專利名稱：一種進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組的免疫球蛋白結(jié)合分子，尤其涉及將金黃色葡萄球菌蛋白和大消化鏈球菌表面蛋白的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域重排獲得的免疫球蛋白結(jié)合分子，其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白結(jié)合分子(Ig binding proteins，IBP)是一類表達(dá)于細(xì)菌表面的能與宿主Ig特定部位結(jié)合的蛋白，調(diào)節(jié)宿主對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)，是細(xì)菌重要致病因子之一。研究最多的IBP主要有三種金黃色葡萄球菌蛋白A(SpA)、人鏈球菌(C和G群)蛋白G(SpG)和部分大消化鏈球菌表面的蛋白L(PpL)。
SpA分子量約57KDa，由524個(gè)左右氨基酸構(gòu)成，其胞外部分含有5個(gè)長58-61個(gè)氨基酸殘基且序列高度同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域(分別命名為E、D、A、B和C)，單個(gè)Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域由三股返折的α螺旋組成，每個(gè)單結(jié)構(gòu)域具有獨(dú)立的Ig結(jié)合活性。SpG分子中包含兩至三個(gè)序列高度同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C1、C2、C3)，其單結(jié)構(gòu)域由兩對(duì)反向平行的β片層和中間的一個(gè)α螺旋組成。PpL分子中包含由4-5個(gè)(依不同菌株而異)由72-76個(gè)氨基酸殘基組成序列高度同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B1-B5)，雖然氨基酸序列與SpG相差甚遠(yuǎn)，但其單結(jié)構(gòu)域構(gòu)象卻相似。晶體結(jié)構(gòu)分析含PpL的B1-B4四個(gè)Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽鏈具有同時(shí)結(jié)合同一Ig分子的兩條kappa輕鏈的特性。SpA和SpG主要與IgG的Fc段具有較強(qiáng)的親和力，同時(shí)SpA還能結(jié)合屬于VH3基因家族的VH區(qū)(與抗原決定簇不重合，不影響與抗原的結(jié)合)，因此，它除了具有與IgG(IgG3除外)較強(qiáng)的親和力外，還能結(jié)合其它類的Ig。SpG還可以結(jié)合IgG的CH1區(qū)(CH1γ)，它僅結(jié)合IgG，并具有更高的親和力。而PpL通過與Ig的輕鏈，主要是κ輕鏈的1、3、4亞型相互作用而結(jié)合免疫球蛋白，結(jié)合位點(diǎn)位于抗原決定簇以外的輕鏈可變區(qū)，其結(jié)合能力與重鏈亞類無關(guān)SpA和SpG與IgG-Fc段的強(qiáng)親和力的特性使其廣泛應(yīng)用于檢測(cè)和純化IgG。此外，SpA還被用作某些自身免疫性疾病的輔助治療，其機(jī)制是清除循環(huán)免疫復(fù)合物和免疫調(diào)節(jié)。這三種主要的天然Ig結(jié)合分子各自在Ig結(jié)合譜上都是有限的。SpA不結(jié)合人IgG3，由于VH3基因家族在不同類Ig的分布不同，SpA只結(jié)合約15％、13％和40％的人IgGFab、IgA和IgM。另外，在不同種系的哺乳動(dòng)物之間的結(jié)合特性差別也很大對(duì)大鼠的Ig結(jié)合弱，對(duì)小鼠的IgG在不同亞類間差別很大，而對(duì)兔的Ig結(jié)合性強(qiáng)。與SpA相似，由于PpL只結(jié)合κ輕鏈的1、3、4亞型，因此只結(jié)合60％的人Ig，對(duì)來源于兔、牛的Ig結(jié)合很弱，而對(duì)鼠的Ig具有較強(qiáng)結(jié)合性。
SpA、SpG和PpL已被廣泛用于免疫化學(xué)反應(yīng)的定量和定性分析。當(dāng)偶連到一個(gè)放射性的、酶性質(zhì)的或熒光標(biāo)簽時(shí)，SpA是一個(gè)很好的、檢測(cè)和定量與該蛋白質(zhì)高親和力結(jié)合的抗體的試劑，酶標(biāo)SpA已廣泛地應(yīng)用到ELISA法的抗體檢測(cè)中，尤其是許多傳染病的特異抗體檢測(cè)中。SpA與金顆粒的微粒結(jié)合可用于免疫電鏡中IgG的定位，使許多特殊結(jié)構(gòu)及病原體的電鏡檢測(cè)成為可能，此外SpA膠體金顆粒也已廣泛應(yīng)用于免疫層析法進(jìn)行免疫學(xué)的抗體檢測(cè)。固定在固相介質(zhì)上的SpA可用于多種動(dòng)物天然抗體和小鼠單克隆抗體的大規(guī)模純化，此外，固相化的SpA還廣泛用于收集免疫復(fù)合物、抗原或完整的細(xì)胞。盡管已經(jīng)發(fā)展了許多用于純化IgG分子的技術(shù)，但優(yōu)選的方法還是用SpA包裹的球珠來吸附和洗脫。利用純化的SpA和包含SpA的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的工程融合蛋白采用類ELISA三明治技術(shù)，可以純化和檢測(cè)DNA片段。與SpA一樣，SPG在抗體的純化，免疫測(cè)定及一些治療中都有廣泛的用途。但其在收集免疫復(fù)合物和純化IgG試劑中有一個(gè)潛在的劣勢(shì)是它能強(qiáng)烈地結(jié)合牛血清白蛋白。然而，SPG的IgG結(jié)合位點(diǎn)和牛血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上是截然不同的。而且工程版的、缺少了牛血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的SPG通過商業(yè)途徑也可以得到。另外，SPG的血清白蛋白結(jié)構(gòu)域一直用作融合蛋白質(zhì)中的純化標(biāo)簽。PpL是一個(gè)很有用的工具，與SpA和SpG相比，其在從添加胎盤牛血清或牛血清白蛋白的介質(zhì)中純化單克隆抗體和從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中純化人源化抗體等方面更具優(yōu)勢(shì)。
由于三種Ig結(jié)合分子的抗體結(jié)合位點(diǎn)不同，protein A和protein G主要與IgG的Fc段恒定區(qū)結(jié)合而protein L與Ig的κ輕鏈可變區(qū)結(jié)合，因此能否集合并優(yōu)化兩種蛋白的Ig結(jié)合功能，構(gòu)建出新型Ig結(jié)合分子用于Ig檢測(cè)，提高免疫診斷的敏感性和特異性，是國外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。1992年，瑞典學(xué)者構(gòu)建出protein L和protein G的融合蛋白Protein LG(以下簡稱pLG)，發(fā)現(xiàn)Protein LG有廣泛的抗體結(jié)合活性能結(jié)合大多數(shù)Ig的Fc、Fab段和Ig輕鏈。與單一的protein L或G相比，其抗體結(jié)合特性更完全，除人類Ig外，還可用于鼠源性抗體的檢測(cè)。1998年，瑞典學(xué)者將protein L的四個(gè)結(jié)合Igκ輕鏈的結(jié)構(gòu)域與protein A四個(gè)結(jié)合IgG的結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建出一種新型雜合蛋白Protein LA(以下簡稱pLA)，結(jié)合譜廣，不僅能結(jié)合人及一些哺乳動(dòng)物的不同類型Ig和IgG所有亞類，還能結(jié)合基因工程單鏈抗體Fv(ScFv)片段而不影響抗體的抗原結(jié)合能力，且與抗體的親和力得以提高，除用于免疫檢測(cè)外，通過親和色譜法還可純化各類Ig及Fv(ScFv)片段，證明Protein LA是一種多功能的抗體結(jié)合分子。1999年，protein A抗體結(jié)合區(qū)和protein L(1-3)抗體結(jié)合區(qū)的融合蛋白ProteinLA被CLONTECH公司開發(fā)為檢測(cè)和純化抗體的商品化試劑，兼有protein A和protein L的雙重功能，Protein LA可結(jié)合各種類型的抗體，解決了傳統(tǒng)方法IgM檢測(cè)困難的弊端。ProteinLA有可溶的、HRP-酶標(biāo)，或結(jié)合瓊脂糖形式的制劑，不僅能提高免疫檢測(cè)的敏感性，還能一步法進(jìn)行抗體純化，簡便易行。國內(nèi)尚未有類似產(chǎn)品出現(xiàn)。
pLA和pLG簡單拼接雖然保留了來源分子各自的功能，但這種結(jié)構(gòu)可能沒有達(dá)到同時(shí)發(fā)揮雙位點(diǎn)結(jié)合的精確構(gòu)象要求。我們選擇IBP分子發(fā)揮作用的基本單位即Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域作為研究的基本對(duì)象，對(duì)單結(jié)構(gòu)域DNA隨機(jī)的重組拼接，并用以噬菌體展示為主的分子進(jìn)化手段篩選，以期得到具有新的結(jié)合功能的重組分子。具體為克隆SpA和PpL的單個(gè)Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域，將單結(jié)構(gòu)域DNA片段在體外隨機(jī)拼接，再應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)將這些重組分子表達(dá)于噬菌體表面，構(gòu)建了SpA和PpL的單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合噬菌體展示文庫，以人Ig為誘餌對(duì)文庫進(jìn)行親和篩選，結(jié)果得到了一種由PpL的B3結(jié)構(gòu)域與SpA的D、A、B、C(主要為D)結(jié)構(gòu)域間隔排列組成的新型Ig結(jié)合分子形式(MDPL-MDPA)n(MDPL，mono-domain of proteinL；MDPA，mono-domain of protein A)，該分子形式在天然IBP中不存在，在重組的IBP分子中也未見報(bào)道，因此是一種新的IBP分子結(jié)構(gòu)形式，由于是通過分子進(jìn)化手段獲得，我們把這類分子統(tǒng)稱為進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子(evolved Ig-binding molecules)，進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5(L-D-L-D-L；L為PpL的B3結(jié)構(gòu)域，D為SpA的D結(jié)構(gòu)域)是其中最具代表性的優(yōu)勢(shì)克隆，該內(nèi)容在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2005年第32卷第6期第535～543頁中具有詳細(xì)描述，但該篇文章對(duì)LD5各種功能特性沒有進(jìn)一步的闡述。
本發(fā)明從多種(MDPL-MDPA)n序列中選取代表序列LD5克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)和純化新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5，對(duì)該蛋白與各免疫球蛋白的結(jié)合特性進(jìn)行了詳細(xì)的測(cè)定，建立了應(yīng)用該分子制備的親和層析柱進(jìn)行基因工程抗體的大規(guī)模純化、天然抗體及單克隆抗體的純化的方法，建立了應(yīng)用該分子標(biāo)記酶進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體的診斷方法，建立了應(yīng)用該分子制備膠體金標(biāo)記酶進(jìn)行免疫層析法檢測(cè)抗體的診斷方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子及其編碼基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的載體、轉(zhuǎn)化體及其基因工程制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一方面，公開了一種重組的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，它是具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。較佳的，它具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
上述分子是發(fā)明人構(gòu)建了一個(gè)噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫后，通過親和篩選發(fā)現(xiàn)的，具體的過程在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2005年第32卷第6期第535～543頁中有詳細(xì)描述。經(jīng)過發(fā)明人的一系列試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該分子具有突出的免疫球蛋白結(jié)合特性不僅能結(jié)合IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc，還能結(jié)合scFv。此外，實(shí)施例也證實(shí)了它與人免疫球蛋白IgG全分子有很高的結(jié)合活性；與人免疫球蛋白IgG Fab片斷比SpA和PpL有增強(qiáng)的結(jié)合活性；與人免疫球蛋白IgM比SpA和PpL有增強(qiáng)的結(jié)合活性；與人免疫球蛋白IgA比SpA和PpL有增強(qiáng)的結(jié)合活性。并且，它與各免疫球蛋白是以Igκ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合模式結(jié)合的。
本發(fā)明的第二方面，公開了一種分離的多核苷酸，它編碼上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子。較佳的，它具有SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三方面，公開了一種表達(dá)載體，它含有上述多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。較佳的，上述載體為原核載體，其中優(yōu)選PET-32a(+)。
本發(fā)明的第四方面，公開了一種宿主細(xì)胞，它被上述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。較佳的，上述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，其中優(yōu)選大腸桿菌，更佳的，為大腸桿菌BL21-TRXB。
本發(fā)明的第五方面，公開了上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的制備方法，該方法包含(1)在適合表達(dá)進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有免疫球蛋白結(jié)合活性的多肽。實(shí)施例中，發(fā)明人將新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建其大腸桿菌表達(dá)菌種，對(duì)該菌種進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，誘導(dǎo)生產(chǎn)進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，用Ni親和層析柱進(jìn)行純化，制備出純化的新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5。
本發(fā)明的第六方面，公開了將上述的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于體外結(jié)合免疫球蛋白，進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子與體外結(jié)合免疫球蛋白結(jié)合的方式為雙位點(diǎn)結(jié)合模式，即與免疫球蛋白κ輕鏈和VH3重鏈這兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合模式。較佳的，上述免疫球蛋白選自IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc中的一種或幾種，更佳的，上述IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc來源于人。同樣較佳的，上述免疫球蛋白為scFv。
優(yōu)選的，上述應(yīng)用為將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于抗體的體外免疫學(xué)檢測(cè)，其中免疫學(xué)檢測(cè)優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附或免疫層析或免疫組化。
同樣優(yōu)選的，上述應(yīng)用為將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于純化抗體，其中抗體優(yōu)選基因工程抗體或天然抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明公開的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，可以廣譜結(jié)合各種免疫球蛋白，與現(xiàn)有技術(shù)中的免疫球蛋白結(jié)合分子相比，它結(jié)合更廣譜，不僅可以結(jié)合IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc，還能結(jié)合scFv，此外，與免疫球蛋白的結(jié)合力也比現(xiàn)有的免疫球蛋白結(jié)合分子高。另一方面，本發(fā)明公開了上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的基因工程制備方法，使得低成本、大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。再一方面，本發(fā)明公開了將上述進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于抗體的體外免疫學(xué)檢測(cè)及抗體的純化，與現(xiàn)有技術(shù)相比，使用了本發(fā)明的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子可以提高檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性，純化的效果也更好。


圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-LD5的構(gòu)建流程2 LD5 cDNA序列的擴(kuò)增mDL2000 Marker1-8pCANTAB5S-LD5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3 LD5表達(dá)序列的PCR產(chǎn)物回收mDL2000 Marker1-4pCANTAB5S-LD5 PCR回收產(chǎn)物圖4 pET32a(+)-LD5的NcoI+Sal I雙酶切鑒定MDL15000Marker1LD5/PET32(a) 質(zhì)粒/Nco I+Sal I2LD5/PET32(a) 質(zhì)粒圖5 融合蛋白LD5的表達(dá)M14400-97400 Daltons Marker1-4LD5/PET32(a)/BL21-TRXB 單克隆 1-4#IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)5空菌BL21-TRXB 對(duì)照
97400、66200、43000、31000、20100、14400分別表示14400-97400 Daltons Marker電泳顯色條帶對(duì)應(yīng)的分子量圖6 融合蛋白LD5的純化M14400-97400 Daltons Marker7LD51-6其他IBP分子圖7 LD5與PpL和SPA對(duì)生物素標(biāo)記人多克隆IgG結(jié)合比較橫坐標(biāo)log(IgG-biotin)(nm)，即IgG-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SPA圖8 LD5與PpL和SPA對(duì)生物素標(biāo)記人多克隆IgM結(jié)合比較橫坐標(biāo)log(IgM-biotin)(nm)，即IgM-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SPA圖9 LD5與PpL和SPA對(duì)生物素標(biāo)記人多克隆IgA結(jié)合比較橫坐標(biāo)log(IgA-biotin)(nm)，即IgA-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SPA圖10 LD5與PpL和SPA對(duì)生物素標(biāo)記人多克隆IgG Fab結(jié)合比較橫坐標(biāo)log(IgFab-biotin)(nm)，即IgFab-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SPA
圖11 LD5與PpL和SPA對(duì)生物素標(biāo)記人多克隆IgG Fc結(jié)合比較橫坐標(biāo)log(IgG Fc-biotin)(nm)，即IgG Fc-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SPA圖12生物素標(biāo)記LD5與scFv KM36、KM38、KM41的結(jié)合橫坐標(biāo)log(LD5-biotin)(nm)，即IgLD5-biotin濃度對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo)OD450nm，即波長450nm的OD值帶“-◆-”線條對(duì)應(yīng)含KM36的TG1菌裂解液上清帶“-□-”線條對(duì)應(yīng)含KM38的TG1菌裂解液上清帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)含KM41的TG1菌裂解液上清帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)空TG1菌裂解液上清圖13 LD5結(jié)合人多克隆IgGFab的競爭抑制橫坐標(biāo)concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子濃度(nm)縱坐標(biāo)percent of inhibitin，即抑制百分?jǐn)?shù)帶“-□-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SpA帶“-○-”線條對(duì)應(yīng)PpL+SpA圖14 LD5結(jié)合人多克隆IgM的競爭抑制橫坐標(biāo)concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子濃度(nm)縱坐標(biāo)percentof inhibitin，即抑制百分?jǐn)?shù)帶“-□-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SpA帶“-○-”線條對(duì)應(yīng)PpL+SpA圖15 LD5結(jié)合人多克隆IgA的競爭抑制橫坐標(biāo)concentration of inhibitor(nm)，即抑制因子濃度(nm)縱坐標(biāo)percent of inhibitin，即抑制百分?jǐn)?shù)帶“-□-”線條對(duì)應(yīng)PpL帶“-△-”線條對(duì)應(yīng)LD5帶“-×-”線條對(duì)應(yīng)SpA帶“-○-”線條對(duì)應(yīng)PpL+SpA圖16 純化基因工程抗體電泳17 純化天然抗體電泳18 純化單克隆抗體電泳19 抗-HCV免疫層析測(cè)試條AHCV Ab陰性血樣檢測(cè)結(jié)果B空白C、DHCV Ab陽性血樣檢測(cè)結(jié)果1chicken anti-Protein A2Core Ag+NS4 Ag3NS5 Ag，NS即丙肝病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(non structure protein)4NS4 Ag5NS3 Ag6Core Ag具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中，術(shù)語“其保守性變異蛋白”是指具有免疫球蛋白高親和活性的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的變異形式，這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-30個(gè)，較佳的1-10個(gè)，更佳的1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸，例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似地氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)地功能，如可以用Val或Leu或Ile取代Ala等，又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)和數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。此外，這些變異形式還包括成熟蛋白與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，比如GST)。此外，變異形式還包括(但不限于)進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子及上述蛋白經(jīng)過修飾后的形式化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?；糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白，這種修飾可以通過將蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成；具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟悉技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明所述的編碼進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的多核苷酸的全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用已公開的質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。應(yīng)用PCR法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的多核苷酸片段。
本發(fā)明中，編碼進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的多核苷酸序列可插入到各種載體中，所述載體包括各種表達(dá)載體，包括本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體，優(yōu)選原核載體，比如pKK223-3、pBR322、pGEX載體等等，在本發(fā)明中適用的載體優(yōu)選PET-32a(+)?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
本發(fā)明中，術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化重組載體的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO，COs.293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。本發(fā)明優(yōu)選原核細(xì)胞中的大腸桿菌BL21-TRXB。
用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaGl2法或熱擊法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
本發(fā)明所述適合表達(dá)進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的條件與表達(dá)所用的宿主細(xì)胞有關(guān)，重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。上述方法中的重組蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
一、一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子原核制備本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5是應(yīng)用分子進(jìn)化方法從噬菌體展示細(xì)菌SpA A、B、C、D單結(jié)構(gòu)域和PpL的B3結(jié)構(gòu)域隨機(jī)重組的分子組合文庫中篩選獲得的新的免疫球蛋白結(jié)合分子形式，詳細(xì)情況在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2005年第32卷第6期第535～543頁中具有詳細(xì)描述。本發(fā)明以含有編碼進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5(L-D-L-D-L；L為PpL的B3結(jié)構(gòu)域，D為SpA的D結(jié)構(gòu)域)cDNA序列克隆pCANTAB5S-LD5為模板，PCR擴(kuò)增LD5的DNA片斷，并通過引物合成方法在擴(kuò)增片斷上游引入NcoI和SalI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。擴(kuò)增片斷用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后NcoI和SalI內(nèi)切酶酶切，酶切片斷行瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，克隆到原核表達(dá)載體PET-32a(+)的NcoI和SalI位點(diǎn)中，構(gòu)建成功原核表達(dá)載體PET32a(+)-LD5，用PET32a(+)載體的下游引物T7ter測(cè)定克隆片段LD5的DNA序列，序列分析結(jié)果證實(shí)PET-32a(+)在NcoI和SalI位點(diǎn)間的插入序列與PALn隨機(jī)分子庫噬菌體篩選的陽性克隆LD5序列完全相符，讀框完全正確，起始子和終止子已加上，插入上下游序列與PET32a(+)載體序列完全一致。取重組質(zhì)粒PET32a(+)-LD5200ng轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-TRXB，獲得LD5的原核表達(dá)菌種。將該菌中培養(yǎng)后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，設(shè)空菌作陰性對(duì)照，SDS電泳顯示在分子量約59000 Daltons處出現(xiàn)對(duì)照菌沒有的一條蛋白帶，符合LD5的分子量。將菌種活化后大量培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni-NTA柱純化獲得純化LD5融合蛋白，SDS電泳顯示純化后僅出現(xiàn)一條蛋白帶，符合其相應(yīng)分子量。
二、新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子與各類抗體及抗體片斷的結(jié)合本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5是細(xì)菌PpL的B3結(jié)構(gòu)域與SpA D單結(jié)構(gòu)域的間隔重復(fù)序列(L-D-L-D-L；L為PpL的B3結(jié)構(gòu)域，D為SpA的D結(jié)構(gòu)域)，其中的PpL B3結(jié)構(gòu)域具有與免疫球蛋白κ輕鏈的結(jié)合功能，SpA D結(jié)構(gòu)域具有與免疫球蛋白VH3重鏈的結(jié)合功能和與免疫球蛋白IgG Fc段結(jié)合的功能。因此，理論上LD5能結(jié)合各類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)Fab和免疫球蛋白IgG Fc。本發(fā)明應(yīng)用上述所表達(dá)純化的LD5融合蛋白進(jìn)行包被，分別對(duì)免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA進(jìn)行生物素標(biāo)記，用ELISA方法分別檢測(cè)LD5與免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA的結(jié)合情況，并與PpL和SpA與上述免疫球蛋白分子的結(jié)合進(jìn)行比較。結(jié)果證實(shí)LD5與免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA的結(jié)合比PpL和SpA有所增強(qiáng)，與免疫球蛋白IgG和免疫球蛋白IgG Fc的結(jié)合與SpA相當(dāng)。
三、新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合模式的證實(shí)本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5是應(yīng)用分子進(jìn)化方法從噬菌體展示細(xì)菌SpA A、B、C、D單結(jié)構(gòu)域和PpL的B3結(jié)構(gòu)域隨機(jī)重組的分子組合文庫中篩選獲得的新的免疫球蛋白結(jié)合分子形式，詳細(xì)情況在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2005年第32卷第6期第535～543頁中具有詳細(xì)描述。該類免疫球蛋白結(jié)合分子形式是文庫篩選所獲得的優(yōu)勢(shì)克隆，所測(cè)定的弱個(gè)克隆中有33個(gè)含有該類結(jié)構(gòu)，由于應(yīng)用人免疫球蛋白結(jié)合分子(包含IgG、IgM、IgA、IgD和IgE類型)作為誘餌對(duì)組合文庫進(jìn)行分子進(jìn)化篩選，因此，可以推定該結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白Fab有著比PpL B3與免疫球蛋白κ輕鏈和SpA與免疫球蛋白VH3重鏈的單獨(dú)結(jié)合功能更強(qiáng)的結(jié)合活性，上述的結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果也證明的這一點(diǎn)。能具備這種增強(qiáng)結(jié)合活性的最可能的結(jié)合形式即是與免疫球蛋白結(jié)合分子κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合模式。要證實(shí)上述與免疫球蛋白結(jié)合分子κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合的試驗(yàn)為結(jié)合競爭試驗(yàn)。
本發(fā)明中我們應(yīng)用了競爭抑制ELISA實(shí)驗(yàn)來證實(shí)LD5與免疫球蛋白結(jié)合分子κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)的結(jié)合。具體對(duì)LD5標(biāo)記生物素，分別應(yīng)用免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgM和免疫球蛋白IgA包被酶標(biāo)板，同時(shí)加入固定濃度的生物素標(biāo)記的LD5和倍比稀釋的各種競爭蛋白(LD5、PpL、SpA和PpL+SpA)，37℃ 45min后洗板，加入親和素-HRP復(fù)合物，37℃ 15min，洗板后TMB顯色5-10min，2M硫酸終止，酶標(biāo)儀讀取OD450nm。計(jì)算各復(fù)孔的OD均值，Excel繪制競爭抑制曲線。如果是雙位點(diǎn)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)，則聯(lián)合用PpL和SpA對(duì)LD5與IgG Fab、IgM、IgA(IgG Fab缺乏Fc段，IgM和IgA的Fc段不能與SpA和LD5結(jié)合，這樣排除了Fc段對(duì)競爭抑制試驗(yàn)的干擾作用)與結(jié)合的抑制作用要明顯小于LD5本身的抑制作用；如果不是雙位點(diǎn)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)，而是分別對(duì)可變區(qū)VH3重鏈和κ輕鏈的單獨(dú)結(jié)合，則聯(lián)合用PpL和SpA對(duì)LD5與IgGFab、IgM、IgA結(jié)合的抑制作用應(yīng)與LD5本身的抑制作用相當(dāng)。結(jié)果可見聯(lián)合用PpL和SpA對(duì)LD5與IgG Fab、IgM、IgA與結(jié)合的抑制作用要明顯小于LD5本身的抑制作用，說明LD5與免疫球蛋白結(jié)合是與κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)的結(jié)合。
四、應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子大規(guī)模純化基因工程抗體、天然抗體和單克隆抗體本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5是應(yīng)用分子進(jìn)化方法從噬菌體展示細(xì)菌SpA A、B、C、D單結(jié)構(gòu)域和PpL的B3結(jié)構(gòu)域隨機(jī)重組的分子組合文庫中篩選獲得的新的免疫球蛋白結(jié)合分子形式，結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了該分子不僅具有SpA和PpL這兩種蛋白的結(jié)合特性，而且產(chǎn)生了其他細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子(包括SpA和PpL)所不具有的κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合特性。在實(shí)際應(yīng)用中SpA、SpG等一些細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合分子已被廣泛應(yīng)用于天然抗體、單克隆抗體和基因工程抗體的純化，在發(fā)明中新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5也被證明能應(yīng)用于天然抗體、單克隆抗體和基因工程抗體的純化。
本發(fā)明中我們將LD5分子共價(jià)偶聯(lián)于CNBr-Sepharose 4B顆粒上制備成親和純化柱，利用該親和純化柱對(duì)來自血液、小鼠腹水及基因工程抗體的CHO-K1工程細(xì)胞株培養(yǎng)液中的各種類型的抗體進(jìn)行純化。具體是將包含各種抗體的血清稀釋后過LD5親和層析柱使抗體結(jié)合在柱子上，再用酸將柱子上的抗體洗脫下來即獲得純化的抗體；將能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)后注射小鼠腹腔，制備腹水，是將包含單克隆抗體的腹水稀釋后過LD5親和層析柱使抗體結(jié)合在柱子上，再用酸將柱子上的抗體洗脫下來即獲得純化的抗體；將基因工程抗體的CHO-K1工程細(xì)胞株體外大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，制備培養(yǎng)液，是將包含單克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)液直接過LD5親和層析柱使抗體結(jié)合在柱子上，再用酸將柱子上的抗體洗脫下來即獲得純化的抗體。
五、應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子ELISA法檢測(cè)特異抗體本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5能與多種人免疫球蛋白分子結(jié)合其中包括免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgG Fc、免疫球蛋白IgM、免疫球蛋白IgA等抗體，因此，將該分子標(biāo)記上辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶等酶分子，可以用作酶復(fù)合物(酶標(biāo)二抗)進(jìn)行ELISA法檢測(cè)特異抗體。
本發(fā)明中我們將LD5分子標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)，替代商品化的抗-HCV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒中的酶復(fù)合酶(HRP標(biāo)記的動(dòng)物抗人免疫球蛋白)進(jìn)行抗-HCV抗體檢測(cè)，并與商品化的抗-HCV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行對(duì)照檢測(cè)，評(píng)價(jià)LD5分子標(biāo)記辣根過氧化物酶作為酶復(fù)合物的檢測(cè)效果。
六、應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子免疫層析法檢測(cè)特異抗體本發(fā)明所述的一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5能與多種人免疫球蛋白分子結(jié)合，其中包括免疫球蛋白IgG Fab、免疫球蛋白IgGF Fc免疫球蛋白IgM、免疫球蛋白IgA等抗體，因此，將該分子與膠體金顆粒充分吸附制備LD5膠體金，可以吸附被檢測(cè)標(biāo)本中的抗體分子用于免疫層析法檢測(cè)特異抗體。
本發(fā)明中我們將LD5膠體金分子充分吸附制備LD5膠體金，在硝酸纖維素膜上用HCV抗原(1.5mg/L)及人IgG(1mg/L)劃線(1mm寬)，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線。檢測(cè)樣品(血清)中的抗體首先與LD5膠體金上的LD5分子結(jié)合，并被固定在膠體金顆粒上，該顆粒運(yùn)動(dòng)至硝酸纖維素膜上用HCV抗原劃線處，如檢測(cè)樣品中含有抗-HCV抗體，則吸附抗體的膠體金顆粒就與HCV抗原結(jié)合被固定在劃線處，形成一紫紅色的膠體金線條，檢測(cè)為陽性，如檢測(cè)樣品中不含有抗-HCV抗體，則膠體金顆粒就不能被HCV抗原結(jié)合被固定在劃線處，不能形成一紫紅色的膠體金線條，檢測(cè)為陰性。應(yīng)用免疫層析法檢測(cè)抗-HCV抗體特異抗體，并與商品化的抗-HCV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行對(duì)照檢測(cè)，評(píng)價(jià)LD5分子膠體金檢測(cè)效果。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
實(shí)施例1 一種新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子原核制備的方法1.新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子cDNA序列及克隆含有編碼進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5(L-D-L-D-L；L為PpL的B3結(jié)構(gòu)域，D為SpA的D結(jié)構(gòu)域)cDNA序列克隆的重組噬菌粒載體pCANTAB5S-LD5，是通過分子進(jìn)化方法篩選獲得，制備pCANTAB5S-LD5的具體步驟在《噬菌體展示SpA及PpL Ig結(jié)合單結(jié)構(gòu)域隨機(jī)組合文庫及親和篩選》，生物物理與生物化學(xué)進(jìn)展，2005年第32卷第6期第535～543頁中已完全公開，即文獻(xiàn)中表4中第3輪篩選的27#/44#和第4輪篩選的4#/33#克隆載體，其cDNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5 cDNA序列(SEQ ID NO2)
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5氨基酸序列(SEQ ID NO1)KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG2.原核表達(dá)載體pET32a(+)-LD5的構(gòu)建流程見圖12.1引物合成 用于PCR擴(kuò)增進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子LD5的cDNA序列的引物為上游5SNco-u5’-TATCCATGGCTGCGGCCCAGCCGGCCTCT-3’，下游5SNoG-d5’-CCTGCGGCCGCAACTGCCGCCGCC-3’。上游引物中引入了NcoI酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，引物DNA序列由上海博亞生物技術(shù)公司(現(xiàn)為英駿生物技術(shù)公司)合成。
2.2 LD5表達(dá)序列的PCR擴(kuò)增 以pCANTAB5S-LD5為模板，用合成的上、下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體積為50μl，加質(zhì)粒模板5ng，上、下游引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg++3mmol，Taq酶1U，加ddH2O至50μl。反應(yīng)條件94℃ 30s-60℃ 30s-72℃ 45s；35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束前72℃延伸5min，產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割膠回收試劑盒回收純化。PCR擴(kuò)增的LD5 cDNA片段在SalI位點(diǎn)后有(G4S)3接頭(為pCANTAB5S載體上固有的)。由圖2可見，PCT產(chǎn)物大小符合1156bp左右。膠回收純化后用NcoI和SalI雙酶切切去(G4S)3接頭，得到LD5表達(dá)序列1103bp，結(jié)果分別見圖3。
2.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及DNA序列測(cè)定 原核表達(dá)載體pET32a(+)購自Novagen公司，pET-32a(+)用NcoI和SalI雙酶切，試劑盒回收酶切產(chǎn)物。上述PCR純化產(chǎn)物用NcoI和SalI雙酶切，試劑盒回收后取400ng與400ng PET-32a(+)載體NcoI和SalI酶切產(chǎn)物連接。轉(zhuǎn)化后挑選重組子酶切鑒定，獲重組質(zhì)粒pET-32a(+)-LD5。提取pET32a(+)-LD5質(zhì)粒，用NcoI和SalI雙酶切(見圖4)，符合理論預(yù)期并用其下游引物測(cè)定插入片段的DNA序列。
2.4 LD5融合蛋白的表達(dá)2.4.1重組表達(dá)載體pET-32a(+)-LD5的轉(zhuǎn)化 氯化鈣法制備大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞(E.coli BL21trxB(DE3)購自Novagen公司)，取pET-32a(+)-LD5 200ng加入感受態(tài)BL21-TRXB100μl，冰水浴30min，42℃ 90s，冰水浴1-2min后加900μl的SOC培養(yǎng)基37℃150rpm培養(yǎng)1h后涂LB平板(含Amp100ng/ml和Kana35 ng/ml)37℃培養(yǎng)過夜。
2.4.2 LD5的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE樣品的制備 從pET-32a(+)-LD5/BL21轉(zhuǎn)化平板上挑取4個(gè)單克隆菌落接種至0.5mlLB(含Amp100ng/ml)中搖床培養(yǎng)3.5h后，取出100μl接至700μlLB(Amp)離心管中培養(yǎng)4h后加200μl甘油制備甘油菌種；余菌液加IPTG至終濃度1mM誘導(dǎo)培養(yǎng)3.5h后取300μl菌液10000rpm離心1分鐘，棄上清，加2×SDS點(diǎn)樣液25μl及0.01PBS25μl，混勻，制成SDS樣品。收集空菌BL21培養(yǎng)液同樣比例制成SDS樣品。
2.4.3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 制備12％SDS聚丙烯酰胺凝膠，將上述樣品及低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白沸水浴5分鐘，加樣，初始加壓5V/cm，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后提高至12V/cm，直至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部。電泳結(jié)束，取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色過夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脫色3-4小時(shí)。結(jié)果見圖5，可見所挑取的四個(gè)克隆在59kd左右均有目的蛋白帶，空BL21均未見該條帶。
2.5融合蛋白LD5的大量表達(dá)及純化2.5.1表達(dá) 將pET-32a(+)-LD5/BL21甘油菌種500μl接至50mlLB(含Amp)培養(yǎng)過夜，再轉(zhuǎn)至500mlLB中3.5h37℃搖床培養(yǎng)3.5h后加1mol/l的IPTG500μl誘導(dǎo)培養(yǎng)3.5h，取出分裝250ml離心管中6000rpm4℃離心10分鐘，去上清，加入20ml的0.1mol/l的PBS重懸于50ml離心管中，11000rpm4℃離心20分鐘，去上清，沉淀加入20ml的8mol/l的尿素重懸，4℃過夜。
2.5.2純化 過夜尿素裂解液11000rpm4℃離心20分鐘，取上清過Ni-NTA柱(金屬螯合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)購自德國QIAGEN公司)，Ni-NTA柱以8M尿素(pH8.0)平衡，尿素裂解液上清上柱，8M尿素(pH7.0)洗柱，以8M尿素(pH4.5)洗脫，收集洗脫峰，0.1M Tris中和，以PBS透析，SDS-PAGE分析純化效果(見圖6)，可見在59kd有LD5的條帶，無明顯雜蛋白帶。蛋白測(cè)序結(jié)果也顯示含有SEQ ID NO1的序列。
實(shí)施例2新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子與各類抗體及抗體片斷的結(jié)合1.與人多克隆IgG的結(jié)合1.1人多克隆IgG購自Sigma公司，PpL和SpA購Sigma公司。
1.21mg/ml人多克隆IgG以PBS(pH7.2)透析。取50μL 3mg/ml長臂活化生物素(購自PIERCE公司)加入1mL IgG(1mg/mL)，在室溫中輕微振蕩4h后加入透析袋在PBS中4℃透析過夜，透析完后加等量甘油于-20℃中保存。
1.3 LD5、PpL和SpA均調(diào)整濃度至1mg/ml后以碳酸鹽緩沖液(pH9.6)1∶200稀釋包被96孔板，每種蛋白均包被3排復(fù)孔，4℃ 24h后PBST洗4-5次，封閉液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封閉37℃ 1h后洗板，生物素標(biāo)記的IgG以一定濃度開始倍比稀釋，最后一孔不加，37℃45min后洗板，加入親和素-HRP復(fù)合物(購自PIERCE公司)，37℃ 15min，洗板后TMB顯色5-10min，2M硫酸終止，酶標(biāo)儀讀取OD450nm；計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，Excel繪制結(jié)合曲線。
結(jié)果可見LD5與人多克隆IgG的結(jié)合與SpA相當(dāng)，明顯高于PpL與人多克隆IgG的結(jié)合(見圖7)。
2.與人多克隆IgM的結(jié)合2.1人多克隆IgM購自Sigma公司，生物素標(biāo)記同1.2。
2.2以LD5 PpL SpA分別包板，與生物素標(biāo)記的IgM結(jié)合，方法同1.3。結(jié)果可見LD5與人多克隆IgM的結(jié)合明顯高于SpA和PpL(見圖8)。
3.與人多克隆IgA的結(jié)合3.1人多克隆IgA購自Sigma公司，生物素標(biāo)記同1.2。
3.2 ELISA方法同1.3。結(jié)果可見LD5與人多克隆IgA的結(jié)合明顯高于SpA和PpL(見圖9)。
4.與人多克隆IgG Fab的結(jié)合4.1對(duì)IgG進(jìn)行木瓜蛋白酶切獲得Fab和Fc4.1.1半胱氨酸活化木瓜蛋白酶多克隆人IgG IgM IgA均購自Sigma公司。木瓜蛋白酶(華美生物技術(shù)有限公司)用PBS溶解成濃度1mg/ml，加EDTA和L-半胱氨酸均至終濃度0.01M，37℃ 30min后以0.1M醋酸鈉透析除去半胱氨酸和EDTA。
4.1.2人多克隆IgG與活化的木瓜蛋白酶按30∶1的質(zhì)量比進(jìn)行酶切，37℃ 5h后加入碘代乙酰胺至0.03M終止反應(yīng)。
4.1.3產(chǎn)物過SpA柱分離Fab和Fc以20mM磷酸鈉緩沖液洗柱，酶反應(yīng)液上柱，收集含F(xiàn)ab的流穿峰，后以0.1M pH3.0的醋酸鈉洗脫結(jié)合的Fc。
4.2 IgGFab IgGFc的生物素標(biāo)記同1.24.3以生物素標(biāo)記的IgGFab進(jìn)行與包被的LD5、SpA和PpL結(jié)合，方法同1.3，結(jié)果可見LD5與人多克隆Ig Fab的結(jié)合明顯高于SpA和PpL(見圖10)。
5.與人多克隆IgG Fc的結(jié)合以生物素標(biāo)記的IgG Fc進(jìn)行與各種IBP分子的結(jié)合，方法同1.3。結(jié)果可見LD5與人多克隆IgG Fc的結(jié)合與SpA相當(dāng)，PpL與人多克隆IgG Fc不結(jié)合(見圖11)。
6.與基因工程scFv的結(jié)合6.1 scFv在大腸桿菌中的表達(dá)和純化6.1.1 scFv的誘導(dǎo)表達(dá)三種scFv的表達(dá)載體，KM36(VH3-Vλ)KM38(VH3-Vκ)KM41(VH1-Vκ)為荷蘭Sanquil實(shí)驗(yàn)室Dr Jan Voorberg提供，其詳細(xì)制備方法由文獻(xiàn)Edward N.van den Brink，EllenA.M.Turenhout，Niels Bovenschen，Bram G.A.D.H.Hei jnen，Koen Mertens，Mar joleinPeters，and Jan Voorberg.Multiple VH genes are used to assemble human antibodiesdirected toward the A3-C1 domains of factor VIII. BLOOD，2001；97(4)966-972完全公開。scFv其N端帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽。轉(zhuǎn)化E Coli TG1，挑取單克隆轉(zhuǎn)接于20ml 2×YTG(Amp100mg/ml)，37℃ 250rpm過夜后擴(kuò)增至500ml 2×YT(Amp100mg/ml 0.1％Glu)，37℃ 250rpm至OD600＝0.5時(shí)加入IPTG至0.1mM，30℃ 220rpm 3h后離心取沉淀菌。
6.1.2誘導(dǎo)菌的裂解和scFv的純化沉淀菌加入冰預(yù)冷的50mMTris-HCl(20％蔗糖1mMEDTA 1mMPMSF)懸浮，20min后，12000rpm離心10min取上清，沉淀再以冰預(yù)冷的5mM MgSO4(1mMPMSF)20min后離心12000rpm 10min取上清。對(duì)獲得的菌體裂解上清以20mM咪唑(500mMNaCl 50mM磷酸鈉pH7.5)，4℃透析過夜；Ni-NTA柱以透析液平衡，樣品上柱，以20mM咪唑洗柱后以100mM咪唑洗脫，收集洗脫液即為純化的scFv。
6.2三種scFv與生物素標(biāo)記LD5結(jié)合的ELISA將三種純化的單克隆scFv KM36、KM38和KM41包板，同時(shí)用不含scFv表達(dá)載體的TG1菌裂解上清包板。用生物素標(biāo)記的LD5對(duì)固相化Ig行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。KM36 KM38 KM41的TG1和空TG1菌裂解上清以碳酸鹽緩沖液1∶200稀釋包被96孔板，每種scFv均包被3排復(fù)孔，4℃ 24h后PBST洗3-4次，封閉液(2％BSA 0.05％TWEEN-20)封閉37℃ 1h后洗板，2mg/ml的生物素標(biāo)記LD5以1∶200開始倍比稀釋，最后一孔不加，余步驟同1.3。結(jié)果可見LD5與KM38(VH3-Vκ)的結(jié)合遠(yuǎn)大于與KM41(VH1-Vκ)和KM36(VH3-Vλ)的結(jié)合(圖12)。
實(shí)施例3新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子κ輕鏈和VH3重鏈的雙位點(diǎn)結(jié)合模式的證實(shí)SpA與IgG的Fc段具有較強(qiáng)的親和力，同時(shí)SpA還能結(jié)合屬于VH3基因家族的VH區(qū)(SassoEH，Silverman GJ，Mannik M.Human IgA and IgG F(ab’)2 that bind to staphylococcalSpA belong to the VHIII subgroup.J Immunol.1991；1471877-1883)。PpL通過與Ig的輕鏈，主要是κ輕鏈的1、3、4亞型相互作用而結(jié)合免疫球蛋白(Nilson BH，Solomon A，BjorckL，et al.PpL from peptostreptococcus magnus binds to the kappa light chain variabledomain；J Biol Chem.1992；267(4)2234-9)。從LD5與各類Ig分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)看，LD5具有對(duì)IgGFab IgM IgA較SpA和PpL更高的親和力，推測(cè)LD5具有對(duì)VH3重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的雙位點(diǎn)結(jié)合特性。競爭抑制試驗(yàn)?zāi)茯?yàn)證是否LD5具有對(duì)VH3重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的雙位點(diǎn)結(jié)合特性，如果是雙位點(diǎn)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)，則聯(lián)合用PpL和SpA對(duì)LD5與IgG Fab、IgM、IgA(IgG Fab缺乏Fc段，IgM和IgA的Fc段不能與SpA和LD5結(jié)合，這樣排除了Fc段對(duì)競爭抑制試驗(yàn)的干擾作用)結(jié)合的抑制作用要明顯小于LD5本身的抑制作用；如果不是雙位點(diǎn)結(jié)合的協(xié)同效應(yīng)，而是分別對(duì)可變區(qū)VH3重鏈和κ輕鏈的單獨(dú)結(jié)合，則聯(lián)合用PpL和SpA對(duì)LD5與IgGFab、IgM、IgA結(jié)合的抑制作用應(yīng)與LD5本身的抑制作用相當(dāng)。
1. LD5結(jié)合IgG Fab的競爭抑制ELISA實(shí)驗(yàn)2mg/ml IgG Fab以碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)1∶200稀釋包被96孔板，用于四類競爭蛋白(LD5自身、PpL+SpA、PpL、SpA)的復(fù)孔各包被三排，另包一排用于不加競爭蛋白組，4℃24h后PBST洗2-3次，封閉(2％BSA 0.05％TWEEN-20)37℃ 1h后洗板，同時(shí)加入固定濃度的生物素標(biāo)記的LD5和倍比稀釋的各種競爭蛋白(初始濃度為生物素標(biāo)記LD5的10倍)，另一排只加入相同固定濃度的生物素標(biāo)LD5，37℃ 45min后洗板，加入親和素-HRP復(fù)合物，37℃ 15min，洗板后TMB顯色5-10min，2M硫酸終止，酶標(biāo)儀讀取OD450nm。計(jì)算各復(fù)孔的OD均值，Excel繪制競爭抑制曲線，抑制百分?jǐn)?shù)＝(OD-ODx)100/OD(單位％，OD代表不加抑制蛋白組的吸光度均值，ODx表示在各種抑制濃度下的三個(gè)復(fù)孔的OD均值)。
結(jié)果可見PpL+SpA、PpL、SpA對(duì)生物素標(biāo)記的LD5 IgG Fab結(jié)合的抑制作用遠(yuǎn)小于LD5本身(圖13)，說明LD5與IgG Fab中的κ輕鏈和VH3重鏈的結(jié)合是同時(shí)雙位點(diǎn)結(jié)合，而不是分別與各個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)結(jié)合。
2. LD5結(jié)合IgM的競爭抑制ELISA實(shí)驗(yàn)以IgM包板，方法同1。結(jié)果可見PpL+SpA、PpL、SpA對(duì)生物素標(biāo)記的LD5 IgG Fab結(jié)合的抑制作用遠(yuǎn)小于LD5本身(圖14)，說明LD5與IgM中的κ輕鏈和VH3重鏈的結(jié)合是同時(shí)雙位點(diǎn)結(jié)合，而不是分別與各個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)結(jié)合。
3. LD5結(jié)合IgA的競爭抑制ELISA實(shí)驗(yàn)以IgA包板，方法同1。結(jié)果可見PpL+SpA、PpL、SpA對(duì)生物素標(biāo)記的LD5 IgG Fab結(jié)合的抑制作用遠(yuǎn)小于LD5本身(圖15)，說明LD5與IgA中的κ輕鏈和VH3重鏈的結(jié)合是同時(shí)雙位點(diǎn)結(jié)合，而不是分別與各個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)結(jié)合。
實(shí)施例4應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子大規(guī)模純化基因工程抗體、天然抗體和單克隆抗體1.瓊脂糖活化(1)稱4g CNBr-Sepharose 4B(購自Pharmacia公司)，用4mM HCl，pH2.5溶液浸泡15min，再用該溶液反復(fù)洗滌5次。
(2)將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2.偶聯(lián)蛋白(1)事先將LD5蛋白120mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。
(2)將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián))，4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。
3.裝柱將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaGl)洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，加入0.02％NaN3于4℃保存?zhèn)溆?.大規(guī)模純化基因工程抗體(1)使用復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司重組的表達(dá)抗Her2的基因工程抗體的CHO-K1工程細(xì)胞株生產(chǎn)基因工程抗體。在工程細(xì)胞株的構(gòu)建中，將目的基因和谷氨酰胺合成酶基因(GS)基因共轉(zhuǎn)染空宿主細(xì)胞，利用GS基因擴(kuò)增系統(tǒng)，使用(硫氨甲硫氨酸(MSX))作為篩選藥物篩選高表達(dá)細(xì)胞株。最后進(jìn)行高表達(dá)細(xì)胞株的單克隆化、適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)，擴(kuò)增、建庫和用于GMP生產(chǎn)。生物反應(yīng)器采用New Brunswick Scientific Co.，CELLIGEN PLUS型。工作體積為1.4L；發(fā)酵溫度為37℃；攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm；通過添加CO2和8％NaHCO3控制pH在7.20；通過環(huán)形供氣裝置(ring sparger)進(jìn)行氣體供應(yīng)，控制通氣流量在0.1-0.2vvm；通過空氣、氧氣、氮?dú)饪刂迫苎踉?0％空氣飽和度。工程細(xì)胞株經(jīng)懸浮擴(kuò)增培養(yǎng)后接種至2.2L生物反應(yīng)器，經(jīng)連續(xù)灌注培養(yǎng)25天，收獲培養(yǎng)上清進(jìn)行純化和評(píng)價(jià)。
(2)基因工程抗體細(xì)胞培養(yǎng)液按100倍床體積直接緩慢加入純化柱，用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液0D280＜0.02為止。
(3)加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸-HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。
(4)以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止冷凍和干裂。純化的蛋白對(duì)PBS透析，-40℃保存。純化蛋白行SDS PAGE凝膠電泳分析，可見純度達(dá)90％以上(圖16)。
5.大規(guī)模純化天然抗體(1)人血清按床體積1/10加樣，血清用PBS稀釋至濃度為20％，緩慢加入純化柱，用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為止。
(2)加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸-HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。
(3)以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止冷凍和干裂。純化的蛋白對(duì)PBS透析，-4O℃保存。純化蛋白行SDS PAGE凝膠電泳分析，可見純度達(dá)90％以上(圖17)。
6.大規(guī)模純化單克隆抗體(1)將抗重組人干擾素-γ單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株復(fù)蘇，該細(xì)胞株來源的詳細(xì)資料見《重組人γ干擾素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞建株研究》，上海免疫學(xué)雜志，1986年第6卷第6期第35～43，RPMI-1640培養(yǎng)液(購自GIBCO公司)培養(yǎng)。于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷(購自SIAMA公司)，注射后第3周內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，每只腹腔注射1ml(含1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml)，種后10天左右時(shí)間腫瘤體積最大，此時(shí)可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次，所取腹水-40℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)單克隆抗體腹水按床體積1/10加樣，小鼠腹水用冷PBS液稀釋4倍后，于1.00×105轉(zhuǎn)離心30min，去沉淀，將上清緩慢加入純化柱，用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為止。加0.1Mol/L pH3.0甘氨酸-HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。
(3)以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02％NaN3于4℃保存。防止冷凍和干裂。純化的蛋白對(duì)PBS透析，-40℃保存。純化蛋白行SDS PAGE凝膠電泳分析，可見純度達(dá)90％以上(圖18)。
實(shí)施例5應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子ELISA法檢測(cè)特異抗體1、LD5分子標(biāo)記辣根過氧化物酶(HRP)取10mg HRP(購自SIAMA公司)加1ml0.1mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鐘后加0.08mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi)20分鐘，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，30分鐘后加21％NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇(AR)沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml 80％冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇(盡量去除乙醇)，沉淀用PH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml LD5(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mg NaBH4混勻，3小時(shí)后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50％飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用0.01mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽(需換液5次)，如有沉淀藉離心除去，上清呈淡棕色即為酶結(jié)合物。加60％甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆谩?br> 2、用HRP標(biāo)記的LD5分子ELISA檢測(cè)抗-HCV抗體購買商用抗-HCV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(上?？迫A生物技術(shù)有限公司)，按照試劑盒的說明書對(duì)383份血液透析患者的血清進(jìn)行抗-HCV抗體的ELISA檢測(cè)，所不同的是將試劑盒中的酶標(biāo)稀釋液重新配置，將原來的酶復(fù)合物改換成HRP標(biāo)記的LD5分子。具體為加100μL稀釋液于包被抗原的檢測(cè)板孔內(nèi)，再加10μL的檢測(cè)血清，蓋好板蓋，置37℃水浴中，保溫45min。甩掉板孔內(nèi)的血清，用洗液洗五次，甩凈孔內(nèi)殘液，再在濾紙上拍打吸干。將HRP標(biāo)記的LD5分子(1mg/ml)按1∶500加入酶標(biāo)記抗體稀釋液(0.02mol/L pH7.2PBS-0.05％吐溫-20-0.1％白明膠-10％健康牛血清)中，混勻后，每空加入100μL，置37℃水浴中，保溫45min。甩掉板孔內(nèi)的酶復(fù)合物液，用洗液洗五次，甩凈孔內(nèi)殘液，再在濾紙上拍打吸干。用100μL微量吸液器，每孔加新配制的TMB A液和B液各100μL，在室溫下避光反應(yīng)大約5～10min，用2mol/L硫酸終止反應(yīng)。用酶標(biāo)測(cè)試儀，在波長450nm下，測(cè)定各孔OD值。所有標(biāo)本用抗-HCV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(上海科華生物技術(shù)有限公司)按照試劑盒的說明書進(jìn)行測(cè)定，與酶復(fù)合物改換成HRP標(biāo)記的LD5分子的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見表1，經(jīng)計(jì)算，應(yīng)用HRP標(biāo)記的LD5分子ELISA檢測(cè)抗-HCV抗體的檢測(cè)結(jié)果與商用試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相比敏感度達(dá)到99.3％，特異性達(dá)100％，總符合率達(dá)到99.7％，說明HRP標(biāo)記的LD5分子完全達(dá)到了商用化的檢測(cè)要求。
表1 HRP標(biāo)記的LD5分子ELISA檢測(cè)抗-HCV抗體與商用試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較

實(shí)施例6應(yīng)用新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子免疫層析法檢測(cè)特異抗體1、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠取0.01％氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積。
2、LD5標(biāo)記膠體金①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH6.0。
②于100ml金溶膠中加入2～3ml LD5蛋白(10mg/ml)，攪拌2～3分鐘。
③加入5ml 1％PEG20000溶液。
④于10000～100000g離心30～60分鐘(根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件)，小心吸去上清液(切忌傾倒)。
⑤將沉淀懸浮于一定體積含0.2～0.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以A1cm/540nm＝1.5左右為宜，以0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4℃保存。
3、免疫層析測(cè)試條的制備測(cè)試條由吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分組成。吸水纖維部分附著有膠體金免疫復(fù)合物；在硝酸纖維素膜上用HCV抗原(1.5mg/L)及人IgG(1mg/L)劃線(1mm 寬)，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，晾干，用50g/L BSA封閉2h，以0.01mol/L PBS洗滌3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5cm×10cm的試條，加干燥劑密封保存。制備的抗-HCV免疫層析測(cè)試條見圖19。
4、抗HCV檢測(cè)將0.1～0.2mL血清點(diǎn)加在測(cè)試條含有金標(biāo)記物的一端的電樣孔即可。結(jié)果判定以測(cè)試條硝酸纖維素膜上出現(xiàn)兩條紅色條帶為抗Hp-CagA IgG陽性；僅出現(xiàn)一條紅色條帶(靠近吸水濾紙端，對(duì)照線)為陰性.如果無紅色條帶出現(xiàn)則視為試劑失效。結(jié)果確定時(shí)間強(qiáng)陽性標(biāo)本在5min內(nèi)即可在檢測(cè)線處見到紅色膠體金顆粒聚集；弱陽性標(biāo)本約需要10min確定。用該抗-HCV免疫層析測(cè)試條對(duì)383份血液透析患者的血清進(jìn)行抗-HCV抗體檢測(cè)，并用商用抗-HCV ELISA抗體檢測(cè)試劑(上?？迫A生物技術(shù)有限公司)作對(duì)照，結(jié)果見表2，經(jīng)計(jì)算，免疫層析測(cè)試條檢測(cè)抗-HCV抗體的檢測(cè)結(jié)果與商用試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相比，敏感度達(dá)到94.5％，特異性達(dá)99.2％，總符合率達(dá)到97.4％，說明LD5制備的抗-HCV免疫層析測(cè)試條完全達(dá)到了實(shí)用化的檢測(cè)要求。
表2 LD5制備的抗-HCV免疫層析測(cè)試條與商用試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較

序列表<110> 上海潤龍生物科技有限公司<120> 一種進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子、其制備方法及應(yīng)用<130> PCNRL060599<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 346<212> PRT<213> Artificial sequence<220>
<223> misc_feature<400> 1Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala1 5 10 15Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly20 25 30Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu35 40 45Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr50 55 60Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn65 70 75 80Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met85 90 95Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys100 105 1l0Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu115 120 125Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu130 135 140Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly145 150 155 160Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala165 170 175
Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr180 185 190Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala195 200 205Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln210 215 220Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln225 230 235 24OArg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr245 250 255Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys260 265 270Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile275 280 285Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe290 295 300Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp305 310 315 320Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys325 330 335Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly340 345<210> 2<211> 1038<212> DNA<213> Artificial sequence<220>
<223> misc_feature<400> 2aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat 60gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa 120gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca 180gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat 240aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac 300gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac 360gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa 420acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga 480aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga 540tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt 600tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcgctgatg cgcaacaaaa taacttcaac 660
aaagatcaac aaagcgcctt ctatgaaatt ttgaacatgc ctaacttaaa cgaagcgcaa 720cgcaatggtt tcattcaaag tcttaaagac gatccaagcc aaagcactaa cgttttaggt 780gaagctaaaa aattaaacga atctcaagca ccgaaagagc tcaaagaaaa aacaccagaa 840gaaccaaaag aagaagttac tattaaagca aacttaatct atgcagatgg aaaaacacaa 900acagcagaat tcaaaggaac atttgaagaa gcaacagcag aagcatacag atatgctgac 960ttattagcaa aagaaaatgg taaatataca gtagacgttg cagataaagg ttatacttta1020aatattaaat ttgctgga 1038
權(quán)利要求
1.一種重組的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，其特征在于，它是具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1或2所述的蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸以及與該多核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體為原核載體。
7.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體為PET-32a(+)。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求5-7中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述原核細(xì)胞為大腸桿菌。
11.如權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述大腸桿菌為BL21-TRXB。
12.一種重組的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的制備方法，其特征在于，該方法包含(1)在適合表達(dá)進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8-11中任一權(quán)利要求所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有免疫球蛋白結(jié)合活性的多肽。
13.權(quán)利要求1或2所述的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于體外結(jié)合免疫球蛋白。
14.如權(quán)利要求13所述的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用途，其特征在于，進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子與體外結(jié)合免疫球蛋白結(jié)合的方式為雙位點(diǎn)結(jié)合模式。
15.如權(quán)利要求14所述的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用途，其特征在于，所述的雙位點(diǎn)結(jié)合模式為進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子與免疫球蛋白κ輕鏈和VH3重鏈這兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合模式。
16.如權(quán)利要求13-15任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述的免疫球蛋白選自IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc中的一種或幾種。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中所述的IgG、IgM、IgA、IgG Fab或IgG Fc來源于人。
18.如權(quán)利要求13-15任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其中所述的免疫球蛋白為scFv。
19.如權(quán)利要求13-15或權(quán)利要求17中任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于，將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于抗體的體外免疫學(xué)檢測(cè)。
20.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于抗體的體外免疫學(xué)檢測(cè)。
21.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于抗體的體外免疫學(xué)檢測(cè)。
22.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于所述的免疫學(xué)檢測(cè)為酶聯(lián)免疫吸附或免疫層析或免疫組化。
23.如權(quán)利要求20或21所述的應(yīng)用，其特征在于所述的免疫學(xué)檢測(cè)為酶聯(lián)免疫吸附或免疫層析或免疫組化。
24.如權(quán)利要求13-15或權(quán)利要求17中任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于純化抗體。
25.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于純化抗體。
26.如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于將進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子用于純化抗體。
27.如權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中所述的抗體為基因工程抗體或天然抗體或單克隆抗體。
28.如權(quán)利要求25或26所述的應(yīng)用，其中所述的抗體為基因工程抗體或天然抗體或單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種分離的進(jìn)化免疫球蛋白結(jié)合分子，它是具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白、或其具有免疫球蛋白結(jié)合活性的保守性變異蛋白。本發(fā)明還公開了該免疫球蛋白結(jié)合分子的編碼基因、基因工程制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明公開的免疫球蛋白結(jié)合分子廣譜結(jié)合各種免疫球蛋白，顯示出很高的免疫球蛋白全分子結(jié)合活性，可用于基因工程抗體的大規(guī)模純化，天然抗體、單克隆抗體的純化，酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法和免疫組化等免疫方法對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)和診斷。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1966526SQ20061011869
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
發(fā)明者潘衛(wèi), 蔣少華, 徐容, 賈建安, 沈毅珺, 楊華, 王錦紅, 陳秋莉, 何俊, 陳璐 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)