專利名稱：β－胞襯蛋白抗原表位多肽及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及抗原表位多肽的篩選、免疫學(xué)方法的建立以及臨床診斷試劑的應(yīng)用，尤其是涉及β-胞襯蛋白抗原表位多肽的篩選，得到具有診斷意義的最佳β-胞襯蛋白表位多肽對應(yīng)的氨基酸序列，以及建立檢測患者血清中β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的免疫學(xué)方法，以及將其作為抗原在制備診斷干燥綜合征的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干燥綜合征(Sjgren Syndrome，SS)是一種以口、眼干燥為主，并累及全身多個系統(tǒng)和器官的全身性自身免疫病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性干燥綜合征。本病主要表現(xiàn)為唾液腺、淚腺及消化道等外分泌腺的炎性細(xì)胞浸潤及破壞，導(dǎo)致進(jìn)行性口干、眼干及內(nèi)臟受累。由于唾液、淚腺分泌減少或停止，出現(xiàn)口、眼干燥難忍、口唇破裂、齲齒猖獗或反復(fù)角膜炎、結(jié)膜炎、腮腺腫大及血管炎等(Fox RI，Stern M，Michelson P，Update insjgren’s syndrome.Curr Opin Rheumatol，2002，Sep12(5)319-8.)。
流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國干燥綜合征的患病率為0.77％，而在50歲以上人群中的患病率達(dá)5％，甚至明顯高于糖尿病(0.67％)、風(fēng)濕性心臟病(0.19％)及肺源性心臟病(0.47％)的患病率?？偦疾∪藬?shù)逾800萬，然而，在臨床上，絕大部份(97％)的干燥綜合征患者未得到及時的診斷和治療，52％的患者被誤診為肺間質(zhì)纖維化、免疫性肝炎及腎炎等，而未能得到正規(guī)的治療或誤治，甚至出現(xiàn)因誤治出現(xiàn)的器官損害。本病為慢性全身性自身免疫病，未經(jīng)正確治療的患者多逐漸出現(xiàn)器官功能異常、衰竭，甚至死亡。淋巴瘤、骨髓瘤等惡性腫瘤在干燥綜合征的發(fā)生率可高達(dá)正常人的40倍(Fox RI，Stern M，Michelson P，Update in Sjgren’s syndrome.Curr Opin Rheumatol，2002，Sep12(5)319-8.)。
目前，本病的早期診斷是困擾臨床醫(yī)師多年的最大問題。臨床診斷上主要靠癥狀、體征、唇腺活檢及非特異的抗核抗體等指標(biāo)。其中唇腺活檢屬創(chuàng)傷性檢查，且敏感性差，大多數(shù)患者不能接受。而抗核抗體、SSA抗、SSB抗體則特異性較差，敏感性也不理想(Reichlin M.Antibodies to Ro and La.Ann Med Interne(Paris)，1998，14934-41.)。大部分患者在確診時已屬于中、晚期，往往病情嚴(yán)重，并有多個臟器受損或并發(fā)癥，治療上已十分困難。
胞襯蛋白(Fodrin)屬于譜蛋白超家族，和紅細(xì)胞譜蛋白具有同源性，均為重要的細(xì)胞膜骨架蛋白。胞襯蛋白廣泛分布于神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞等非紅細(xì)胞細(xì)漿膜下，與漿膜平行呈板狀分布。胞襯蛋白由α和β兩個亞單位組成，分子量分別為240kD和235kD。α和β亞單位以邊對邊的形式反向平行分布，形成松散的異二聚體，這兩個異二聚體進(jìn)一步以頭對頭的形式形成圓柱狀的四聚體，與肌動蛋白相交連形成肌動蛋白膠體，參與構(gòu)成細(xì)胞膜骨架，維持細(xì)胞的形態(tài)(Glenney JR Jr，Glenney P，F(xiàn)odrin is the general spectrin-like protein found in most cells whereas spectrin andthe TW protein have a restricted distribution.Cell，1983，34(2)503-12.Bennett V，Gilligan DM，et al，The spectrin-based membrane skeleton and micron-scale organization of theplasma-membrane.Annu Rev Cell Biol，1993，927-66.)。研究表明，胞襯蛋白可參與細(xì)胞的運(yùn)動及維持細(xì)胞的連接和形態(tài)，可能與周圍神經(jīng)，腦，腎臟，肝臟及全身性自身免疫病的發(fā)生有關(guān)。
近幾年來，國外及本發(fā)明發(fā)明人的前期研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合征相關(guān)的α-胞襯蛋白抗體在本病的發(fā)病機(jī)制及診斷中有一定意義。本發(fā)明人運(yùn)用重疊蛋白片段表達(dá)篩選得到了一條干燥綜合征相關(guān)的α-胞襯蛋白抗原表位多肽，雖然其敏感性、特異性相比抗核抗體、SSA抗、SSB抗體有所提高，但最終因篩選方法中運(yùn)用原核表達(dá)重疊重組蛋白結(jié)合免疫檢測分析，局限了抗原表位多肽的獨(dú)立檢測價值，加上國外許多研究中病例樣本小等，該抗體在干燥綜合征診斷中的特異性、敏感性仍不盡如人意(Rieko A.，Naozumi I.，IchiroS.，Yoshio H.et al，Development of Autoimmune Exocrinopathy Resembling sjogren’ssyndrome in Adoptively Transferred Mice With autoreactive CD4+ T cells.Arthiritis ＆Rheum，2003，DEC 48(12)3603-3609.何菁，李晶，栗占國，陳巧林.抗α-胞襯蛋白表位多肽抗體在干燥綜合征診斷中的意義，中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2003，7(10)600-603.He Jing，Chen Qiaolin，Li Zhanguo，Antibodies to α-fodrin-derived peptide in sjogren’s Syndrome.Annals of Rheumatic Diseases，2006，65(4)549-550.陳巧林，樸海燕，何菁，李晶，栗占國.干燥綜合征抗原α-胞襯蛋白抗原表位的篩選與鑒定，中國免疫學(xué)雜志，2005，11(21)864-872.Fox RI，Konttinen Yi.，F(xiàn)isher A，Use of Muscarinic Agonists in the Treatment ofsjogren’s syndrome.Clin Immunol.2001，101(3)249-263.)。
國外學(xué)者M(jìn)asataka等人通過對胞襯蛋白(Fodrin)的β-亞單位β-胞襯蛋白進(jìn)行研究，選取β-fodrin全長cDNA 7561bp中的298-2158bp對應(yīng)的共計616aa為對象，用得到的重組表達(dá)的616aa蛋白為檢測抗原，結(jié)果顯示抗β-胞襯蛋白抗體在原發(fā)性干燥綜合征、繼發(fā)性干燥綜合征患者血清中的陽性率為51％和84％，而在紅斑狼瘡患者、系統(tǒng)性硬化病及正常人血清中的陽性率僅為6％、19％和4％。但由于研究中選擇的不是在人體內(nèi)表達(dá)的β-胞襯蛋白全長蛋白序列為對象，而且血清標(biāo)本的例數(shù)不充分，加上檢測抗原為重組表達(dá)蛋白，每批來源不穩(wěn)定，使得該抗體的陽性率沒有得到真正的提高，在臨床上一直沒有得到應(yīng)用(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodiesto the Amino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells inPatients with sjogren’s Syndrome.The Joumal of Immunology，2001，1675449-5456.)。
綜上所述，在該領(lǐng)域進(jìn)行的多是很初步的探索，仍有多個方面的問題尚待澄清。目前已知的干燥綜合征診斷抗原(蛋白或多肽)中，尚缺乏一種針對人干燥綜合征特異性強(qiáng)，陽性率高的標(biāo)志物；缺乏穩(wěn)定的抗原來源及特異性的診斷方法也是問題的核心。因此，篩選及鑒定新的干燥綜合征相關(guān)抗原(蛋白或多肽等)，尋找一種敏感性高、特異性強(qiáng)而臨床又易于檢測的抗體，對干燥綜合征的臨床診斷具有重要而迫切的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對前述研究現(xiàn)狀及干燥綜合征臨床診斷需求，本發(fā)明的目的在于提供一種新的β-胞襯蛋白表位多肽，以及其對應(yīng)的氨基酸序列。所述的β-胞襯蛋白表位多肽可以特異性地檢測干燥綜合征患者血清中的抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體，該抗體檢測結(jié)果顯示在干燥綜合征患者(原發(fā)、繼發(fā))血清中的陽性率高，而其他對照疾病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡)及正常人群血清中陽性率很低，完全符合臨床診斷的需要。因而所述的β-胞襯蛋白表位多肽可以被提供作為人干燥綜合征臨床診斷用抗原。
本發(fā)明的第二個目的在于提供所述的β-胞襯蛋白表位多肽的篩選方法。本發(fā)明采用新的生物信息學(xué)方法結(jié)合免疫檢測分析方法，篩選獲得的可作為人干燥綜合征抗原的β-胞襯蛋白的表位多肽。
本發(fā)明的第三個目的在于提供一種將含有所述β-胞襯蛋白表位多肽或其衍生物作為抗原用于檢測干燥綜合征患者血清抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的方法，即單特異性ELISA法。本發(fā)明對所述的免疫學(xué)檢測方法的各種條件均進(jìn)行了優(yōu)化，并得到實(shí)驗驗證。
本發(fā)明的第四個目的在于提供所述的β-胞襯蛋白表位多肽在制備用于診斷干燥綜合征的藥物的應(yīng)用。該應(yīng)用是基于所述的β-胞襯蛋白表位多肽測定抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征診斷中的價值評定。具體地，本發(fā)明所述的β-胞襯蛋白表位多肽可以用于制備干燥綜合征的臨床診斷試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明提供了一種β-胞襯蛋白抗原表位多肽及其對應(yīng)的氨基酸序列，所述多肽的特征在于含有以下(a)或(b)氨基酸序列(a)、由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的多肽，該氨基酸序列如下NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH(b)、在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。
SEQ ID NO.1所示多肽為β-胞襯蛋白序列中的部分氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明人選取人全長7561ntβ-胞襯蛋白基因序列ORF(311-7405nt)核酸序列對應(yīng)的氨基酸序列為對象，通過采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5種國際上關(guān)于抗原表位預(yù)測的方法(Odorico M，Pellequer JL，BEPITOPEpredicting the location of continuous epitopes and patterns in proteins.J MolRecognit.2003，Jan-Feb；16(1)20-22.)，分析了上述2365aa長度的β-胞襯蛋白的抗原決定簇，進(jìn)一步通過合成多肽及免疫檢測，得到了一條敏感性和特異性均很高的抗原多肽，同時，經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)序列衍生的多肽，也顯示很好的抗原抗體反應(yīng)，該多肽及其對應(yīng)的衍生物即為本發(fā)明所述的β-胞襯蛋白表位多肽，均可以很好檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG型抗體。迄今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于該多肽(包括篩選到的抗原表位多肽及衍生多肽)序列的抗原性、該多肽檢測血清中對應(yīng)抗體的方法及其作為抗原在干燥綜合征診斷中意義的研究。
本發(fā)明所述的β-胞襯蛋白表位多肽可以用本領(lǐng)域人員所熟知的方法得到，例如固相合成法等。
上述所選取的人全長7561ntβ-胞襯蛋白基因序列來源于NCBI(＞gi|4507195|ref|NP_003119.1|spectrin，beta，non-erythrocytic 1 isoform 1 [Homosapiens])。
根據(jù)發(fā)明的第三個目的，本發(fā)明建立了含有所述β-胞襯蛋白表位多肽SEQ ID NO.1作為抗原用于檢測干燥綜合征患者血清抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的方法(單特異性ELISA)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的原理是將純化的、已鑒定生化特性的抗原包被在固相的聚苯乙烯微孔板上；若為抗體陽性，已稀釋的血清中的特異性抗體將與包被在固相上的抗原結(jié)合；第二步，過氧化物酶標(biāo)記的抗人抗體與已結(jié)合的抗體反應(yīng)；第三步，結(jié)合的標(biāo)記抗體與色原底物溶液作用后而呈現(xiàn)顏色。顏色的深淺與血清標(biāo)本中抗體的濃度成正比。
ELISA檢測產(chǎn)品大致可以分為三種“單特異性ELISA”試劑盒(包被有單特異性抗原)可提供對一種抗體的定量體外檢測；“抗體譜ELISA”試劑盒可在一條微孔板上對多種不同抗體分別進(jìn)行半定量體外檢測；“混合ELISA”試劑盒的固相包被有混合抗原，可半定量檢測多種抗體，而其單特異性需進(jìn)一步檢測。
ELISA檢測中，由于抗原抗體反應(yīng)需要必須的結(jié)合條件(pH值、離子濃度和等電點(diǎn)等)，本發(fā)明中發(fā)明人在實(shí)驗初始階段，發(fā)現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)較弱，后期經(jīng)過一系列pH值及反應(yīng)離子濃度(包括pH6.01×PBS、pH6.51×PBS、pH7.01×PBS、pH7.51×PBS、pH8.01×PBS、pH8.51×PBS、pH9.01×PBS、pH9.51×PBS等)的調(diào)整后，確定了穩(wěn)定的最佳包被緩沖液(pH9.01×PBS)；另外包被抗原的濃度過高和過低都會影響ELISA檢測的特異性和敏感性，尤其在臨床患者血清抗體滴度不平衡的情況下，選擇抗原多肽的最佳包被濃度是ELISA檢測的關(guān)鍵要素。對此本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗，將所述β-胞襯蛋白表位多肽經(jīng)多次不同范圍的梯度稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，具體經(jīng)過3次梯度稀釋，包被量分別為1ng、10ng、100ng、1000ng；10ng、40ng、60ng、80ng、100ng；40ng、45ng、50ng、55ng、60ng。最終確定了檢測多肽的最佳包被量(50ng)，以此包被量進(jìn)行血清抗體檢測，效果最好；再有，關(guān)于對血清中抗原抗體非特異性反應(yīng)的阻止問題，也是臨床ELISA檢測試劑能很好應(yīng)用的另一關(guān)鍵因素。本發(fā)明發(fā)明人通過所在研究小組以往的經(jīng)驗，分別采用1％OVA/PBS、1％BCA/PBS、1％脫脂奶粉/PBS及封閉用正常用兔血清等，最終通過臨床血清樣本檢測反應(yīng)背景比對，確定運(yùn)用業(yè)內(nèi)統(tǒng)一的封閉用正常兔血清經(jīng)特定處理后作為封閉液(具體程序為將封閉用正常兔血清先62℃滅活20分鐘，然后在25ml滅活過的封閉用正常兔血清中加入0.3275g Tris、0.21915g NaCl，再用HCl調(diào)至pH8.0)，這樣可以使得抗β-胞襯蛋白表位多肽抗體檢測的特異性能達(dá)到最佳。
通過以上條件優(yōu)化，本發(fā)明中發(fā)明人將含有所述β-胞襯蛋白表位多肽(SEQ IDNO.1)按一定濃度，包被在固相的聚苯乙烯微孔板上，然后加入陽性干燥綜合征患者血清，最終加入過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，除以上優(yōu)化條件外，其他環(huán)節(jié)與常規(guī)單特異性ELISA相同。本發(fā)明經(jīng)過優(yōu)化建立的單特異性ELISA方法可以很好的檢測臨床干燥綜合征患者血清的抗IgG抗體，實(shí)驗結(jié)果顯示，該方法得到的干燥綜合征患者血清抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的陽性率高、特異性強(qiáng)，完全符合臨床診斷疾病的要求。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的β-胞襯蛋白表位多肽測定抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征診斷中的價值評定有明顯的優(yōu)勢，詳述如下國外學(xué)者M(jìn)asataka等人利用系統(tǒng)性硬化病繼發(fā)干燥綜合征的患者血清，從HepG2細(xì)胞cDNA文庫中，篩選分離出編碼β-胞襯蛋白氨基端部分的cDNA片段，發(fā)現(xiàn)該片段與β-fodrin全長cDNA 7561nt中的298-2158nt同源。選取該片段核酸對應(yīng)的共計616aa為對象，重組表達(dá)代表該段β-胞襯蛋白的不同大小片段FOD1-60，F(xiàn)OD1-103，F(xiàn)OD1-272，F(xiàn)OD1-463，F(xiàn)OD1-616，F(xiàn)OD273-616，western blots鑒定結(jié)果顯示，32份抗β-胞襯蛋白抗體陽性的干燥病人血清均能與含有1-272氨基酸部分的片段蛋白反應(yīng)，均不與而不與FOD1-60及FOD273-616反應(yīng)，其中1份與FOD1-103重組蛋白反應(yīng)。以FOD1-616為檢測抗原來檢測干燥綜合征患者的血清抗β-胞襯蛋白抗體。結(jié)果顯示抗β-胞襯蛋白抗體在原發(fā)性干燥綜合征、繼發(fā)性干燥綜合征患者血清中的陽性率為51％和84％，在紅斑狼瘡患者、系統(tǒng)性硬化病及正常人血清中的陽性率僅為6％、19％和4％，該抗體檢測對干燥綜合征具有一定的價值。但由于研究中選擇的不是在人體內(nèi)表達(dá)的β-胞襯蛋白全長蛋白序列為對象，而且血清標(biāo)本的例數(shù)不充分，加上檢測抗原為重組表達(dá)蛋白，每批來源不穩(wěn)定，使得該抗體真正的價值沒有得到體現(xiàn)，患者抗體檢測陽性率沒有得到真正的提高，在臨床上一直沒有得到應(yīng)用(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodiesto the Amino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells inPatients with Sjogren’s Syndrome.The Journal of Immunology，2001，1675449-5456.)。
基于以上研究，本發(fā)明人采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5種國際關(guān)于抗原表位預(yù)測的方法，分析了2365aa長度的β-胞襯蛋白的抗原決定簇，進(jìn)一步通過合成多肽及免疫檢測，得到了一條敏感性和特異性均很高的抗原多肽，該多肽可以很好檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體。本發(fā)明人將該多肽作為檢測抗原，用上述建立好的單特異性ELISA的方法檢測干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人血清中的抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體。本發(fā)明研究共檢測干燥綜合征患者182例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者113例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者136例，正常人212例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該多肽對干燥綜合征的抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體測定具有較高的敏感性和特異性，可以達(dá)到通過血清學(xué)的方法診斷干燥綜合征的目的，為干燥綜合征的臨床診斷提供客觀的實(shí)驗室依據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明的第四個目的，本發(fā)明還提供了所述的β-胞襯蛋白表位多肽在制備用于診斷干燥綜合征的藥物的應(yīng)用。
根據(jù)上述關(guān)于β-胞襯蛋白表位多肽測定抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征診斷中的價值評定結(jié)果、β-胞襯蛋白表位多肽測定抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體初步免疫學(xué)方法以及臨床診斷試劑盒的要求，本發(fā)明人制備了β-胞襯蛋白表位多肽IgG臨床診斷用試劑盒。具體采用的是夾心法固相酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)，用于定量檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體；所述的β-胞襯蛋白表位多肽抗原被包被于微孔板上，可拆分的微孔板(1×8)共12板條，可以完成96人份的檢測。
本試劑盒經(jīng)過3個不同的反應(yīng)階段自身抗體結(jié)合并形成夾心復(fù)合物，最后產(chǎn)生酶聯(lián)顏色反應(yīng)，顏色的深淺與樣品中抗體的濃度成一定的比例關(guān)系。步驟1樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清加入微孔板的反應(yīng)孔內(nèi)，任何存在的抗體結(jié)合在微孔內(nèi)表面，30分鐘孵育后洗滌除去非反應(yīng)成分。步驟2加入HRP過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG，結(jié)合抗原抗體復(fù)合物，15分鐘孵育后洗滌除去未結(jié)合的多余的酶標(biāo)。步驟3加入TMB底物，15分鐘孵育后試劑顏色變成藍(lán)色，加入終止液(含1M HCl)終止反應(yīng)；試劑顏色變成黃色。
顏色的深淺與樣品中IgG抗體的濃度成一定的比例關(guān)系。樣品的IgG抗體含量可根據(jù)其O.D.值由標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出來。在酶標(biāo)儀或分光光度計中讀取結(jié)果。450nm作為初始波長，600至650nm(優(yōu)選為620nm)作為參考波長。


圖1為2365aa長度的全長β-胞襯蛋白二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果圖；分別用Gamier-Robson和Chou-Fasman法推測二維結(jié)構(gòu)，Kyte-Doolittle標(biāo)準(zhǔn)分析親水性(Hydrophilicity)，Karplus-Schulz標(biāo)準(zhǔn)推測柔韌性(Flexible)，Janeson-Wolf方法預(yù)測抗原性指數(shù)(Antigenic index)，Plot-Emini方法分析表面可及性(Surface probability)。
圖2為2365aa長度的全長β-胞襯蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果圖；橫坐標(biāo)表示的是序列的位置，縱坐標(biāo)表示的是預(yù)測方法的多少，1是指有1種方法預(yù)測那個位點(diǎn)是個epitope(抗原決定簇)，依次類推。該方法準(zhǔn)確性大于75％。
圖3為單特異性酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體原理示意圖。圖中，用抗原(β-胞襯蛋白抗原表位多肽)包被微量板孔，制成固相載體。加患者(干燥綜合征及疾病對照組等)血清到板孔中，其所含的抗體(抗β-胞襯蛋白表位多肽抗體)特異性地與固相載體中存在的抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。除去多余物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體，使之與上述免疫復(fù)合物反應(yīng)。洗板，除去多余的結(jié)合物，加入底物(TMB)。該反應(yīng)產(chǎn)生有顏色產(chǎn)物，顏色強(qiáng)度與特異性抗體含量成正比。
圖4為本發(fā)明所述的β-胞襯蛋白表位多肽建立的單特異性ELISA法的檢測程序示意圖；圖5顯示β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在不同疾病的陽性率；由圖可見，抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在原發(fā)性和繼發(fā)性干燥綜合征中的陽性率明顯高于SLE、RA及正常對照(P均＜0.01)。
圖6顯示自身抗體在干燥綜合征患者血清樣本中檢測的敏感性和特異性。在干燥綜合征患者中，抗β-胞襯蛋白表位多肽抗體的敏感性及特異性明顯高于SSA、SSB及抗核抗體(P均＜0.01)。因此，抗β-胞襯蛋白表位多肽抗體在干燥綜合征血清學(xué)診斷中具重要價值。
具體實(shí)施例方式
下面將參照附圖結(jié)合多種實(shí)施例來說明本發(fā)明所涉及的發(fā)明主題以及應(yīng)用本發(fā)明中的β-胞襯蛋白表位多肽及其相應(yīng)的抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體來實(shí)施干燥綜合征臨床診斷等具體實(shí)施方式
。
本發(fā)明所用術(shù)語“β-胞襯蛋白表位多肽”指具有共同序列SVETEDNKEKKSAK(即NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH)的多肽或?qū)⑸鲜霭被嵝蛄薪?jīng)過添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由此衍生的多肽。
實(shí)施例1β-胞襯蛋白表位多肽的篩選及鑒定前述的研究工作已經(jīng)證明，利用基因工程的方法純化出的β-胞襯蛋白融合蛋白能夠特異性的結(jié)合干燥綜合征患者血清中的抗β-胞襯蛋白抗體，然后通過特定的方法可以將其檢出(Masataka K，Tetsuroh O，Yoko O，Junichi K，and Yutaka K，Autoantibodies to theAmino-Terminal Fragment of β-Fodrin Expressed in Glandular Epithelial Cells in Patientswith sjogren’s Syndrome.The Journal of Immunology，2001，1675449-5456.)。本發(fā)明的實(shí)驗中，發(fā)明人選取全長β-胞襯蛋白基因ORF核酸序列對應(yīng)的氨基酸序列為對象，采用Standard，Karplus，Emini，Amphiphi，Pellequer等5種國際關(guān)于抗原表位預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)方法，全面分析了上述2365aa長度的β-胞襯蛋白二級結(jié)構(gòu)(親水疏水性等)，具體見圖1。
進(jìn)一步分析上述2365aa長度的β-胞襯蛋白抗原決定簇，結(jié)果見圖2，按抗原趨勢指數(shù)排列，得到并合成了共計32條多肽。32條計算分析得到的較好的抗原表位序列(均為從NH3端到COOH端排序)如下VDDWDNENSSARLFE SVETEDNKEKKSAK DISVDHPDEKSIITYEKYESLASDLLEWIE WERLEKAEHERELAL NELIRQEKLEQLARRLWEYLLELLRARFCYQELCQLGKDLTSVMRLL IVSSSDVGHDEYSTQSHRFESLEP EIKAQQDKLNTRWS LQQFLRDLDDFQSEIDNYEEDYQKMRDMQEKVDSIDDRHRKNMRLKDNRDLQKFLQDCESTTQTKAQRLFDA
SQEGKSTDEVDSKRLT KEIQGHQPRIDDIFER NIVTDSSSLSAEAIRQMMSEEKAKDEQSAVS EERRGKLDERHRLF INSGHSDAATIAEWKDFGRIQDKHKKLPEEL ADDIQKRENEVLEA EIDARNDSFTTCIELGREIGQSVDEVEKLIKR EVRRQQEEEERKRRP PSPTSDRKAKTALPAEYLFQAKDDEEMNTW SSAISSDKHEVSASTQ KREKDKEKDKEKRFS將上述32條合成的β-胞襯蛋白表位多肽采用單特異性ELISA方法分別檢測臨床10例β-胞襯蛋白IgG抗體檢測陽性的干燥綜合征確診患者血清抗體。
具體步驟是32條合成的β-胞襯蛋白表位多肽分別用包被緩沖液(上述自制的PBS緩沖液，pH 9.6)稀釋至0.5μg/ml，包被酶標(biāo)板(100μl/孔)，4℃孵育過夜。以0.1％PBS-Tween洗板5次，每孔加入封閉用正常兔血清緩沖液(BNRS)(用前經(jīng)過處理，見上述)150μl，37℃孵育3h，洗板5次?？功?胞襯蛋白陽性SS患者血清標(biāo)本(IgG陽性10例)各以PBS稀釋50倍后加入(100μl/孔)，37℃孵育1h。洗板5次后對應(yīng)加入PBS 1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗(Santa Cruz產(chǎn)品)，37℃孵育1h。洗板后加入TMB顯色液顯色10min，加入1mol/L的濃HCL終止后測定標(biāo)本在450nm處的A值。每板同時設(shè)空白對照、陽性對照及陰性對照(均來自β-fodrin蛋白大規(guī)模篩選檢測過樣本)。采用反應(yīng)OD值的平均值，比較32條合成多肽與SS患者血清IgG的反應(yīng)強(qiáng)弱，得到的最強(qiáng)反應(yīng)活性的多肽認(rèn)定為SS(干燥綜合征)相關(guān)抗體最佳檢測抗原β-胞襯蛋白表位多肽。
通過分析及免疫檢測，得到了一條反應(yīng)最強(qiáng)的抗原多肽第2條，其序列為SVETEDNKEKKSAK(即NH3-Ser-Val-Glu-Thr-Glu-Asp-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Ser-Ala-Lys-COOH)，可以很好檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體，在32條多肽中與干燥綜合征陽性血清IgG抗體反應(yīng)最強(qiáng)，OD平均值為1.02，結(jié)果見表1。
表1 32條β-胞襯蛋白合成多肽的序列及其對應(yīng)的單特異性ELISA檢測結(jié)果



同時，為了分析上述篩選得到的SEQ ID NO.1多肽抗原性的普遍穩(wěn)定性，通過對SEQ ID NO.1多肽經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由此衍生的多肽，重新合成一系列多肽，通過以上免疫檢測步驟，發(fā)現(xiàn)均可以很好檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體，均顯示與干燥綜合征陽性血清IgG抗體很好的反應(yīng)，OD平均值結(jié)果見表2。
表29條β-胞襯蛋白SEQ ID NO.1多肽衍生物的序列及其對應(yīng)的單特異性ELISA檢測結(jié)果

上表中，序號為1-5的序列是在SEQ ID NO.1序列的首末端添加不同數(shù)量氨基酸(用下劃線標(biāo)出)的序列序號為6和7的序列是在SEQ ID NO.1序列插入1個或多個氨基酸(用下劃線標(biāo)出)的序列；序號為8和9的序列是在SEQ ID NO.1序列首末端缺失1個或多個氨基酸的序列。
本發(fā)明的試驗中發(fā)明人利用的是Flechsler等報道的固相合成法(Anderson EC，et al，Proc，Natl.Acad.USA 1998，957574-79.)合成了該條共14個氨基酸的β-胞襯蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)及其對應(yīng)的衍生物。迄今為止，國內(nèi)外尚無關(guān)于該多肽序列的抗原性、該多肽檢測血清中對應(yīng)抗體的方法及其作為抗原在干燥綜合征診斷中意義的研究。
實(shí)施例2 β-胞襯蛋白表位多肽對患者血清中抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的檢測及其價值評定本發(fā)明實(shí)驗中針對合成多肽的氨基酸特性及其與抗體反應(yīng)的情況，經(jīng)過一系列pH值及反應(yīng)離子濃度的調(diào)整后，我們確定了以pH9.6的自配PBS為包被緩沖液；同時也針對包被抗原濃度進(jìn)行了相應(yīng)的實(shí)驗，將該β-胞襯蛋白表位多肽SEQ ID NO.1進(jìn)行梯度稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示，用以上pH9.6的自配PBS包被緩沖液將肽稀釋為0.5μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育4小時后，進(jìn)行血清抗體檢測，效果最好；另外，關(guān)于對非特異性反應(yīng)的阻止問題，通過發(fā)明人以往的實(shí)驗經(jīng)驗，首次運(yùn)用業(yè)內(nèi)統(tǒng)一的封閉用正常兔血清經(jīng)特定處理后作為封閉液，使得抗β-胞襯蛋白表位多肽抗體檢測的特異性能達(dá)到最佳。具體操作如下封閉每孔加經(jīng)處理的封閉用正常兔血清緩沖液(BNRS)150μl，4℃溫育過夜。
BNRS的配制正常兔血清25ml (先62℃滅活20分鐘)Tris 0.3275gNaCl 0.21915g用HCl調(diào)pH至8.0本研究利用上述的SEQ ID NO.1多肽采用上述經(jīng)過優(yōu)化而建立好的酶聯(lián)免疫吸附法(單特異性ELISA法)對干燥綜合征(SS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者及正常人血清中的抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體進(jìn)行檢測，以評價該多肽抗體在各種疾病中的分布。
具體步驟是首先選擇上述篩選到的β-胞襯蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)，用包被緩沖液(上述PBS緩沖液，pH9.6)稀釋至0.5μg/ml，包被酶標(biāo)板(100μl/孔)，4℃孵育過夜。以0.1％PBS-Tween洗板5次，每孔加入經(jīng)過處理的封閉用兔血清緩沖液(BNRS)(用前經(jīng)過處理，見上述)150μl，37℃孵育3h，洗板5次?；颊哐鍢?biāo)本(包括干燥綜合征患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及正常人)以pH7.2 PBS稀釋50倍后分別加入包被孔中(100μl/孔)，37℃孵育1h。洗板5次后分組加入pH7.2 PBS 1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗(Santa Cruz產(chǎn)品)，37℃孵育1h。洗板后加入TMB顯色液顯色10min，加入1mol/L的濃HCL終止后測定標(biāo)本在450nm處的A值。每板同時設(shè)空白對照、陽性對照及陰性對照((均來自β-fodrin蛋白大規(guī)模篩選檢測過樣本)。采用待測標(biāo)本A值＞正常標(biāo)本均數(shù)+2×標(biāo)準(zhǔn)差為陽性域值，分析SEQ IDNO.1多肽與SS患者及對照組血清IgG的反應(yīng)情況。
檢測原理示意圖見圖3。
本發(fā)明研究中共檢測干燥綜合征患者182例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者113例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者136例，正常人212例。
1.檢測程序概要如圖4所示，多肽進(jìn)行包被，50ng/孔，4℃過夜，洗滌，加入封閉用正常兔血清緩沖液(BNRS)150微升，濕盒中37℃過夜，洗滌。樣品稀釋液1∶50稀釋臨床病人血清，將稀釋的樣本，和立即可用的對照血清，分別加到微量孔內(nèi)(100微升)，在濕盒中孵育60分鐘/37℃。再洗滌，加入已稀釋的酶標(biāo)記IgG溶液100微升，在濕盒中再孵育60分鐘/37℃，洗滌，加入底物溶液100微升，在濕盒中再孵育10分鐘/37℃，加入終止液(100微升)，在450納米處讀數(shù)2.檢測過程2.1將檢測所需數(shù)目的微孔條放到微孔板(已包被好多肽SEQ ID NO.1并已經(jīng)封閉完成)框上并準(zhǔn)備好一張草簽。
2.2在微量孔內(nèi)分別加入100微升的已稀釋樣本或立即可用的對照血清。留一個孔為底物空白使用，例如

2.3將樣品于濕盒內(nèi)37℃(±1℃)孵育60分鐘(±5分鐘)。
2.4孵育后以洗液緩沖液洗滌板孔(使用自動洗板機(jī)或手工洗板)-吸去或甩去洗液-每孔內(nèi)加入300微升洗液-吸去或甩去洗液-重復(fù)洗滌過程4次(共5次！)-將微孔板翻轉(zhuǎn)過來在紙巾上拍打，使微孔中不再含有液體2.5加入酶標(biāo)記抗體。
于適當(dāng)孔內(nèi)(底物空白除外)加入100微升IgG酶標(biāo)記抗體混合物2.6濕盒內(nèi)37℃(±1℃)孵育60分鐘(±1分鐘)。
2.7孵育后，以洗液清洗板孔(洗滌見上)2.8 加入底物于每孔內(nèi)加入100微升底物溶液(包括底物空白孔)2.9濕盒內(nèi)37℃(±1℃)孵育10分鐘(±1分鐘)。
2.10終止反應(yīng)每孔內(nèi)加入100微升終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。
2.11讀取消光度以底物空白為空白對照液，60分鐘內(nèi)讀取450納米的OD值，參考波長范圍為620納米-690納米(例如650納米)。
本實(shí)施例主要通過以下幾個方面闡明本發(fā)明β-胞襯蛋白表位多肽(SEQ ID NO.1)在干燥綜合征患者診斷中的意義1、β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體陽性率在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人血清之間的比較。
本發(fā)明的研究實(shí)驗中，發(fā)明人用單特異性ELISA方法檢測了β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及正常人血清檢測中的陽性率(表3，圖5)。應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)比較各組數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征患者血清檢測中的陽性率顯著高于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和正常人，p值均＜0.01。原發(fā)和繼發(fā)性干燥綜合征的β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體的陽性率相近，無統(tǒng)計學(xué)差異。
表3.β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在不同疾病的陽性率

*包括SLE繼發(fā)SS患者13例，RA繼發(fā)SS者19例，皮肌炎繼發(fā)SS、未分化結(jié)締組織病繼發(fā)SS患者各2例。
2、抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及正常人血清中滴度的比較。
由表4可見β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在干燥綜合征的平均滴度明顯高于RA、SLE患者及正常人。
表4.SS、SLE、RA及正常人抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體滴度的比較

3、抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體與其它自身抗體在干燥綜合征的敏感性和特異性的比較。
表5，圖6顯示了抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體、SSA抗體、SSB抗體及ANA在干燥綜合征中的敏感性和特異性。其中ELISA法檢測抗α-胞襯蛋白抗體相應(yīng)檢測試劑盒及方法由德國IMETEC生物試劑公司提供；歐蒙斑點(diǎn)法檢測抗SSA、SSB抗體相應(yīng)檢測試劑盒及方法由德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗診斷有限公司提供；間接免疫熒光法檢測抗核抗體(ANA)相應(yīng)檢測試劑盒及方法由德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗診斷有限公司提供。本發(fā)明實(shí)驗結(jié)果顯示抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體特異性和敏感性均明顯高于抗α-胞襯蛋白抗體、SSB抗體、SSA抗體和ANA。因此，結(jié)合敏感性和特異性，抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體在診斷中的意義可能優(yōu)于其他自身抗體。
表5.自身抗體在干燥綜合征的敏感性和特異性

實(shí)施例3 β-胞襯蛋白表位多肽作為抗原在制備臨床干燥綜合征診斷試劑盒中的應(yīng)用本發(fā)明人采用夾心法固相酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)，將所述的β-胞襯蛋白表位多肽抗原包被于微孔板上，制備了β-胞襯蛋白表位多肽IgG臨床診斷用試劑盒，用于定量檢測抗β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體，共可以完成96人份的檢測。具體內(nèi)容如下1.試劑盒組成材料包被了高度純化β-胞襯蛋白表位多肽可拆分的微孔板(1×8)12板條1塊；β-胞襯蛋白表位多肽IgG標(biāo)準(zhǔn)品0/6.3/12.5/25/50/100U/ml各1瓶，每瓶1.5ml；質(zhì)控血清(含IgG和陰性質(zhì)控)各1瓶，1.5ml；濃縮的樣品緩沖液1瓶，20ml；HRP過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG1瓶，15ml；TMB底物1瓶，15ml；終止液(含1M HCl)1瓶，15ml；濃縮洗滌緩沖液1瓶，20ml2.技術(shù)參數(shù)(1)樣本血清或血漿(2)樣本量每次實(shí)驗100ul未稀釋樣本(3)總孵育室溫下(18-28℃)60分鐘(4)質(zhì)控范圍0-100U/ml(5)靈敏度1U/ml(6)儲存2-8℃(7)有效期生產(chǎn)后9個月或標(biāo)明有效期(8)包裝規(guī)格96人份
3.試劑盒性能(1)特異性 高度純化的β-胞襯蛋白表位多肽抗原被包被于微孔板上，制備的β-胞襯蛋白表位多肽試劑盒僅用于特異性檢測的抗體。
(2)校正 β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體定量檢測系統(tǒng)無國際標(biāo)準(zhǔn)校正。
4.免疫分析程序(1)自備材料儀器 酶標(biāo)儀，450nm波長漩渦振蕩器加樣器10ul，100ul，1000ul試劑準(zhǔn)備 蒸餾水量筒100ml，1000ml裝洗滌液的飼料容器可選擇多通道加樣器可重復(fù)的加樣器100ul數(shù)據(jù)分析軟件(2)樣品收集，處理和保存使用血清或血漿樣本檢測β-胞襯蛋白表位多肽IgG抗體，血清或血漿用樣品稀釋緩沖液以1∶50的比例稀釋(20ul樣本+1ml緩沖液)，病人無須禁食，也不用特別的準(zhǔn)備，靜脈穿刺，取血采樣，形成凝結(jié)后離心去除顆粒。
樣品如果不直接使用，2-8℃下可保存5天或-20℃下可保存6個月，將其分為小部分避免反復(fù)冷凍。
膽紅素和溶血素對結(jié)果無影響。
(3)試劑的準(zhǔn)備/儲存除樣品緩沖液和洗滌緩沖液外，全部試劑均為即用型液體；開蓋后試劑2-8℃下可至少保存30天或標(biāo)簽上的有效期。
實(shí)驗中不用的板條立即放回帶干燥劑的包裝中，2-8℃下密封保存，以免變質(zhì)。
洗滌緩沖液的準(zhǔn)備蒸餾水50倍稀釋后裝到1000ml容器。稀釋后的緩沖液可在2-8℃下至少保存30天或標(biāo)簽上的有效期。
稀釋緩沖液的準(zhǔn)備蒸餾水5倍稀釋后裝到100ml容器。稀釋后的緩沖液可在2-8℃下至少保存30天或標(biāo)簽上的有效期。
(4)技術(shù)要點(diǎn)質(zhì)控血清或樣本必須每次作為未知分析，以檢測實(shí)驗的可靠性。
加樣和樣本處理使用帶一次性吸頭的微量加樣器取樣；直接加入微孔底部。為避免交叉污染，每次更換吸頭取樣。對懷疑高濃度的病人樣本應(yīng)進(jìn)一步稀釋，并在結(jié)果計算時調(diào)整。
(5)試驗過程不同批號不要混用全部試劑和樣本使用前恢復(fù)到室溫。
所有病人樣本用樣品稀釋緩沖液以1∶50的比例稀釋(20ul樣本+1ml緩沖液)，混合均勻。標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清為即用型，不必稀釋。
根據(jù)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控決定所需的板條，每個樣品，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控都應(yīng)做雙份。
建議使用的試驗方案


每孔加入100ul血清稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清，室溫下孵育1小時(18-28℃)；倒空微孔板，每孔用300ul洗滌緩沖液沖洗3次；每孔加入100ul酶標(biāo)液，室溫下孵育60分鐘；倒空微孔板，每孔用300ul洗滌緩沖液沖洗3次；每孔加入100ul底物TMB，室溫下黑暗中孵育10分鐘；每孔加入100ul的終止液，靜止5分鐘；停止反應(yīng)后30分鐘內(nèi)，測定結(jié)果，450nm作為初始波長，620nm(可以用600至690nm)作為參考波長。
(6)結(jié)果分析以吸光度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(直線、半對數(shù)或?qū)?shù)坐標(biāo)紙)。
由標(biāo)準(zhǔn)曲線可直接確定血清的抗體濃度。
(7)實(shí)驗參數(shù)精度

靈敏度1U/ml對應(yīng)在稀釋實(shí)驗中，高抗體濃度的樣本用樣本緩沖液稀釋并檢測。結(jié)果在全部測試范圍內(nèi)成線性關(guān)系。
SEQUENCE LISTING(序列表)<110>中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院<120>β-胞襯蛋白抗原表位多肽及其篩選方法與應(yīng)用<140>
<141>2006-08-30<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14<212>PRT<213>人工序列<400>1Ser Val Glu Thr Glu Asp Asn Lys Glu Lys Lys Ser Ala Lys。
1 5 10
權(quán)利要求
1.β-胞襯蛋白抗原表位多肽，其特征在于，包括如下(a)或(b)的多肽(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的β-胞襯蛋白抗原表位多肽的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟A)選取人全長7561 ntβ-胞襯蛋白基因序列ORF核酸序列對應(yīng)的2365 aa長度的氨基酸序列為對象，采用Standard、Karplus、Emini、Amphiphi、Pellequer五種關(guān)于抗原表位預(yù)測的標(biāo)準(zhǔn)方法，全面分析上述2365 aa長度的β-胞襯蛋白二級結(jié)構(gòu)，確定其抗原決定簇；B)按抗原趨勢指數(shù)排列，計算分析得出較好的抗原表位序列，合成候選的若干條多肽，通過免疫檢測，得到了一條敏感性和特異性均很高的抗原多肽；C)通過添加不同數(shù)量的氨基酸重新合成含有該序列的多肽，經(jīng)免疫檢測也顯示很好的抗原抗體反應(yīng)，得到具有抗原表位活性的多肽及其對應(yīng)的衍生物。
3.一種用于檢測干燥綜合征患者的免疫學(xué)方法，其特征在于將如權(quán)利要求1所述的β-胞襯蛋白表位多肽作為抗原，采用單特異性ELISA法檢測干燥綜合征患者血清抗β-胞襯蛋白多肽IgG抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫學(xué)方法，其特征在于所述的ELISA法中，包被緩沖液的pH值為9.0，反應(yīng)離子濃度為1×PBS。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫學(xué)方法，其特征在于所述的ELISA法中，抗原多肽即所述β-胞襯蛋白表位多肽的包被量為50ng。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫學(xué)方法，其特征在于所述的ELISA法中，將業(yè)內(nèi)統(tǒng)一的封閉用正常兔血清經(jīng)特定處理后作為封閉液，所述的特定處理的具體程序為將封閉用正常兔血清先62℃滅活20分鐘，然后在25ml滅活過的封閉用正常兔血清中加入0.3275g Tris、0.21915g NaCl，再用HCl調(diào)至pH8.0。
7.如權(quán)利要求1所述的β-胞襯蛋白抗原表位多肽在制備診斷干燥綜合征的藥物中的應(yīng)用。
8.含有如權(quán)利要求1所述的β-胞襯蛋白抗原表位多肽的診斷干燥綜合征的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及β－胞襯蛋白抗原表位多肽的篩選，得到具有診斷意義的最佳β－胞襯蛋白多肽對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明所述的β－胞襯蛋白抗原表位多肽，包括如下(a)或(b)的多肽(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗原表位功能的由(a)衍生的多肽。所述的β－胞襯蛋白表位多肽可以特異性地檢測干燥綜合征患者血清中的抗β－胞襯蛋白多肽IgG抗體，完全符合臨床診斷的需要。本發(fā)明還提供了檢測患者血清中β－胞襯蛋白多肽IgG抗體的免疫學(xué)方法，以及將其作為抗原在制備診斷干燥綜合征的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/53GK1935837SQ200610037369
公開日2007年3月28日 申請日期2006年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月30日
發(fā)明者陳巧林 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院