilBiology&Biochemistry29,1585-1589)。然而這種方法的缺點是每種糖形成兩個色譜峰，色譜圖復(fù)雜，不利于定量分析。Amelungetal(1996)l7](Amelungetal.1996.Determinationofneutralandacidicsugarsinsoilbycapillarygas-liquidchromatographyaftertrifluoroaceticacidhydrolysis.SoilBiology&Biochemistry28，1631-1639)采用O-甲基-肟-三甲基硅垸法來克服形成多重峰的缺點，但只能部分克服多重峰的形成，加之反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不利于保存W，仍限制了定量分析的可靠性。糖腈乙酰酯衍生法曾被用來測定生物樣品中的中性糖和氨基糖問(GuerrantandMoss1984.Determinationofmonosaccharidesasaldononitrile,O-methyloxime,alditol,andcyclitolacetatesderivativesbygaschromatography.AnalyticalChemistry56,633~638)。這種方法比糖醇乙酰酯法操作簡單，并且每種糖色譜峰單一，因此也優(yōu)于三甲基硅醚衍生法。ZhangandAmelung(1996)[9(ZhangandAmelung.1996.Gaschromatographicdeterminationofmuramicacid,glucosamine,mannosamine,andgalactosamineinsoils.SoilBiology&Biochemistry28，1201-1206)建立了用糖腈乙酰酯法測定土壤氨基糖的方法，然而這種方法還沒有應(yīng)用于土壤中性糖的測定。通常土壤中性糖采用硫酸和三氟乙酸(TFA)水解及相應(yīng)的純化程序進行純化[7]。然而當采用糖腈乙酰酯衍生時，哪種水解和純化程序較合適仍不清楚。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法，并找出適合于糖腈乙酰酯衍生測定土壤中性糖的水解和純化方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法，具體步驟如下，(1)土壤樣品的水解稱取含有4-5mg有機碳的土壤樣品，用9-12ml4M三氟乙酸進行水解，水解后，加入IOOng戊五醇溶液振蕩搖勻后過濾得水解液；(2)水解液的純化用氫氧化鉀中和水解液，調(diào)pH為6.6-6.8，經(jīng)過離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，固體物質(zhì)用3-4ml蒸餾水溶解，并加入10(Hig肌醇溶液，冷凍干燥，獲得干燥樣品；(3)樣品的衍生采用糖腈乙酰酯法將樣品進行衍生；然后進行氣相色譜測定。所述水解溫度可為103-108。C，時間4-4.5h;濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫至45。C蒸干，殘余物溶解于15-20ml蒸餾水中，并用0.3-0.5mol/LKOH調(diào)pH為6.6-6.8，沉淀在2800-3000轉(zhuǎn)/min離心10-15min;中性糖在吡啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基吡啶為催化劑的條件下與鹽酸羥胺和乙酸酐發(fā)生糖腈乙酰酯反應(yīng)，所得衍生物可利用氣相色譜測定，即可將步驟(3)的樣品用體積比l:l乙酸乙酯正己烷溶解后，即可進行氣相色譜分析。所述糖腈乙酰酯法將樣品進行衍生過程為向干燥樣品的衍生瓶中加入290-350pl衍生試劑，加蓋密封，在75-80。C下加熱25-30min，其間振蕩2畫5次；冷卻至室溫后，加入0.9-1.1ml乙酸酐，密封再次加熱20-22min，其間振蕩2-5次；冷卻后加入1.4-1.6ml的二氯甲垸；過量的衍生試劑通過以下兩步來去除首先，加入0.9-1.1milmol/LHCl，激烈振搖25-35s后，移走上層液體；其次，與上面步驟相同，用1-1.2ml的蒸餾水洗3-4次，在最后一次洗滌過程中盡可能去除水相，剩余的有機相在40-45t:下用N2吹干后，用200-300^tlv/v=l:1的乙酸乙酯-正己烷混合溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，即可進行氣相色譜測定；衍生試劑為4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg'mL"的鹽酸羥胺和40mg-mL"的4-二甲基氨基吡啶。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.重現(xiàn)性好。由于土壤樣品成分較復(fù)雜，需較多的處理過程，本發(fā)明采用內(nèi)標法(內(nèi)標為戊五醇)測定土壤中性糖，所得數(shù)據(jù)準確，重現(xiàn)性好。2.靈敏度高，線性范圍寬，其線性范圍為10-640嗎mr1。3.回收率高，操作快速。平均回收率達到100.1%，且本發(fā)明色譜峰單一，所得數(shù)據(jù)準確可靠。本發(fā)明采用的純化程序和糖腈乙酰酯衍生法操作步驟簡單、快速，因此本發(fā)明優(yōu)于糖醇乙酰酯衍生法和三甲基硅醚衍生法，可以滿足日常分析的需求。圖1:中性糖的氣相色譜圖，其中a:標樣,b:土壤樣品1.核糖,2.鼠李糖，3.阿拉伯糖，4.木糖，5.巖藻糖，6.戊五醇，7.甘露糖，8.葡萄糖，9.半乳糖，10.肌醇。具體實施方式下面列舉一個實施例，對本發(fā)明加以進一步說明。實施例l:按如下步驟測定土壤中性糖的含量。l.l儀器與試劑AgilentHP6890氣相色譜儀，配火焰離子化檢測器(FID)，DM-1型石英毛細管氣相色譜柱(30mx0.25mmx0.25nm)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍干燥儀，精密加熱器，離心機，烘箱，pH計等。8種中性糖標準，如核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖，及內(nèi)標戊五醇和肌醇都從Sigma-Aldrich公司和Fluka公司購買；鹽酸羥胺從Sigma-Aldrich公司購買，4-二甲氨基吡啶從Fluka公司購買；二氯甲垸、乙酸乙酯、正己烷和無水甲醇從Dima公司購買；吡啶、三氟乙酸(TFA)、鹽酸和乙酸酐均為分析純。1.2溶液的配制標準溶液和內(nèi)標的配制8種中性糖，戊五醇和肌醇的濃度均為1mg/mL。衍生試劑的配制4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg'mL"的鹽酸羥胺和40mg'mi;'的4-二甲基氨基吡啶。1.3供試土壤采用4種不同性質(zhì)的土壤。紅壤采自江西紅壤研究試驗站，兩種黑土分別采自吉林省公主嶺(G)和黑龍江省海倫(H)，棕壤采自遼寧省沈陽，4種土壤均為表層土壤(0-20cm)，風(fēng)千后過250iim篩，基本性質(zhì)見表l。表1供試土壤基本理化性質(zhì)(0-20cm)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.4土壤樣品的處理1.4.1水解和純化一分別稱取含有4mg有機碳的上述土壤樣品(有機碳含量采用元素分析儀進行測定)放入水解瓶中，加入10ml4MTFA在105。C水解411[7]。水解后，加入100pL的lmg/mL戊五醇溶液(內(nèi)標)振蕩搖勻后過濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45。C蒸干，殘余物溶解于20ml蒸餾水中，并用0.4mol/LKOH調(diào)pH為6.6-6.8，沉淀在3000轉(zhuǎn)/min離心10min。上清液再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，固體物質(zhì)用4ml蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移到5ml衍生瓶中并加入10(HiL的lmg/mL肌醇溶液，進行冷凍干燥(8小時以上)。1.4.2衍生分別向上述含干燥樣品的衍生瓶中加入300p銜生試劑(4:l的吡啶-甲醇溶液，含有32mg-mL"的鹽酸羥胺和40mg'mL"的4-二甲基氨基吡啶)，加蓋密封，在75-8(TC下加熱30min，其間振蕩2-3次。冷卻至室溫后，加入lml乙酸酐，密封再次加熱20min，其間振蕩2-3次。冷卻后加入1.5ml的二氯甲烷。過量的衍生試劑通過以下兩步來去除首先，加入lmllmol/LHCl，激烈振搖30s后，移走上層液體。其次，與上面步驟相同，用lml的蒸餾水洗3次，在最后一次洗滌過程中盡可能去除水相。剩余的有機相在45"C下用N2吹干后，用200|11體積比為l:l的乙酸乙酯-正己垸混合溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，即可進行氣相色譜測定。1.5色譜分析梯度升溫程序為柱溫175'C，保持4min，以4'C/min的速度升溫至225°C，保持2min，再以5(TC/min的速度升溫至30(TC，保持2min。載氣為N2，流速1.2ml/min。進樣量為1^1，分流比為30:1。進樣口溫度為250。C，檢測器溫度為30(TC，以峰面積內(nèi)標法定量。本發(fā)明中所用的色譜柱為非極性毛細管色譜柱；本實驗采用的為DM-1柱，實際上HP-1，OV-l也可以，因為它們都是非極性柱。其中DM陽1，HP-1，OV-l指的是不同廠家生產(chǎn)的柱子。1.6標準曲線，重現(xiàn)性和回收率吸取8種中性糖的標準溶液稀釋成一系列含有10、20、40、80、160、320和640叫ml"的溶液，并加入50pL的lmg/mL戊五醇溶液按照上述方法衍生后，進行氣相色譜測定。每個樣品設(shè)3個重復(fù)來評價方法的重現(xiàn)性，回收率采用加標回收率法進行評價。其中，戊五醇作為內(nèi)標一在水解之后加入，肌醇作為內(nèi)標二在衍生之前加入。2.結(jié)果與討論2.1純化、衍生和氣相色譜技術(shù)(1)純化采用KOH中和TFA水解液，使有機和無機雜質(zhì)沉淀，然后通過離心去除沉淀。ZhangandAmdung(1996)[9]用無水甲醇溶解氨基糖，而不溶于甲醇的KC1(鹽酸與K0H反應(yīng)生成KC1)通過離心法去除。然而，本發(fā)明的試驗過程中，加入甲醇時，沒有沉淀產(chǎn)生，可能是TFA完全蒸發(fā)的結(jié)果，因此加入甲醇這步可以省略。通過本發(fā)明的純化步驟之后，獲得了較好的色譜峰。說明這種純化程序適合TFA水解和糖腈乙酰酯衍生。并且本發(fā)明的純化程序比ZhangandAmelung(1996)[9]和Amelungetal(1996)[7]的純化程序快速且簡單。例如Amelungetal(1996)["采用XAD-7吸附樹脂和Dowex50WX8陽離子交換樹脂來移走有機和無機雜質(zhì)。(2)衍生本發(fā)明的衍生程序比糖醇乙酰酯衍生法快[8]。盡管RumpdandDig皿c(2006)[4]改進了糖醇乙酰酯衍生法，但某些糖的回收率較低，且變異系數(shù)較高。且本發(fā)明色譜峰單一，因此也優(yōu)于三甲基硅醚衍生法。(3)氣相色譜技術(shù)本發(fā)明采用非極性柱DM-1來分離8種中性糖的衍生物，非極性與極性柱相比具有柱壽命長和容易清洗的優(yōu)點。8種中性糖和兩種內(nèi)標的色譜圖見圖l，都達到了基線分離。保留時間見表2。表28種中性糖和內(nèi)標衍生物的保留時間(ir)和相對校正因子(i^<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2線性范圍和回收率(1)線性范圍本發(fā)明8種中性糖的線性范圍為10-640嗎mr1(7^0.999)。目前已知方法測定土壤中性糖的線性范圍還未見報道[7]。8種中性糖標準的平均變異系數(shù)小于4.2%(n=3)，儀器的平均變異系數(shù)小于2%(n=3)。(2)回收率中性糖相對于戊五醇的回收率見表3。用TFA水解時，8種中性糖的平均回收率為100.1%，說明在整個樣品準備過程中，內(nèi)標與8種中性糖的損失程度是一致的?；厥章首儺愊禂?shù)的變化范圍為1.6-10.6%，且這個變異系數(shù)比Amehmgetal(19%)[71報道的數(shù)值低。另外，戊五醇相對于肌醇的回收率為85%，說明選用戊五醇作為內(nèi)標比較合適。此外，實驗方法的摸索過程中，本發(fā)明研究了硫酸水解中性糖的效果，發(fā)現(xiàn)戊五醇相對于肌醇的回收率僅為51%，可能是因為其與BaS04共沉淀的原因(硫酸水解時采用氫氧化鋇中和)。另外8種中性糖的變異系數(shù)為13-205%,變異系數(shù)較大。因此，當采用糖腈乙酰酯衍生法測定土壤中性糖時，硫酸不適合水解中性糖。其硫酸水解中性糖的過程與上述方法不同之處在于土壤樣品在lml的12MH2S04室溫下水解16h，再用lMH2SO4100。C水解6h(Huetal.1995.Soilcarbohydratesinaggradinganddegradingagroecosystems:influencesofflmgiandaggregates.Agriculture,EcosystemsandEnvironment54,77-88)[1()]。水解后，加入100pg戊五醇(內(nèi)標)振蕩搖勻后過濾。濾液用Ba(OH)2調(diào)pH至中性(pH6.6-6.8)，然后以2800-3000轉(zhuǎn)/min離心10-15min去除沉淀。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫至45。C蒸干，殘留的固體物質(zhì)用4mL蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移到5ml的衍生瓶中并加入100nL的lmg/mL肌醇溶液，進行冷凍干燥(8h以上)。表3TFA水解的中性糖相對于內(nèi)標戊五醇的加標回收率(means±SD，n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.3方法的應(yīng)用采用4種不同性質(zhì)的土壤對本發(fā)明進行驗證，測得4種土壤的變異系數(shù)為4.6%-7.6%(表4)，在這4種土壤中，中性糖的總含量范圍為1622.4-5269.9mgkg"，約占土壤有機質(zhì)的10%，與Amelungetal(1996)(71和Murataetal(1999產(chǎn)等人的報道一致。阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖在8種中性糖中占主要部分，約占8種中性糖總量的90%，與Angersetal.(1988)[1|](Angersetal.1988.Determinationofcarbohydratecompositionofsoilhydrolysatesbyhigh-performanceliquidchromatography.JournalofChromatography454，444~449)等人的報道一致。表44種土壤的中性糖含量(0-20cm)(means士SD，n=5)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.結(jié)論總之，本發(fā)明涉及一種同時測定土壤8種中性糖的氣相色譜分析方法，具有靈敏度高，線性范圍寬，重現(xiàn)性好，回收率高，操作快速等優(yōu)點，可以滿足日常分析的需求。109.3士1.693.5±8.2109.7±6.3雨.l±1.7塘醇糖糖,五i路箭巖戊甘葡權(quán)利要求1.一種土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法，其特征在于具體步驟如下，(1)土壤樣品的水解稱取含有4-5mg有機碳的土壤樣品，用9-12ml4M三氟乙酸進行水解，水解后，加入100μg戊五醇溶液振蕩搖勻后過濾得水解液；(2)水解液的純化用氫氧化鉀中和水解液，調(diào)pH為6.6-6.8，經(jīng)過離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，固體物質(zhì)用3-4ml蒸餾水溶解，并加入100μg肌醇溶液，冷凍干燥，獲得干燥樣品；(3)樣品的衍生采用糖腈乙酰酯法將樣品進行衍生；然后進行氣相色譜測定。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法，其特征在于水解溫度為103-108。C，時間4-4.5h。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法，其特征在于濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在室溫至45。C蒸干，殘余物溶解于15-20ml蒸餾水中，并用0.3-0.5mol/LKOH調(diào)pH為6.6-6.8，沉淀在2800-3000轉(zhuǎn)/min離心10-15min。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法，其特征在于中性糖在吡啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基吡啶為催化劑的條件下與鹽酸羥胺和乙酸酐發(fā)生糖腈乙酰酯反應(yīng)，所得衍生物可利用氣相色譜測定，即可將步驟(3)的樣品用體積比l:l乙酸乙酯正己烷溶解后，即可進行氣相色譜分析。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的分析方法，其特征在于所述糖腈乙酰酯法將樣品進行衍生過程為，向干燥樣品的衍生瓶中加入290-350pl衍生試劑，加蓋密封，在75-80。C下加熱25-30min，其間振蕩2-5次；冷卻至室溫后，加入0.9-1.1ml乙酸酐，密封再次加熱20-22min，其間振蕩2-5次；冷卻后加入1.4-1.6ml的二氯甲垸；過量的衍生試劑通過以下兩步來去除首先，加入0.9-1.1ml1mol/LHCl，激烈振搖25-35s后，移走上層液體；其次，與上面步驟相同，用1-1.2ml的蒸餾水洗3-4次，在最后一次洗滌過程中盡可能去除水相，剩余的有機相在40-45"C下用N2吹干后，用200-300^1體積比為1:1的乙酸乙酯-正己垸混合溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，即可進行氣相色譜測定；衍生試劑為4:1的吡啶-甲醇溶液，含有32mg.mU1的鹽酸羥胺和40mg'mL"的4-二甲基氨基吡啶。全文摘要本發(fā)明涉及土壤碳水化合物的測定，具體地說是一種土壤中性糖的糖腈乙酰酯衍生毛細管氣相色譜分析方法，具體步驟如下，(1)土壤樣品的水解稱取含有4-5mg有機碳的土壤樣品，用9-12ml4M三氟乙酸進行水解，水解后，加入100μg戊五醇溶液振蕩搖勻后過濾得水解液；(2)水解液的純化用氫氧化鉀中和水解液，調(diào)pH為6.6-6.8，經(jīng)過離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，固體物質(zhì)用3-4ml蒸餾水溶解，并加入100μg肌醇溶液，冷凍干燥，獲得干燥樣品；(3)樣品的衍生采用糖腈乙酰酯法將樣品進行衍生；然后進行氣相色譜測定。本發(fā)明優(yōu)點是靈敏度高、精密度和準確度好且操作快速，適合于日常分析和檢測。文檔編號G01N1/34GK101210864SQ20061015582公開日2008年7月2日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者威張,明張,張旭東申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所