專利名稱：：對隱色孔雀綠和孔雀石綠進(jìn)行免疫測定的方法和試劑盒的制作方法對隱色孔雀綠和孔雀石綠進(jìn)行免疫測定的方法和試劑盒發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及新的免疫原、抗體和偶聯(lián)物，它們用于檢測和/或測定隱色孔雀綠(leucomalachiteGreen)和孔雀石綠(MalachiteGreen)的免疫測定。本發(fā)明也涉及用于檢測或測定隱色孔雀綠和孔雀石綠的免疫測定方法和試劑盒。"檢測(detecting)"是指定性分析隱色孔雀綠和/或孔雀石綠在樣品中的存在或不存在。"測定(determining)"是指定量分析隱色孔雀綠和/或孔雀石綠在樣品中的量。發(fā)明背景孔雀石綠是養(yǎng)魚中使用的外用驅(qū)蟲劑、殺真菌劑和殺菌劑。然而，它卻是潛在的致癌劑、致突變劑和致畸變劑。自從1933年以來，已經(jīng)認(rèn)識到在可食用魚類(例如鮭魚(trout)和鰻魚(eel))中的非法和威脅公眾安全的使用。吸收后，孔雀石綠迅速地被還原為其無發(fā)色團(tuán)的代謝物隱色孔雀綠，其是在受處理的水生動(dòng)物的藥物殘留分析中檢測到的普遍的殘留物?？兹甘G和隱色孔雀綠具有下列結(jié)構(gòu)式孔雀石綠隱色孔雀綠。最近孔雀石綠和隱色孔雀綠受到殘留物分析者的高度觀注，因?yàn)樵陴B(yǎng)殖的大西洋鮭魚和鱈(hake)魚中發(fā)現(xiàn)了它們(參見，對食物和飼料的每周歐盟快速預(yù)警才艮告2003/2004(WeeklyECRapidAlertReportsforFoodandFeed2003/2004))。用于孔雀石綠和隱色孔雀綠測定的方法相當(dāng)有限?？兹甘G具有光譜可見光區(qū)域(580-620nm)的發(fā)色團(tuán)，這種發(fā)色團(tuán)在孔雀石#錄的分析中相當(dāng)有幫助。然而，隱色孔雀綠在260-270nm具有入max,使得其在相同的條件下難于分析。已經(jīng)采用了很多方法來避免該問題。一種方法使用過柱后氧化的步驟，在HPLC分離后和檢測前，將隱色孔雀綠氧化為孔雀石綠，以允許在更高的波長進(jìn)行檢測。通常，將分散于Celite(商品名)的鉛氧化物或其本身包裝放入短柱中使用。在另一變通方法中，Klein等人(E.Klein，M.Edelhaeuser和R.Lippold，Dtsch.Lebensm,Rundsch.，1991，87,350)使用二氧化鉛進(jìn)行過柱前的氧化，測定的孔雀石綠為母體和隱色孔雀綠的總和。已使用電化學(xué)氧化作為二氧化鉛的替代物。檢測孔雀石綠和隱色孔雀綠的可選擇的方法是使用LC-MS。粒子束LC-MS已經(jīng)用于在鯰魚(catfish)中確認(rèn)孔雀石綠。歐洲最4氐要求的執(zhí)4亍才及卩艮(Europeanminimumrequriedperformanelimit,MRPL),殘留物實(shí)驗(yàn)室的定性參數(shù)，設(shè)定孔雀石綠和隱色孔雀綠的總量為2jug/kg。最近，氣相色鐠質(zhì)語(GC-MS)和其它液相色鐠串連質(zhì)鐠(LC-MS/MS)方法已經(jīng)出現(xiàn)于第五屆歐洲殘留物會(huì)議(EuroResidueConference)中。GC-MS和LC-MS方法都具有良好的表現(xiàn)，能以遠(yuǎn)低于設(shè)定MRPL的濃度可靠地檢測和鑒定這些殘留物。特異性結(jié)合反應(yīng)，例如抗體-抗原相互作用，已經(jīng)在免疫測定中廣泛使用，用來檢測組織提取物中存在的多種物質(zhì)。因此，例如放射性免疫測定(RIA)可用于孔雀石綠和隱色孔雀綠的測定。放射性免疫測定非常敏感，但卻需要放射性核素示蹤物，例如1251和&。目前還沒有已知用于孔雀石綠和隱色孔雀綠的RIA。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是非放射性的方法，可選用該方法對孔雀石綠和隱色孔雀綠進(jìn)行定性和定量測定。最近，用于孔雀石綠的測試試劑盒已經(jīng)可以商業(yè)性獲得。BiooScientific生產(chǎn)孔雀石綠ELISA測試試劑盒，其設(shè)計(jì)為僅檢測孔雀石綠。這表明Bioo試劑盒包含抗基于孔雀石綠的免疫原的抗體，不像本發(fā)明使用基于隱色孔雀綠的免疫原。這得到BiooScientific提供的信息的進(jìn)一步支持，該信息給出對隱色孔雀綠的交叉反應(yīng)性為1%。由于孔雀石綠快速和廣泛地代謝為隱色孔雀綠，BiooScientific免疫測定要求在抗原-抗體結(jié)合之前引入樣品預(yù)處理步驟，使隱色孔雀綠轉(zhuǎn)化為孔雀石綠。這使所述免疫測定因使用額外的步驟而比本發(fā)明更費(fèi)時(shí)以及更易產(chǎn)生試驗(yàn)誤差。在第一方面，本發(fā)明提供包含隱色孔雀綠的免疫原，其中隱色孔雀綠通過交聯(lián)劑與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)、且該交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位伸出。本發(fā)明也提供對抗這樣的免疫原的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含隱色孔雀綠的偶聯(lián)物，其中隱色孔雀綠通過交聯(lián)劑與可檢測的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合、且該交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位伸出。本發(fā)明的免疫原和偶聯(lián)物均可得自于下式I的半抗原，其中交聯(lián)劑(該交聯(lián)劑包含-X-Y-Z)從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位伸出其中X是第一個(gè)二價(jià)連接，Y是第二個(gè)二價(jià)連接，Z是可與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)(產(chǎn)生免疫原)或可與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)(產(chǎn)生偶聯(lián)物)的反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選，交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位伸出。優(yōu)選，X是選自O(shè)、S和N的雜原子，最優(yōu)選在免疫原的情況中X是O原子，最優(yōu)選在偶聯(lián)物的情況中X是N原子。優(yōu)選，Y是d.u),更優(yōu)選C2.6，最優(yōu)選C3，取代或未取代的直鏈，飽和亞烷基部分(alkylenemoiety),或亞芳基部分(arylenemoiety)。一個(gè)合適的取代基是羰基(CO)。有利的是，z(與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)(產(chǎn)生免疫原)或與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)(產(chǎn)生偶聯(lián)物)之前)選自羧酸、二疏代吡啶基(dithiopyridyl)、順丁烯二酰亞胺、氨基、羥基、巰基(thiol)、硫酯或醛部分。與賦予抗原性的載發(fā)明概述"式I體材料偶聯(lián)之前，Z是羧酸(COOH)時(shí)，羥基的氧原子首先與DCC結(jié)合，然后與NHS結(jié)合，形成帶有強(qiáng)效離去基團(tuán)的酯。通過賦予抗原性的栽體材料上的游離氨基，對上述酯的羰基(C-O)進(jìn)行親核攻擊，導(dǎo)致酰胺鍵和形成所期望的免疫原。當(dāng)Z在與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)前是巰基(在石危酯的情形下，該琉基通過在堿性條件下水解而形成)時(shí)，有該巰基和BrCH2C(0)NH-HRP參與的親核取代反應(yīng)導(dǎo)致溴被巰基取代，并形成所期望的偶聯(lián)物。本領(lǐng)域讀者可參考BioconjugateTechniquesG.Hermanson,ed.,AcademicPress,1996，785pp.(其內(nèi)容以其全部在此引入)中關(guān)于Z反應(yīng)基團(tuán)和賦予抗原性的載體材料或可檢測的標(biāo)記物之間相互作用的詳細(xì)描述，其中Z是選自羧酸、二硫代吡啶基、順丁烯二酰亞胺、氨基、羥基、巰基、硫酯或醛部分所組成的組中的剩余者(remainder)。最有利的是，Z(與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)(產(chǎn)生免疫原)之前)是羧酸(COOH)部分。最有利的是，Z(與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)(產(chǎn)生偶聯(lián)物)之前)是巰基或硫酯部分。最有利的是，半抗原是對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A)。半抗原A的結(jié)構(gòu)式顯示于圖1。優(yōu)選，免疫原是與賦予抗原性的材料偶聯(lián)的對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠，其中所述材料可以是選自牛血清白蛋白(BSA)和牛曱狀腺球蛋白(BTG)?？兹甘G的半抗原衍生物(以及相應(yīng)的免疫原、抗體和偶聯(lián)物)可通過用交聯(lián)劑在孔雀石綠未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位(優(yōu)選對位)以相似的方式衍生而制得?？兹甘G的半抗原衍生物之一是對-(3-羧基丙氧基)孔雀石綠(半抗原B)，結(jié)構(gòu)式也顯示于圖1。將半抗原(如上所述)與修飾或未修飾的賦予抗原性的栽體材料偶聯(lián)，可制備免疫原。優(yōu)選，所述栽體材料是蛋白質(zhì)、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。所獲得的免疫原然后施用于哺乳動(dòng)物宿主以激發(fā)產(chǎn)生特異性抗體，可以是多克隆抗體，其然后用于研發(fā)對隱色孔雀綠和孔雀石綠的免疫測定方法，使用與標(biāo)記物偶聯(lián)的半抗原作為檢測試劑。在其它方面，本發(fā)明涉及抗本發(fā)明免疫原的抗體，所述抗體能夠與隱色孔雀綠和孔雀石綠的至少一種結(jié)構(gòu)性表位結(jié)合。在其它方面，本發(fā)明涉及對隱色孔雀綠具有特異性的抗體，其特征在于對孔雀石綠具有交叉反應(yīng)性?？蛇x，所述抗體(以及包括這些抗體的方法和試劑盒)對孔雀石綠具有超過10%的交叉反應(yīng)性。進(jìn)一步可選，所述抗體具有超過'25口％的交叉反應(yīng)性:在每個(gè)這樣的情形中'，所提到的可選對隱孔雀綠的最小交叉反應(yīng)性是以對隱色孔雀石綠的交叉反應(yīng)性為100%而言的。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備這些抗體的方法，該方法包括通過重復(fù)施用本發(fā)明免疫原免疫動(dòng)物(優(yōu)選脊推動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物)的步驟以及從所述被免疫的動(dòng)物收集所產(chǎn)生的血清的步驟。優(yōu)選，本方法進(jìn)一步包含將所述的血清抗體固定于背板底物(backingsubstrate),優(yōu)選固體支撐物，最優(yōu)選聚苯乙烯(polystyrene)固體支撐物。優(yōu)選，所述抗體是多克隆抗體。作為備選，所述抗體是單克隆抗體。在另一方面，本發(fā)明包含偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含與可檢測的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的此處所公開的半抗原。優(yōu)選，標(biāo)記物選自酶、發(fā)光物、放射活性物或它們的混合物。更優(yōu)選，標(biāo)記物是酶，優(yōu)選過氧化物酶，最優(yōu)選，辣根過氧化物酶(HRP)。作為備選，或另外的，發(fā)光物可以是生物發(fā)光物、化學(xué)發(fā)光物或焚光物。優(yōu)選，偶聯(lián)物是與可檢測的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的對-(3-乙酰疏代丙酰氨基)隱色孑L雀纟錄(p-(3-acetylthiopropanamido)leucomalachite)。一種這樣的合適的標(biāo)記物是辣根過氧化物酶。在另一方面，本發(fā)明包括檢測或測定樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠的方法，該方法包括將樣品與至少一種本發(fā)明的偶聯(lián)物接觸，并與至少一種本發(fā)明抗體接觸；檢測或測定結(jié)合的偶聯(lián)物；從標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠的存在或其量。這是半定量的方法，而下面的方法是定量的方法。該半定量的方法可選檢測或測定樣品中分析物，該分析物選自隱色孔雀綠、孔雀石綠或隱色孔雀綠和孔雀石綠的混合物。作為備選，該方法包括將一份樣品與至少一種本發(fā)明的偶聯(lián)物以及至少一種本發(fā)明的抗體接觸，并且將其它樣品與至少一種本發(fā)明的抗體接觸；測定第一份樣品中結(jié)合的偶聯(lián)物(從而測定隱色孔雀綠和孔雀石綠的總量)，并測定第二份樣品中結(jié)合的孔雀石綠(從而測定孔雀石綠的量)；從標(biāo)準(zhǔn)曲線中推導(dǎo)樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠各自的量。可以理解的是，在第一份樣品中測定的步驟是竟?fàn)幮悦庖邷y定，該測定被安排為測定隱色孔雀綠和孔雀石綠的總量。也可以理解的是，在第二份樣品分中測定的步驟是免疫測定，該測定被安排為測定結(jié)合型孔雀石綠的量。后者的測定步驟可使用合適的分光鏡方法(spectroscopicmethod)進(jìn)行。本發(fā)明備選方法中的推導(dǎo)步驟如下進(jìn)4亍推導(dǎo)第二份樣品中結(jié)合型孔雀石鄉(xiāng)錄的量，以及4焦導(dǎo)第一傷"洋品中隱色孔雀綠和孔雀石綠的量，隨后從第二份樣品的結(jié)合型孔雀石綠的量減去第一份樣品的隱色孔雀綠和孔雀石綠的量，得到樣品中隱色孔雀綠的量。在另一方面，本發(fā)明包括檢測或測定隱色孔雀綠和孔雀石綠的試劑盒，該試劑盒包括至少一種本發(fā)明的偶聯(lián)物，以及至少一種本發(fā)明的抗體。試劑盒可選包括使用所述偶聯(lián)物和所述抗體檢測隱色孔雀綠和孔雀石綠的使用說明書。這是半定量試劑盒，其能可選的檢測或測定樣品中選自隱色孔雀綠、孔雀石綠以及隱色孔雀綠與孔雀石綠的混合物的分析物。作為備選，該試劑盒用于測定隱色孔雀綠和孔雀石綠中的每一個(gè)，該試劑盒包括至少一種本發(fā)明的偶聯(lián)物，以及至少一種本發(fā)明的抗體。這樣的試劑盒可選的包括使用所述偶聯(lián)物和所述抗體測定樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠各自的量的說明書。優(yōu)選，樣品是溶液，例如生物液體。更優(yōu)選樣品是血清或尿。在本發(fā)明任意單獨(dú)的方法和試劑盒中，用于制備偶聯(lián)物的基本半抗原和用于制備免疫原(其刺激抗體生成)的基本半抗原，可以是相同或不同的。優(yōu)選它們是不同的，這樣增加測定的敏感性。不期望被如此限制，可以認(rèn)為樣品中的靶分析物更有能力與一種偶聯(lián)物竟?fàn)幙贵w結(jié)合位點(diǎn)，該偶聯(lián)物是與刺激生成抗體的免疫原在結(jié)構(gòu)上有稍許不同。如此獲得的更好的敏感性結(jié)果例證于下面的實(shí)施例12。在本發(fā)明任意單獨(dú)的方法和試劑盒中，所述方法或試劑盒每個(gè)對隱色孔雀綠顯示敏感性或IC5o(ng/ml)低于35ng/ml,可選低于30ng/ml。如果用于制備偶聯(lián)物的基本半抗原和用于制備免疫原(其刺激抗體生成)的基本半抗原是不同的，所述方法或試劑盒每個(gè)對隱色孔雀綠顯示敏感性或IC5。(ng/ml)低于10ng/ml,可選低于7.5ng/ml，進(jìn)一步可選低于5.0ng/ml。在本發(fā)明任意單獨(dú)的方法和試劑盒中，所述方法或試劑盒每個(gè)對孔雀石綠顯示敏感性或ICs()(ng/ml)低于150ng/ml，可選低于125ng/ml，進(jìn)一步可選低于105ng/ml。如果用于制備偶聯(lián)物的基本半抗原和用于制備免疫原(其刺激抗體生成)的基本半抗原是不同的，所述方法或試劑盒每個(gè)對孔雀石綠顯示敏感性或IC5o(ng/ml)低于35ng/ml,可選低于25ng/ml,進(jìn)一步可選低于15ng/ml。在另一方面，本發(fā)明涉及至少一種根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物，以及至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗體，在檢測或測定樣品(例如生物體液)中隱色孔雀綠和孔雀石綠的用途。發(fā)明附圖現(xiàn)通過實(shí)施例和參考相應(yīng)附圖來描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1顯示對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A)、對-(3-羧基丙氧基)孔雀石綠(半抗原B)、對-(3-乙酰碌^代丙酰氨基)隱色孔雀綠(半抗原C)的結(jié)構(gòu)式。圖2顯示圖1的對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A)的制備步驟。圖3顯示圖1的對-(3-羧基丙氧基)孔雀石綠(半抗原B)的制備步驟。圖4顯示圖1的對-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠(半抗原C)的制備步驟。圖5顯示圖1的對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A)的NMR結(jié)果。圖6顯示對BSA的MALDI結(jié)果。圖7顯示對免疫原I(結(jié)合BSA的圖1所示對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A))的MALDI結(jié)果。圖8顯示用于開發(fā)隱色孔雀綠和孔雀石綠的竟?fàn)幮訣LISA的竟?fàn)幮訣LISA微滴定板測定。
發(fā)明內(nèi)容制備半抗原按圖2的三個(gè)步驟制備對-(3-羧基丙氧基)隱色孔雀綠(半抗原A)。首先，4-羥基苯曱醛，1,與4-溴丁酸乙酯在有碳酸鉀存在的條件下在乙腈中回流得到對[3-(乙基羧基)丙氧基]苯甲醛，2。所獲得的酯，2，與N，N-二曱苯胺在有硫酸存在的條件下于12(TC反應(yīng)48小時(shí)得到中等收率的對[3-(乙基羧基)丙氧基]隱色孔雀綠，3。將隱色孔雀綠酯，3，與氫氧化鈉在四氫呋喃(THF)和曱醇中皂化后得到半抗原A。通過用鉛氧化物(Pb02)或2,3-二氯-5,6-二氰基-l,4-苯醌(DDQ)氧化半抗原A得到對(3-羧基丙氧基)孔雀石綠，半抗原B(圖3)。在三步中制備半抗原C，對-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠(圖4)。首先，在酸性條件下4-硝基苯甲醛，4，與N，N-二曱笨胺加熱得到對硝基隱色孔雀綠，5。其在曱酸銨存在下在MeOH/THF中用Pd/C還原得到對氨基隱色孔雀綠，6。最后，在N，N-二異丙基乙胺存在下在1,4-二'惡烷(dioxane)中，使對氨基隱色孔雀綠與N-琥珀酰亞氨基3-(乙酰硫代)丙酸酯反應(yīng)，并在室溫?cái)嚢柽^夜得到半抗原C。制備免疫原和偶聯(lián)物盡管此處公開的半抗原提供指定的結(jié)構(gòu)性表位，它們本身沒有免疫原性，因此需要與載體材料結(jié)合，當(dāng)施用給宿主動(dòng)物時(shí)，其將引起免疫反應(yīng)。合適的載體材料通常包含聚(氨基酸)片段，包括多肽、蛋白質(zhì)和糖蛋白。有用的載體材料的實(shí)例有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(eggovalbumin),牛Y球蛋白、牛曱狀腺球蛋白(BTG)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)等。作為備選，可使用具有足夠數(shù)量的、可以利用的氨基基團(tuán)(例如賴氨酸)的合成性聚(氨基酸)，也可以利用攜有反應(yīng)性官能團(tuán)的其它合成或天然的聚合物。特別是，碳水化合物、酵母或多糖可與所述半抗原結(jié)合產(chǎn)生免疫原。此處公開的半抗原也可與可檢測的標(biāo)記物結(jié)合，用于制備在免疫測定中使用的偶聯(lián)物(或檢測試劑)，所述標(biāo)記物例如酶(如辣根過氧化物酶)、具有焚光性質(zhì)的底物或放射性標(biāo)記。熒光底物可以是例如，熒光素的單價(jià)殘留物或其衍生物。免疫原形成(實(shí)施例7和8)涉及常規(guī)的偶聯(lián)化學(xué)，其中半抗原A羥基的氧首先與DCC結(jié)合，然后與NHS結(jié)合，形成帶有強(qiáng)效離去基團(tuán)的酯。通過蛋白質(zhì)(BSA或BTG)上的游離氨基，對上述酯的羰基進(jìn)行親核攻擊，導(dǎo)致酰胺鍵和形成靶免疫原。半抗原A-HRP偶聯(lián)物的形成遵循相似的機(jī)理，并使用EDC和硫代NHS(實(shí)施例9)。水解半抗原C來形成硫代衍生物，隨后由水解的半抗原C對修飾型HRP進(jìn)行親核取代，導(dǎo)致形成偶聯(lián)物(實(shí)施例10)。為了確認(rèn)半抗原已與栽體材料充分偶聯(lián)，在免疫之前，使用基質(zhì)支持UV激光解吸附/離子化飛行時(shí)間質(zhì)"i普(matrix-assistedUVlaserdesorption/ionisationtime-of-flightmassspectroscopy,MALDI-TOFMS)評估每一種免疫原。為了產(chǎn)生用于檢測隱色孔雀綠和孔雀石綠的抗體，本發(fā)明的免疫原適合用于免疫接種。對免疫原進(jìn)行MALDI-TOF分析的一般過程使用VoyagerSTR生物光傳研究站(BiospectrometryResearchStation)激光解吸附質(zhì)譜以及延時(shí)萃取進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜。每個(gè)待分析樣品的等份試樣在0.1。/。的三氟乙酸(TFA)水溶液中稀釋得到lmg/ml的樣品溶液。使用芥子(Sinapinic)酸的基質(zhì)分析等份試樣(lm1),牛血清白蛋白用作外標(biāo)(externalcalibrant)。圖6顯示了對BSA栽體材料的分析。如圖所示，存在主要的信號，其表示此樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量為m/z66,400。在m/z33,203的信號與雙電極形式(doubly-chargedform)的主要成分一致。觀察到其他信號，包括m/z13,495。制備抗血清為了得到多克隆抗血清，本發(fā)明的免疫原與弗氏佐劑(Freund，sAdjuvant)混合，并將混合物注射于宿主動(dòng)物，例如兔、羊、小鼠、豚鼠或馬。進(jìn)行進(jìn)一步的注射(力a強(qiáng)注射)，并對血清取樣以評估抗體滴度。當(dāng)獲得最佳滴度時(shí)，將宿主動(dòng)物放血得到合適容積的特異性抗血清?？贵w純化所需的純度取決于預(yù)期的應(yīng)用。對于很多目的而言，沒有對純度的要求，然而，在其他情況下，例如當(dāng)抗體固定于固體支撐物時(shí)，可進(jìn)行純化步驟去除不期望的物質(zhì)和消除非特異性結(jié)合。本發(fā)明制備的特異性抗體用作檢測或測定生物液體中隱色孔雀綠和孔雀石綠的免疫測定中的試劑。本發(fā)明的抗體能夠與代謝的隱色孔雀綠以及與母體孔雀石綠結(jié)合。實(shí)施例實(shí)施例1:制備對[3-(乙基羧基)丙氣基l苯甲醛(2)向4-羥基苯曱醛，1，(20g,164mMol)和碳酸鉀(68g,492mMol)的乙腈(300ml)的混懸液中加入4-溴丁酸乙酯(35.2ml，246mMol)。然后將混合物加熱回流過夜。冷卻至室溫后，過濾掉固體，真空除去溶劑。然后向殘留物中加入水(200ml)，并用乙酸乙酯萃取(3x200ml)。合并有機(jī)相用鹽水(brine)洗(lx200ml)，硫酸鈉干燥，過濾、蒸發(fā)至干燥。所得殘留物使用30%乙酸乙酯的己烷溶液作為洗液(eluent)在硅膠(silicagel)上經(jīng)過急驟層析(flashchromatography),純化得到無色油狀2(27g,69.8%)。IR光譜(film):1733.7，1692.5，1601.2,1577.9,1509.8,1257.7,1161.1cm"。實(shí)施例2:制備對p-(乙基^4l)丙氣基]隱色孔雀緣(3)向?qū)3-(乙基羧基)丙氧基]苯曱醛2(10g，42.4mMol)和N,N-二甲基苯胺(12.38g，106mMol)的混合物中加入濃疏酸(2ml)，并且混合物在120。C加熱48小時(shí)。然后冷卻溶液至室溫，加入水(200ml),用固體碳酸鈉中和混合物，再用乙酸乙酯萃取(3x100ml),用鹽水洗(lx100ml),^L酸鈉干燥，過濾并真空濃縮至千燥。所得粗品使用25%乙酸乙酯的己烷溶液作為洗液在硅膠上經(jīng)過急驟層析，純化得到橘色油狀酯3(6.9g，35%)。IR光譜(film):1735.3，1612.2，1518.3，1242.6cm-1。實(shí)施例3:制備對-(3-羧基丙氣基)隱色孔雀綠(半抗原A)向酯，3，(8.4g，18.75mMol)溶于曱醇和THF(2:1,240ml)混合物所得的溶液中加入氫氧化鈉(2N，40ml)。將混合物在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。真空去除溶劑并加入水(100ml)。該溶液通過加入HCl(2N)中和至pH7，所獲得的沉淀通過過濾收集，在干燥器中經(jīng)五氧化二磷干燥。得到藍(lán)/綠色固體的半抗原A(3.2g,40%)。NMR/3C，溶劑5-MeOH(圖5):178.8,156,9，148.9，137.7，133.6,130.6，129.9，114.1,112.9,66.6，54.2，40.9,30.9，24.6。實(shí)施例4:制備對硝基隱色孔雀綠向?qū)ο趸綍跞?，(12.81g,84.77mMol)和N，N-二曱基苯胺(24.76g,204.3mMol)中加入硫酸(5ml)。加熱48小時(shí)后，加入水(200ml),該溶液通過加入飽和碳酸鈉溶液中和。所得溶液用二氯曱烷(3x200ml)和乙酸乙酯(3x200ml)萃取，經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干燥。粗品通過柱層析純化(使用硅膠；20%乙酸乙酯的乙烷溶液)得到黃色固體對硝基隱色孔雀綠，5,(3.5g，ll%)。NMR13C，溶劑CDC13:153.5，149.5,146.2，131.0,129.4，123.4,113,9，54.9,40.9。實(shí)施例5:制備對氨基隱色孔雀綠向甲醇和四氬呋喃(l:l,160ml)混合物中的對硝基隱色孔雀綠(2.1g，5.6mMol)中加入曱酸銨(1.91g，30.29mMol)和Pd/C(300mg,2.83mMo1)，并且將混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。真空去除溶劑，加入水(200ml)，用乙酸乙酯(3x200ml)萃取所得溶液，硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干燥。粗品通過柱層析純化(使用硅膠；10%己烷的乙酸乙酯溶液)得到蠟狀紫/紅色固體對氨基隱色孔雀綠，6,(2.43g，75%)。實(shí)施例6:制備對-(3-乙酰疏代丙酰氨基)隱色孔雀綠(半抗原C)對氨基隱色孔雀綠(470mg,1.36mMol)、N，N-二異丙基乙胺(350M1,2.04mMol)和N-琥珀酰3-(乙酰硫代)丙酸酯(367mg，1.5mMol)在1，4-二嗜烷(25ml)中室溫?cái)嚢柽^夜。真空去除溶劑。粗品通過柱層析純化(硅膠；乙酸乙酯己烷，1:5)得到紫色油狀對-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠，半抗原C，(560mg，87%)。IR光i普(film):1741,1692，1611,1518，1353,1204cm-1實(shí)施例7:半抗原A與BSA偶聯(lián)(制備免疫原I)向半抗原A(60mg，0.14mMol)的DMF(2ml)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(17.7mg,0.154mMol)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(31.8mg,0.154mMo1),將混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。通過過濾去除所形成的二環(huán)己脲，將濾出液滴加至BSA(200mg)的0.1M碳酸氫鈉溶液(pH8.5，9ml)中?；旌衔镌谑覝?cái)嚢柽^夜。該溶液在4。C用50mM磷酸緩沖液pH7.2透析24小時(shí)(換3次透析液)，然后凍干。MALDI結(jié)果顯示47.9摩爾半抗原A已經(jīng)與1摩爾BSA偶聯(lián)(圖7)。實(shí)施例8:半抗原A與BTG偶聯(lián)(制備免疫原II)用半抗原A(80mg)、N-羥基琥珀酰亞胺(24mg)、DCC(36mg)和BTG(150mg),按實(shí)施例7的方法，使半抗原A與BTG偶聯(lián)。實(shí)施例9:半抗原A與HRP(辣根過氣化物酶)偶聯(lián)將EDC.HC1(10mg)溶于水(0.5ml),并立即加至半抗原A(2mg)的DMF溶液(0.2ml)中?；旌虾?，將該溶液滴加至HRP(20mg)的水溶液(lml)中。力口入硫代NHS(sulfo-NHS，5mg)，將反應(yīng)混合物于室溫避光保溫過夜。在已用pH7.2PBS(石癢S吏鹽S爰沖液)預(yù)平衡的PD-104主(Pharmacia)上連續(xù)脫鹽，去除過量半抗原。然后將半抗原-HRP偶聯(lián)物用10LPBS/pH7.2在4。C透析過夜。實(shí)施例10:對-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠與HRP(辣根過氧化物酵)偶聯(lián)將1M的氫氧化鉀溶液(100ml)加至對-(3-乙酰硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠(2mg)的DMF溶液(0.2ml)中。保溫10分鐘后，加入0.1M的磷酸緩沖液，隨后加入1MHC1。混合后，將該溶液滴加于修飾型HRP(20mg)的溶液中。在已用pH7.2PBS(磷酸鹽緩沖液)預(yù)平衡的PD-10柱(Pharmacia)上連續(xù)脫鹽，去除過量半抗原。然后將半抗原-HRP偶聯(lián)物用10LPBS/pH7.2在4°C透析過夜。實(shí)施例11:制備抗實(shí)施例8所得免疫原II的抗體將免疫原II的水溶液與弗氏完全佐劑(FCA)配制成2mg/ml免疫原的在50%(v/v)FCA中的乳液。三只羊用該乳液免疫(lG免疫)，在每只羊臀部取四個(gè)位點(diǎn)，每一位點(diǎn)肌肉內(nèi)注射0.251111該乳液。隨后的免疫(加強(qiáng)免疫)包含lmg/ml免疫原。所有加強(qiáng)免疫物在50。/。(v/v)弗氏完全佐劑(FCA)中乳化，并且以與1°免疫相同的方式以月為間隔持續(xù)l年施用。在每次加強(qiáng)免疫后7-14天取血樣。處理每個(gè)樣本以產(chǎn)生抗血清，通過辛酸和硫酸銨沉淀進(jìn)一步純化得到免疫球蛋白(Ig)級分(fraction)。Ig級分通過竟?fàn)幮訣LISA微滴板測試來評估，如下面實(shí)施例12所描述。實(shí)施例12:ELISA測定隱色孔雀綠和孔雀石綠抗免疫原II(半抗原A-BTG)(實(shí)施例8)的抗血清的Ig級分用10mMTrispH8.5稀釋，用它對增強(qiáng)結(jié)合型96孔聚苯乙烯微滴板的孔進(jìn)行包被(125Ml/孔)。適當(dāng)?shù)目贵w包被稀釋度用標(biāo)準(zhǔn)ELISA棋盤技術(shù)(checkerboardtechnique)測定。該板在37。C保溫2小時(shí)，用含有吐溫20的Tris緩沖鹽水(Trisbufferedsaline)(TBST)洗4次，拍干。在TBST中制備O、5、10、50、100、250、500和1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)隱色孔雀綠和孔雀石綠溶液，每種濃度各取50ja1添加至相應(yīng)孔中(圖8)。75jul偶聯(lián)物I(半抗原A-HRP)(實(shí)施例9),用包含EDTA、D-甘露醇、蔗糖、碌u柳來和BSA的Tris纟爰沖液(pH7.2)稀釋后，力口至每個(gè)孑U如圖8所顯示。適當(dāng)?shù)呐悸?lián)物稀釋度也用標(biāo)準(zhǔn)ELISA棋盤技術(shù)測定。該板在37匸保溫2小時(shí)。過量的未結(jié)合的偶聯(lián)物通過在IO分鐘內(nèi)用TBST洗6次而除去。將125Ml的四曱基聯(lián)苯氨(TMB)底物溶液加于板上每孔，然后將板室溫避光保溫15-20分鐘。通過向每孔加入125Ml0.2M112804終止反應(yīng)。然后使用微滴板讀數(shù)器在450nm處測量吸收值。測試中所得數(shù)據(jù)列于表1。表1:用抗免疫原II(半抗原A-BTG)(實(shí)施例8)的抗血清和偶聯(lián)物I(實(shí)施例9)進(jìn)行隱色孔雀綠和孔雀石綠的竟?fàn)幮晕⒌伟鍦y定得到的數(shù)據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>山50=在450nm的吸收值B=在xng/ml標(biāo)準(zhǔn)濃度、在450nm的吸收值B0=在Ong/ml標(biāo)準(zhǔn)濃度、在450nm的吸收值IC5o-產(chǎn)生50%B/BG的標(biāo)準(zhǔn)濃度%CR=基于隱色孔雀綠特異性的交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)-這是本說明書中術(shù)語"交叉反應(yīng)性"的含意。75)al偶聯(lián)物C(半抗原C-HRP)(實(shí)施例10)，用包含EDTA、D-甘露醇、蔗糖、碌u柳汞和BSA的Tris緩沖液(pH7.2)稀釋后，力口于每個(gè)孑L,如圖8所顯示。適當(dāng)?shù)呐悸?lián)物稀釋度也用標(biāo)準(zhǔn)ELISA棋盤技術(shù)測定。該板在25'C保溫1小時(shí)。過量的未結(jié)合的偶聯(lián)物通過在10-15分鐘內(nèi)用TBST洗6次而除去。將125|il的四曱基聯(lián)苯氨(TMB)底物溶液加于板上每孔，然后將板室溫避光保溫20分鐘。通過向每孔加入100n10.2MH2S04終止反應(yīng)。然后使用微滴板讀數(shù)器在450nm處測量吸收值。測試中所得數(shù)據(jù)列于表2。表2:用抗免疫原II(半抗原A-BTG)(實(shí)施例8)的抗血清和偶聯(lián)物II(實(shí)施例IO)進(jìn)行隱色孔雀綠和孔雀石綠的竟?fàn)幮晕⒌伟鍦y定得到的數(shù)據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>IC5o=產(chǎn)生50%B/BQ的標(biāo)準(zhǔn)濃度%CR=基于隱色孔雀綠特異性的交叉反應(yīng)百分?jǐn)?shù)隱色孔雀綠的敏感度或IC幼(ng/ml)在表2顯示為3.74,表1顯示為27.33?？兹甘浀?文感度或IC50(ng/ml)在表2顯示為13.962，表1顯示為103.39?？梢哉J(rèn)為，這些敏感度差異是由于使用偶聯(lián)物而該偶聯(lián)物帶有與免疫原的交聯(lián)基結(jié)構(gòu)不同的交聯(lián)基造成的。不期望受限于理論，可以認(rèn)為測試中的受分析物更能與所述偶聯(lián)物竟?fàn)幙贵w結(jié)合位點(diǎn)，因此增加測試敏感度但保留其特異性。本發(fā)明將不限于此處描述的實(shí)施方案，其可在不偏離本發(fā)明范圍下進(jìn)行修改或修飾。權(quán)利要求1、免疫原，其包含隱色孔雀綠且該隱色孔雀綠利用交聯(lián)劑與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)，其中所述交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位伸出。2、權(quán)利要求l的免疫原，其中所述交聯(lián)劑包含-X-Y-Z:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中X是第一個(gè)雙價(jià)連接，Y是第二個(gè)雙價(jià)連接，Z是能夠與賦予抗原性的材料偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。3、權(quán)利要求1或2所述的免疫原，其中所述交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位伸出。4、權(quán)利要求2或3所述的免疫原，其中X是選自O(shè)、S和N的雜原子，其中X最優(yōu)選O原子。5、權(quán)利要求2-4之一的免疫原，其中Y是Cw。，更優(yōu)選C2.6，最優(yōu)選C3,取代或未取代的直鏈，飽和亞烷基部分，或亞芳基部分。6、權(quán)利要求2-5之一的免疫原，其中Z(與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)之前)選自羧基、二硫代吡啶基、順丁烯二酰亞胺、氨基、羥基、巰基、硫酯或醛部分，其中Z(與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)之前)可選是羧基(COOH)部分。7、免疫原，包含與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)的對-(3-羧基丙氣基)隱色孔雀纟錄。8、權(quán)利要求l-7之一的免疫原，其中所述載體材料選自蛋白質(zhì)、蛋白片段、合成多肽或半合成多肽。9、抗權(quán)利要求l-8之一的免疫原的抗體，其中所述抗體能與隱色孔雀綠和孔雀石綠的至少一種結(jié)構(gòu)性表位結(jié)合。10、抗權(quán)利要求l-8之一的免疫原的抗體，所述抗體具有對隱色孔雀綠的特異性，其特征在于對孔雀石綠具有交叉反應(yīng)性，其中所述抗體可選對孔雀石綠有大于10%的交叉反應(yīng)性。11、偶聯(lián)物，包含通過交聯(lián)劑與可檢測的標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的隱色孔雀綠，其中所述交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位、鄰位或間位伸出。12、權(quán)利要求ll的偶聯(lián)物，其中所述交聯(lián)劑包含-X-Y-Z:其中X是第一個(gè)雙價(jià)連接，Y是第二個(gè)雙價(jià)連接，Z是能夠與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。13、權(quán)利要求11或12所述的偶聯(lián)物，其中所述交聯(lián)劑從隱色孔雀綠的未取代苯環(huán)的對位伸出。14、權(quán)利要求12或13所述的偶聯(lián)物，其中X是選自O(shè)、S和N的雜原子，其中X最優(yōu)選N原子。15、權(quán)利要求12-14之一的偶聯(lián)物，其中Y是C，更優(yōu)選(:2.6，最優(yōu)選Q，取代或未取代的直鏈，飽和亞烷基部分，或亞芳基部分。16、權(quán)利要求12-15之一的偶聯(lián)物，其中Z(與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)之前)選自羧基、二疏代吡啶基、順丁烯二酰亞胺、氨基、羥基、巰基、硫酯或醛部分。17、權(quán)利要求12-16之一的偶聯(lián)物，其中Z(與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)之前)是巰基或硫酯。18、偶聯(lián)物，包含與可檢測的標(biāo)記物偶聯(lián)的對-(3-硫代丙酰氨基)隱色孔雀綠。19、權(quán)利要求11-18之一的偶聯(lián)物，其中可檢測的標(biāo)記物選自酶、發(fā)光物質(zhì)和放射活性物質(zhì)。20、檢測或測定樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠的方法，該方法包括將該樣品與至少一種權(quán)利要求11-19之一所述偶聯(lián)物和至少一種權(quán)利要求9或10所述抗體接觸；檢測結(jié)合的偶聯(lián)物；從標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出樣品中隱色孔雀纟錄和孔雀石纟錄的存在或其量。21、測定樣品中包含隱色孔雀綠和孔雀石綠的每種分析物的量的方法，該方法包括將該樣品與至少一種權(quán)利要求11-19之一所述偶聯(lián)物和至少一種權(quán)利要求9或IO所述抗體接觸并測定結(jié)合的偶聯(lián)物；將該樣品與至少一種權(quán)利要求9或IO所述抗體接觸并測定結(jié)合的孔雀石綠；從標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出樣品中隱色孔雀綠和孔雀石綠各自的量。22、用于檢測或測定隱色孔雀綠和孔雀石綠的試劑盒，該試劑盒包括至少一種權(quán)利要求11-19之一所述偶聯(lián)物和至少一種權(quán)利要求9或10所述抗體。23、至少一種權(quán)利要求11-19之一所述偶聯(lián)物和至少一種權(quán)利要求9或10所述抗體用于檢測或測定樣品如生物液體中隱色孔雀綠和孔雀石綠的用途。全文摘要本發(fā)明提供半抗原、包含與賦予抗原性的載體材料偶聯(lián)的所述半抗原的免疫原、包含與標(biāo)記物結(jié)合的所述半抗原的偶聯(lián)物、以及對抗這樣的免疫原并能與隱色孔雀綠和孔雀石綠結(jié)合的抗體。文檔編號G01N33/53GK101149375SQ200610064048公開日2008年3月26日申請日期2006年9月22日優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日發(fā)明者埃爾奧亞特·本奇克,安德魯·P·勞里,斯蒂芬·P·菲茨杰拉德,羅伯特·I·麥康奈爾申請人:蘭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