專(zhuān)利名稱(chēng)：肌酸激酶活性測(cè)定用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定試樣中所含肌酸激酶(以下稱(chēng)CK)活性的試劑。
背景技術(shù)：
CK是由二個(gè)亞組構(gòu)成的二聚物的磷酸酶。CK的亞組中有B型(腦型)和M型(肌型)兩種。CK因兩種亞組的不同組合，而存在三種異酶(CK-MM、CK-MB和CK-BB)，CK-MM多含于筋骨，CK-MB多含于心肌，CK-BB多含于腦中。因心肌梗塞和肌肉營(yíng)養(yǎng)不良等疾病，本存在于發(fā)病部位的CK異酶會(huì)流失到血液中，因此，在臨床檢查中存在于血清和血漿等試樣中的CK的活性值就成為診斷上述疾病的重要指標(biāo)。
CK在血液中會(huì)鈍化，要在生物試樣中加入CK活化劑后再進(jìn)行活性測(cè)定。因此，CK活性測(cè)定用試劑中含有N-乙酰-L-半胱氨酸(以下稱(chēng)NAC)和硫代丙三醇等含SH基的化合物(以下稱(chēng)SH化合物)，作為CK活化劑。
CK活化劑為不穩(wěn)定物質(zhì)，受試劑中所含雜質(zhì)銅、鐵等金屬離子的影響，CK活化劑的SH基在試劑保存過(guò)程中漸漸被氧化，變成二硫化物基，分子中的SH基變成二硫化物基的CK活化劑(變質(zhì)的CK活化劑)將失去活化CK的作用。因此，為防止CK活化劑變質(zhì)，穩(wěn)定CK活化劑，常常用乙二胺四乙酸(EDTA)來(lái)螯合CK活化劑變質(zhì)之源金屬離子。
但是，EDTA穩(wěn)定CK活化劑的效果并不十分理想，用經(jīng)長(zhǎng)期保存的試劑并不能充分活化測(cè)定用試樣中的CK，有時(shí)無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供長(zhǎng)期保存后也能正確進(jìn)行測(cè)定的CK活性測(cè)定用試劑。
本發(fā)明提供含有氨基甲烷磺酸和CK活化劑的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑。
本發(fā)明提供一種長(zhǎng)期保存后也能正確測(cè)定的CK活性測(cè)定用試劑。


圖1顯示CK活性測(cè)定反應(yīng)原理的模式圖。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施方式的CK活性測(cè)定用試劑含有氨基甲烷磺酸和CK活化劑。試劑中的氨基甲烷磺酸濃度以能穩(wěn)定CK活化劑為準(zhǔn)，并無(wú)特別要求。
本發(fā)明中的氨基甲烷磺酸還“含有”氨基甲烷磺酸鹽。作為氨基甲烷磺酸鹽比如可以是鉀鹽、鈉鹽、銨鹽(包括與甲胺、二甲胺、甲基乙基胺、三乙胺等合成的鹽)等。
作為CK活化劑，沒(méi)有特定，只要具有活化試樣中的CK的作用即可。比如可以使用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、N-鳥(niǎo)苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽、巰基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤蘚糖醇、巰基醋酸、2-巰基乙醇、溴2-氨乙基異硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)2-巰基乙烷磺酸及硫代丙三醇等SH化合物。這些CK活化劑也可以?xún)煞N以上組合使用，但最好單獨(dú)使用?；旌显嚇雍驮噭┑姆磻?yīng)液中CK活化劑的濃度(最終濃度)為0.1～200mM，優(yōu)選10～100mM。
關(guān)于CK活性測(cè)定用試劑在溶液狀態(tài)下的pH值并無(wú)特別限定，最好是5.0～11.0。要維持pH值，最好在試劑中添加緩沖劑。作為緩沖劑比如可以使用樹(shù)枝狀鹽酸緩沖劑、咪唑醋酸緩沖劑、磷酸緩沖劑、檸檬酸緩沖劑、蘋(píng)果酸緩沖劑、草酸緩沖劑、酞酸緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、醋酸緩沖劑、琥珀酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、碳酸緩沖劑等良好緩沖劑。
CK活性測(cè)定用試劑中最好含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和磷酸肌酸。
CK活性測(cè)定用試劑既可以將各種成份凍結(jié)干燥為固態(tài)也可以將其溶解在溶液里形成液態(tài)。
CK活性測(cè)定用試劑最好是含有第一試劑和第二試劑的套裝試劑，此時(shí)，第一試劑和/或第二試劑可以是凍結(jié)干燥狀態(tài)，也可以?xún)蓚€(gè)試劑都是液態(tài)。
當(dāng)CK活性測(cè)定用試劑包括第一試劑和第二試劑時(shí)，優(yōu)選第一試劑中含有G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及CK活化劑，第二試劑含有磷酸肌酸。
G6PDH、HK和GK其來(lái)源無(wú)特定，可以來(lái)自細(xì)菌、酵母、動(dòng)植物等，也可來(lái)源于用基因重組技術(shù)生成的物質(zhì)。G6PDH的最終濃度為0.5～40U/ml之間，優(yōu)選1～10U/ml。HK或GK的最終濃度為0.5～20U/ml之間，優(yōu)選1～6U/ml。
CK活性測(cè)定用試劑中可以放入乙二胺四醋酸(EDTA)、二亞乙基三胺五醋酸(DTPA)、環(huán)己二胺四醋酸(以下稱(chēng)Cy DTA)等螯合劑。當(dāng)CK活性測(cè)定用試劑由第一試劑和第二試劑組成時(shí)，優(yōu)選螯合劑放在第一試劑。CK活化劑變質(zhì)的原因是試劑中含有金屬離子，螯合劑具有通過(guò)螯合試劑中的金屬離子來(lái)抑制CK活化劑變質(zhì)的效果。
氨基甲烷磺酸可以含在第一試劑和第二試劑的任何一個(gè)當(dāng)中，也可以?xún)烧叨己?。除第一試劑和第二試劑外還可以制備含有氨基甲烷磺酸的第三試劑，在測(cè)定前混合進(jìn)去。氨基甲烷磺酸接觸到CK活化劑，可以使變質(zhì)的CK活化劑的二硫化物基還原為SH基。氨基甲烷磺酸不僅具有這種作用，它還有防止CK活化劑的SH基轉(zhuǎn)化為二硫化物基的作用。
含氨基甲烷磺酸的第一試劑和第二試劑組成的套裝試劑可以通過(guò)以下方法制備混合氨基甲烷磺酸、G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化劑，配制第一試劑；再配制含有磷酸肌酸的第二試劑。
第一試劑和含氨基甲烷磺酸的第二試劑組成的套裝試劑可以通過(guò)以下方法制備混合G6 PDH、NAD或NADP、乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)和CK活化劑，配制第一試劑；再配制含有氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸的第二試劑。
在第一試劑中添加氨基甲烷磺酸，可以抑制長(zhǎng)期保存造成的SH化合物變質(zhì)，從而穩(wěn)定SH化合物。當(dāng)?shù)诙噭┲刑砑影被淄榛撬釙r(shí)，可以使因長(zhǎng)期保存而變質(zhì)、從而失去CK活化作用的SH化合物還原到變質(zhì)前的狀態(tài)(可以活化CK的狀態(tài))。因此，通過(guò)在第一試劑或第二試劑中添加氨基甲烷磺酸，都可以保證即使使用長(zhǎng)期保存后的試劑也能進(jìn)行準(zhǔn)確的CK活性測(cè)定。
本實(shí)施方式的CK活性測(cè)定用試劑的測(cè)定對(duì)象是試樣中含有的全部CK的活性、CK-MM的活性、CK-MB的活性和CK-BB的活性之中的任意一個(gè)。在臨床檢查中一般是測(cè)定試樣中的全部CK的活性或CK-MB的活性。通過(guò)在CK活性測(cè)定用試劑中加入與CK的M型亞組特異締合的抗體(以下稱(chēng)抗CK-M抗體)，即可測(cè)定試樣中的CK-MB的活性(Wurzburg et al.，1977，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，15131-135)。作為抗CK-M抗體，只要是能特別識(shí)別M型亞組的抗體，它既可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，還可以將二者混合起來(lái)使用。另外，還可以使用抗體的碎片及其衍生物。抗體的碎片及其衍生物具體來(lái)說(shuō)有Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab)2以及s Fv碎片等(Blazar et al.，1997，J.Immunol.，1595821-5833及Bird et al.，1988，Science，242423-426)。抗體的次類(lèi)并不限定于IgG，也可以是IgM等。
用于測(cè)定的試樣，可以是血清，血漿、血液、髓液、尿液和精液等，以血漿或血清為好。
下面，根據(jù)圖1介紹CK活性測(cè)定的反應(yīng)過(guò)程的一例。
在含有CK的試樣中加入含有上述成份的CK活性測(cè)定用試劑，將出現(xiàn)如圖1所示的反應(yīng)。在圖1中，被CK活化劑活化的CK催化了由磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP的反應(yīng)(反應(yīng)1)。含在試劑中的乙糖激酶(HK)或葡萄糖激酶(GK)通過(guò)含在試劑中的葡萄糖和反應(yīng)1生成的ATP生成葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP(反應(yīng)2)。含在試劑中的G6PDH又從反應(yīng)2中生成的G6P和NAD或NADP生成6-二氧磷-D-葡糖酸和NADH或NADPH(反應(yīng)3)。NADH或NADPH生成后試樣和試劑的混合液中波長(zhǎng)340nm附近的吸光度就會(huì)升高。監(jiān)視此吸光度升高過(guò)程，就可以測(cè)定試樣中CK的活性。
最好讓CK活性測(cè)定用試劑中含有鎂離子。在試劑中添加鎂鹽即可做到這一點(diǎn)。作為鎂鹽可以使用醋酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂等。
也可以在試劑中添加有防腐劑和表面活性作用的化合物。作為防腐劑，比如可以使用疊氮化鈉等。有表面活性作用的化合物可使用非離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子表面活性劑和白朊等，具體地說(shuō)，可以使用三通類(lèi)(Union Carbide Chemicals andPlastics Co.的注冊(cè)商標(biāo))、乳液類(lèi)(花王(株)的注冊(cè)商標(biāo))、牛血清白蛋白(BSA)等等。
試樣中有時(shí)含有腺嘌呤脫氨酶。腺嘌呤脫氨酶特別是多含在溶血試樣中，給CK的活性測(cè)定帶來(lái)負(fù)面影響。為了避免這種負(fù)面影響，最好在試劑中添加阻止腺嘌呤脫氨酶作用的抑制劑。對(duì)抑制劑種類(lèi)并無(wú)特定，只要是抑制腺嘌呤脫氨酶作用的東西即可，比如可以用腺苷一磷酸(AMP)和P1P5二腺苷-5’-五氯乙烷酸(AP5A)等。
用雙動(dòng)法測(cè)定活性也可以避免腺嘌呤脫氨酶的負(fù)面影響。所謂雙動(dòng)法就是先測(cè)定腺嘌呤脫氨酶等酶的活性，然后添加磷酸肌酸，讓CK進(jìn)行酶反應(yīng)，再測(cè)定試樣中的激酶的活性(CK活性和腺嘌呤脫氨酶等酶的活性之和)。這些測(cè)定結(jié)果的差即為CK的活性值。
(實(shí)施例1)以下列出了測(cè)定CK活性用第一試劑和第二試劑的基本構(gòu)成。
<第一試劑>pH 6.6咪唑125mM醋酸鎂12.5mM環(huán)己二胺四醋酸2.0mMADP 2.5mM
AMP 6.25mMAP5A 12.5M葡萄糖25mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/LNAC 30mM<第二試劑A>pH 9.0磷酸肌酸150mM將上述物質(zhì)按上述濃度溶解在蒸餾水中，配制第一試劑和第二試劑A。然后在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸5mM，配制第二試劑B；在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸10mM，配制第二試劑C；在第二試劑A中添加氨基甲烷磺酸20mM，配制第二試劑D；再配制與第二試劑A同樣成份的第二試劑E。
將上述第一試劑和第二試劑A～D在4℃的溫度下保存4個(gè)月，然后用日立7170S型自動(dòng)分析儀將第一試劑180μl、第二試劑45μl作為試樣和酶校準(zhǔn)品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，測(cè)定在340nm處的吸光度變化。第一試劑和第二試劑E不進(jìn)行4℃環(huán)境下的4個(gè)月長(zhǎng)期保存，配制試劑后馬上測(cè)定上述試樣的CK活性。測(cè)定進(jìn)行二次，測(cè)定結(jié)果的平均值如下面表1所示。表1中顯示的值是將吸光度變化量放大10000倍后的值。
表1

如上所示，使用含有氨基甲烷磺酸并經(jīng)長(zhǎng)期保存的第二試劑B～C時(shí)獲得的吸光度變化量測(cè)定值(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為測(cè)定值)比使用經(jīng)長(zhǎng)期保存的第二試劑A時(shí)的測(cè)定值更接近使用第二試劑E時(shí)的測(cè)定值。
這說(shuō)明因長(zhǎng)期保存而變質(zhì)的NAC與氨基甲烷磺酸接觸后又回到變質(zhì)前的狀態(tài)，得以充分活化CK。從以上可以看出，使用含氨基甲烷磺酸的試劑，即使試劑經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存也能夠正確測(cè)定試樣中的CK活性。
(實(shí)施例2)以下是CK活性測(cè)定用第一試劑和第二試劑的基本構(gòu)成。
<第一試劑A>pH 6.6咪唑125mM醋酸鎂12.5mMCyDTA 2.0mMADP 2.5mMAMP 6.25mMAP5A 12.5μM葡萄糖30mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/LNAC 30mM<第二試劑>pH 9.0磷酸肌酸150mM將上述物質(zhì)按上述濃度溶解在蒸餾水中，配制第一試劑A和第二試劑。然后，在第一試劑A中添加氨基甲烷磺酸1mM，配制第一試劑B；再在第一試劑A中添加氨基甲烷磺酸2mM配制第一試劑C。
將上述第一試劑A～C和第二試劑在4℃的溫度下保存1個(gè)月，然后用日立7170S型自動(dòng)分析儀將第一試劑180μl、第二試劑45μl作為試樣和酶校準(zhǔn)品(calibrator)(Sysmex公司制)5.6μl混合，測(cè)定在340nm處的吸光度變化。測(cè)定進(jìn)行二次，測(cè)定結(jié)果的平均值如下面表2所示。表2所示值是將吸光度變化量放大10000倍后的值。
表2

使用含有氨基甲烷磺酸并經(jīng)長(zhǎng)期保存的第一試劑B、C顯示出的測(cè)定值高于只經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期保存的第一試劑A。
如上所示，氨基甲烷磺酸與NAC在一起可以抑制NAC經(jīng)長(zhǎng)期保存而變質(zhì)，從而得以充分活化試樣中的CK。以上可以看出，使用添加了氨基甲烷磺酸的試劑，即使長(zhǎng)期保存后也能正確地測(cè)定CK的活性。
(實(shí)施例3)使用含NAC以外的SH化合物的CK活性測(cè)定用試劑來(lái)評(píng)價(jià)氨基甲烷磺酸穩(wěn)定SH化合物的作用。
將下列物質(zhì)按下列濃度溶解在蒸餾水中，并將pH維持在6.6。
咪唑125mM醋酸鎂12.5mMEDTA 2.5mMADP 2.5mMAMP 6.25mMAP5A 12.5μM葡萄糖30mMNADP 2.5mMG6PDH 1875U/L乙糖激酶3750U/L
在上述成份中作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一個(gè)和氨基甲烷磺酸10mM，配制5種第一試劑。同時(shí)，也作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一個(gè)，不添加氨基甲烷磺酸，再配制5種第一試劑。對(duì)這十種試劑以37℃施加5天的溫度負(fù)荷后對(duì)試劑中的SH基進(jìn)行定量。
另外，作為CK活化劑添加30mM半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和硫代丙三醇中的一個(gè)，不添加氨基甲烷磺酸，配制5種第一試劑，不施加溫度負(fù)荷對(duì)試劑中的SH基進(jìn)行定量。
SH基的定量是用DTNB 5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5，5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))做的。在試劑中添加DTNB，如果有SH化合物，則相當(dāng)于SH化合物所含SH基的量的二硫化物鍵斷裂，產(chǎn)生5-巰基-2-硝基苯(甲)酸(5-Mercapto-2-nitrobenzoic acid)。5-巰基-2-硝基苯(甲)酸一產(chǎn)生，則波長(zhǎng)412nm處的吸光度升高，測(cè)定之以定量試劑中的SH基。定量結(jié)果如以下表3所示，定量結(jié)果是相對(duì)于使用未添加氨基甲烷磺酸的第一試劑、在未施加溫度負(fù)荷的情況下而定量的SH基的量的百分比。
表3


無(wú)論使用哪個(gè)CK活化劑，添加氨基甲烷磺酸的第一試劑其施加溫度負(fù)荷后的SH基殘留量比不添加氨基甲烷磺酸的第一試劑更多。這說(shuō)明無(wú)論哪種CK活化劑都可以通過(guò)添加氨基甲烷磺酸抑制變質(zhì)的發(fā)生。由此可知，氨基甲烷磺酸可以提高各種CK活化劑的保存穩(wěn)定性。
如上所述，在第一試劑和第二試劑之一添加氨基甲烷磺酸，試劑即使長(zhǎng)期保存也能正確地測(cè)定CK活性。
權(quán)利要求
1.一種肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶活化劑。
2.權(quán)利要求1描述的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于所述肌酸激酶活化劑是一種含有SH基的化合物。
3.權(quán)利要求1描述的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于所述肌酸激酶活化劑是選自N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、N-鳥(niǎo)苷-L-半胱氨酸、半胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽、巰基琥珀酸、硫葡萄糖、二硫赤蘚糖醇、巰基醋酸、2-巰基乙醇、溴2-氨乙基異硫糖醛(aminoethyl isothiouronium)、2-巰基乙烷磺酸及硫代丙三醇中的至少一種。
4.權(quán)利要求1或2描述的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于還至少含有以下一種化合物葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
5.權(quán)利要求1或2描述的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于還含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖、腺苷二磷酸(ADP)及磷酸肌酸。
6.權(quán)利要求1描述的肌酸激酶活性測(cè)定用試劑，其特征在于還含有與肌酸激酶M型亞組特異締合的抗體。
7.一種肌酸激酶活性測(cè)定用套裝試劑，其特征在于包括二種試劑，其分別是含有肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一試劑和含有氨基甲烷磺酸及磷酸肌酸的第二試劑。
8.一種肌酸激酶活性測(cè)定用套裝試劑，其特征在于包含二種試劑，其分別是含有氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)的第一種試劑，含有磷酸肌酸的第二種試劑。
9.肌酸激酶活性測(cè)定用套裝試劑的制造方法，其特征在于包括以下配制步驟a)將肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配制第一試劑；及b)將氨基甲烷磺酸和磷酸肌酸混合配制第二試劑。
10.肌酸激酶活性測(cè)定用套裝試劑的制造方法，其特征在于包括以下配制步驟a)將氨基甲烷磺酸、肌酸激酶活化劑、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)、二磷酸吡啶核苷酸(NAD)或磷酸煙酰胺腺苷二核苷酸(NADP)、乙糖激酶或葡萄糖激酶、葡萄糖及腺苷二磷酸(ADP)混合，配制第一試劑；及b)配制含有磷酸肌酸的第二試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供含有氨基甲烷磺酸和肌酸激酶(CK)活化劑的肌酸激酶(CK)活性測(cè)定用試劑。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1916623SQ20061010982
公開(kāi)日2007年2月21日 申請(qǐng)日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日
發(fā)明者酒井康裕 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社