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用于質譜法的電離修飾劑的制作方法

文檔序號:6114782閱讀:127來源:國知局
專利名稱:用于質譜法的電離修飾劑的制作方法
背景技術
在分析蛋白質生物化學中,質譜法已經(jīng)發(fā)展成了一種多用途技術。選擇的儀器類型為MALDI-TOF質譜儀,并且針對用胰蛋白酶或內(nèi)蛋白酶(endoproteinase)-C形式的內(nèi)肽酶裂解所產(chǎn)生的分子量為0.8-3kDa的肽類對分析窗進行優(yōu)化。
然而,盡管裂解過程被設計用于產(chǎn)生可確保電離的基礎殘基(basicresidue)均質分布的肽這一事實,但是一些分子比其它分子更易于檢測。這是由于可導致一些肽完全猝滅的電離競爭所致。一個突出的實例是阿爾茨海默病淀粉樣肽(Alzheimer’s amyloid peptide)(Aβ)。已知用內(nèi)肽酶Lys-C產(chǎn)生的Aβ的三個肽片段表現(xiàn)極為不同(Grüninger等2000,使用基于質譜法的檢測系統(tǒng)鑒定β-分泌酶樣活性(Identification of beta-secretase-likeactivity using a mass spectrometry-based assay system).NatureBiotechnology,1866-70)。氨基末端片段和中間片段具有極佳的電離特性,但是使用優(yōu)選的MALDI-TOF方法從未檢測到羧基末端片段(Rüfenacht等2005,使用與質譜法組合的激光切割顯微術對阿爾茨海默病斑塊中的Aβ肽進行定量(Quantification of the Aβpeptide in Alzheimer’s plaques bylaser dissection microscopy combined with mass spectrometry).J.MassSpectrom.;40193-201)。
但是羧基末端被認為是淀粉樣肽的關鍵部分。Aβ以不同鏈長出現(xiàn)。大部分肽終止于殘基40,而少量肽終止于殘基42。較長的形式具有高得多的成纖維傾向并且因此被認為是產(chǎn)生問題的原因。
此外,具有意義的是區(qū)分通過修飾產(chǎn)生的不同Aβ種類,例如Aβ(11-16)和Aβ(pyroGlu11-16)片段(Huse等,2002,高爾基體外側網(wǎng)絡中的γ-分泌酶加工優(yōu)先產(chǎn)生在阿爾茨海默病大腦中蓄積的截短的淀粉狀蛋白種類(γ-Secretase processing in the trans-Golgi network preferentially generatestruncated amyloid species that accumulate in Alzheimer’s disease brain).J.Biol Chem.27716278-16284)或除了天然形式的甲硫氨酸外還在35位上帶有甲硫氨酸亞砜的Aβ。Hou等(甲硫氨酸-35氧化減少阿爾茨海默病的淀粉樣Ab-(1-42)肽的原纖維裝配(Methionine-35 oxidation reduces fibrilassembly of the amyloid Ab-(1-42)peptide of Alzheimer’disease).J.Biol.Chem.(2002)27740172-40176)證實在生理pH下Met-35側鏈氧化成甲硫氨酸亞砜(Met-35(ox))顯著妨礙42-殘基Aβ-(1-42)的原纖維形成速率。Met-35(ox)還改變特征性Aβ原纖維形態(tài)并且防止初原纖維形成,而它是β-淀粉樣變和相關神經(jīng)毒性的關鍵中間體。
因此,強烈需要一種用于檢測這類以前用質譜法無法檢測的分子的方法。
因此,本發(fā)明涉及修飾多肽并因此使得可用質譜法檢測以前用該方法無法檢測的多肽的新分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了以下通式的化合物 n=0、1、2、3、4、5、6、7或8;X=H、OH、F、Cl、Br、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R=無殘基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R’=無殘基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R”=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;
R””=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;或者R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””彼此鍵合與它們所連接的氮原子一起形成環(huán),并且R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””一起為-CH2-(CH2)p-,其中p為1、2或3;或者X和R彼此鍵合與它們所分別連接的氮原子和碳原子一起形成環(huán),并且X和R一起為-(CH2)k-,其中k為1、2、3或4。
優(yōu)選地,n=1,X=OH或H,R=H,R’=無殘基,R”=H,R=H且R””=H。也優(yōu)選其中n=4、X=H、R=H、R’=無殘基、R”=H、R=H且R””=H的上述化合物。
X決定在分析物與電離修飾劑之間產(chǎn)生酰胺鍵的轉化反應的反應性。當X為Cl或Br時,在復合峰型中鑒別出修飾的胺是可能的。電離修飾劑中含有的氯或溴以同位素混合物的形式存在并且產(chǎn)生不同的雙帶型。當用這類標記修飾分析物時,可通過峰型從其它峰中容易地鑒別出相應的加合物。
本發(fā)明進一步提供了上述化合物作為電離修飾劑的用途。
本文所用的術語“電離修飾劑”或“飛行修飾劑”指的是能夠結合所關注的多肽并且通過結合改變所關注的多肽在質譜法中的行為的分子。電離修飾劑能夠接受或提供至少一個電子。優(yōu)選地,電離修飾劑對一種氨基酸(即賴氨酸)具有特異性。
本文所用的術語“多肽”或“所關注的多肽”指的是不同長度的氨基酸鏈。多肽可以是蛋白質或其片段或者肽或其片段。優(yōu)選地,多肽是β-淀粉樣肽Aβ1-40和Aβ1-42的C-末端片段,如例如Aβ(29-40)和Aβ(29-42)。
此外,本發(fā)明提供了對來自包含標記和未標記形式的所關注的多肽的來源的所述多肽進行定量的方法,所述方法包括以下步驟(a)用電離修飾劑修飾分離的多肽;(b)通過質譜法分析制備的多肽,并且由此測定多肽來源中存在的所關注的多肽的量。
本發(fā)明的一個實施方案涉及對所關注的多肽進行定量的方法,其包括(a)提供多肽來源;(b)將確定量的用穩(wěn)定同位素標記的多肽加入到(a)的來源中;(c)分離未標記和標記的所關注的多肽;(d)制備分離的所關注的多肽用于通過質譜法進行分析;(e)用電離修飾劑修飾分離的多肽;(f)通過質譜法分析制備的所關注的多肽;和(g)測定多肽來源中存在的所關注的多肽的量。
所關注的多肽的來源可以是體液,例如血液,或者所關注的多肽可以獲自組織樣品(例如勻漿的腦樣品)或細胞培養(yǎng)物。組織樣品、體液或細胞培養(yǎng)物可以是哺乳動物組織樣品、哺乳動物體液或哺乳動物細胞。優(yōu)選的組織樣品、細胞和體液來源于人或小鼠。
在所述的來源中,所關注的多肽可以以可溶性或聚集的形式存在。聚集的所關注的多肽可以形成斑塊,由此本文所用的術語“斑塊”指的是聚集的多肽的沉著物??梢酝ㄟ^包括一般生物化學多肽純化方法的方法和包括激光切割顯微術的用于從組織中特異性切下結構的方法從組織樣品中獲得含有聚集的多肽的所關注的多肽的來源(即含有聚集的β淀粉狀蛋白的淀粉樣沉著物)。
激光切割顯微術方法包括低溫消融(cold ablation)和激光壓力彈射步驟(Schütze等(1998),通過激光介導的單細胞操作鑒定表達的基因(Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of singlecells),Nature Biotechnology 16737-742;Simone等(1998),激光-俘獲顯微切割開啟用于分子分析的顯微鏡新領域(Laser-capture microdissectionopening the microscopic frontier to molecular analysis),TIG 14272-276)。激光切割顯微術可用于俘獲任意特異性表型或可通過光學顯微術鑒別的表型組織改變。例如,該技術可以有助于通過對分離的樣本進行單獨的顯微切割和分析(例如通過微陣列)來檢測正常細胞或組織與病理材料之間在基因表達上的差異。因此,與不使用激光切割所必須的整體組織分析相比,可以更容易地對重要改變進行定性和定量分析并且具有更大的準確度。在分析多肽組成之前通過激光切割分離所關注的結構的優(yōu)點是有用的,其中不需要平均的多肽組成或濃度,但其中需要分析特異性生物結構。
含有聚集的所關注的多肽的切下的來源可能僅代表整個斑塊的一部分。在Aβ的情況下,斑塊為球形。為了測定整個斑塊中所關注的多肽的量,所測定的斑塊切下部分中所關注的多肽的量必須用校正因子進行平衡。校正因子取決于組織切片的厚度和平均斑塊直徑,將切下的小片的淀粉狀蛋白含量外推至整個球體(Andreas Güntert“來自人和轉基因小鼠的斑塊比較中的激光切割顯微術(laser dissection microscopy in the comparison ofplaques from human and transgenic mice)”Diploma thesis 2002,Biozentrum der Universitt Basel,瑞士)。
此外,在切下后,斑塊可以通過靜電效應被轉移至容器中。
可以通過包括多肽生物化學、組織化學和免疫化學的方法測定組織樣品、細胞培養(yǎng)物或體液中所關注的多肽的存在??梢詢?yōu)選通過包括用剛果紅或硫磺素S染色的組織化學方法或通過免疫組織化學方法測定組織樣品中聚集的所關注的多肽。更優(yōu)選地,通過用組織化學和免疫組織化學方法雙重染色測定組織樣品中聚集的所關注的多肽的存在。這類方法是本領域技術人員眾所周知的。最優(yōu)選地,通過首先用剛果紅染色、然后用免疫組織化學方法測定組織樣品中聚集的所關注的多肽的存在。優(yōu)選地,通過對體液樣品進行蛋白質印跡實驗測定體液中所關注的多肽的存在。
在本發(fā)明的方法中,將用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽作為標準品加入到所關注的多肽來源中,然后開始溶解和/或分離操作。將該標準品、即用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽直接加入到勻漿的組織樣品、切下的多肽沉著物、體液樣品或細胞培養(yǎng)物中。
可以在開始時將標準品(用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽)摻入所關注的多肽來源中,例如摻入切下的多肽沉著物中或摻入體液樣品中。由于待定量的未標記的所關注的多肽與標記的所關注的多肽標準品除了相同原子的質量不同之外在化學上是相同的,所以它們在聚集的所關注的多肽或可溶性的所關注的多肽(例如聚集的淀粉狀蛋白或可溶性淀粉狀蛋白)的所需的溶解和/或分離操作方面均表現(xiàn)相同,這些多肽可以被其它多肽結合,導致分析物與標準品的等量損耗。在所述操作之前和之后比較標記的標準品的量使得可以測定該來源中初始存在的未標記的所關注的多肽的量。
用至少一種選自包括2H、13C、15N和18O的組的穩(wěn)定同位素標記所關注的多肽標準品。優(yōu)選地,用15N或13C標記所關注的多肽標準品。更優(yōu)選地,用15N標記所關注的多肽標準品。優(yōu)選地,用質譜中同位素圖分離所必須的種類的穩(wěn)定同位素標記所關注的多肽標準品。
加入確定量的用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽標準品。優(yōu)選地,以與所關注的多肽來源中存在的所關注的多肽的有效量處于相同范圍內(nèi)的量加入標記的所關注的多肽標準品。可以在預實驗中、例如如Rüfenacht等(通過與質譜法組合的激光切割顯微術對阿爾茨海默病斑塊中的Aβ肽進行定量(Quantification of the Aβpeptide in Alzheimer’s plaques by laser dissectionmicroscopy combined with mass spectrometry).J.Mass Spectrom.;2005;40193-201)所述來確定該量。
可以以重組方式生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中用作標準品的用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽。用于制備表達構建體和用于重組生產(chǎn)多肽的方法以及多肽是本領域所公知的,并且在Ausubel,Current Protocols in MolecularBiology/Polypeptide science,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1994)中有概述。
可以通過化學合成生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中用作標準品的用穩(wěn)定同位素標記的所關注的多肽。用于合成生產(chǎn)多肽或其片段的方法是本領域所公知的,例如多肽的固相合成,并且在Ausubel,Current Protocols inPolypeptide science,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中有概述。固相肽合成是用于制備合成肽的最常用方法,并且已經(jīng)使用用于α-氨基保護的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(Burdick,D等,J BiolChem 1992,267,546-554)和Boc(叔丁氧羰基)(Barrow,C.J.等,J Mol Biol1992,225,1075-1093)方法獲得了成功合成。
加入所關注的多肽標準品后,可以通過包括免疫沉淀法和免疫親和色譜法的多肽化學方法從體液、優(yōu)選從血清或CSF中分離全部所關注的多肽,包括標記的和未標記的所關注的多肽。
因此,在另一個實施方案中,步驟(c)中所關注的多肽是通過包括肽化學和免疫化學的方法從體液中分離的。
為了測定含有聚集的所關注的多肽的所關注的多肽來源中所關注的多肽含量,必須將聚集的所關注的多肽溶解。在本發(fā)明的方法中,通過包括用增溶劑溶解和任選地在標記的所關注的多肽標準品存在下的機械增溶法的方法溶解聚集的所關注的多肽。本發(fā)明的增溶劑可以是具有溶解聚集的所關注多肽能力的所有試劑,例如六氟丙醇;酸如例如甲酸;脲-SDS。機械增溶法可以包括聲波振蕩。聚集的所關注的多肽的溶解操作在加入的標記的所關注的多肽標準品存在下進行,由此確保所關注的多肽標準品與待定量的所關注的多肽等量損耗。
因此,在另一個實施方案中,步驟(c)中的所關注的多肽是通過包括用增溶劑溶解和任選地聲波振蕩的方法從所關注的多肽沉著物中分離的。
隨后制備分離的所關注的多肽用于通過質譜法進行分析。用于通過質譜法分析的制備物包括使待分析的Aβ電離得到改善的方法。導致電離改善的方法包括通過包括化學碎裂和酶消化的方法進行碎裂。
隨后,用化學反應使任選地碎裂的多肽與飛行修飾劑結合。與飛行修飾劑的化學反應包括肽游離N-末端的電荷衍生化,以便提高敏感性并通過源衰變后MALDI質譜法促進片段離子的形成(J.Stults等(1993)Anal.Chem.65,1703-1708;B.Spengler等(1997)Int.J.Mass Spectrom.169-170,127-140;Z.Huang等(1999)Anal.Biochem.268,305-317;StaudenmannW.和James P.Proteome ResearchMass Spectrometry(P.James編輯)Springer Verlag,Berlin(2001)143-166)。可以使分離的多肽直接與飛行修飾劑反應以便制備用于質譜法分析的制備物?;蛘?,可以使分離的多肽在碎裂后與飛行修飾劑反應?;瘜W碎裂可以使用溴化氰進行。酶消化可以使用選自包括內(nèi)多肽酶(endopolypeptidease)Lys-C、胰蛋白酶、內(nèi)多肽酶Glu-C和胃蛋白酶的組的蛋白酶進行。在本發(fā)明的方法中,可以將分離的多肽進行干燥并重新溶于緩沖液,然后用蛋白酶消化。溶解的多肽的碎裂可使質譜分析中的檢測限更好(Gruenigner等(2000),使用基于質譜法的檢測系統(tǒng)鑒定β-分泌酶-樣活性(Identification of β-secretase-like activity usinga mass spectrometry-based assay system).Nature biotechnology 1866-70)。
因此,在另一個實施方案中,步驟(d)中的分離的所關注的多肽是通過包括化學碎裂和酶消化的方法制備的以用于通過質譜法進行分析。
在進行質譜分析前,可以使溶解的和任選地碎裂的所關注的多肽脫鹽。當存在作為電離競爭者的離子化合物時(例如由緩沖液引入的),建議將樣品脫鹽(例如,通過ZipTip)。
然后,通過質譜法分析分離的和任選地碎裂的所關注的多肽。目前用于生物材料的電離技術包括ESI(電噴霧-電離)和MALDI(基質輔助激光解吸附電離)。優(yōu)選地,所用的質譜分析是MALDI-TOF(飛行時間)質譜分析。MALDI-TOF-MS分析的光譜主要由完整的單電荷的分子離子組成。較大的分子如多肽還可以產(chǎn)生多電荷離子以及單電荷多聚體,這取決于它們的濃度。
就作為所關注的多肽的Aβ而言,天然14N Aβ的峰型與質譜法中其人工15N同系物基線分離,由此使得可辨別質譜中天然的所關注的多肽和標準所關注的多肽。
可以通過用于質譜分析的不同手段來測定聚集的所關注的多肽來源中存在的所關注的多肽例如Aβ的量a)通過比較標記的標準品(就Aβ而言15N-標記的淀粉狀蛋白標準品)與來自所關注的多肽來源的所關注的多肽的兩個主峰的峰高;b)通過比較分離的峰型的所有峰的峰高;c)通過比較兩個主峰下的面積;或d)通過比較兩種不同峰型的所有峰下的面積之和。然后使用操作開始時加入的標記的所關注的多肽標準品的確定量和已知量可以計算多肽來源中存在的多肽量。在必須測定三維淀粉樣沉著物例如斑塊中存在的多肽例如Aβ的量的情況下,計算中必須包括校正因子。
阿爾茨海默病的特征在于患者腦中的淀粉樣原纖維的胞外沉著物。已知許多不同的Aβ變體隨氨基-以及羧基-末端上的異質性而出現(xiàn)。特別有意義的是羧基-末端的異質性,因為帶有42個氨基酸的較長形式(Aβ1-42)比含有40個氨基酸的較短形式(Aβ1-40)發(fā)生聚集的傾向大得多。因此,重要的是在兩種長度變體之間進行區(qū)分。因此決定性的部分是C-末端。然而,在使用內(nèi)肽酶Lys-D產(chǎn)生的三個部分中,使用質譜法檢測不到C-末端肽片段。需要對死亡前淀粉樣沉著進行定量的方法作為輕度或臨床上易混淆情況下的診斷工具以及用于監(jiān)測以防止Aβ沉著為目的的療法的有效性。
因此,本發(fā)明進一步提供了對AβX-40和/或AβX-42進行檢測和定量的方法,其包括(a)提供淀粉樣肽AβX-40和/或AβX-42的來源;(b)加入確定量的用穩(wěn)定同位素標記的β淀粉樣肽AβX-40和/或AβX-42;(c)在標記的β淀粉狀蛋白存在下分離β淀粉狀蛋白AβX-40和/或AβX-42;(d)用蛋白酶消化分離的β淀粉狀蛋白AβX-40和/或AβX-42;(e)用電離修飾劑修飾β淀粉狀蛋白AβX-40和/或AβX-42的片段;(f)通過質譜法分析消化的β淀粉樣肽片段;和(g)通過測定C-末端片段的長度變體的量測定該來源中存在的β-淀粉樣肽AβX-40和/或AβX-42的量。
優(yōu)選地,X為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11(Aβ1-40、Aβ2-40、Aβ3-40、Aβ4-40、Aβ5-40、Aβ6-40、Aβ7-40、Aβ8-40、Aβ9-40、Aβ10-40、Aβ11-40、Aβ1-42、Aβ2-42、Aβ3-42、Aβ4-42、Aβ5-42、Aβ6-42、Aβ7-42、Aβ8-42、Aβ9-42、Aβ10-42和Aβ11-42)。更優(yōu)選地,X為1。
優(yōu)選的(g)的C-末端片段的長度變體為Aβ29-40和Aβ29-42。還優(yōu)選的(g)的C-末端片段的長度變體為Aβ11-40和Aβ11-42。
上述這些方法使得可以在C-末端片段(AβX-40和AβX-42)的兩種變體之間進行區(qū)分,并且可以對樣品、即獲自組織樣品的淀粉樣沉著物中各個變體的量進行定量。
本發(fā)明的另一個實施方案為對修飾的淀粉樣肽進行定量的方法,其包括(a)提供修飾的淀粉樣肽Aβ的來源;(b)加入確定量的用穩(wěn)定同位素標記的修飾的β淀粉樣肽Aβ;(c)在標記的β淀粉狀蛋白存在下分離修飾的β淀粉狀蛋白Aβ;(d)用蛋白酶消化分離的修飾的β淀粉狀蛋白Aβ;(e)用電離修飾劑修飾修飾的β淀粉狀蛋白Aβ的片段;(f)通過質譜法分析消化的修飾的β淀粉樣肽片段;和(g)測定該來源中存在的修飾的β淀粉樣肽Aβ的量。
Aβ肽的修飾可以是Aβ(11-16)谷氨酸11的環(huán)化,由此產(chǎn)生N-末端N-焦谷氨酸種類Aβ(pyroGlu11-16)。優(yōu)選地,淀粉樣肽的修飾是甲硫氨酸35的側鏈氧化成甲硫氨酸亞砜(Met-35(ox))。甲硫氨酸35指的是β-淀粉樣肽的氨基酸鏈35位上的氨基酸甲硫氨酸。優(yōu)選的淀粉樣肽的來源是腦中的淀粉狀蛋白斑塊。腦可以來源于哺乳動物。優(yōu)選的腦為人腦或小鼠腦。
用本發(fā)明的方法定量的β淀粉狀蛋白的其它形式包括交聯(lián)肽,例如Aβ(X-38)、Aβ(X-39)、Aβ(X-40)、Aβ(X-41)、Aβ(X-42)、Aβ(X-43),其中X為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11,并且所述的肽在3和/或11位上被焦谷氨酸化(pyroglutinated)。這些交聯(lián)的肽可以任選地被蛋白酶陣列碎裂,以便適合所述方法的分析窗。術語β淀粉狀蛋白和Aβ在本發(fā)明中等同使用。
優(yōu)選的β淀粉狀蛋白或其片段的來源是獲自組織樣品、血清和CSF的淀粉樣沉著物。獲自組織樣品的淀粉樣沉著物包括致密斑塊(神經(jīng)斑或老年斑)、彌漫性斑塊以及導致微血管病變的小動脈和小靜脈中的淀粉樣沉著物。淀粉樣沉著物主要包括聚集的β淀粉狀蛋白,還有少量其它成分。最優(yōu)選的是獲自腦組織的淀粉狀蛋白斑塊。
優(yōu)選地,淀粉樣沉著物是通過激光切割顯微術從組織樣品中切下的。優(yōu)選地,淀粉樣沉著物是從組織切片中切下的,更優(yōu)選地,它們是從腦切片中切下的。
β淀粉狀蛋白可以以聚集的或可溶性形式存在于β淀粉狀蛋白來源中。盡管已知斑塊中的Aβ?lián)饺肓说矸蹣釉w維,但是Aβ的可溶性非原纖維形式確實在體內(nèi)存在。Teller等(Teller,J.K.等,Nat Med 1996,2,93-95)在來自唐氏綜合征受試者和正常老年對照組的腦的水提取物中檢測到了可溶性Aβ種類;在尸體解剖時由胎兒和年齡為4天-61歲的受試者獲得樣品。在唐氏綜合征受試者中,可溶性Aβ的量高出數(shù)倍,并且它隨著年齡而增加。此外,在神經(jīng)斑形成之前很長時間就出現(xiàn)可溶性Aβ的升高。Kuo等(Kuo,Y.M.等,J Biol Chem 1996,271,4077-4081)檢查了來自8位AD受試者和4位正常對照受試者的腦的水提取物,發(fā)現(xiàn)可溶性Aβ的量增加了6倍。對可溶性Aβ進行的超濾實驗證實了Aβ寡聚體的存在。
聚集的β淀粉狀蛋白可以是折疊成″β-折疊″結構(beta-pleated sheet)原纖維的淀粉樣原纖維,其中淀粉樣原纖維根據(jù)包括以下的標準分類(1)剛果紅結合證實并且在交叉的起偏振器之間觀察時顯示綠色雙折射;(2)直徑為6-10nm的精細無分支纖維的電子顯微鏡證實;(3)存在特征-結構;和(4)與在絲心蛋白中觀察到的交叉圖譜類似的x-射線纖維衍射圖譜。
可以通過包括蛋白質生物化學、組織化學和免疫化學的方法測定組織樣品或體液中β淀粉狀蛋白的存在。優(yōu)選地,通過包括用剛果紅或硫磺素S染色的組織化學方法或通過免疫組織化學方法測定組織樣品中聚集的β淀粉狀蛋白的存在。更優(yōu)選地,通過用組織化學和免疫組織化學方法雙重染色測定組織樣品中聚集的β淀粉狀蛋白的存在。最優(yōu)選地,通過首先用剛果紅染色、然后使用免疫組織化學方法測定組織樣品中聚集的β淀粉狀蛋白的存在。優(yōu)選地,通過對體液樣品進行蛋白質印跡實驗測定體液中β淀粉狀蛋白的存在。
用穩(wěn)定同位素標記并且被作為標準品加入的Aβ代表了與Aβ來源中待定量的Aβ相同的Aβ形式。因此,用穩(wěn)定同位素標記的Aβ可以選自包括Aβ1-40、Aβ2-40、Aβ3-40、Aβ4-40、Aβ5-40、Aβ6-40、Aβ7-40、Aβ8-40、Aβ9-40、Aβ10-40、Aβ11-40、Aβ1-42、Aβ2-42、Aβ3-42、Aβ4-42、Aβ5-42、Aβ6-42、Aβ7-42、Aβ8-42、Aβ9-42、Aβ10-42、Aβ11-42和Aβ29-X的組,其中X為37、38、39、40、41、42或43。用至少一種選自包括2H、13C、15N和18O的組的穩(wěn)定同位素標記Aβ標準品。優(yōu)選地,用15N或13C標記Aβ標準品。更優(yōu)選地,用15N標記Aβ標準品。優(yōu)選地,用質譜中同位素圖分離所必須的種類的穩(wěn)定同位素標記所關注的多肽標準品。
加入確定量的用穩(wěn)定同位素標記的Aβ標準品。優(yōu)選地,以與所關注的多肽來源中存在的Aβ的有效量處于相同范圍內(nèi)的量加入標記的Aβ標準品??梢栽陬A實驗中確定該量。
可以通過化學合成生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中用作標準品的用穩(wěn)定同位素標記的Aβ標準品。用于合成生產(chǎn)多肽的方法是本領域所公知的,例如多肽的固相合成,并且在Ausubel,Current Protocols in Polypeptide science,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中有概述。使用合成Aβ肽在體外形成的淀粉樣原纖維與分離自老年斑的那些淀粉樣原纖維相同這一現(xiàn)象的證實(Kirschner,D.A.;Inouye,H.;Duffy,L.K.;Sinclair,A.;Lind,M.;Selkoe,D.J.Proc Natl Acad Sci USA 1987,84,6953-6957)已經(jīng)驗證了合成肽在不同研究中的用途。固相肽合成是用于制備合成肽的最常用方法,并且已經(jīng)使用用于α-氨基保護的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(Burdick,D等,J Biol Chem 1992,267,546-554)和Boc(叔丁氧羰基)(Barrow,C.J.等,J Mol Biol 1992,225,1075-1093)方法獲得了成功合成。盡管Aβ肽合成存在中等難度,但是已經(jīng)證實標準偶聯(lián)方法和側鏈保護策略足以成功進行合成。為了將穩(wěn)定同位素引入Aβ標準品,在合成方法中使用穩(wěn)定同位素標記的氨基酸。
可以以重組方式生產(chǎn)在本發(fā)明的方法中用作標準品的用穩(wěn)定同位素標記的Aβ淀粉樣肽。用于重組生產(chǎn)天然Aβ的方法在本領域中有描述,例如在EP0641861中。優(yōu)選地,可通過用15N氯化銨飼喂重組大腸桿菌來生產(chǎn)標記的Aβ。穩(wěn)定同位素的其它來源包括13C-標記的葡萄糖和生長在15N-標記的底物上的藻類提取物。
盡管已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明,但是參照具體實施例可以更好地理解本發(fā)明,本文包括這些實施例的目的僅僅在于結合下列附圖用于解釋本發(fā)明,而并非旨在限制本發(fā)明,另有說明的除外。


圖1以圖解方式表示本發(fā)明方法的原理,以Aβ淀粉狀蛋白的C-末端片段的鑒別為例。用內(nèi)肽酶Lys-D消化Aβ產(chǎn)生三個片段(步驟1)。用飛行修飾劑 處理三個片段(步驟2),在此情況下,飛行修飾劑與游離氨基●特異性結合。結合的飛行修飾劑改變了所述片段的飛行行為并且使得能夠檢測C-末端片段和在Aβ(1-40)與Aβ(1-42)之間進行區(qū)分。
圖2表示用25個人致密斑塊、但不使用電離修飾劑(IM)獲得的MALDI-TOF質譜圖(MS)。無法對β-淀粉樣肽的C-末端片段進行鑒別或定量。不能在Aβ1-40與Aβ1-42之間進行區(qū)分。
圖3表示用35個人致密斑塊與電離修飾劑(IM)獲得的MALDI-TOF質譜圖。因IM而可檢測Aβ的C-末端片段,并且能在Aβ1-40與Aβ1-42之間進行區(qū)分。
圖4表示使用電離修飾劑(IM)的45只PS2APP轉基因小鼠(Richards等(2003)共表達hAPPswe和hPS2mut的PS2APP轉基因小鼠表現(xiàn)出與年齡相關的離散性腦淀粉樣沉著和與認知缺陷相關的炎癥(PS2APPtransgenic mice,coexpressing hAPPswe and tPS2mut,show age-relateddiscrete brain amyloid deposition and inflammation associated with cognitivedeficits).J Neurosci.23,8989)的致密斑塊的MALDI-TOF-質譜圖。IM使得可以在Aβ1-40與Aβ1-42之間進行區(qū)分。此外,可以通過本發(fā)明的方法檢測35位上甲硫氨酸磺化氧化形式的小修飾。
圖5表示來自氨和34種小胺(用電離修飾劑(IM)衍生的乙醇胺、甘氨酸和半胱胺)的離子噴霧質譜圖。
圖6表示電離修飾劑的實例。
具體實施例方式
除非另有說明,否則按照生產(chǎn)商的說明使用實施例中涉及的商購試劑。
實施例1精氨酸-NHS加合物及其在檢測阿爾茨海默病斑塊中的Aβ的羧基-末端中的應用 L-精氨酸向其HBF4鹽的轉化將350mg L-精氨酸(2mMoles)溶于8ml H2O。用約0.25ml 8M的四氟硼酸滴定該溶液,直到pH表現(xiàn)出從pH 6降至pH 2-3。冷凍干燥后,加入1ml二甲基甲酰胺(DMF),在第二次冷凍干燥后,得到澄明的、非常粘稠的油狀物。
L-精氨酸N-羥基琥珀酰亞胺的合成將25.5mg O-(N-琥珀酰亞胺基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽溶于0.32ml DMF。向該溶液中加入70.6mg L-精氨酸HBF4鹽制備物和60μl吡啶。將該混合物在20℃下溫育并通過電噴霧質譜法(類型API 150MCA)監(jiān)測反應。L-精氨酸N-羥基琥珀酰亞胺極具反應性并且在稀釋該樣品和進樣所需的幾秒鐘過程中大量已經(jīng)被轉化回游離酸或酰胺(因用于質譜法的緩沖系統(tǒng)中包含的銨離子所致)。5小時后所需產(chǎn)物的比例最佳。該制備物稱作電離修飾劑粗品。
與獲自腦切片的碎裂的Aβ肽的反應該操作是已經(jīng)描述的操作的擴展(專利申請EP 03024739.9和Rüfenacht等2005)。根據(jù)該描述,從腦薄切片上切下斑塊,用抗-Aβ抗體或用剛果紅染色,在顯微鏡下通過激光切割切下并且通過激光壓力彈射收集在微量離心管內(nèi)。接下來,用70%甲酸溶解斑塊中包含的聚集的Aβ,在真空中干燥并且用內(nèi)蛋白酶Lys-C消化。
通常,消化物的體積為10μl,用10mM NaHCO3緩沖。向該消化物中加入5μl電離修飾劑粗品溶液并且在20℃下溫育1小時。
在該衍生化過程后,操作步驟與(Rüfenacht等2005)中所述的相同,包括首先用ZipTip脫鹽,與基質混合以便進行MALDI-TOF MS。
任選地,可以在用70%甲酸溶解纖維前即刻加入已知量的15N-標記的Aβ。這使得可對斑塊中包含的Aβ量進行定量。天然14N Aβ和重組生產(chǎn)的15N Aβ在化學上是相同的,因此在因吸附造成的損耗方面以及在蛋白酶裂解和電離方面表現(xiàn)相同。但當通過質譜法進行分析時,來源于15N Aβ的峰移位至較高質量。通過測定相應的14N與15N峰的比例,可以確定內(nèi)源性Aβ的量。當重點集中在羧基-末端時,必須選擇足夠的Aβ?lián)饺肓?spike)。在到目前為止所分析的組織樣品中,我們以不同比例檢測到了4種不同的羧基-末端(因腦樣品的來源而異)Aβ(29-40)WT、Aβ(29-40)M35Mox、Aβ(29-42)WT和Aβ(29-42)M35Mox。WT代表在35位具有甲硫氨酸殘基的野生型,而M35Mox代表氧化形式。為了對M35Mox形式進行定量,可以使用15N Aβ(1-40)或15N Aβ(1-42)或任意其它15N Aβ(X-Y)形式(Riek等在水溶液中的NMR研究無法鑒定兩種具有廣泛不同的斑塊-感受態(tài)的阿爾茨海默病肽的單體形式Aβ(1-40)ox和Aβ(1-42)ox之間的顯著構象差異(NMR studies in aqueous solution fail to identify significant conformationaldifferences between the monomeric forms of two Alzheimer peptides withwidely different plaque-competence,Aβ(1-40)ox and Aβ(1-42)ox);Eur.J.Biochem.268,5930-5936(2001))。CNBr裂解操作產(chǎn)生甲硫氨酸亞砜(Dbeli等.生物技術方法提供了聚集感受態(tài)單體阿爾茨海默病1-42殘基淀粉樣肽的手段(A biotechnological method provides access to aggregationcompetent monomeric Alzheimer’s 1-42 residue amyloid peptide);BioTechnology 13,988-993(1995))。為了對WT形式進行定量,可以使用重組融合蛋白。用內(nèi)蛋白酶Lys-C消化產(chǎn)生真正片段(authentic fragment)Aβ(17-28)和Aβ(29-X)。實例在圖1、2和3中給出。
實施例26-胍基己酸-NHS加合物的合成和分析物峰向質譜儀分析窗的位移
6-胍基己酸向其HBF4鹽的轉化6-胍基己酸在有機溶劑中具有較差的溶解度,但是當轉化成其HBF4鹽時,它可溶于甲醇。將346mg 6-胍基己酸(2mMoles)溶于0.25ml H2O,然后用約250μl 8M的四氟硼酸中和。冷凍干燥后,得到463mg白色粉末。理論產(chǎn)率466mg。
6-胍基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺加合物的合成將6.3mg 6-胍基己酸HBF4鹽溶于120μl甲醇(200mM)并且將溶于120μl(200mM)二甲基甲酰胺的2.8mg N-羥基琥珀酰亞胺加入到70mgN-環(huán)己基碳二亞胺、N’-甲基聚苯乙烯珠粒(Novo Biochem,Lufelfingen,瑞士)中。將該漿液于20℃下在旋轉振蕩器上緩慢攪拌并通過電噴霧質譜法監(jiān)測反應。8小時后,反應幾乎完成,然后可以將其引入所需測定達不超過48小時。
用6-胍基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺加合物對小伯胺進行衍生化以便將m/z值移入電噴霧質譜儀的分析窗。
在20℃下,將10μl含有氯化銨、乙醇胺、甘氨酸和半胱胺(各20mM)的混合物用10μl 6-胍基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺加合物(大約濃度為100mM)處理1小時。在MS分析之前,加入30μl水,然后取5μl用500μl MS緩沖液(50%乙腈和50%10mM乙酸銨)稀釋,將其中的2μl進樣至電噴霧質譜儀(類型API 150MCA)。未衍生的胺的m/z值為18(NH4離子)、62(乙醇胺離子)、76(甘氨酸離子)和77(半胱胺離子),因此在質譜儀的分析窗之外。如圖5中所示,當與電離修飾劑軛合時,修飾的胺的所有預期的峰均是可見的。
權利要求
1.以下通式的化合物 其中n=0、1、2、3、4、5、6、7或8;X=H、OH、F、Cl、Br、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R=無殘基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R’=無殘基、H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R”=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;R””=H、CH3、C2H5、C3H7或C4H9;或者R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””彼此鍵合與它們所連接的氮原子一起形成環(huán),并且R’和R”或R”和R或R和R””或R和R””一起為-CH2-(CH2)p-,其中p為1、2或3;或者X和R彼此鍵合與它們所分別連接的氮原子和碳原子一起形成環(huán),并且X和R一起為-(CH2)s-,其中s為1、2、3或4。
2.根據(jù)權利要求1所述的化合物,其中n=1X=OH或HR=HR’=無殘基R”=HR=HR””=H
3.根據(jù)權利要求1所述的化合物,其中n=4X=HR=HR’=無殘基R”=HR=HR””=H
4.作為電離修飾劑的權利要求1至3中任意一項所述的化合物。
5.對來自包含標記和未標記形式的所關注的多肽的來源的所述所關注的多肽進行定量的方法,所述方法包括以下步驟(a)用電離修飾劑修飾分離的多肽;(b)通過質譜法分析制備的多肽,并且由此測定該多肽來源中存在的所關注的多肽的量。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法,其中電離修飾劑是權利要求1至3中任意一項所述的化合物。
7.根據(jù)權利要求5至6中任意一項所述的方法,其中多肽是β淀粉樣肽的C-末端片段Aβ(29-40)、Aβ(29-42)。
8.根據(jù)權利要求5至7中任意一項所述的方法,其中標記的多肽是用至少一種穩(wěn)定同位素標記的。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法,其中標記的多肽是用選自包括15N、13C、18O和2H的組的穩(wěn)定同位素標記的。
10.根據(jù)權利要求5至9中任意一項所述的方法,其中步驟(e)中制備的多肽在通過質譜法進行分析之前被脫鹽。
11.根據(jù)權利要求5至10中任意一項所述的方法,其中通過MALDI-TOF質譜法對步驟(e)中制備的多肽進行分析。
12.對所關注的多肽進行檢測和定量的方法,其包括(a)提供多肽來源;(b)將確定量的用穩(wěn)定同位素標記的所述多肽加入到(a)的來源中;(c)分離未標記和標記的多肽;(d)制備分離的多肽用于通過質譜法進行分析;(e)用電離修飾劑修飾分離的多肽;(f)通過質譜法分析制備的多肽;和(g)測定該多肽來源中存在的多肽的量。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法,其中電離修飾劑是權利要求1至3中任意一項所述的化合物。
14.根據(jù)權利要求12至13中任意一項所述的方法,其中步驟(a)中的多肽來源是從組織樣品獲得的。
15.根據(jù)權利要求12至14中任意一項所述的方法,其中步驟(a)中的多肽來源是從組織樣品獲得的淀粉樣沉著物。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法,其中淀粉樣沉著物是通過用激光切割顯微術切下而從組織樣品獲得的。
17.根據(jù)權利要求15或16所述的方法,其中組織樣品是從腦獲得的。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法,其中所述的腦是人或嚙齒動物的腦。
19.根據(jù)權利要求12至14中任意一項所述的方法,其中步驟(a)中的多肽來源是體液。
20.根據(jù)權利要求12至19中任意一項所述的方法,其中步驟(b)中加入的標記的多肽是以重組方式生產(chǎn)的并且用至少一種穩(wěn)定同位素標記的多肽。
21.根據(jù)權利要求12至19中任意一項所述的方法,其中步驟(b)中加入的標記的多肽是以合成方式生產(chǎn)的并且用至少一種穩(wěn)定同位素標記的多肽。
22.根據(jù)權利要求12至21中任意一項所述的方法,其中步驟(b)中加入的多肽是用選自包括15N、13C、18O和2H的組的穩(wěn)定同位素標記的。
23.根據(jù)權利要求12至13、19至22中任意一項所述的方法,其中步驟(c)中的多肽是通過包括多肽化學和免疫化學的方法從體液中分離的。
24.根據(jù)權利要求12至18、20至22中任意一項所述的方法,其中步驟(c)中的多肽是通過包括用增溶劑溶解的方法從沉著物中分離的。
25.根據(jù)權利要求12至24中任意一項所述的方法,其中步驟(d)中的分離的多肽是通過包括化學碎裂和酶消化的方法制備的以用于通過質譜法進行分析。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法,其中步驟(d)中的分離的多肽是通過用蛋白酶進行酶消化制備的以用于通過質譜法進行分析,所述的蛋白酶選自包括內(nèi)多肽酶Lys-C、胰蛋白酶和內(nèi)多肽酶Glu-C的組。
27.根據(jù)權利要求12至26中任意一項所述的方法,其中步驟(f)中的制備的多肽在通過質譜法進行分析之前被脫鹽。
28.根據(jù)權利要求12至27中任意一項所述的方法,其中通過MALDI-TOF質譜法對步驟(f)中的制備的多肽進行分析。
29.根據(jù)權利要求12至28中任意一項所述的方法,其中所關注的多肽是長度變體AβX-40和/或AβX-42,其中X為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
30.根據(jù)權利要求29所述的方法,其中測定步驟(g)的來源中存在的β-淀粉樣肽AβX-40和/或AβX-42的量是通過測定C-末端片段的長度變體的量來進行的。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法,其中步驟(g)中測定的C-末端片段的長度變體是Aβ29-40和/或Aβ29-42。
32.根據(jù)權利要求30所述的方法,其中步驟(g)中測定的C-末端片段的長度變體是Aβ11-40和/或Aβ11-42。
33.根據(jù)權利要求29所述的方法,其中X為1。
34.根據(jù)權利要求12至28中任意一項所述的方法,其中所關注的多肽是β淀粉樣肽的C-末端片段Aβ(29-40)或Aβ(29-42)。
35.根據(jù)權利要求12至28中任意一項所述的方法,其中所關注的多肽是修飾的淀粉樣肽Aβ。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法,其中所述的修飾是淀粉樣肽的35位甲硫氨酸的氧化。
37.根據(jù)權利要求35所述的方法,其中所述的修飾是淀粉樣肽的11位谷氨酸的環(huán)化。
38.基本如本文以上所述的方法,尤其參照上述實施例的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)的化合物,其中R、R’、R”、R”’、R””、X和n如說明書和權利要求書中所定義,本發(fā)明還涉及所述化合物作為電離修飾劑的用途。本發(fā)明進一步涉及對來自含有標記和未標記形式的所述多肽的來源的多肽或其片段進行定量的方法,其包括(a)用電離修飾劑修飾分離的多肽,(b)通過質譜法分析制備的多肽或其片段,并且由此測定多肽或其片段的來源中存在的多肽或其片段的量。
文檔編號G01N23/00GK1891690SQ20061009432
公開日2007年1月10日 申請日期2006年6月30日 優(yōu)先權日2005年6月30日
發(fā)明者H·多貝利 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
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