專利名稱：一種檢測(cè)19－去甲睪酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)19-去甲睪酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
19-去甲睪酮(19-nortestosterone，NT)是一種合成激素，是具有雄激素作用，屬于合成代謝類類固醇。臨床主要用于治療貧血老年性骨質(zhì)疏松，還能促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育，增加訓(xùn)練耐力和訓(xùn)練負(fù)荷。但其也存在著很嚴(yán)重的副作用，母體攝入會(huì)使女性胎兒男性化，引起生殖性畸形。女性長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生男性化特征，男性長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致過(guò)早禿頂。短期大劑量服用會(huì)導(dǎo)致肝功能障礙，還可能導(dǎo)致癌癥、糖尿病、精神錯(cuò)亂等。因此，加強(qiáng)對(duì)該藥物的檢測(cè)是十分必要的。
檢測(cè)19-去甲睪酮?dú)埩袅康幕瘜W(xué)方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣—質(zhì)聯(lián)機(jī)(GC/MS)、液—質(zhì)聯(lián)機(jī)(HPLC/MS)、毛細(xì)管電泳(CE)等，由于所需儀器設(shè)備復(fù)雜和過(guò)程繁瑣，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)19-去甲睪酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括19-去甲睪酮特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)19-去甲睪酮半抗原；當(dāng)所述包被原為19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)19-去甲睪酮半抗原。
所述19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過(guò)將19-去甲睪酮半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或活性酯法或水溶性碳化二亞胺法(EDC)進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述19-去甲睪酮半抗原是將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)?；磻?yīng)得到的；所述載體蛋白可為卵清蛋白(OVA)、兔血清白蛋白(RSA)或鼠血清白蛋白(MSA)等。
所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選堿性磷酸酯酶；堿性磷酸酯酶標(biāo)記抗抗體可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法如戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法將酶交聯(lián)在抗抗體上；堿性磷酸酯酶標(biāo)記的19-去甲睪酮半抗原可采用混合酸酐法將堿性磷酸酯酶與19-去甲睪酮半抗原偶聯(lián)得到。所述19-去甲睪酮半抗原是將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)?；磻?yīng)得到的。
所述19-去甲睪酮特異性抗體可為19-去甲睪酮單克隆抗體或19-去甲睪酮多克隆抗體；它們均是用19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述19-去甲睪酮單克隆抗體為19-去甲睪酮鼠單克隆抗體，所述19-去甲睪酮多克隆抗體優(yōu)選為19-去甲睪酮兔多克隆抗體。所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體，優(yōu)選為羊抗兔抗抗體。
所述19-去甲睪酮鼠單克隆抗體優(yōu)選為19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的抗體。
19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613已于2006年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)。
以上抗體均可以用19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原按常規(guī)方法制備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白等常用載體蛋白；所述19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過(guò)將19-去甲睪酮半抗原和載體蛋白用活性酯法或混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述19-去甲睪酮半抗原是將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)酰化反應(yīng)得到的。
為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。
所述濃縮洗滌液為0.01M～0.05M、含0.01％疊氮化鈉(Na3N)和1％吐溫80的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明試劑盒的濃縮洗滌液中含有的疊氮鈉在溶液中抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)溶液的穩(wěn)定性其到一個(gè)保護(hù)作用。
當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，所述顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
所述濃縮復(fù)溶液可為含0.5％牛血清白蛋白和0.1％吐溫20、0.01～0.05M的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
所述包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液是含有5％脫脂奶粉的0.01～0.05M磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量；所述終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或氫氧化鈉緩沖液。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)19-去甲睪酮的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織或飼料時(shí)，用均質(zhì)器均質(zhì)動(dòng)物組織樣品或飼料，稱取2g樣品和0.5g抗壞血酸加入到8ml乙腈和2ml 1mol/L氫氧化鈉的混合液中，振蕩混勻，室溫3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，取上清液1ml移置離心管中，加入1ml 1mol/L氫氧化鈉和2ml乙腈，混勻，再加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷與二氯甲烷的體積比為8∶2)振蕩混勻，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍铮?ml的上述的用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物取水相，即可進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為尿液時(shí)，取2ml尿液到離心管中，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘直至清亮，移取1ml尿液到離心管中，加入2ml的乙腈，再加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷與二氯甲烷的體積比為8∶2)混勻，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?ml上述的用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取水相進(jìn)行分析。
2)利用上述檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
其中可作為固定19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或19-去甲睪酮抗抗體的載體物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。其中優(yōu)選為聚苯乙烯制成的微量反應(yīng)板凹孔，其優(yōu)點(diǎn)為聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗原吸附其上后還是保留原來(lái)的免疫活性，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。
本發(fā)明的檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、飼料及尿液等樣品中19-去甲睪酮的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。
將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)?；磻?yīng)合成半抗原，其優(yōu)點(diǎn)在于給19-去甲睪酮接出一個(gè)含4個(gè)碳鏈的間隔臂，突出了19-去甲睪酮分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——睪酮，使制備的19-去甲睪酮抗體對(duì)19-去甲睪酮免疫原或包被原均有很高的識(shí)別能力。再將19-去甲睪酮半抗原采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過(guò)低或過(guò)高都對(duì)免疫不利，半抗原與KLH、RSA和HSA的結(jié)合摩爾比分別為12∶1、17∶1和17∶1。
本發(fā)明的試劑盒可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織、尿樣等樣品中19-去甲睪酮的殘留量。本發(fā)明的檢測(cè)原理是當(dāng)微孔條上預(yù)包被19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和19-去甲睪酮抗體工作液后，樣本中殘留的19-去甲睪酮和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗19-去甲睪酮的抗體，加入酶標(biāo)記物進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止；當(dāng)微孔條上包被抗抗體時(shí)，加入19-去甲睪酮抗體工作液后，再加入系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液和酶標(biāo)半抗原，樣品殘留的19-去甲睪酮和酶標(biāo)半抗原競(jìng)爭(zhēng)抗19-去甲睪酮抗體，顯色；顯色終止后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)，樣本吸光度值與其殘留物19-去甲睪酮的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物19-去甲睪酮的含量。也可根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品溶液顏色的深淺，與系列濃度的19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)液顏色比較判斷樣品中19-去甲睪酮的濃度范圍。
本發(fā)明的檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織及尿液等樣品中19-去甲睪酮的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品；采用高特異性的19-去甲睪酮單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利，檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。


圖1為以19-去甲睪酮抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線2為以抗抗體為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例的方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、以19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備及其檢測(cè)方法以19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有19-去甲睪酮與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液用稀釋液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體稀釋成蛋白濃度為0.1～1μg/L的酶標(biāo)記抗抗體工作液，12ml/瓶，1瓶。稀釋液為含有0.1‰甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％小牛血清，1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)的溶液。
(3)19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液19-去甲睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，3ml/瓶。把19-去甲睪酮稀釋為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液為pH 8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液(4)顯色液顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，7ml/瓶。
(5)19-去甲睪酮鼠單克隆抗體工作液用含有1％BSA的pH 7.9，0.5mol/L磷酸鹽緩沖液將19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的抗體稀釋成蛋白濃度為2.0μg/L使用，12ml/瓶，1瓶。
(6)濃縮洗滌液0.01M～0.05M、含0.1‰(質(zhì)量濃度)疊氮化鈉(Na3N)和1％(質(zhì)量濃度)吐溫80的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液含0.5％牛血清白蛋白和1‰吐溫20、0.01～0.05M的磷酸鹽緩沖液，分為50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的3倍。
(9)包被緩沖液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
(10)封閉液含有5％脫脂奶粉的0.01磷酸鹽緩沖液。
其中，19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物、19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、19-去甲睪酮半抗原的合成方法半抗原的合成將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)?；磻?yīng)合成半抗原。其優(yōu)點(diǎn)在于給19-去甲睪酮接出一個(gè)含4個(gè)碳鏈的間隔臂，突出了19-去甲睪酮分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)——睪酮，使制備的19-去甲睪酮抗體對(duì)19-去甲睪酮免疫原或包被原均有很高的識(shí)別能力。
2、包被原將19-去甲睪酮半抗原和兔血清白蛋白(RSA)采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。
包被原的具體制備方法如下(1)取19-去甲睪酮半抗原2g溶于20ml，0.5M的氫氧化鈉溶液中；(2)再取1.5g碳化二亞胺溶于5ml純水并加到步驟(1)的溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)；(3)取兔血清白蛋白20g溶于75ml pH9.6的碳酸鹽緩沖液并滴加到步驟(2)的溶液中4℃攪拌過(guò)夜，0.1M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次，最后將抗原濃縮或凍干保存。
3、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將19-去甲睪酮與兔血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、19-去甲睪酮鼠單克隆抗體的制備1、免疫原將19-去甲睪酮半抗原和血藍(lán)蛋白(KLH)采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
免疫原的制備方法1)取19-去甲睪酮半抗原2g溶于30ml，50％的N，N-二甲基甲酰胺溶液中；2)再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二噁烷并加到步驟1)溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)；3)取血藍(lán)蛋白32g溶于70ml pH9.6的碳酸鹽緩沖液中并加到步驟2)溶液中4℃攪拌過(guò)夜，然后在0.2M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次，最后將酶標(biāo)記半抗原抗原濃縮或凍干保存。
2、19-去甲睪酮鼠單克隆抗體制備動(dòng)物免疫程序 采用Balb/c小鼠為免疫動(dòng)物，19-去甲睪酮半抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時(shí)將免疫源與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化 取免疫Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，按10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直至得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株-19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的單克隆抗體。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成1×106～5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化 采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，14天后腹腔注射19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613 5×106個(gè)/只，10天后采集腹水。經(jīng)辛酸—飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
三、酶標(biāo)抗抗體的制備以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
羊抗鼠抗抗體和堿性磷酸酯酶采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)，得到堿性磷酸酯酶標(biāo)記的抗抗體。
將羊抗鼠抗抗體與堿性磷酸酯酶進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法優(yōu)選戊二醛法，用堿性磷酸酯酶以2∶1的比例與羊抗兔抗抗體偶聯(lián)，有60％～70％的酶與8％的抗抗體偶聯(lián)，酶標(biāo)記物的產(chǎn)量比使用辣根過(guò)氧化物酶高。
酶標(biāo)羊抗鼠抗抗體具體步驟如下1)稱取堿性磷酸酯酶25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)夜。
2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1min，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以聚己二醇濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
3)取羊抗鼠抗抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
4)用1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3h。
5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2h。
6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。
7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中。
8)將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的19-去甲睪酮的方法如下一、樣品前處理a、動(dòng)物組織和飼料用均質(zhì)器均質(zhì)動(dòng)物組織樣品或飼料，稱取2g樣品和0.5g抗壞血酸加入到8ml乙腈和2ml氫氧化鈉(1mol/L)的混合液中，振蕩10min，3000g以上，15℃，離心10min取上清液1ml移置離心管中，加入1ml氫氧化鈉(1mol/L)和2ml乙腈，振蕩1min加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷與二氯甲烷的體積比為8∶2)振蕩10min，3000g以上，15℃，離心10min去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍镉?ml用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物取水相，取50μl進(jìn)行分析；b、尿液取2ml尿液到離心管中，3000g以上，15℃，離心10min，直至清亮，移取1ml尿液到離心管中，加入2ml乙腈，振蕩1min，加入3ml正己烷和二氯甲烷的混合液(正己烷與二氯甲烷的體積比為8∶2)振蕩10min，3000g以上，15℃，離心10min去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?ml用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μl水相進(jìn)行分析。
二、檢測(cè)方法
a、向19-去甲睪酮與兔血清白蛋白偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液(各2孔)50μl，然后加入19-去甲睪酮鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。
b、倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，用蓋板膜封板，37℃恒溫箱中反應(yīng)30min。
c、取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15-30min。
d、每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀將波長(zhǎng)范圍測(cè)定在400nm波長(zhǎng)處，測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
三、結(jié)果分析所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。
公式中B為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以19-去甲睪酮濃度的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中19-去甲睪酮的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液中19-去甲睪酮的濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為0.1μg/L。
實(shí)施例2、以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備方法以羊抗兔抗抗體作為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒包括(1)包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板；(2)堿性磷酸酯酶標(biāo)記的19-去甲睪酮半抗原工作液將堿性磷酸酯酶標(biāo)記的19-去甲睪酮半抗原稀釋為0.1～1μg/L的工作液，12ml/瓶，1瓶。所用的稀釋液為含有0.1‰甘油(可防止放入-20℃環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1％的硫柳汞防腐劑(便于保存)的溶液。
(3)19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)溶液19-去甲睪酮系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L，3ml/瓶。把19-去甲睪酮稀釋為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液為pH值為8.3，0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
(4)顯色液顯色液為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液，7ml/瓶。
(5)19-去甲睪酮兔多克隆抗體工作液用含有1％BSA的pH 7.9，0.5mol/L磷酸鹽緩沖液將抗體稀釋成蛋白濃度為2.0μg/L使用，12ml/瓶，1瓶。
(6)濃縮洗滌液0.01M～0.05M、含0.1‰(質(zhì)量濃度)疊氮化鈉(Na3N)和1％(質(zhì)量濃度)吐溫80的磷酸鹽緩沖液。40ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的20倍。
(7)終止液2mol/L氫氧化鈉，8ml/瓶，1瓶。
(8)濃縮復(fù)溶液含0.5％牛血清白蛋白和1‰吐溫20、0.01～0.05M的磷酸鹽緩沖液，分為50ml/瓶，1瓶。為正常使用濃度的3倍。
(9)包被緩沖液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。
(10)封閉液磷酸鹽緩沖液和5％脫脂奶粉的以1∶5比例混合的混合物。
其中，羊抗兔抗抗體包被原、19-去甲睪酮兔多克隆抗體、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的19-去甲睪酮半抗原的制備方法如下一、酶標(biāo)板的制備1、包被原的制備以兔源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。
2、包被有羊抗兔抗抗體的酶標(biāo)板制備方法用包被緩沖液將羊抗兔抗抗體稀釋成1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液(濃縮洗滌液用去離子水稀釋19倍)洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
二、19-去甲睪酮兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以免疫原(19-去甲睪酮半抗原與和血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物)免疫劑量為1mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的福氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3～4周取相同劑量免疫原加等量福氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7～10d后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。
三、酶標(biāo)半抗原的制備堿性磷酸酯酶標(biāo)記半抗原的制備19-去甲睪酮半抗原的制備同實(shí)施例1中的19-去甲睪酮半抗原制備方法。
酶標(biāo)半抗原制備采用混合酸酐法將堿性磷酸酯酶與19-去甲睪酮半抗原偶聯(lián)得到酶標(biāo)記19-去甲睪酮半抗原。
具體方法如下1)取19-去甲睪酮半抗原2g溶于30ml 50％(質(zhì)量百分含量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中；2)再取0.5ml氯甲酸異丁酯溶于5ml無(wú)水二噁烷中，然后加到步驟1)得到的溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)；3)取堿性磷酸酯酶32g溶于70ml pH9.6的碳酸鹽緩沖液中，然后加到步驟2)得到的溶液中4℃攪拌過(guò)夜，然后在0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次得到酶標(biāo)記19-去甲睪酮半抗原，最后將酶標(biāo)記半抗原濃縮或凍干保存。
利用該試劑盒檢測(cè)樣品中殘留的19-去甲睪酮的方法如下樣品前處理的具體步驟同實(shí)施例1中的樣品前處理步驟檢測(cè)方法a、向羊抗兔抗抗體包被的酶標(biāo)板微孔中加入19-去甲睪酮兔多克隆抗體工作液100μl，37℃反應(yīng)30min。
b、倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl及堿性磷酸酯酶標(biāo)記的19-去甲睪酮半抗原工作液50μl，37℃反應(yīng)30min。
c、倒出孔中液體，重復(fù)洗板步驟，加入底物顯色液100μl，輕輕振蕩混勻，37℃恒溫箱避光顯色15～30min。
d、每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀將波長(zhǎng)范圍設(shè)定在400nm波長(zhǎng)處，測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
結(jié)果分析的方法同實(shí)施例1中的結(jié)果分析方法，該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2所示。結(jié)果分析表明，制備的試劑盒整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.5小時(shí)就可以完成，最低檢測(cè)限為0.1μg/L。
實(shí)施例3、試劑盒精密度、準(zhǔn)確度和保存期試驗(yàn)1、試劑盒精密度試驗(yàn)(1)標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批試劑盒抽取10個(gè)試劑盒，再?gòu)拿總€(gè)試劑盒的酶聯(lián)板中各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.9μg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值(OD值)，計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.4％～10.9％之間。符合精密度小于15％的要求。
表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在5.9％～10.6％之間。符合精密度小于15％的要求。
表2標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)

(2)樣本可重復(fù)性試驗(yàn)每個(gè)雞肉樣品、飼料樣品、尿樣樣品按25μg/kg濃度添加19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，分別取實(shí)施例1和實(shí)施例2中制備的三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表3-表5所示，結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于22％，飼料樣本的變異系數(shù)均低于20％，尿樣本的變異系數(shù)均低于18％。符合變異系數(shù)小于25％的要求。
表3雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表4飼料樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表5尿樣樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

實(shí)施例2中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表6-表8所示，結(jié)果表明雞肉樣本變異系數(shù)均低于20％，飼料樣本的變異系數(shù)均低于20％，尿樣本的變異系數(shù)均低于20％。
表6雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


表7飼料樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表8尿樣樣品可重復(fù)性試驗(yàn)


2、試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定每個(gè)雞肉樣品、飼料樣品、尿樣樣品分別按25μg/kg濃度、按50μg/kg濃度添加19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)品，分別利用實(shí)施例1或?qū)嵤├?的試劑盒按照實(shí)施例1或?qū)嵤├?的方法檢測(cè)常山酮，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算準(zhǔn)確度。實(shí)施例1的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表9所示，結(jié)果表明雞肉添加的準(zhǔn)確度在71.9％-103.2％之間，飼料添加準(zhǔn)確度在82.4％-112.4％之間，尿液添加準(zhǔn)確度在67.5％-108.7％之間。
表9實(shí)施例1的試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn) μg/kg(L)

實(shí)施例2的試劑盒測(cè)定結(jié)果如表10所示，結(jié)果表明雞肉添加的準(zhǔn)確度在68.5-96.4之間，飼料添加準(zhǔn)確度在65.2-102.3之間，尿液添加準(zhǔn)確度在73.5-101.3之間。
表10實(shí)施例2的試劑盒的準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn) μg/kg(L)

3、試劑盒保存期試驗(yàn)將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒分別保存在2-8℃，6個(gè)月后，測(cè)定試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、19-去甲睪酮添加實(shí)際測(cè)定值，結(jié)果表明實(shí)施例1的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度，實(shí)施例2的試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將上述試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括19-去甲睪酮特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)19-去甲睪酮半抗原；當(dāng)所述包被原為19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)19-去甲睪酮半抗原；所述19-去甲睪酮半抗原是將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)酰化反應(yīng)得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括19-去甲睪酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液；所述載體蛋白為卵清蛋白、兔血清白蛋白或鼠血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述19-去甲睪酮特異性抗體為19-去甲睪酮單克隆抗體或19-去甲睪酮多克隆抗體；它們均是用19-去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述19-去甲睪酮半抗原是將19-去甲睪酮和琥珀酸酐通過(guò)?；磻?yīng)得到的；所述載體蛋白為鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠或羊抗兔抗抗體；所述19-去甲睪酮單克隆抗體為19-去甲睪酮的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-3-3 CGMCC No.1613分泌的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為0.01M～0.05M、含0.01％疊氮化鈉和1％吐溫80的磷酸鹽緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酯酶時(shí)，顯色劑為4-硝基酚磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮復(fù)溶液為含0.5％牛血清白蛋白和0.1％吐溫20、0.01～0.05M的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所述封閉液是含有5％脫脂奶粉的0.01～0.05M磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1～2mol/L的硫酸、鹽酸或氫氧化鈉緩沖液；所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
10.一種檢測(cè)19-去甲睪酮的方法，包括以下步驟1)樣品前處理當(dāng)樣品為動(dòng)物組織或飼料時(shí)，稱取2g動(dòng)物組織或飼料勻漿物和0.5g抗壞血酸加入到8ml乙腈和2ml 1mol/L氫氧化鈉的混合液中，振蕩混勻，室溫3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，取上清液1ml移置離心管中，加入1ml 1mol/L氫氧化鈉和2ml乙腈，混勻，再加入3ml體積比為8∶2的正己烷和二氯甲烷的混合液振蕩混勻，3000g，15℃，離心10-15分鐘，去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍镉?ml的權(quán)利要求8所述的用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物取水相，即可進(jìn)行分析；當(dāng)樣品為尿液時(shí)，取2ml尿液到離心管中，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘直至清亮，移取1ml尿液到離心管中，加入2ml的乙腈，再加入3ml體積比為8∶2的正己烷和二氯甲烷的混合液混勻，3000g以上，15℃，離心10-15分鐘，去除上層正己烷相，取中間層有機(jī)相在氮?dú)饬飨峦耆稍?，?ml權(quán)利要求8所述的用去離子水稀釋2倍的濃縮復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取水相進(jìn)行分析；2)利用權(quán)利要求1-9中任一所述的檢測(cè)19-去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)19－去甲睪酮的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。該檢測(cè)19－去甲睪酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括19－去甲睪酮特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為19－去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)19－去甲睪酮半抗原；當(dāng)所述包被原為19－去甲睪酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)19－去甲睪酮半抗原。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查的檢測(cè)動(dòng)物組織、尿樣中19－去甲睪酮藥物殘留量。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1811443SQ20061000728
公開(kāi)日2006年8月2日 申請(qǐng)日期2006年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月17日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬(wàn)宇平, 張素霞, 馮才偉, 史為民, 吳小平, 汪善良, 江海洋 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)