專利名稱：：Ph梯度離子交換lc-ms和與質(zhì)譜相容的緩沖液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及液相色譜-質(zhì)語聯(lián)用儀(LC-MS)。本發(fā)明尤其涉及用于pH梯度離子交換LC-MS的體系和使用所述體系的方法。本發(fā)明也涉及與質(zhì)鐠相容的緩沖體系及使用所述緩沖體系的方法。
背景技術(shù)：
：在一個(gè)液相色語體系中或一個(gè)全溶液液相色鐠體系中，液相色語(LC)柱位于進(jìn)樣器和檢測器之間，用以將待分析的樣品中一種或多種感興趣的組分與多種干擾組分分離并通過檢測器對這些組分進(jìn)行檢測。液相色鐠體系中的典型的質(zhì)譜檢測器可以測量并輸出樣品中組分的單位體積的質(zhì)鐠或單位時(shí)間的質(zhì)鐠。從這類輸出信號，可提供一種"色鐠圖"。然后操作員可用該色語圖準(zhǔn)確鑒定并定量樣品中存在的化學(xué)組分。色譜法的趨勢一直是向更高性能和小型化液相色鐠柱的方向發(fā)展。近期朝小型化發(fā)展的勢頭強(qiáng)勁的原因在于，小型的液相色語柱具有極低的溶劑消耗量并且對分析樣品的體積的需求急劇降低，從而可在樣品量有限時(shí)提供高效、靈敏的分離。在液相色譜中，使用微粒填充的狹窄直徑柱可以獲得高分離度。小型的微粒填充的液相色鐠柱一般通過用分離介質(zhì)、例如鍵合的二氧化硅微粒均勻填充狹窄直徑的管而制得，分離介質(zhì)也被稱為填料或固定相。常規(guī)用于制備小型分析柱的物質(zhì)包括聚合物、玻璃、金屬、熔融二氧化硅及其子類中涂有聚合物的熔融二氧化硅和包覆聚合物的熔融二氧化硅。代表性的金屬典型地包括不銹鋼和玻璃襯里不銹鋼。小型液相色i普柱包括小口徑柱、微徑柱及毛細(xì)管柱。這些柱子的長度一般為約5mm-300mm，但在某些情況下可接近最高達(dá)5000mm的長度。小口徑柱通常具有約2mm的內(nèi)徑，而微徑柱具有近似lmm的直徑。溶融二氧化硅及其它毛細(xì)管柱一般具有小于lmm、通常小于0.lmm的內(nèi)徑。實(shí)際上，具有0.075mm內(nèi)徑的毛細(xì)管柱幾乎已成為液相色語質(zhì)諳連用儀的標(biāo)準(zhǔn)配備。熔融二氧化硅毛細(xì)管柱可承受高填充壓力，例如9000psi或更大。用反相填料填充的二氧化硅毛細(xì)管已用在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中，用于通過HPLC-MS/MS分析蛋白質(zhì)/肽。該方法使用與質(zhì)語檢測器連用的高效液相色譜(HPLC)體系。成千上萬的蛋白質(zhì)/肽通過HPLC分離，然后用串聯(lián)的質(zhì)鐠表征。肽序列的鑒定通過將質(zhì)鐠/質(zhì)語(MS/MS)語圖與理論鐠圖比較來進(jìn)行。蛋白質(zhì)通過將肽序列與來自染色體組或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的預(yù)測片斷相比較進(jìn)行鑒定。離子交換HPLC廣泛用在蛋白質(zhì)/肽的分離中。其對生物聚合物的分離提供高分辨率而不使蛋白質(zhì)/肽變性。但是，離子交換HPLC需要使用鹽梯度以從固定相中洗脫樣品。鹽導(dǎo)致高霧流并干擾質(zhì)譜信號。因此所有的離子交換HPLC在實(shí)施質(zhì)語分析前需要大量的樣品清洗工作以除去鹽。這種做法耗時(shí)。此外，一些樣品會在清洗步驟中損失。很明顯，對用于分離和分析生物樣品和藥物樣品的離子交換LC-MS的新方法和新體系具有迫切需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及pH梯度離子交換LC-MS體系，該體系包括一個(gè)進(jìn)樣器；一個(gè)或多個(gè)HPLC泵；一個(gè)或多個(gè)LC柱，該柱獨(dú)立地選自離子交換柱、整體柱和一個(gè)或多個(gè)離子交換柱與一個(gè)或多個(gè)適于多維LC-MS的LC柱的組合柱，并且其中所述一個(gè)或多個(gè)LC柱中至少一個(gè)用于pH梯度LC-MS;一個(gè)緩沖體系，該體系含有一種緩沖酸或堿或其結(jié)合物，其中所述緩沖酸或堿在pH約2到約IO的范圍內(nèi)具有緩沖能力；并且其中所述緩沖酸或堿與質(zhì)語儀相容；和一個(gè)質(zhì)譜儀。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多維LC-MS是二維LC-MS。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)譜儀包括一個(gè)電噴霧離子化(ESI)接口或一個(gè)基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)接口。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)離子交換柱。在另一實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)整體柱。在再一實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)或多個(gè)離子交換柱與一個(gè)或多個(gè)適于二維LC-MS的LC柱的組合柱。在又一實(shí)施方案中，所述pH梯度是一個(gè)連續(xù)的pH梯度。本發(fā)明也涉及用于pH梯度LC-MS的緩沖體系。該緩沖體系含有一種緩沖酸或堿或其結(jié)合物，其中所述緩沖酸或堿在pH約2到約10范圍內(nèi)具有緩沖能力；并且其中所述緩沖酸或堿與質(zhì)i普儀相容。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述緩沖酸或堿選自碳酸、曱酸、乙酸、烷基-C00H、取代的烷基-C00H、烯基-C00H、取代的烯基-C00H、炔基-C00H、取代的炔基-COOH、H00C(R》C-C(R2)C00H、H00C(R1)C(R2)C00H、氫氧化銨、碳酸氫銨、烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、取代的二烷基胺、取代的三烷基胺、吡啶、取代的吡啶、吡溱、取代的吡噪、峻溱、取代的峻溱、嘧咬和取代的嘧^:,其中W和W獨(dú)立地為h、烷基或取代的烷基。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述緩沖酸或緩沖堿選自碳酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙炔酸、馬來酸、丙二酸、2-曱基丙二酸、2，2-二曱基丙二酸、2-乙基丙二酸、和2，2-二乙基丙二酸、氫氧化銨、碳酸氫銨、曱胺、乙胺、三曱胺、三乙胺、吡咬、甲基取代的吡咬、吡溱、峻"秦和嘧咬。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖酸或緩沖堿的至少一種是碳酸。在另一實(shí)施方案中，所述緩沖酸或緩沖堿的至少一種是丙二酸。本發(fā)明還涉及將本文所述的緩沖體系用于pH梯度LC-MS、pH梯度離子交換LC-MS、或具有ESI接口或MALDI接口的pH梯度離子交換LC-MS的方法。本發(fā)明還涉及用本文所述的pH梯度離子交換LC-MS體系分離、分析或分離并分析混合物的方法。本發(fā)明還涉及用本文所述的緩沖體系分離、分析或分離并分析混合物的方法。在某些實(shí)施方案中，所述混合物是選自蛋白質(zhì)、肽、小分子及生物標(biāo)志化合物的一個(gè)或多個(gè)種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混合物是蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混合物是肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混合物是小分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述混合物是生物標(biāo)志化合物。圖la和lb顯示通過離子交換LC/MS/MS從牛血清白蛋白(BSA)中分離肽。圖2顯示通過離子交換HPLC對蛋白質(zhì)混合物的分離。圖3顯示收集的蛋白質(zhì)混合物的MALDI-T0F質(zhì)鐠。圖4顯示9個(gè)pH流分的基峰色鐠圖。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，術(shù)語"LC-MS，，、"LC"可以代表LC或HPLC(高效液相色i普)。"MS"可以代表質(zhì)i普或串聯(lián)質(zhì)譜(包括但不限于MS、MS/MS或MS/MS/MS)。在本發(fā)明中，緩沖酸或堿包括其離子或非離子形式中的任何一種或其結(jié)合物，只要該形式具有所需的緩沖能力。例如，丙二酸一一其中R1和R2為H的HOOC(R1)C(R2)COOH——可以是下列三種形式中的任何一種或其一種結(jié)合物OOCCH2COO_、H00CCH2C00—和HOOCCH2COOH。乙酸可以是下列兩種形式的任何一種或其一種結(jié)合物CH3C0(T和CH3COOH。三曱胺可以是下列兩種形式的任何一種或其一種結(jié)合物(CH3)3N和(CH3)3NH+。當(dāng)緩沖酸或堿與質(zhì)譜儀相容時(shí)(與質(zhì)傳相容)，其在室溫下是穩(wěn)定的。但是，當(dāng)在質(zhì)鐠儀中用能量源處理時(shí)，緩沖酸或堿本身易揮發(fā)或分解成易揮發(fā)的小分子。因此，它不干擾分析物的質(zhì)譖。當(dāng)將一種與質(zhì)譜相容的緩沖體系用于pH梯度LC-MS時(shí)，它消除了與鹽梯度的使用相關(guān)的對柱進(jìn)行大量沖洗的需要。質(zhì)i普儀中的典型能量源包括但不限于，在電噴霧離子化(ESI)接口情況下的熱或在基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)接口情況下的激光。例如，當(dāng)丙二酸緩沖液用熱或激光處理時(shí)，丙二酸分解形成乙酸和二氧化碳，兩者都易揮發(fā)并且不干擾分析物的質(zhì)鐠。丙二酸及其衍生物的分解可以下式描述<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，W和R"獨(dú)立地為H、烷基或取代的烷基。本文所用的"一個(gè)或多個(gè)"優(yōu)選一個(gè)或最高達(dá)十個(gè)、一個(gè)或最高達(dá)六個(gè)，并且更優(yōu)選一個(gè)或最高達(dá)兩個(gè)。術(shù)語"梡基"指的是具有1-4個(gè)碳原子并且更優(yōu)選1-3個(gè)碳原子的烷基。此術(shù)語可用以下基團(tuán)作為示例，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基等。"取代的烷基"指的是具有1-3個(gè)并且優(yōu)選1-2個(gè)取代基的烷基，所述取代基選自烷氧基、?；ⅤＱ趸?、氨基、取代的氨基、氰基、鹵素、羥基、硝基、羧基及羧基酯。"烷氧基"指的是基團(tuán)"烷基-0-"，其包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基等。"?；?指的是基團(tuán)H-C(0)-、烷基-C(0)-。"酰氧基"指的是烷基-c(o)o-。"氨基"指的是基團(tuán)-冊2。"取代的氨基"指的是基團(tuán)-NITR",其中R'和R"獨(dú)立地選自氬、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基和取代的炔基。"鹵代"或"鹵素"指的是氟、氯、溴和碘，并且優(yōu)選氟或氯。"羧基，，指的是-C00H和-C00一。"羧基酯，，指的是-C(0)0-烷基和-C(0)0-取代的烷基。"烯基"指的是優(yōu)選具有2-4個(gè)碳原子、且更優(yōu)選2-3個(gè)碳原子并且具有至少1個(gè)不飽和烯位點(diǎn)的烯基。所述基團(tuán)例如乙烯基(乙烯-l-基)、烯丙基等。"取代的烯基"指的是具有1-3個(gè)取代基并且優(yōu)選1-2個(gè)取代基的烯基，所述取代基選自烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氰基、卣素、鞋基、硝基、羧基及羧基酯。應(yīng)理解術(shù)語"取代的烯基，，既包括E(順式)同分異構(gòu)體也包括Z(反式)同分異構(gòu)體，二者都是合適的。同分異構(gòu)體可以是純同分異構(gòu)化合物或E和Z組分的混合物。"炔基"指的是具有至少l個(gè)不飽和炔位點(diǎn)并具有2-4個(gè)碳原子、更優(yōu)選2-3個(gè)碳原子的不飽和烴。所述基團(tuán)例如乙炔-l-基、丙炔-1-基、丙炔-2-基等。"取代的炔基"指的是具有1-3個(gè)取代基并且優(yōu)選1-2個(gè)取代基的炔基，所述取代基選自烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氰基、卣素、羥基、硝基、羧基及羧基酯。"取代的吡夂"指的是用1-3個(gè)、優(yōu)選1-2個(gè)取代基取代的吡咬，所述取代基選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、?；?、酰氧基、氨基、取代的氨基、氰基、卣素、羥基、硝基、羧基及羧基酯。"取代的吡溱"指的是用1-3個(gè)、優(yōu)選1-2個(gè)取代基取代的吡溱，所述取代基選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、?；?、酰氧基、氨基、取代的氨基、氰基、鹵素、鞋基、硝基、羧基及羧基酯。"取代的噠溱"指的是用1-3個(gè)、優(yōu)選1-2個(gè)取代基取代的噠溱，所述取代基選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、?；ⅤＱ趸?、氨基、取代的氨基、氰基、面素、鞋基、硝基、羧基及羧基酯。"取代的嘧啶"指的是用1-3個(gè)、優(yōu)選1-2個(gè)取代基取代的嘧咬，所述取代基選自烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、酰基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氰基、囟素、羥基、硝基、羧基及羧基酯。pH梯度離子交換LC-MS體系的一個(gè)實(shí)例包括一個(gè)進(jìn)樣器；一個(gè)或多個(gè)HPLC泵；一個(gè)LC柱，選自離子交換柱、整體柱和一個(gè)離子交換柱與一個(gè)適合于二維LC-MS的LC柱的組合柱；一個(gè)緩沖體系，包括緩沖酸或堿或其結(jié)合物，其中所述緩沖酸或堿在pH約2到約10的范圍內(nèi)具有緩沖能力，并且其中所述緩沖酸或堿與質(zhì)鐠儀相容；和一個(gè)質(zhì)鐠儀。液相色讒的整體柱可包括笫一柱(或區(qū))和第二柱(或區(qū))。兩柱(或區(qū))具有正交分離模式，此處正交分離模式意指兩種不同的分離機(jī)制。當(dāng)兩柱具有正交分離模式時(shí)，它們通常用兩種不同的固定相填充。例如，一根柱可選自陽離子交換柱、陰離子交換柱、親和柱和金屬螯合柱；而另一根柱可以是反相柱。在另一實(shí)例中，兩柱可獨(dú)立地選自陽離子交換柱、陰離子交換柱、親和柱、金屬螯合柱和反相柱。具有正交分離模式的兩柱可通過管和接頭相連；可直接連接；或可通過螺母和接頭直接連接。一個(gè)整體柱也可以具有填充在同一柱中的兩個(gè)區(qū)，以形成混合床HPLC柱。例如，柱的一部分用強(qiáng)陽離子交換填料填充而柱的其余部分用反相填料填充。整體柱還可含有一個(gè)或多個(gè)其它柱(或區(qū))。用于整體柱的材料可以選自但不限于熔融二氧化硅、涂有聚合物的熔融二氧化硅、包覆聚合物的熔融二氧化硅、不銹鋼、玻璃、玻璃襯里不銹鋼、金屬或聚合物。本文所用的pH梯度可包括將pH保持在設(shè)定值、使pH值階梯式變化、使pH在一定時(shí)間段內(nèi)從一個(gè)值漸變到另一個(gè)值(連續(xù)的pH梯度)，或其組合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是使用PH梯度進(jìn)行離子交換HPLC-MS分析?？捎脧?qiáng)陽離子交換柱進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)/肽樣品通過流動相A上樣到柱上。流動相A含有緩沖液并且具有某一低的pH值，例如約2.5。在此條件下，所有的樣品是正電性的并被強(qiáng)陽離子交換柱吸附。然后使用各種pH梯度，樣品隨著逐漸增加的pH值4皮流動相洗脫。當(dāng)流動相的pH高于樣品中物質(zhì)種類的等電點(diǎn)(Pl)時(shí)，該物質(zhì)種類失去它們的正電荷并從柱中洗脫出來。在此實(shí)施方案中，無需用鹽洗脫。因此，無需在質(zhì)譜分析前清洗樣品。此方法可以使用電噴霧離子化(ESI)接口或者基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)接口。對于ESI接口，將洗脫液直接噴霧到質(zhì)諉儀中，無需任何清洗。對于MALDI接口，收集洗脫液并將此樣品的一小部分放到板上用于質(zhì)謙分析。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明可應(yīng)用于二維HPLC-MS分析。多數(shù)二維HPLC-MS分析在反相梯度和質(zhì)鐠分析前需要進(jìn)行大量的柱沖洗?？梢允褂胮H梯度離子交換HPLC-RPLC-MS/MS而無需任何的鹽清洗步驟。在某些實(shí)施方案中，本文所述的緩沖體系可用于例如根據(jù)其等電點(diǎn)(Pi)分離蛋白質(zhì)/肽。本文所述的緩沖體系也可用于例如與適合反相分離的溶劑相結(jié)合以分離小分子。本文所述的緩沖體系和pH梯度離子交換LC-MS體系也可用于發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志化合物。生物標(biāo)志化合物為在生物介質(zhì)例如人體組織、細(xì)胞或體液中可測量的細(xì)胞的、生化的或分子的變化。它們表明生物事件或與特定的疾病狀態(tài)直接相關(guān)的協(xié)同事件的存在。下列實(shí)施例示例說明實(shí)施本發(fā)明的多種方式中的幾種。實(shí)施例實(shí)施例1具有ESI接口的pH梯度離子交換LC-MS/MS這是一個(gè)通過pH梯度離子交換LC/MS/MS從牛血清白蛋白(BSA)中分離肽的實(shí)施例。BSA首先被胰蛋白酶消化成肽。使用pH梯度通過強(qiáng)陽離子交換(SCX)HPLC分離肽混合物。使用IXQDECAXPplus(ThermoFinnigan，SanJose，CA)進(jìn)行SCX。該體系配備一個(gè)強(qiáng)陽離子交換柱(SCX，320jam,IDx100,，5|im,ColumntechnologyInc.，CA)。溶劑為0.05%的甲酸和5mM丙二酸的20/80乙腈/水溶液。溶劑的pH值通過氨水(氫氧化銨)調(diào)節(jié)，以分別產(chǎn)生pH值為3.O的緩沖液A和pH值為8.0的緩沖液B。肽混合物首先用緩沖液A上樣到SCX柱上。在最初的50min，梯度洗脫由100%的A開始，從50min到150min，漸變?yōu)?。/fl的A(100。/。的B)，從150min到195min，停留在0%的A，接著從196min到210min，漸變?yōu)?00%的A。根據(jù)肽的等電點(diǎn)將它們洗脫出來?？梢詫㈦南疵撘褐苯訃婌F到質(zhì)鐠儀中而無需任何預(yù)清洗。微電噴霧接口使用與LCQDecaXPplus的入口垂直的30jam金屬針頭。質(zhì)i普儀被設(shè)置為在一次全MS掃描后，在MS鐠中三個(gè)強(qiáng)度最大的離子上進(jìn)行三次MS/MS掃描，掃描中4吏用如下的DynamicExclusioni殳置重復(fù)計(jì)數(shù)，2;重復(fù)時(shí)間，0.5min;排除(exclusion)時(shí)間，3.Omin。用BioWorks3.1集群軟件包中的TurboSEQUEST程序?qū)φ张５鞍讛?shù)據(jù)庫自動檢查所獲得的MS/MS光譜。一個(gè)被接受的SEQUEST結(jié)果必須具有至少0.1分值的ACn(在最高得分(hit)和次高得分之間的Xcorr的差值)(不管電荷狀態(tài))。具有a+l個(gè)電荷狀態(tài)的肽只有當(dāng)它們是完全被胰蛋白酶消化并具有至少1.9的交叉相關(guān)性(Xcorr)時(shí)才被接受；具有a+2個(gè)電荷狀態(tài)的肽只有當(dāng)它們具有的Xcorr>2.2時(shí)才被接受；并且具有a+3個(gè)電荷狀態(tài)的肽只有當(dāng)它們具有的Xcorr>3.75時(shí)才4皮接受。圖la和lb顯示了通過pH梯度離子交換LC/MS/MS從牛血清白蛋白(BSA)中分離肽。表1顯示胰蛋白酶消化BSA的形式的肽的分析。通過離子交換LC-MS/MS鑒定了二十九種獨(dú)特的肽，約為全部肽的50%。結(jié)果表明沒有來自緩沖酸、曱酸或丙二酸的干擾。曱酸具有揮發(fā)性，而丙二酸在實(shí)驗(yàn)條件下分解。因此當(dāng)前實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖體系與質(zhì)譜是相容的。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例2具有MALDI接口的pH梯度離子交換LC-MS/MS在此實(shí)施例中，蛋白質(zhì)通過pH梯度離子交換HPLC進(jìn)行了分離，接著通過MALDI-TOF(飛行時(shí)間)進(jìn)行分析。用SCX柱分離。以下為pH梯度離子交換HPLC分離的條件柱SCX2.1x100mm，來自columntechnologyinc.,緩沖溶液A:20mM丙二酸，pH為3.0,緩沖溶液B:20mM丙二酸，用NH3H20調(diào)節(jié)pH為10.0，上樣量100pga-乳白蛋白(溶解在緩沖液A中)，流速1ml/min，梯度25分鐘內(nèi)B從0-畫。圖2顯示了在上述條件下通過pH梯度離子交換HPLC分離蛋白質(zhì)混合物。收集pH梯度離子交換HPLC的樣品洗脫液的少量流分(10ja1)并直接用于MALDI-TOF的分析。在MS/MS分析前無需進(jìn)行樣品預(yù)清洗，而該樣品預(yù)清洗對于常規(guī)的鹽梯度是必須的。所有的MALDI-T0F-MS實(shí)驗(yàn)均用BrukerReflexIH儀器實(shí)施?；|(zhì)是芥子酸(SA)在溶液C中的飽和溶液。溶液C是0.1%的三氟乙酸的50/50水/乙腈溶液。將樣品洗脫液(0.5yL)和基質(zhì)(0.5juL)相混合并應(yīng)用到SCOUT384乾板上并風(fēng)干。接著進(jìn)行MALDI-T0F分析。圖3顯示了樣品洗脫液的TOF光語。分子量約14.1KD的信號與ot-乳白蛋白相應(yīng)。當(dāng)激光能施加于板上時(shí)，甲酸蒸發(fā)并且丙二酸分解。兩者都不干擾MS/MS分析。實(shí)施例3使用pH梯度和反相分離的2DLC/MS/MS進(jìn)行的肽的鑒定樣品的制備研究中所用的小鼠肝臟是8周大的C57鼠。將C57鼠處死后立即將肝移出并放在水冷的PBS緩沖液中。用剪刀切碎并清洗除去血液后，用液氮冷凍肝組織。將冷凍的肝組織在液氮冷卻的研缽中碾碎，并且將此粉末懸浮在預(yù)冷卻的8M尿素、4%CHAPS、40mMTrispH8.0、65mM二辟u蘇糖醇(DTT)的溶液中。攪拌之后，將溶胞產(chǎn)物在41C下貯存2小時(shí)。在IOOW下將溶胞產(chǎn)物經(jīng)聲波處理30s并以15，OOOg離心lh。然后收集上層清液并通過Bradford檢測法確定蛋白質(zhì)的濃度。每600ng肝樣品放入200jaL變性溶液中(6M鹽酸胍，100mM碳酸氫銨，pH8.3);各自用2juLlM的DTT還原?；旌衔镌?71C下培養(yǎng)2.5h,然后添加10pLlM的捵乙酰胺(LAA)以烷基化。接下來將混合物在室溫下在暗處再培養(yǎng)40分鐘。通過3kDaMicrocon離心過濾儀(Mi11ipore，Bedford,MA，USA)超濾，將各部分中的蛋白質(zhì)混合物置換到pH為8.5的100mM碳酸氫銨緩沖液中。將緩沖液交換的樣品混合在一起，并在371C下用胰蛋白酶(50:1)培養(yǎng)過夜。將消化的肽混合物凍干并在使用前溶解于0.1%的曱酸中。2D-LC-MS/MS用2D-IX-Nano-LTQ工作站(ThermoFinnigan，SanJose，CA，USA)進(jìn)行正交的2D-LC-MS/MS。此體系配有一個(gè)強(qiáng)陽離子交換柱(SCX，320nm，IDxi00mm，ColumntechnologyInc.,Fremont,CA，USA)、兩個(gè)C18反相捕集柱(RP,320|nmx20mm,C18，5jam，ColumntechnologyInc.，F(xiàn)remont,CA，USA)和一個(gè)C18反相毛細(xì)管柱(RP，75pmxi50mm，C18,5jnm，ColumntechnologyInc.，F(xiàn)remont,CA，USA)。分流后毛細(xì)管柱的流速為每分鐘約200納升。LTQ的接口是納電噴霧源。質(zhì)譜儀被設(shè)置為在一次全MS掃描后，在MS語中十個(gè)強(qiáng)度最大的離子上進(jìn)行十次MS/MS掃描，掃描中^f吏用如下的DynamicExclusioni更置重復(fù)次數(shù)，2;重復(fù)時(shí)間，O.5min;朝卜除時(shí)間，1.5min。pH梯度洗脫-SCX-RP-MS/MSSCX柱用來自樣品泵的梯度pH緩沖液洗脫。樣品泵的緩沖液A與B從ColumntechnologyInc.(Fremont,CA,USA)獲得，pH值分另'J為約3.0和8.0。用緩沖液A(pH為3.0)將共300ng的胰蛋白酶消化的鼠肝樣品通過樣品泵上樣到SCX柱上，并將LTQ的IO通閥的位置置于廢液。在第一種儀器方法中，總獲得時(shí)間設(shè)為540min。LTQ的IO通閥的位置在開始時(shí)切換到源，180邁in時(shí)切換到廢液并在360min時(shí)切換回源。樣品泵的梯度在第一個(gè)180min段從0。/。B漸變?yōu)?0。/。B(pH從3.0到3.5)，在第二個(gè)180min段從30%B漸變?yōu)?0%B(pH從3.5到4.0)，在第三個(gè)180min段從60%B漸變?yōu)?0%B(pH從4.0到4.5)。MS泵同時(shí)運(yùn)行三個(gè)180minRP梯度。第二種儀器方法也是540min。LTQ的10通閥的位置在開始時(shí)切換到廢液，180min時(shí)切換到源并在360min時(shí)切換回廢液。樣品泵的梯度在第一個(gè)180min段從70%B漸變?yōu)?0%B(pH從4.5到5.0),在第二個(gè)180min段從80%B漸變?yōu)?5%B(pH從5.0到5.5)，在第三個(gè)180min段從85%B漸變?yōu)?0%B(pH從5.5到6.0)。MS泵的RP梯度與前面相同。第三種儀器方法與第一種相同，除樣品泵的pH梯度之外，該梯度為在第一個(gè)180min段從90%B漸變?yōu)?5%B(pH從6.0到7.0)，在第二個(gè)180min段從95%B漸變?yōu)?00%B(pH從7.0到8.0),且在第三個(gè)180min段從0%B變?yōu)?%B(pH為3.0)。結(jié)果結(jié)果概括在圖4和表2中。圖4顯示九個(gè)pH流分的基峰色諳圖。在肽混合物的流分中使用了連續(xù)的pH梯度。表2顯示通過該方法鑒定的肽和蛋白質(zhì)。用該方法鑒定了4700種以上的蛋白質(zhì)。表2<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage15<table><table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>已對本發(fā)明進(jìn)行了一定程度的詳盡描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，本發(fā)明所公開的實(shí)施方案僅為示例性的，而且應(yīng)理解的是，可對各部分的排列及組合采取多種改變而不偏離本發(fā)明的主旨和范圍。盡管本文所述的實(shí)施方案就其形式和排列而言，對信息單元的描述可能看起來存在某些限制，但本發(fā)明的適用性遠(yuǎn)超出這些實(shí)施方案，這點(diǎn)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識到的。權(quán)利要求1.一種用于pH梯度離子交換LC-MS的體系，包括一個(gè)進(jìn)樣器；一個(gè)或多個(gè)HPLC泵；一個(gè)或多個(gè)LC柱，該柱獨(dú)立地選自離子交換柱、整體柱和一個(gè)或多個(gè)離子交換柱與一個(gè)或多個(gè)適于多維LC-MS的LC柱的組合柱，并且其中所述一個(gè)或多個(gè)LC柱的至少一個(gè)用于pH梯度LC-MS；一個(gè)緩沖體系，該體系包括一種緩沖酸或堿或其結(jié)合物，其中所述緩沖酸或堿在pH約2到約10的范圍內(nèi)具有緩沖能力；并且其中所述緩沖酸或堿與質(zhì)譜儀相容；和一個(gè)質(zhì)譜儀。2.權(quán)利要求l的體系，其中所述多維LC-MS是二維LC-MS。3.權(quán)利要求l的體系，其中所述質(zhì)鐠儀包括一個(gè)ESI接口或MALDI接口。4.權(quán)利要求l的體系，其中所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)離子交換柱。5.權(quán)利要求l的體系，其中所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)整體柱。6.權(quán)利要求l的體系，其中所述一個(gè)或多個(gè)LC柱包括一個(gè)或多個(gè)離子交換柱與一個(gè)或多個(gè)適于多維LC-MS的LC柱的組合柱。7.權(quán)利要求l的體系，其中所述pH梯度為連續(xù)的pH梯度。8.權(quán)利要求l的體系，其中所述緩沖酸或堿選自碳酸、曱酸、乙酸、烷基-C00H、取代的烷基-C00H、烯基-C00H、取代的烯基-C00H、炔基-C00H、取代的炔基-C00H、H00C(R"C-C0OC00H、H00C0OC(R"C00H、氫氧化銨、碳酸氫銨、烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、取代的二烷基胺、取代的三烷基胺、吡啶、取代的吡咬、吡"秦、取代的吡，秦、噠秦、取代的歧漆、嘧啶和取代的嘧啶，其中Ri和R'獨(dú)立地為H、烷基或取代的烷基。9.權(quán)利要求8的體系，其中所述緩沖酸或堿選自碳酸、曱酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙炔酸、馬來酸、丙二酸、2-曱基丙二酸、2，2-二甲基丙二酸、2-乙基丙二酸、和2，2-二乙基丙二酸、氫氧化銨、碳酸氫銨、甲胺、乙胺、三曱胺、三乙胺、吡啶、曱基取代的吡啶、吡脊、歧"秦和嘧咬。10.權(quán)利要求9的體系，其中所述緩沖酸或堿的至少一種是碳酸。11.權(quán)利要求9的體系，其中所述緩沖酸或堿的至少一種是丙二酸。12.—種用于pH梯度LC-MS的緩沖體系，包括一種緩沖酸或堿或其結(jié)合物，其中所述緩沖酸或堿在pH約2到約10的范圍內(nèi)具有緩沖能力；并且所述緩沖酸或堿與質(zhì)i普儀相容。13.權(quán)利要求12的體系，其中所述pH梯度為連續(xù)的pH梯度。14.權(quán)利要求12的緩沖體系，其中所述緩沖酸或堿選自碳酸、曱酸、乙酸、烷基-C00H、取代的烷基-C00H、烯基-C00H、取代的烯基-COOH、炔基-C00H、取代的炔基-C00H、H00C(R1)C=C(R2)C00H、H00C0OC0OC00H、氫氧化銨、碳酸氫銨、烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、取代的二烷基胺、取代的三烷基胺、吡啶、取代的吡咬、吡溱、取代的吡溱、噠溱、取代的歧溱、嘧啶和取代的嘧啶，其中W和W獨(dú)立地為H、烷基或取代的烷基。15.權(quán)利要求14的緩沖體系，其中所述緩沖酸或堿選自碳酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙炔酸、馬來酸、丙二酸、2-曱基丙二酸、2，2-二曱基丙二酸、2-乙基丙二酸、和2，2-二乙基丙二酸、氫氧化銨、碳酸氫銨、曱胺、乙胺、三曱胺、三乙胺、吡啶、曱基p比咬、吡嗪、噠喚和嘧咬。16.權(quán)利要求15的緩沖體系，其中所述緩沖酸或堿的至少一種是碳酸。17.權(quán)利要求15的緩沖體系，其中所述緩沖酸或堿的至少一種是丙二酸。18.—種將權(quán)利要求12-17的緩沖體系之一用于pH梯度LC-MS的方法。19.一種將權(quán)利要求12-17的緩沖體系之一用于pH梯度離子交換LC-MS的方法。20.—種將權(quán)利要求12-17的緩沖體系之一用于具有ESI接口或MALDI接口的pH梯度離子交換LC-MS的方法。21.—種用權(quán)利要求1-11的體系之一分離、分析或分離并分析混合物的方法。22.—種用權(quán)利要求12-17的緩沖體系之一分離、分析或分離并分析混合物的方法。23.權(quán)利要求21-22之一的方法，其中所述混合物是選自蛋白質(zhì)、肽、小分子及生物標(biāo)志化合物的一個(gè)或多個(gè)物質(zhì)種類。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述混合物是蛋白質(zhì)。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述混合物是肽。26.權(quán)利要求23的方法，其中所述混合物是小分子。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述混合物是生物標(biāo)志化合物。全文摘要本發(fā)明描述了一種用于pH梯度離子交換LC-MS的體系和使用所述體系的方法。并且公開了與質(zhì)譜儀相容的用于pH梯度LC-MS的緩沖體系及使用所述緩沖體系的方法。文檔編號G01N30/00GK101198862SQ200580050116公開日2008年6月11日申請日期2005年12月6日優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日發(fā)明者嶸曾,謝佳輝申請人:謝佳輝;曾嶸