專利名稱：：可溶性協(xié)同信號(hào)分子在檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及體外檢測(cè)樣品的方法，更具體地涉及運(yùn)用免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)可溶性的協(xié)同信號(hào)分子的方法。背錄技術(shù)自身免疫病嚴(yán)重危害人類身體健康，以類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)為例，它呈世界性分布，熱帶少見，溫帶、寒帶多見。在中國人群發(fā)病率為0.3%-0.5%，患者約有400500萬，隨年齡增加，患病率有增高的趨勢(shì)，女性與男性發(fā)病率比例為3:1。自身免疫應(yīng)答紊亂是導(dǎo)致這類疾病病情持續(xù)進(jìn)展的重要原因。以RA為例，浸潤在滑膜組織中的自身反應(yīng)性T細(xì)胞在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的致病作用。自身反應(yīng)性T細(xì)胞由外源性抗原或改變的自身抗原所活化，通過粘附分子的作用進(jìn)入關(guān)節(jié)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，造成滑膜組織損傷。這群T細(xì)胞表達(dá)活化/記憶性的標(biāo)志如CD45R、CD化HLA-DR以及VLA-1等,表明它們處于持續(xù)的高活化狀態(tài)。對(duì)于自身反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)活化原因，經(jīng)典的雙信號(hào)學(xué)說認(rèn)為，T細(xì)胞的活化需要TCR與抗原肽MHC分子復(fù)合物介導(dǎo)的第一信號(hào)以及由協(xié)同信號(hào)分子B7-CD28通路提供的第二信號(hào)介導(dǎo)。協(xié)同信號(hào)分子是表達(dá)在細(xì)胞表面的糖蛋白，它們參與調(diào)控TCR信號(hào)而促進(jìn)或抑制T細(xì)胞的致敏、活化、生長和分化。根據(jù)其對(duì)T細(xì)胞功能發(fā)揮正性或負(fù)性調(diào)控作用，可將其分為協(xié)同刺激分子或協(xié)同抑制分子。PD-1(程序性死亡-1，Programmeddeath-l)蛋白是表達(dá)于活化T、B細(xì)胞以及髓系細(xì)胞表面的協(xié)同抑制受體。PD-1是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的協(xié)同抑制分子，與其配體結(jié)合可抑制下游信號(hào)事件而抑制T、B細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。抑制性信號(hào)通路受胞漿區(qū)ITSM的介導(dǎo)，磷酸化的酪氨酸殘基募集SHP-2磷酸酶，使TCR、BCR信號(hào)通路成分脫磷酸化而發(fā)揮抑制效應(yīng)。PD-1的作用與抗原劑量密切相關(guān)，對(duì)低濃度抗原刺激所致的增殖反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)。協(xié)同抑制分子CTLA-4、PD-1等在T細(xì)胞活化后表達(dá)上調(diào)而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答，在維持外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用。協(xié)同刺激信號(hào)與抑制信號(hào)的平衡一旦打破將會(huì)導(dǎo)致自身免疫病等免疫病理現(xiàn)象的發(fā)生。然而，目前僅部分研究了CD28、ICOS在RA患者滑膜液浸潤細(xì)胞中的表達(dá)情況，尚且缺乏深入的機(jī)理研究。協(xié)同信號(hào)分子如PD-1等與RA的確切關(guān)系尚不為人們所知，對(duì)協(xié)同信號(hào)分子以及它們的可溶性形式在RA中的系統(tǒng)研究亟待進(jìn)行。由此可見，可溶性PD-1及其配體是進(jìn)一步了解研究RA等自身免疫疾病的自身免疫應(yīng)答紊亂狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一，因此本領(lǐng)域迫切需要提供一種方法，用此方法可以檢測(cè)到人體內(nèi)天然的可溶性PD-1及其配體PD-L1，從而更有效地開展與此類疾病相關(guān)的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種體外檢測(cè)液體樣品中的可溶性PD-l(sPD-l)及其配體的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種方法的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1蛋白或其配體的方法，包括步驟(a)將所述樣品與抗PD-1的抗體或抗PD-1配體的抗體進(jìn)行接觸，從而形成可溶性PD-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物；(b)檢測(cè)可溶性TO-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物，從而確定可溶性PD-1蛋白或其配體的存在與否。在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)通過夾心法檢測(cè)可溶性PD-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，它包括步驟(1)將PD-1或其配體的抗體包被固相載體，得到包被有PD-1或其配體的抗體的固相載體；(2)在包被有PD-1或其配體的抗體的固相載體上加入液體樣品；(3)加入酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-1或其配體抗體；(4)加入底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)。在另一優(yōu)選例中，所述的PD-l或其配體的抗體為多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的配體是PD-L1。在另一優(yōu)選例中，所述的PD-1或其配體為人PD-1或其配體。在另一優(yōu)選例中，所述的液體樣品包括血清、血槳、滑膜液、尿液或乳汁等。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗可溶性PD-1蛋白或其配體的抗體的用途，它可用于制備輔助性檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑是一固相載體，所述的固相載體上固定有抗PD-l或其配體的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括固相載體，PD-1或其配體的抗體，酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-1或其配體抗體，底物。在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體上包被有PD-1或其配體的抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的配體為ra-Ll。在另一優(yōu)選例中，所述的PD-1或其配體為人PD-1或其配體。在另一優(yōu)選例中，所述的PD-1或其配體的抗體為多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的不同種屬抗人PD-1或其配體抗體為單克隆抗體。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1蛋白或其配體的試劑盒，它包括固相載體，PD-1或其配體的抗體，酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-l或其配體抗體，底物。在另一優(yōu)選例中，上述試劑盒中所述的固相載體上包被有PD-1或其配體的抗體。在另一優(yōu)選例中，上述試劑盒中所述的PD-1或其配體的抗體為多克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，上述試劑盒中所述的不同種屬抗人PD-1或其配體抗體為單克隆抗體。在另一優(yōu)選例中，上述試劑盒中所述的PD-1或其配體為人PD-1或其配體。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括包被抗體的緩沖液和底物緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括洗滌液，封閉液和終止液。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括說明書。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種方法，用此方法可以檢測(cè)到人體內(nèi)天然的可溶性PD-1及其配體PD-L1，從而可更有效地輔助性檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。圖1A、B顯示了RA患者外周血和滑膜液中單個(gè)核細(xì)胞協(xié)同信號(hào)分子的mRNA表達(dá)水平；*表示與其它組比較？<0.05。HC表示健康人對(duì)照，RA表示類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，OA表示骨關(guān)節(jié)炎對(duì)照，PB表示外周血，SF表示滑液。圖1C顯示了RA患者不同細(xì)胞亞群協(xié)同信號(hào)分子的mRNA表達(dá)水平。承表示與RA患者外周血(PB)組比較p〈0.05，+表示與RA患者的滑液來源的CD8+T細(xì)胞組比較p<0.05。圖2顯示了流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析協(xié)同信號(hào)分子在RA患者不同細(xì)胞亞群的表達(dá)水平。圖3顯示了外周血和滑膜液中單個(gè)核細(xì)胞Fas的mRNA表達(dá)水平。圖4顯示了細(xì)胞因子對(duì)協(xié)同信號(hào)分子的誘導(dǎo)作用。圖5顯示了RA患者及對(duì)照組滑膜液或血清中可溶性協(xié)同信號(hào)分子的檢測(cè)結(jié)果。圖6顯示了PD-1全長mRNA及不同長度剪切體的表達(dá)情況。圖7顯示了重組人PD-1-Ig、PD-Ll-Ig對(duì)T細(xì)胞活化增殖的影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明人在對(duì)RA病理機(jī)制進(jìn)行了深入的研究后發(fā)現(xiàn)，可溶性PD-1及其可溶性配體PD-Ll在RA患者血清和滑膜液中顯著升高，血清中增高的可溶性PD-1和可溶性PD-Ll(sPD-1和sPD-L1)與類風(fēng)濕因子(RF)存在顯著相關(guān)性，揭示可溶性PD-1等分子對(duì)T細(xì)胞異?；罨哂幸欢ǖ牟±碚{(diào)控作用。具體而言，發(fā)明人原本推測(cè)協(xié)同刺激分子在RA患者關(guān)節(jié)局部表達(dá)水平升高，而協(xié)同抑制分子在滑膜浸潤T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面可能表達(dá)下調(diào)，負(fù)調(diào)控機(jī)制的缺乏導(dǎo)致T細(xì)胞的持續(xù)活化而介導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，關(guān)節(jié)損害持續(xù)進(jìn)展。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在RA患者滑膜液浸潤T細(xì)胞中協(xié)同抑制分子PD-1、CTLA-4等表達(dá)顯著增加，它們相應(yīng)的配體在滑膜液浸潤巨噬細(xì)胞表面也上調(diào)表達(dá)，繼而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可溶性協(xié)同信號(hào)分子拮抗了協(xié)同抑制分子的調(diào)控作用而對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞的持續(xù)活化發(fā)揮病理調(diào)控作用。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人制備了一種試劑盒，運(yùn)用ELISA方法，首次在人體內(nèi)證實(shí)了可溶性PD-1和可溶性PD-Ll的存在，也建立了檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1或可溶性PD-Ll的方法。輔助性檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供的檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法是在液體樣品中檢測(cè)可溶性協(xié)同信號(hào)分子，優(yōu)選可溶性PD-l和/或其配體，所述的配體優(yōu)選PD-Ll。所述的液體樣品為血清，血漿，滑膜液，尿液，或乳汁，其中優(yōu)選使用血清或滑膜液。可以用本領(lǐng)域常規(guī)的方法檢測(cè)液體樣品中的可溶性協(xié)同信號(hào)分子，優(yōu)選使用抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)方法，即通過將樣品中的可溶性協(xié)同信號(hào)分子與己知的該信號(hào)分子的抗體結(jié)合來判斷樣品中是否存在該可溶性協(xié)同信號(hào)分子。更佳地選用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中通過以下步驟進(jìn)行檢測(cè)(a)將人PD-1或人PD-Ll抗體包被ELISA板;(b)加入液體樣品使形成可溶性人PD-1與人PD-1抗體復(fù)合物或可溶性人PD-L1與人PD-Ll抗體復(fù)合物I;(c)加入酶標(biāo)記的羊/或鼠抗人PD-1抗體或抗人PD-Ll抗體使產(chǎn)生帶酶標(biāo)記的雙抗體夾心復(fù)合物II;(d)加入底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，根據(jù)0D值判斷、檢測(cè)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中通過以下步驟進(jìn)行檢測(cè)(a)將人PD-1或人PD-Ll抗體包被ELISA板；(b)加入液體樣品使形成可溶性人PD-1與人PD-1抗體復(fù)合物或可溶性人PD-Ll與人PD-Ll抗體復(fù)合物I;(c)加入羊/或鼠抗人PD-1抗體或抗人PD-L1抗體使產(chǎn)生雙抗體夾心復(fù)合物II;(d)加入酶標(biāo)記的鼠抗羊或羊抗鼠抗抗體使產(chǎn)生帶酶標(biāo)記的復(fù)合物III;(e)加入底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，根據(jù)0D值判斷、檢測(cè)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，在羊/或鼠抗人PD-1抗體或抗人PD-L1抗體上標(biāo)記生物素，再與酶標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合用于檢測(cè)。所述的人PD-1或人PD-L1抗體是本領(lǐng)域常用的，優(yōu)選多克隆抗體。所述的多克隆抗體可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制得。所述的羊/或鼠抗人PD-1抗體或抗人PD-Ll抗體是本領(lǐng)域常用的，優(yōu)選單克隆抗體。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256:495，1975;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人，Eur.J".Immunol.6:292,1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.，1981)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可以定性，也可以定量。輔助性檢獮類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑本發(fā)明提供了一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1或其配體的試劑。所述的試劑是一固定有抗PD-1或其配體的抗體的固相載體。所述的固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，即通常所稱的ELISA板。其材料可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，包括(但不限于)聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺，纖維素等。其形狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，包括(但不限于)微量滴定板、小珠和小試管等。其中優(yōu)選聚苯乙烯微量滴定板。所述的微量滴定板可以是單孔或多聯(lián)孔條。所述的PD-1或PD-Ll的抗體用于包被固相載體，優(yōu)選羊抗人PD-1或羊抗人PD-L1的抗體，它們可以是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體，例如R&DSystems公司的產(chǎn)品?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行抗體包被，優(yōu)選的方法是將人PD-1或人PD-L1抗體用包被緩沖液制成濃度為1-10ug/ml的溶液，加于固相載體表面，4'C放置1824小時(shí)或37"C保溫2小時(shí)后用洗滌緩沖液將未吸附在固相載體表面的抗體洗去；然后加入封閉液。所述的包被緩沖液選用(但不限于)pH9.6的碳酸鹽緩沖液，pH7.2的磷酸鹽緩沖液，pH7-8的Tris-HCL緩沖液。所述的洗滌緩沖液選用(但不限于)含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液。所述的封閉液選用(但不限于)胎牛血清，羊血清或兔血清。輔助性檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑盒本發(fā)明提供了一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1或其配體的試劑盒。所述的試劑盒包括固相載體，PD-1的抗體或PD-L1的抗體,酶標(biāo)記的不同種屬抗ra-1或抗PD-Ll抗體，底物。所述的固相載體在ELISA測(cè)定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)，即通常所稱的ELISA板。其材料可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，包括(但不限于)聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺，纖維素等。其形狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，包括(但不限于)微量滴定板、小珠和小試管等。其中優(yōu)選聚苯乙烯微量滴定板。所述的微量滴定板可以是單孔或多聯(lián)孔條。所述的PD-1或PD-Ll的抗體用于包被固相載體，優(yōu)選羊人PD-1或羊人PD-Ll的抗體，它們可以是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體，例如R&DSystems公司的產(chǎn)口叩o可以用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行抗體包被，優(yōu)選的方法是將人PD-1或人PD-Ll抗體用包被緩沖液制成濃度為l-10ug/ml的溶液，加于固相載體表面，4'C放置1824小時(shí)或37X:保溫2小時(shí)后用洗滌緩沖液將未吸附在固相載體表面的抗體洗去；然后加入封閉液。所述的包被緩沖液選用(但不限于)pH9.6的碳酸鹽緩沖液，pH7.2的磷酸鹽緩沖液,pH7-8的Tris-HCL緩沖液。所述的洗滌緩沖液選用(但不限于)含0.05%吐溫20的磷酸緩沖液。所述的封閉液選用(但不限于)胎牛血清，羊血清或兔血清。本發(fā)明試劑盒可包括鼠/羊抗人PD-1抗體或人PD-Ll抗體作為與液體樣品反應(yīng)的抗體。所述的反應(yīng)用抗體上可帶有酶標(biāo)識(shí)構(gòu)成所述的酶標(biāo)識(shí)的非人種屬抗人PD-1或抗人PD-Ll抗體。所述的非人種屬抗體是單克隆或多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。本發(fā)明可以將酶標(biāo)識(shí)在羊抗鼠或鼠抗羊的抗體上。本發(fā)明還可以在鼠/羊抗人PD-1抗體或人PD-Ll抗體上標(biāo)記生物素，再與酶標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合用于檢測(cè)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域所熟知的酶，例如(但不限于)辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)，堿性磷酸酶(alkalinephosohatase，AP)，葡萄糖氧化酶和e-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中優(yōu)選服P。本發(fā)明試劑盒包含本領(lǐng)域熟知的底物，包括(但不限于)鄰苯二胺(0-phenylenediamine,0PD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5，5'-tetraraethylbenzidine，TMB),2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2，-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)，ABTS]，3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phe由propionicacid,HPPA]，X寸石肖基苯磷酸酉旨(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)等，其中優(yōu)選TMB。使用的底物緩沖液是本領(lǐng)域熟知的，例如(但不限于)PH5.0磷酸鹽檸檬酸，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，用該底物緩沖液配制TMB使用液，使用液中含有TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml，底物緩沖液(ffl5.5)10ml，0.75%H20232"1。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，試劑盒還包括酶催化的顯色反應(yīng)的終止液，終止液的pH1-6，優(yōu)選2NH2S04,或1%十二烷基硫酸鈉。本發(fā)明的試劑盒還可以包括陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品。所述的陰性對(duì)照品為不含PD-1或PD-Ll的液體，可以是(但不限于)以復(fù)鈣人血槳(recalcifiedhumanplasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似；或正常人血清。所述的陽性對(duì)照品以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的陽性對(duì)照品為重組人PD-l或PD-L1嵌合體。本發(fā)明提供的試劑盒可用于定性，也可用于定量檢測(cè)。用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以按本領(lǐng)域熟知的方法，一種優(yōu)選的方法包括步驟(1)將人PD-1或人PD-Ll的多克隆抗體包被ELISA板，37。C過夜，用洗滌緩沖液洗板，加入封閉液后再洗板；(2)在不同的孔內(nèi)分別加入正常人血清，樣品血清或滑膜液和人H3-1或人PD-L1融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，37"C孵育2小時(shí)，洗板；(3)加入反應(yīng)抗體，即鼠抗人PD-1單克隆抗體或鼠抗人PD-Ll單克隆抗體，37。C孵育2小時(shí)，洗板；(4)加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(針對(duì)人Ig的抗體己吸收)，37。C孵育2小時(shí)，洗板；(5)加入TMB底物顯色后加入終止液終止反應(yīng)；(6)在酶標(biāo)儀上讀出0D值。定量測(cè)定時(shí)，將人PD-1或人PD-Ll融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋的濃度與對(duì)應(yīng)的OD值作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品的量。在另一優(yōu)選例中，上述步驟(3)和(4)變?yōu)?3')加入生物素標(biāo)記的反應(yīng)抗體，即鼠抗人PD-1單克隆抗體或鼠抗人PD-L1單克隆抗體，37'C孵育2小時(shí)，洗板；(4')加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37'C孵育2小時(shí)，洗板。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、首次建立了在液體樣品中檢測(cè)可溶性PD-1及其配體的方法，并首次證實(shí)了人體內(nèi)存在可溶性PD-1和可溶性PI)-L1;2、本發(fā)明提供的方法可作為體外輔助檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的有效手段而用于臨床檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室研究；3、本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可以利用現(xiàn)有設(shè)備(如酶標(biāo)儀)，成本低廉，適于推廣。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l檢測(cè)可溶性協(xié)同信號(hào)分子美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)1987年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)l.晨僵至少1小時(shí)(26周)。2.3個(gè)或3個(gè)以上關(guān)節(jié)腫&6周)。3.對(duì)稱性關(guān)節(jié)腫(^6周)。4.腕、掌指、近端指關(guān)節(jié)腫脹&6周)。5.皮下結(jié)節(jié)。6.手X線改變(至少有骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)間隙狹窄)。7.類風(fēng)濕因子陽性(滴度>1:20)。以上7項(xiàng)中具備4項(xiàng)或四項(xiàng)以上即可診斷。材料和方法l材料淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM(AXIS-SHIELD);小鼠抗人單抗anti-CD4-PercP,anti-CD4-FITC，anti-CD8-FITC,anti-CD14-FITC，anti-CTLA-4-APC，anti-PD-l-FITC,anti國CD80-PE，anti-PD-Ll-PE-CY7及相應(yīng)同型對(duì)照抗體(BDBioscience);RneasyMiniKit(Qiagen);SensiscriptRTKit(Qiagen);人可溶性CTLA陽4ELISA試劑盒(BenderMedSystems);人可溶性CD80ELISA試劑盒(BenderMedSystems);重組人細(xì)胞因子IFN-y、IL-IO、TNF-a(R&DSystems);CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞分選試劑盒(DynalBiotech);抗人CD3和CD28單抗"Bioscience);[3H]-TdR(上海原子核研究所)；人CTLA-4、PD墨1、BTLA、CD28、ICOS、C腦、CD86、PD-L1、PD-L2、ICOSL、fulllengthPD-l(flPD陽l)、PD-ldeleteexon3(PD-lAex3)、PD-ldeleteexon2(PD-lAex2)、PD-ldeleteexon2，3(PD-lAex2，3)熒光定量PCR引物(Invitrogen);ELISA檢測(cè)抗體及相關(guān)試劑；SYBRGreen(ABI)等。2實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀FACSAria(BectonDickinson);低溫高速離心機(jī)(BECKMAN);c02培養(yǎng)箱(Heraus，Germany);實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI);分光光度計(jì)(BECKMAN);DY-A型電泳儀；凝膠掃描成像系統(tǒng)(UVP-GDS8000);酶標(biāo)儀(SpectraMax250);多頭收集儀(TOMTECHarvester96);e液閃儀(PerkinElmer);紫外核酸分析儀(BECKMAN);高速低溫離心機(jī)(Eppendorf);倒置顯微鏡(Nikon);超凈臺(tái)等。3病例和樣本本發(fā)明包括95例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者，為上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科、內(nèi)科門診或住院患者。所有病例均符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的ACR標(biāo)準(zhǔn)?；颊吣挲g54士15歲；性別男24/女71;病程15±12年。從其中37例患者獲得滑膜液和全血標(biāo)本，另外58例獲取滑膜液和血清標(biāo)本用于ELISA檢測(cè)。采用30例OA患者(年齡64±17歲；性別男12/女18;病程9±4年)滑膜液和全血標(biāo)本作為對(duì)照(上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海市第六人民醫(yī)院)。所有標(biāo)本均采集自2個(gè)月內(nèi)未服用激素和免疫抑制劑的患者。采用50例健康志愿者外周血標(biāo)本分離單個(gè)核細(xì)胞和血清作正常對(duì)照組。滑膜液標(biāo)本通過滑膜腔穿刺或關(guān)節(jié)手術(shù)無菌獲得，肝素抗凝，經(jīng)350g離心3min,收集上清并保存于-80。C冰箱。外周血或滑膜液單個(gè)核細(xì)胞通過LymphoprepTM分離獲得。4外周血及關(guān)節(jié)滑膜液單個(gè)核細(xì)胞制備采用淋巴細(xì)胞分離液LymphoprepTM密度梯度離心法從抗凝全血和關(guān)節(jié)滑膜液分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC;synovialfluidmononuclearcell,SFMC)，2%FCS/PBS洗滌2次，備用。5T細(xì)胞和單核細(xì)胞亞群的分離及鑒定5.1采用Dynabeads陽選分離CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說明書操作，過程簡述如下(1)重懸混勻Dynabeads溶液；(2)取72pl已接CD4或CD8單抗的Dynabeads(分選CD14+單核細(xì)胞則加25^tlCD14單抗包被的Dynabeads)并用lml0.1%BSA/PBS洗滌1次；(3)加入1ml單個(gè)核細(xì)胞懸液(lxl07/1111),置于旋轉(zhuǎn)搖床4°C孵育20min;(4)將Eppendorf管置入MPC-S磁場(chǎng)(DynalBiotech)孵育3min;(5)棄上清，用0.in/。BSA/PBS洗滌磁珠結(jié)合細(xì)胞3次，目的細(xì)胞結(jié)合在磁珠上。5.2采用Dynabeads(DynalBiotech)陰選分離CD4+T細(xì)胞步驟如下(1)"107單個(gè)核細(xì)胞重懸于lOOplBufferl(含有2mMEDTA的0.1%BSA/PBS);(2)力n20|ilFCS，20planti-CD14，anti-CD16,anti-CD56,anti-CDw123,anti-CD36，anti-CD8，anti-CD19，anti-Glycophorin的抗體混合物，4°C孵育20min;(3)加入2mlBufferl，混勻，4°C300g離心8min，棄上清；(4)細(xì)胞重懸于900^1Bufferl，力[]100預(yù)先洗滌的Dynabeads，室溫孵育15min;(5)加入lmlBufferl，混勻，均分為兩等份，分別移入新的Eppendorf管中；(6)將Eppendorf管置入MPC-S磁場(chǎng)(DynalBiotech)孵育3min;(7)吸取上清，移至新的無菌Eppendorf管中；(8)重復(fù)步驟(5)-(8)1次，收集上清，其中含有分離得到的CD4+T細(xì)胞。5.3分離細(xì)胞的鑒定取部分陰選CD4+T細(xì)胞以及陽選分離得到的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞，去除Dynabeads，計(jì)數(shù)，取2x105細(xì)胞分別與FITC標(biāo)記的CD4單抗、CD8單抗或CD14單抗(BDBioscience)冰上孵育20min，用2%FCS/PBS洗滌2次，加30(Htl1%多聚甲醛固定，F(xiàn)ACS檢測(cè)。結(jié)果表明分離得到的各細(xì)胞亞群純度均大于97%。陽選分離得到的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞分別用35(HdRLT裂解，用于下游RNA抽提，cDNA合成以及熒光定量PCR分析。陰選分離得到的CD4+T細(xì)胞用于細(xì)胞培養(yǎng)。6細(xì)胞因子對(duì)協(xié)同信號(hào)分子的誘導(dǎo)作用健康人PBMC以lxl06/ml接種在24孔板中，在含有100U/ml青霉素、10(Hig/ml鏈霉素、10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，試驗(yàn)組分別加入不同濃度的重組人IFN-y、IL-10或TNF-a(R&DSystems),設(shè)置培養(yǎng)基對(duì)照組，37°C，5%C02培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞，分選CD4+T細(xì)胞或CD14+單核細(xì)胞，抽提RNA，用于熒光定量PCR檢測(cè)各種協(xié)同信號(hào)分子的mRNA水平，并選擇濃度為25ng/ml的各細(xì)胞因子刺激組及對(duì)照組單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。7T細(xì)胞活化后PD-1mRNA不同長度剪切體的表達(dá)豐度檢測(cè)分離得到的RA、OA患者SFMC、PBMC以及正常人PBMC以2xl()5/孔密度接種在96孔板中，在含有1pg/ml抗CD3單抗(cloneOKT-3,eBioscience)和0.05|ag/ml抗CD28單抗(cloneCD28.2,eBioscience)，100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素，10%FCS的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，設(shè)置不加抗體對(duì)照組。收集細(xì)胞，抽提RNA,用于熒光定量PCR檢測(cè)全長PD-l(flPD-l)，PD-1deleteexon3(PD-lAex3)，PD-1deleteexon2(PD-lAex2),PD-1deleteexon2,3(PD-lAex2，3)等PD-1分子mRNA不同長度剪切體的表達(dá)豐度。8RNA抽提使用Qiagen公司RneasyMiniKit抽提PBMC、SFMC總RNA，步驟如下細(xì)胞加入350pl裂解液(RLT)反復(fù)吹打裂解加入等體積35(HU70%乙醇，混勻吸出700nl樣品至Rneasyminicolumn,放在2ml收集管上^8000g(210000rpm)，15s離心，倒去收集管中液體(如果樣品超過70(^1，再重復(fù)一次)加入350nlRWlS8000g(Sl0000rpm)，15s離心，倒去收集管中液體加入80nlDNA酶，室溫15mini加入350nlRWlS8000g(^雨00rpm)，15s離心，棄去收集管將Rneasyminicolumn放在新的2ml收集管上，加入500nlRPE(工作濃度)28000g&10000rpm)，15s離心，倒去收集管中液體加入500nlRPE(工作濃度)28000g&10000rpm),2min離心，棄去收集管將Rneasyminicolumn放在新1.5ml收集管上加入30-50|xlRnase-free水^8000g(^10000rpm)，lmin離心，收集管中液體，測(cè)OD值紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度和純度9cDNA合成使用Qiagen公司的SensiscriptRTKit,按照說明書操作，簡述如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>逆轉(zhuǎn)錄酶1.0無RNA酶的水可變RNA模板(〈50ng)可變總體積2037。C孵育60分鐘，93。C孵育5分鐘,離心，-20°C保存cDNA。IO熒光定量PCR檢測(cè)CTLA-4、PD-1、BTLA、CD28、ICOS、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2禾卩ICOSL基因的引物設(shè)計(jì)使用AppliedBiosystems的PrimeExpress2.0軟件，flPD-1、PD-lAex3、PD-lAex2、PD-lAex2，3引物設(shè)計(jì)序列如下(S叫.ID.No.l-30):基因熒光定量PCR特異性引物序列基因Seq.ID.No.序列(5，-3，)GAPDH1上游引物GTGAAGGTCGGAGTCAACG2下游弓l物TGAGGTCAATGAAGGGGTCCTLA-43上游引物TGCTTGATTGCGTGGAATTG4下游弓l物CCACCAGCTGTGGCTTCCTPD-1上游引物CAGTGGCATCCCGAAACG6下游引物CACAGCCAGGAGCTCTTCTGACD28上游弓1物CCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA8下游弓l物GGCTTAGAAGGTCCGGGAAAICOS9上游弓l物GCACGACCCTAACGGTGAATAC10下游引物TGGGTGCCAGAGTTCCATATTACD8011上游引物GTGTTATCCACGTGACCAAGGA12下游引物TTGCCAGTAGATGCGAGTTTGTCD8613上游引物TGCCATGCCAATTTGCAA14下游引物GCCTAAGTATACCTCATTCAGAACCAAPD-L115上游弓i物CTTCAAGCAGGGATTCTCAACCT16下游引物TAAGTCCCACATTGCCTGCATPD丄217上游引物GAATTGCAGCTTCACCAGATAGC18下游引物AAGTTGCATTCCAGGGTCACAICOSL19上游引物CTGGGCCTTTAGGTGAATGTG20下游引物AATGCCCGGTGATGACAACTflPD-l21上游引物CTCAGGGTGACAGAGAGAAG22下游引物GACACCAACCACCAGGGTTTPD-lAex323上游弓1物AGGGTGACAGGGACAATAGG24下游引物CCATAGTCCACAGAGAACACPD-lAex225上游引物GGTTCTTAGAGAGAAGGGCA26下游引物GACACCAACCACCAGGGTTTPD-lAex2，327上游引物TGGTTCTTAGGGACAATAGG28下游引物:TCTTCTCTCGCCACTGGAAABTLA29上游弓l物AGCCACTCAACAACTCTTTATGTGA30下游引物:TTGCCACTTCGTCCTTGGA基因表達(dá)采用熒光定量PCR方法，內(nèi)參用GAPDH基因，H20為陰性對(duì)照,反應(yīng)體系l:5稀釋的cDNA模板4.85pl熒光定量PCR引物(上游引物、下游引物各5pM)0.15|al2xSYBRGreenPCR緩沖體系(AppliedBiosystems)5pl總體積10nl加入384孔PCR反應(yīng)板，反應(yīng)在ABI7900S叫uenceDetectionSystem中進(jìn)行，反應(yīng)過程如下50°C2分鐘▼95°C10分鐘95°C15秒1、0個(gè)循環(huán)或50個(gè)循環(huán)*60°C1分鐘，*測(cè)定flPD-l、PD-lAex3、PD-lAex2、PD陽lAex2,3mRNA不同長度剪切體循環(huán)50次。目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-(關(guān)基因"—GAPDHCT)(cr:循環(huán)閾值)。11流式細(xì)胞術(shù)(FACS)5xl0Mxl()S細(xì)胞重懸在50pl含有2%FCS/PBS中，加入適量目的分子的熒光標(biāo)記抗體或同型對(duì)照，混勻后室溫避光孵育30min，力卩2%FCS/PBS2ml，混勻后300g離心8min，棄上清，重復(fù)洗1遍。細(xì)胞重懸于300^12%FCS/PBS中，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CTLA-4分子因容易被內(nèi)吞，需要進(jìn)行穿膜染色，細(xì)胞在4%多聚甲醛中室溫固定20min，300g離心8min，棄上清，細(xì)胞用500^12°/。FCS/0.5%saponin/PBS重懸，室溫孵育10min，離心，去上清，加入5(^12%FCS/0.5%saponin/PBS以及10pl抗人CTLA-4單抗室溫孵育lh，洗1遍，用30(Hil1%多聚甲醛重懸細(xì)胞。運(yùn)用FACS-AriaTM上機(jī)分析。12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清和滑膜液中可溶性協(xié)同信號(hào)分子可溶性CTLA-4、PD-1和PD-L1(sCTLA隱4、sPD-l和sPD-Ll)ELISA主要試劑見表1。其它試劑包括PBS:NaCi8.00g，KCl0.20g,Na2HPO4xl2H2O，KH2PO40.20g;洗液(WashBuffer):0.05%Tween20/PBS;封閉液(BlockingBuffer):0.5%BSA/0.05%Tween/PBS;TMB底物；終止液2NH2S04。表1可溶性CTLA-4、PD-1和PD-LIELISA檢測(cè)主要試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>具體操作步驟(1)包板加包被抗體100nl/孔，37°C，過夜；(2)洗板加300i^l洗液/孔，洗板，x2次;(3)封閉加250nl封閉液/孔，室溫孵育2h;(4)洗板:加300nl洗液/孔，洗板，x3次;(5)加樣品(1:2稀釋)和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品100nl/孔，設(shè)置雙復(fù)孔，37°C，孵育2h;(6)洗板加300nl洗液/孔，洗板，x3次;(7)加入反應(yīng)抗體lOO^il/孔，37°C,孵育2h;(8)洗板:加30(Hd洗液/孔，洗板，x3次;(9)加入鏈霉素-HRP或抗體-HRP，370C，避免光線直射，孵育lh;(10)洗板加300^1洗液/孔，洗板，x6次；(11)加入TMB底物100^1/孔，避光顯色；(12)加入終止液100pil/孔，終止反應(yīng)；(13)讀數(shù)酶標(biāo)儀(Bio-RadLaboratories)上讀出OD值(測(cè)量波長450nm，參考波長540nm或620nm)。人可溶性CD80(sCD80)采用humansC80InstantELISAKit(BenderMedsystems)檢測(cè)，步驟簡述如下(1)加15(Hll雙蒸水到標(biāo)準(zhǔn)品孔中(梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品己包被于孔中)；(2)加雙蒸水到空白孔中；(3)力卩l(xiāng)OOpl雙蒸水到樣品孔中(已包被anti-humansCD80mAb,HRP-Conjugate-anti-SCD80mAb以及樣品稀釋成份，均為干凍粉劑)；(4)加5(Hil滑膜液或血清到樣品孔中，雙復(fù)孔，封膜，室溫孵育3h;(5)加400^1洗液/孔，洗板，x3次;(6)加入TMB底物100^1/孔，避光顯色10min;(7)加入終止液100pl/L,終止反應(yīng)；(8)讀數(shù)酶標(biāo)儀(Bio-RadLaboratories)上讀出OD值(測(cè)量波長450畫，參考波長620nm)，該試劑盒檢測(cè)低限值為0.32ng/ml。13可溶性PD-1、PD-L1功能試驗(yàn)健康人外周血CD4+T細(xì)胞(4xl04/孔)、4000Gry照射的PBMC(2xloV孔，作為APC)接種到抗CD3單抗(lpg/ml)預(yù)先包被的96孔板中，在含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，加或不加梯度濃度的人PD-l-Ig、PD-Ll-Ig、controlIg(Ong/ml，0.2pg/ml,lpg/ml，5pg/ml，25^g/ml)，在37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)4天，收集細(xì)胞前18h時(shí)加入lpCi[3H]，收集細(xì)胞，e液體閃爍儀檢測(cè)[3H]的摻入量，分析PD-l-Ig，PD-Ll-Ig對(duì)CD4+T細(xì)胞活化增殖的影響。14統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照基因表達(dá)水平采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩組之間的差別采用Student'st檢驗(yàn)，在進(jìn)行U檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)之前預(yù)先采用單因素ANOVA分析。p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1協(xié)同抑制分子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜液浸潤T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高從23例RA患者、10例OA患者外周血和滑膜液以及22份健康人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，運(yùn)用熒光定量PCR方法分析包括CTLA-4、PD-1、BTLA、CD28、ICOS、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2以及ICOSL等分子在內(nèi)的CD28家族協(xié)同分子mRNA表達(dá)水平。見圖1。結(jié)果表明，與健康人及OA對(duì)照組相比較，協(xié)同抑制分子包括CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2以及CTLA-4的配體CD80等分子的mRNA在RA患者滑膜液浸潤單個(gè)核細(xì)胞中選擇性的表達(dá)升高，其中CTLA-4和PD-1mRNA水平較健康人對(duì)照分別升高了11.9倍、5.1倍；較OASFMC分別升高了3.3倍、1.5倍。它們相應(yīng)的配體CD80和PD-L1mRNA較對(duì)照組也顯著升高(圖1A)，而CD28、ICOS、CD86以及ICOSL等表達(dá)無明顯變化趨勢(shì)(圖1B)。CTLA-4和PD-1信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答，維持機(jī)體外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用，因此發(fā)明人進(jìn)一步研究這些協(xié)同信號(hào)分子在免疫細(xì)胞亞群的表達(dá)情況。發(fā)明人分選出9例1^患者外周血和滑膜液中的€04+、008+1細(xì)胞亞群以及€014+巨噬細(xì)胞，熒光定量PCR分析結(jié)果表明，CTLA-4和PD-1mRNA在RA患者滑膜液浸潤C(jī)D4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)均升高，并且CTLA-4mRNA高表達(dá)于滑膜液浸潤C(jī)D4+T細(xì)胞，而CD80和PD-L1mRNA在滑膜液浸潤C(jī)D14+巨噬細(xì)胞表達(dá)顯著升高(圖ic)。發(fā)明人進(jìn)一步運(yùn)用FACS研究分析協(xié)同抑制分子在RA患者滑膜液浸潤免疫細(xì)胞的表達(dá)情況(因?yàn)镃TLA-4分子在細(xì)胞膜表面表達(dá)后很快被內(nèi)吞，所以同時(shí)還進(jìn)行了穿膜染色，標(biāo)識(shí)為iCTLA-4，膜表面表達(dá)的CTLA-4標(biāo)識(shí)為sCTLA-4)，與熒光定量PCR結(jié)果相一致。結(jié)果表明，ctla-4、pd-1分子在滑膜液浸潤cd4+t細(xì)胞表達(dá)顯著升高，而相應(yīng)配體CD80和PD-L1在滑膜液浸潤C(jī)D14+巨噬細(xì)胞表面表達(dá)也增高(圖2A,B)。發(fā)明人還運(yùn)用熒光定量PCR研究了另外一種負(fù)性調(diào)節(jié)分子Fas的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Fas分子mRNA在RA患者外周血和滑膜液浸潤單個(gè)核細(xì)胞表面表達(dá)升高(圖3A)，而且Fas在RA患者滑膜液浸潤C(jī)D4+T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平顯著高于CD8+T細(xì)胞以及外周血T細(xì)胞(圖3B)。發(fā)明人運(yùn)用熒光定量PCR和FACS分析，結(jié)果表明，協(xié)同抑制分子CTLA-4、PD-1、PD-L1等負(fù)性調(diào)控分子以及CD80在RA患者滑澳液漫潤T細(xì)應(yīng)和巨嗛細(xì)胞中表達(dá)顯著增加。這一結(jié)果出人意料，表明機(jī)體在罹患RA后，體內(nèi)的免疫調(diào)控機(jī)制對(duì)過強(qiáng)的免疫應(yīng)答仍然發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。2細(xì)胞因子IFN-y、tnf-a可誘導(dǎo)cd80和pd-l1在單核細(xì)胞的表達(dá)發(fā)明人運(yùn)用在RA患者滑膜液中顯著升高的細(xì)胞因子IFN-y、TNF-a以及IL-10刺激培養(yǎng)健康人PBMC12h，分析CTLA-4、PD-1、CD80和PD-L1等分子的表達(dá)情況。見圖4。如圖4A所示，結(jié)果表明，IFN-y和TNF-a可以劑量依賴方式選擇性的誘導(dǎo)CD80和PD-L1mRNA在CD14+單核細(xì)胞中表達(dá)，而對(duì)CTLA-4和PD-1表達(dá)無明顯影響。IL-10對(duì)協(xié)同抑制分子配體和受體的mRNA表達(dá)均無影響。發(fā)明人進(jìn)一步選擇25ng/ml濃度IFN-y、TNF-a和IL-10刺激健康人PBMC培養(yǎng)12h細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行FACS分析，進(jìn)一步確認(rèn)了IFN-Y和TNF-a可以誘導(dǎo)CD80禾QPD-L1在CD14+單核細(xì)胞表面的表達(dá)(圖4B)。上述細(xì)胞因子在細(xì)胞活化狀態(tài)下也不能誘導(dǎo)CTLA-4禾bPD-1的表達(dá)。3可溶性PD-1在RA患者血清和滑膜液中顯著增高且與類風(fēng)濕因子相關(guān)CTLA-4、PD-1信號(hào)途徑在免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，但出現(xiàn)了CTLA-4和PD-1在RA患者滑膜液浸潤T細(xì)胞表達(dá)增高，相應(yīng)的配體CD80和PD-L1在CD14+巨噬細(xì)胞表面也增加，而t細(xì)胞卻處于持續(xù)活化狀態(tài)這一矛盾現(xiàn)象。發(fā)明人認(rèn)為主要有兩種可能一、存在針對(duì)這些分子的自身反應(yīng)性抗體，封閉了抑制性通路；二、存在可溶性協(xié)同信號(hào)分子如可溶性CTLA-4(solubleCTLA-4，sCTLA-4)、可溶性PD-l(solublePD-l，sPD-l)、可溶性CD80(solubleCD80，sCD80)或PD-L1(solublePD-Ll,sPD-Ll)封閉了抑制性通路。發(fā)明人研究了可溶性協(xié)同信號(hào)分子存在的可能性。發(fā)明人測(cè)定了95例RA患者血清，37例RA患者滑膜液，以及對(duì)照組14例骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者血清，30例OA患者滑膜液，50例健康人血清中sCTLA-4、sPD-l、sCD80以及sPD-Ll的表達(dá)水平。見圖5和表2。圖5A及表2的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，sPD-l、sPD-Ll在RA患者血清和滑膜液中顯著升高，sCD80在RA患者滑膜液和血清中有一定程度升高，未檢測(cè)到sCTLA-4的升高。血清中增高的sPD-l以及sPD-Ll與類風(fēng)濕因子(rheumatoidfactor，RF)存在顯著相關(guān)性，但與C-反應(yīng)蛋白(CReactiveProtein,CRP)以及紅細(xì)胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,ESR)無顯著相關(guān)。sCD80與RF也有相關(guān)性(圖5B-D)。表2血清和滑膜液中可溶性協(xié)同信號(hào)分子的濃度(ng/ml,均值土標(biāo)準(zhǔn)誤)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*與HC及OA對(duì)照組比較p<0.05,#與RASF比較p<0.05,+與RAsera比較p<0.054RA患者體內(nèi)編碼PD-lmRNA的選擇性剪切現(xiàn)象PD-lAex3mRNA剪切體選擇性增加PD-l分子全長mRNA包含exonl(編碼信號(hào)肽)，exon2(編碼胞膜外Ig樣區(qū))，exon3(編碼跨膜區(qū))，exon4禾口5(編碼胞內(nèi)區(qū))(Genebankaccessionnumber:NMJ)05018)。除了全長mRNA(flPD-l)外，還存在幾種不同的剪切體，包括PD-lAex2，PD-lAex3，PD-lAex2，3，PD-lAex2，3，4。PD-lAex2去除了exon2(胞膜外Ig樣區(qū))；PD-lAex3剪切去除了exon3(跨膜區(qū))，但胞膜外Ig樣區(qū)保存完好；PD-lAex2，3則去除了編碼胞膜外Ig樣區(qū)和跨膜區(qū)的序列。因此可以推斷PD-lAex3編碼可溶性PD-1分子。如圖6A所示,在讀碼框未受到影響的三種PD-1mRNA剪切體中，PD-lAex3在RA患者外周血和滑膜液單個(gè)核細(xì)胞中選擇性表達(dá)增高，而其它兩種mRNA剪切體因表達(dá)豐度太低而檢測(cè)不到。發(fā)明人進(jìn)一步檢測(cè)PD-lAex3mRNA在RA患者外周血和滑膜液單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)增高是否與T細(xì)胞活化狀態(tài)有關(guān)。為此，發(fā)明人用抗CD3單抗、抗CD28單抗刺激RA患者PBMC、SFMC、OA患者PBMC、SFMC以及健康人PBMC培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞測(cè)定PD-lAex3mRNA水平。結(jié)果表明單抗刺激活化T細(xì)胞后PD-lAex3mRNA表達(dá)水平并不增加，提示PD-lAex3mRNA表達(dá)水平的增高是RA患者特異性的，RA患者體內(nèi)存在PD-lAex3mRNA的選擇性剪切現(xiàn)象(圖6B)。5可溶性PD-1阻斷PD-1通路介導(dǎo)的抑制信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖發(fā)明人運(yùn)用人PD-卜Ig、PD-Ll-Ig進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)(PD-l-Ig、PD-Ll-Ig分別含有PD-1、PD-L1完整的胞膜外區(qū)，因此能夠很好的模擬可溶性PD-1、可溶性PD-L1的生物學(xué)功能人PD-l-Ig包含的PD-1分子胞膜外區(qū)氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>人PD-Ll-Ig包含的PD-L1分子胞膜外區(qū)氨基酸序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>結(jié)果表明，PD-l-Ig以及PD-Ll-Ig處理組CD4+T細(xì)胞坩殖均顯蕃高于對(duì)照組(圖7)，提示可溶性PD-1、可溶性PD-Ll可分別有效阻斷PD-l信號(hào)通路介導(dǎo)的抑制信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。實(shí)施例2-4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注1、+表示試劑盒中包括該項(xiàng)2、鼠抗人PD-1單克隆抗體購自eBioscience公司，再用本領(lǐng)域熟知的方法標(biāo)記辣根過氧化物酶或生物素試劑盒中還包括磷酸緩沖液(PBS):NaCl8.00g，KC10.20g,Na2HP04X12H20,KH2P04,0.20g;洗滌緩沖液含O.05%Tween20的上述PBS;封閉液含0.5免胎牛血清(BSA)和0.05%Tween的上述PBS;TMB底物；酶催化反應(yīng)終止液2NH2S04;陰性對(duì)照品正常人血清；陽性對(duì)照品重組人PD-1/Fc嵌合體(腿DSystems)。實(shí)施例5-7ELISA試劑盒實(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注1、十表示試劑盒中包括該項(xiàng)2、鼠抗人PD-l單克隆抗體購自eBioscience公司，再用本領(lǐng)域熟知的方法標(biāo)記辣根過氧化物酶或生物素試劑盒中還包括磷酸緩沖液(PBS):NaCl8.OOg,KCl0.20g'Na2HP04X12H20,KH2P04，0.20g;洗滌緩沖液含O.05%Tween20的上述PBS;封閉液含0.5M胎牛血清(BSA)和0.05%Tween的上述PBS;TMB底物；酶催化反應(yīng)終止液2NH2S04;陰性對(duì)照品正常人血清；陽性對(duì)照品重組人PD-Ll/Fc嵌合體(R&DSystems)。實(shí)施例8試劑盒的使用標(biāo)本在測(cè)試者不知道的情況下(單盲)，采用50例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清標(biāo)本(RA-sera)，32例RA患者滑膜液標(biāo)本(RA-SF),22例骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者滑膜液和血清標(biāo)本(OA-SF和OA-sera)和50例健康志愿者血清(HC-sera)。用實(shí)施例2制得的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下-(1)包板每孔加入羊抗人PD-1多克隆抗體IOOW，37°C，過夜；(2)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X2次；(3)封閉每孔加入250W封閉液，室溫孵育2小時(shí)；(4)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X3次；(5)以每孔IO(HU的量將樣品(l:2稀釋)和梯度稀釋的陽性對(duì)照品加入不同的孔內(nèi)，設(shè)置雙復(fù)孔，37°C，孵育2小時(shí)；(6)洗板每孔加入30(Ha洗漆緩沖液，洗板，X3次；.(7)每孔加入鼠抗人PD-1單克隆抗體10(^1，37'C，孵育2小時(shí)；(8)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X3次；(9)每孔加入HRP-羊抗鼠IgG，37°C，避免光線直射，孵育l小時(shí)；(10)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X6次；(11)每孔加入TMB底物IOOW，避光顯色；(12)每孔加入終止液iocmi，終止反應(yīng)；(13)讀數(shù)酶標(biāo)儀(Bio-RadLaboratories)上讀出0D值(測(cè)量波長450nm，參考波長540nm或620nm)。結(jié)果見表3。表3血清和滑膜液中可溶性PD-1的濃度(ng/ml，均值士標(biāo)準(zhǔn)誤)HCseraRAseraRASFOAseraOASFsPD-l0.28±0.033.65±0.41*2.卯±0.63*0.09±0.010.15±0.03*與HC及OA對(duì)照組比較p〈0.05,結(jié)果顯示，實(shí)施例2制得的試劑盒可用于檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1。實(shí)施例9一10試劑盒的使用用實(shí)施例3、4制得的試劑盒重復(fù)實(shí)施例8，得到類似的結(jié)果，表明所制得的試劑盒可用于檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1。實(shí)施例ll試劑盒的使用標(biāo)本在測(cè)試者不知道的情況下(單盲)，采用50例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清標(biāo)本(RA-sera)，32例RA患者滑膜液標(biāo)本(RA-SF)，22例骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者滑膜液和血清標(biāo)本(OA-SF和OA-sera)和50例健康志愿者血清(HC-sera)。用實(shí)施例5制得的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下(1)包板每孔加入羊抗人PD-LI多克隆抗體lOOHl，37°C，過夜；(2)洗板每孔加入30(H4洗滌緩沖液，洗板，X2次；(3)封閉每孔加入250W封閉液，室溫孵育2小時(shí)；(4)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X3次；(5)以每孔的量將樣品(l:2稀釋)和梯度稀釋的陽性對(duì)照品加入不同的孔內(nèi)，設(shè)置雙復(fù)孔，37°C，孵育2小時(shí)；(6)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X3次；(7)每孔加入鼠抗人PD-Ll單克隆抗體10(Ha，37°C，孵育2小時(shí)；(8)洗板每孔加入30(Ha洗滌緩沖液，洗板，X3次；(9)每孔加入HRP-羊抗鼠IgG，37°C，避免光線直射，孵育l小時(shí)；(10)洗板每孔加入300W洗滌緩沖液，洗板，X6次；(11)每孔加入TMB底物IOOW，避光顯色；(12)每孔加入終止液IOOW，終止反應(yīng)；(13)讀數(shù):酶標(biāo)儀(Bio-RadLaboratories)上讀出0D值(測(cè)量波長450nm，參考波長540nm或620nm)。結(jié)果見表4。表4血清和滑膜液中可溶性PD-L1的濃度(ng/ml，均值士標(biāo)準(zhǔn)誤)HCseraRAseraRASFOAseraOASFsPD-Ll0.60±0.083.35士0.54'2.76±0.49*0.57士0.060.46±0.02*與HC及OA對(duì)照組比較p<0.05,,結(jié)果顯示，實(shí)施例5制得的試劑盒可用于檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-L1。實(shí)施例12—13試劑盒的使用用實(shí)施例6、7制得的試劑盒重復(fù)實(shí)施例11，得到類似的結(jié)果，表明所制得的試劑盒可用于檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-L1。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉可溶性協(xié)同信號(hào)分子在檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的用途<130>063942<160>32<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物〈400〉1gtgaaggtcggagtcaacg19<210>2<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>raise—feature<223〉引物<400〉2tgaggtcaatgaaggggtc19<210>3<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400>3tgcttgattgcgtggaattg20<210〉4<211>19<212〉腿<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物〈400〉4ccaccagctgtggcttcct19<210〉5<211>18<212>腿<213〉人工序列<220><221>misc一feature<223〉引物<柳〉5cagtggcatcccgaaacg18<210>6<211>21〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223>引物<400>6cacagccaggagctcttctga21<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400>7cctcctccttacctagacaatgaga25<210〉8<211〉20<212>DNA<213>人工序列<400>8ggcttagaaggtccgggaaa20<210>9<211〉22<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400>9gcacgaccctaacggtgaatac22<210〉10<211〉22<212>腿<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature〈223〉引物<400>10tgggtgccagagttccatatta<210〉11<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉11gtgttatccacgtgaccaagga<210>12<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>12ttgccagtagatgcgagtttgt<210>13<211>18<212>腿<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223>引物<400>13tgccatgccaatttgcaa<210〉14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature說明書第27/33頁222222<223>引物<400>14gcctaagtatacctcattcagaaccaa27<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>15cttcaagcagggattctcaacct23<210〉16<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400>16taagtcccacattgcctgca<210>17<211>23<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400>17gaattgcagcttcaccagatagc23<210〉18<211〉21<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉18aagttgcattccagggtcaca21<210〉19<211〉21<212〉DNA<213〉人丁.序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>19ctgggcctttaggtgaatgtg<210>20<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉20aatgcccggtgatgacaact<210>21<211>20<212>DNA〈213>人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400>21ctcagggtgacagagagaag<210〉22<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈221〉misc一feature<223>引物<400>22gacaccaaccaccagggttt<210〉23<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400>233gggtg織ggg3C助t3gg說明書第29/33頁21202020<210〉24<211〉20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400〉24ccstagtccacagag;aacac20<210>25<211>20<212〉醒〈213〉人工序列<220〉<221〉raise—feature<223〉引物<400〉25ggttcttagagag幼gggca20<210〉26<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<■〉26gacaccaaccaccagggttt20〈210〉27<211〉20<212〉腿<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature〈223>引物<400>27tggttcttagggacaatagg20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223〉引物<400>28tcttctctcgccactggaaa20<210><211><212><213〉<220><221><223〉<400>2925DNA人工序列misc—feature引物29agccactcaacaactctttatgtga25<210〉<211><212〉<213><220><221><223><咖〉3019腿人T.序列raise—feature引物30ttgccacttcgtccttgga<210〉31<211>288<212>PRT<213〉智人<400〉31MetGinliePro1GinAlaProTrpProValValTrpAlaValLeuGin51015LeuGlyTrpArgProGlyTrpPheLeuAspSerProAspArgProTrp202530AsnProProThrPhePheProAlaLeuLeuValValThrGluGlyAsp354045AsnAlaThrPheThrCysSerPheSerAsnThrSerGluSerPheVal505560LeuAsnTrpTyrArgMetSerProSerAsnGinThrAspLysLeuAla65707580AlaPheProGluAspArgSerGinProGlyGinAspCysArgPheArg859095ValThrGinUuProAsnGlyArgAspPheHisMetSerValValArg19100105110AlaArgArgAsnAspSerGlyThrTyrLeuCysGlyAlalieSerLeu115120125AlaProLysAlaGinlieLysG〗.uSerLeuArgAlaGluLeuArgVal130135140ThrGluArgArgAlaGluValProThrAlaHisProSerProSerPro145150155160ArgProAlaGlyGinPheGinThrLeuValValGlyValValGlyGly165170175LeuLeuGlySerLeuValLeuLeuValTrpValLeuAlaVallieCys180.185190SerArgAlaAlaArgGlyThrI]eGlyAlaArgArgThrGlyGinPro195200205LeuLysGluAspProSerAlaValProValPheSerValAspTyrGly210215220GluLeuAspPheGinTrpArgGuLysThrProGluProProValPro225230235240CysValProGluGinThrGluTyrAlaThrlieValPheProSerGly245250255MetGlyThrSerSerProAlaArgArgGlySerAlaAspGlyProArg260265270SerAlaGinProLeuArgProGluAspGlyHisCysSerTrpProLeu275280285<210>32<211>290<212>PRT<213>智人<400>32MetArgliePheAlaGlylieliePheThrAlaCysCys151015ArgAlaPheThrlieThrAlaProLysAspLeuTyrValValGluTyr202530GlySerAsnValThrMetGluCysArgPheProValGluArgGluLeu354045AspLeuLeuAlaLeuValValTyrTrpGluLysGluAspGluGinVal505560lieGinPheValAlaGlyGluGluAspLeuLysPro'GinHisSerAsn65707580PheArgGlyArgAlaSerLeuProLysAspGinLeuLeuLysGlyAsn859095AlaAlaLeuGinlieThrAspValLysLeuGinAspAlaGlyValTyr100105110CysCyslielieSerTyrGlyGlyAlaAspTyrLysArglieThrLeu115120125LysValAsnAlaProTyrArgLyslieAsnGinArglieSerValAsp130135140ProAlaThrSerGluHisGluLeulieCysGinAlaGluGlyTyrPro145150155160GluAlaGluVallieTrpThrAsnSerAspHisGinProValSerGly165170175LysArgSerValThrThrSerArgThrGluGlyMetLeuLeuAsnVal180185190ThrSerSerLeuArgValAsnAlaThrAlaAsnAspValPheTyrCys195200205ThrPheTrpArgSerGinProG〗y(tǒng)GinAsnHisThrAlaGluLeulie210215220lieProGluLeuProAlaThrHisProProGinAsnArgThrHisTrp225230235240ValLeuLeuGlySerlieLeuLeuPheLeulieValValSerThrVal245250255LeuLeuPheLeuArgLysGinValArgMetLeuAspValGluLysCys260265270GlyValGluAspThrSerSerLysAsnArgAsnAspThrGinPheGlu275280285GluThr290權(quán)利要求1.一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-l蛋白或其配體的方法，其特征在于，包括步驟(a)將所述樣品與抗PD-1的抗體或抗PD-1配體的抗體進(jìn)行接觸，從而形成可溶性PD-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物；(b)檢測(cè)可溶性PD-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物，從而確定可溶性PD-1蛋白或其配體的存在與否。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)通過夾心法檢測(cè)可溶性PD-1蛋白-抗體復(fù)合物或可溶性PD-1配體-抗體復(fù)合物。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將PD-1或其配體的抗體包被固相載體，得到包被有PD-1或其配體的抗體的固相載體；(2)在包被有PD-1或其配體的抗體的固相載體上加入液體樣品；(3)加入酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-1或其配體抗體；(4)加入底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)。4.如權(quán)利要求i所述的方法，其特征在于，所述的配體是ra-Li。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PD-1或其配體為人PD-1或其配體。6.如權(quán)利要求1—5任一所述的方法，其特征在于，所述的液體樣品包括血清、血漿、滑膜液、尿液或乳汁等。7.—種抗可溶性PD-l蛋白或其配體的抗體的用途，其特征在于，制備輔助性檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑或試劑盒。8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的試劑是一固相載體，所述的固相載體上固定有抗PD-1或其配體的抗體。9.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的試劑盒包括固相載體，PD-1或其配體的抗體，酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-l或其配體抗體，底物。10.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的配體為PD-Ll。11.一種體外檢測(cè)液體樣品中可溶性PD-1蛋白或其配體的試劑盒，其特征在于，它包括固相載體，PD-1或其配體的抗體，酶標(biāo)記的不同種屬抗PD-1或其配體抗體，底物。12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的固相載體上包被有PD-1或其配體的抗體。13.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的PD-1或其配體的抗體為多克隆抗體。14.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的不同種屬抗人PD-1或其配體抗體為單克隆抗體。15.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。全文摘要本發(fā)明公開了一種測(cè)定液體樣品中可溶性信號(hào)分子方法，并且公開了使用PD-1或其配體的抗體可制備體外輔助檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑和試劑盒。利用本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，首次證實(shí)了人體中可溶性PD-1和可溶性PD-L1的存在。本發(fā)明提供的試劑盒有利于臨床檢驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室研究。文檔編號(hào)G01N33/577GK101122603SQ200610029799公開日2008年2月13日申請(qǐng)日期2006年8月8日優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日發(fā)明者兵萬,臧敬五申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院