專利名稱：作為胰島素耐受性的靶標(biāo)/標(biāo)記的cd99的制作方法
作為胰島素耐受性的把標(biāo)/標(biāo)記的CD99
2型糖尿病是在世界范圍內(nèi)重要性快速增長的疾病，可以描述為胰臟/3 細(xì)胞不能以|8細(xì)胞胰島素分泌的增強(qiáng)4M嘗外周胰島素耐受性^細(xì)胞衰竭)。
可以認(rèn)為胰島素耐受性是2型糖尿病i^艮的第一步，并J^診斷出糖 尿病之前數(shù)年就已經(jīng)發(fā)生。在這第一個階段中，患者保持血糖正常，通過 增強(qiáng)胰島素分泌來4M嘗肌肉和肝對胰島素應(yīng)答性的降低。在2型糖尿病發(fā) 展的4^階段，^細(xì)胞功能降低，引起葡萄糖耐量降低并最終導(dǎo)致糖尿病。 已經(jīng)顯示通過減輕體重、鍛煉或藥物治療進(jìn)行早期干預(yù)可以延緩或甚至防 止在葡萄糖耐量降低的患者中糖尿病的iLjl(Diabetes Prevention Program Research Group, N. Engl. J. Med. 346 (2002) 393-403)。因此，胰烏素耐受 性的早期診斷將允許通過M尿病治療或防止該疾病^L艮的其他手段進(jìn)行
早期干預(yù)。目前，檢測胰島素耐受性的惟一可靠的可能性是通過正常jMt-
高胰島素鉗夾(EHC). HOMA模型常用于評估胰島素耐受性，但不是公認(rèn) 的診斷方法(Wallace等，Diabetes Care 27(2004)1487ff.)。由于它們費時費 力，因此，這些方法不能成為廣泛的患者篩查程序。因此胰島素耐受性的 分子標(biāo)記將對于該疾病的檢測非常有用。
目前最經(jīng)常使用的2型糖尿病治療不直接針對胰島素耐受性。存在對 于主要在外周葡萄糖攝取水平下發(fā)揮作用的治療方法(如胰島素致敏物)的 安全性擔(dān)憂。因此，鑒定其他更好的治療靶標(biāo)和比目前常用的標(biāo)志物(如 EHC或HOMA法)更靈敏或更可靠的標(biāo)志物也是有用的，所述標(biāo)志物用于 檢測胰島素耐受性或功效。
此外，鑒定可以在血漿中檢測的標(biāo)志物也是有利的。 本發(fā)明的目的在于鑒定和提供新靶標(biāo)，所述乾標(biāo)用于篩選防止、減弱 或抑制胰島素耐受性的化合物和篩選允許在II型糖尿病早期階段監(jiān)測和/
或診斷胰島素耐受性并且比目前的更為可靠的標(biāo)志物。
令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)使用蛋白質(zhì)CD99能克服(至少部分克服)目 前該領(lǐng)域已知的問題。
CD99是32-kDa聘_膜蛋白，已經(jīng)與單核細(xì)胞的遷移以及T細(xì)胞和胸腺 細(xì)胞的分化和凋亡相聯(lián)系。CD99的生物功能還沒有什么了解。
令人驚奇地，在胰烏素耐受性中發(fā)現(xiàn)了 CD99分泌水平的改變。因此， 本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防胰烏素耐受性的靶標(biāo)以及用于早期診斷 糖尿病中胰島素耐受性的新標(biāo)志物。優(yōu)選地，所述改變?yōu)榉置贑D99水平 的提高.
EndogHn是跨膜蛋白這一事實意味著為了在血漿中出現(xiàn)分泌形式，必 須產(chǎn)生SeqIDNo. 1的序列片段。因此，本發(fā)明方法中使用的把標(biāo)或通過 本發(fā)明方法可檢測的標(biāo)志物還包括Seq ID No. 1的可溶性片段。這些可溶
質(zhì)結(jié)構(gòu)"(跨膜結(jié)構(gòu)域后第二;M酸至序列C端)的部分或;任何片^:.
因此，本文使用的術(shù)語"CD99，，或"蛋白質(zhì)CD99，，應(yīng)理解為包括Seq ID No. 1 的可溶性片段以及Seq ID No. 1的蛋白質(zhì)或其與Seq ID No. 1至少90 %同 源的突變體。為了測定兩個^^^列之間的百分比同源性，以最優(yōu)比較 目的將序列進(jìn)行比對(例如為了與另一多肽或核酸分子進(jìn)行最佳比對，可以 在序列中引入缺口)。接著比較相應(yīng)的M酸位置上的氨基酸殘基或核苷 酸。當(dāng)一個序列上的位置被與另一序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸泉基占據(jù) 時，則分子在該位置上同源，本文使用的氨基酸"同源性"與氨基酸"同一性" 等價。兩序列之間的百分比同源性是序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)(即百分 比同源性等于相同位置lfc/位置總數(shù)乘以100)。
在優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)志物CD99由可通過實施例4中所述ELISA 檢測的Seq ID No. 1的任何片段或突變的或天然形式組成。
在優(yōu)選的實施方案中，新耙標(biāo)和/或標(biāo)志物CD99可用于診斷、監(jiān)測以 及篩選目的。
用于患者監(jiān)測時，本發(fā)明的診斷方法可幫助在患者隨訪中評估療效和
胰島素耐受性的復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)CD99用于監(jiān)測糖尿病療 效的用途。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的診斷方法用于患者篩選目的。即用于 通過測量CD99水平并將CD99水平與胰島素耐受性存在與否進(jìn)行聯(lián)系來 在沒有糖尿病先期診斷的情況下評估受試者。
本發(fā)明的方法可用于通過引起糖尿病的不同階段(即胰島素耐受性、葡 萄糖耐量降低和糖尿病)來監(jiān)測疾病的H
因此本發(fā)明提供用于監(jiān)測糖尿病iU艮的方法，其包括以下步驟(a)提 供得自個體的液體樣品，(b)在將所述樣品與CD99的特異性結(jié)合劑在適于 所述結(jié)合劑和CD99之間形成復(fù)合體的條件下接觸和(c)將(b)中形成的復(fù)合 體的量與胰烏素耐受性中形成的復(fù)合體的量相關(guān)聯(lián).
本發(fā)明還提供用于監(jiān)測糖尿病療效的方法，其包括以下步驟(a)提供 得自進(jìn)行M尿病治療的患者的液M品，(b)將所述樣品與CD99的特異 性結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和CD99之間形成復(fù)合體的條件下接觸和(c)將 (b)中形成的復(fù)合沐的量與未進(jìn)行治療時形成的復(fù)合體的量相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明提供用于篩選與CD99相互作用的化合物的方法，其包括以下 步驟(a)在允許化合物或多種化合物與CD99相互作用的條件下使蛋白質(zhì) CD99與所述化合物或多種化合物接觸；和(b)檢測所述化合物或多種化合 物與所述多肽之間的相互作用。
本發(fā)明提供用于篩選防止和/或抑制和/或減弱胰島素耐受性的化合物 的方法，其包括以下步驟a)使化合物與蛋白質(zhì)CD99接觸；和b)測量蛋 白質(zhì)CD99的活性，其中抑制或刺激蛋白質(zhì)CD99的活性的化合物為可以 防止和/或抑制和/或減弱胰島素耐受性的化合物。優(yōu)選地，所述方法還包括 在步驟a)之前或步驟a)和b)之間固定蛋白質(zhì)CD99的步驟。
本文使用的術(shù)語"活性，，涉及例如CD99介導(dǎo)細(xì)胞遷移的能力、誘導(dǎo)凋 亡的能力或與親環(huán)蛋白A結(jié)合的能力(參閱如Cerisano等，2004， Oncogene 23， 5664-5674; Kim等，2004， Immunol. Lett. 95， 155-159)。
本發(fā)明還包括無細(xì)胞測定。這些測定包括使CD99形式(如全長多肽、
所述多肽的生物活性片段或包含所述多肽全部或部分的融合蛋白)與測試 化合物接觸并測定該測試化合物與所述多肽結(jié)合的能力?？梢匀缟鲜鲋苯?或間接測定該測試化合物與所述多肽的結(jié)合。在一個實施方案中，該測定 包括使所述多肽與已知結(jié)合所述多肽的化合物接觸，以形成測定混合物，
的能力，其中測定所述測試化合物與所述多JiM目互作用的能力包括測定測 試化合物與已知化合物相比，與所述多肽優(yōu)先結(jié)合的能力。
本發(fā)明的無細(xì)胞測定適于使用膜結(jié)合形式的多肽或其可溶性片段。對 于包括膜結(jié)合形式多肽的無細(xì)胞測定，可能需要使用增溶劑以將膜結(jié)合形 式的多肽維持在溶液中。這些增溶劑的實例包括非離子型去污劑如正辛基 葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛it^-N-甲基葡糖酰
胺、癸B!^-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-IOO、 Triton X-114、 Thesit、異十 三聚(乙二醇醚)n、 3-(3-膽酰胺丙基)二甲氨基H-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、 3-(3-膽酰胺丙基)二甲氨基-2-羥基-l-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPSO)或N-十二烷 基-N， N-二甲基-3-HJ^l-丙磺酸內(nèi)鹽。
在本發(fā)明以上測定方法的多個實施方案中，可能需要固定多肽以便于 從多肽與結(jié)合分子的未復(fù)合形式中分離復(fù)合形式以及提供測定的自動化。
在存在和不存在候選化合物的情況下與結(jié)合分子的相互作用。這些容器的 實例包括微量滴定板、試管和微量離心管，在一個實施方案中，可以提供 融合蛋白，其加入了允許一種或兩種蛋白質(zhì)與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。例如谷 胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical; St. Louis, Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定^LL，其接著再與測試化合物組 合，或者將測試化合物與非吸附的結(jié)合蛋白或多肽組合，接著在有助于形 成復(fù)合體的條件下(如生理條件下的鹽和pH)溫育混合物。溫育后，洗滌珠 子或微量滴定板以去除任何未結(jié)合的組分，直接或間接(如上文所述)測量 復(fù)合體的形成。或者，可以從基質(zhì)中解離復(fù)合體，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定 上文所述多肽的結(jié)合水平或活性。
在本發(fā)明的篩選測定中還可以使用將蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上的其他技 術(shù)。例如，可以使用綴合生物素和鏈霉抗生物素蛋白來固定上文所述的多
肽或其結(jié)合分子。可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals; Rockford， Ill.)由生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)來制備生物 素化的本發(fā)明多肽或其乾分子，并固定在包被鏈霉抗生物素蛋白的96 ;U1 (Pierce Chemical)中?；蛘呖梢栽谄桨宓目字醒苌芘c多肽或結(jié)合分子反 應(yīng)但不干擾本發(fā)明多肽與其結(jié)合分子的結(jié)合的抗體。通過抗體綴合將未結(jié) 合的結(jié)合蛋白或本發(fā)明多肽捕獲在孔中。除了上述用于GST-固定的復(fù)合體 的方法以外，用于檢測這些復(fù)合體的方法包括使用與本文所述多肽或結(jié)合
相關(guān)的酶活性的酶聯(lián)測定。
本發(fā)明還提供篩選防止和/或抑制和/或延緩胰島素耐受性的化合物的 方法，其包括檢測在存在或不存在所述化合物的情況下宿主分泌的可溶性 CD99,其中防止和/或抑制和/或延緩胰島素耐受性的化合物為改變了宿主 分泌的CD99水平的化合物。
宿主可以是培養(yǎng)物中代表/S細(xì)胞的宿主細(xì)胞，或者是可用作胰烏素耐 受性模型的動物。
本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)CD99作為把標(biāo)和/或標(biāo)志物用于篩選防止和/或 抑制胰烏素耐受性的化合物的用途.
本發(fā)明的診斷、監(jiān)測或患者篩選方法基于來自個體的液體樣品。與本 領(lǐng)域已知的方法不同，通過4吏用特異性結(jié)合劑特異性地測量來自該液* 品的CD99。
特異性結(jié)合劑為例如CD99的受體或CD99的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員 會理解，術(shù)語特異性用于表示樣品中存在的其他生物分子不與對CD99具 有特異性的結(jié)合劑顯著結(jié)合。低于5%交叉反應(yīng)性的水平認(rèn)為是不顯著。
特異性結(jié)合劑優(yōu)選為與CD99反應(yīng)的抗體。術(shù)語"抗體"指多克隆抗體、 單克隆抗體、這些抗體的片段以及包含抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因構(gòu)建體。
通過本領(lǐng)域現(xiàn)有方法產(chǎn)生抗體，例如Tijssen (Tijssen， P.，《Practice
and theory of enzyme immunoassays》 11 (1990)全書,特另'J是43-78頁； Elsevier,Amsterdam)中所述。對于本發(fā)明公開的成就，使用了在兔中產(chǎn)生 的多克隆抗體。然而，顯然還可以使用來自不同物種(如大鼠或豚鼠)的多 克隆抗體以及單克隆抗體。由于可以以任何數(shù)量產(chǎn)生具有恒定特性的單克 隆抗體，因此它們代表了在開發(fā)用于臨床常規(guī)的測定中的理想工具。在本 發(fā)明方法中CD99單克隆抗體的產(chǎn)生和使用還是另一優(yōu)選的實施方案。
技術(shù)人員會理解，既然已經(jīng)將CD99鑒定為用于診斷胰島素耐受性的 標(biāo)志物，就可以使用備選方法達(dá)到與本發(fā)明的成果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。例如可以 使用產(chǎn)生抗體的備選策略。這些策略包括使用代表CD99表位的合成肽用 于免疫等?；蛘呖梢允褂肈NA免疫，也稱為DNA接種。
為了進(jìn)行測量，在適于形成結(jié)合劑-CD99復(fù)合體的條件下使得自個體 的液*品接觸CD99的特異性結(jié)合劑。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員可以無需進(jìn) 行發(fā)明性努力而容易地鑒定這些適當(dāng)?shù)臏赜龡l件，因此這些條件無需指定。
作為本發(fā)明公開的方法的最后步驟，測量復(fù)合體的量并與胰島素耐受 性診斷進(jìn)行關(guān)聯(lián)，或者與各自的對照進(jìn)行關(guān)聯(lián)，如上文所述.本領(lǐng)域技術(shù) 人員會理解，在相關(guān)教科書中都詳細(xì)描述了測量特異性結(jié)合劑-CD99復(fù)合 體的多種方法(參閱如Tijssen P.，見上文或Diamandis，等編輯(1996) Immunoassay, Academic Press, Boston).
優(yōu)選以夾層型測定形式中檢測CD99。在這種測定中，使用第一種特 異性結(jié)合劑將CD99捕獲在一面，在另一面使用第二種經(jīng)標(biāo)記而可以直接 或間接檢測的特異性結(jié)合劑.
如上文所述，已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)可以在得自個體樣品的液體樣品中測量 CD99。在胰島素耐受性診斷中應(yīng)用標(biāo)志物CD99不需要組織和活抬r樣品。
在優(yōu)選的實施方案中，使用血清作為液體樣品材料實施本發(fā)明的方法。
在另 一優(yōu)選的實施方案中，使用血漿作為液體樣品材料實施本發(fā)明的 方法。
在另一優(yōu)選的實施方案中，使用全血作為液體樣品材料實施本發(fā)明的 方法。
對組織樣品應(yīng)用常規(guī)蛋白組學(xué)方法導(dǎo)致鑒定了許多針對所選擇組織的 潛在標(biāo)志物候選，然而令人驚奇地，本發(fā)明的發(fā)明人能夠檢測體液樣品中
的CD99。甚至更令人驚奇地，他們能夠證明在這些得自個體的液體樣品 中CD99分存在可與胰島素耐受性診斷相關(guān)。
可以在已建立的方法，例如原位胰島素耐受性、活檢或免疫組織學(xué)方 法中使用具很大優(yōu)勢的CD99抗體.
優(yōu)選地，在定性(CD99存在與否)或定量(測定CD99的量)免疫測定中 使用CD99抗體。
已經(jīng)證明在胰島素耐受性和糖尿病領(lǐng)域中測量蛋白質(zhì)CD99水平非常 具有優(yōu)勢。因此，在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及在由得自個體的 液體樣品進(jìn)行的胰島素耐受性診斷中使用蛋白質(zhì)CD99作為標(biāo)志分子。
術(shù)語標(biāo)志分子用于表示個體的體液中測量到的分析物CD99水平的變 化標(biāo)志著胰島素耐受性的存在。
優(yōu)選在II型糖尿病早期診斷中使用新標(biāo)志物CD99。 特別優(yōu)選在葡萄糖耐受不良的早期診斷中使用新標(biāo)志物CD99。 還特別優(yōu)選在糖尿病的疾病iUl監(jiān)測中使用新標(biāo)志物CD99, 使用蛋白質(zhì)CD99本身代表了胰島素耐受性診斷這一具有挑戰(zhàn)性的領(lǐng) 域的顯著進(jìn)步。將測量CD99與其他已知的糖尿病標(biāo)志物(如胰島素)或有 待發(fā)現(xiàn)的其他胰島素耐受性標(biāo)志物組合會引起進(jìn)一步的改進(jìn)。因此在另一 優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及在由得自個體的液,品進(jìn)行的糖尿病、 優(yōu)選胰島素耐受性診斷中使用CD99作為糖尿病、優(yōu)選胰島素耐受性標(biāo)志 分子與另一糖尿病、優(yōu)選胰島素耐受性的標(biāo)志分子組合。可以與胰島素耐 受性測量組合的優(yōu)選選擇的其他糖尿病標(biāo)志物為胰烏素、前胰島素和/或 C-肽。
通常最好以試劑盒形式提供特異性結(jié)合測定(如免疫測定)領(lǐng)域的診斷 試劑，所述試劑盒包括特異性結(jié)合劑和進(jìn)行測定所需的輔助試劑。因此本 發(fā)明還涉及免疫試劑盒，其包括CD99的至少一種特異性結(jié)合劑和用于測 量CD99的輔助試劑。
評估新標(biāo)志物CD99臨床可用性的一種方法是通過用EHC法測量葡 萄糖移去率來測量診斷為胰島素耐受性的17名患者中的水平，并與通過用 相同方法測定的表明為正常的17名患者中所測量的葡萄糖移去率水平進(jìn) 行比較。對于統(tǒng)計學(xué)分析，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)斯氏t檢驗，<0.05的值認(rèn)為是顯著 的。
測試的準(zhǔn)確性可以通過其接收器工作特性(ROC)進(jìn)行描述(特別參閱 Zweig， M. H.和Campbell, G.， Clin. Chem. 39 (1993) 561-577)。 ROC圖是 由在觀察數(shù)據(jù)的完整范圍內(nèi)連續(xù)改變判斷閾值而得到的所有敏感性/特異 性對的曲線。
實驗室測試的臨床性能取決于其診斷準(zhǔn)確性或?qū)⑹茉囌哒_歸類至臨 ^目關(guān)的亞組的能力。診斷準(zhǔn)確性測量該測試正確區(qū)分研究受試者中兩種 不同狀態(tài)的能力。這些狀態(tài)為例如使泉和疾病。
在每種情況下，ROC曲線描述在判斷閾值的完整范圍內(nèi)敏感性對1-特異性作圖得到的兩種分布之間的重疊，y軸為敏感性或真陽性分?jǐn)?shù)定義 為(真陽性測試結(jié)果數(shù))/(真陽性數(shù)+假陰性測試結(jié)果數(shù))l。這也稱為存在疾 病或病癥時的陽性度。它僅計算自受影響亞組.x軸為假陽性分?jǐn)?shù)或1々 異性[定義為(假陽性結(jié)果數(shù))/(真陰性結(jié)果數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù))l。它是特異性 的指標(biāo)，完全計算自未受影響亞組。由于真陽性和假陽性分?jǐn)?shù)通過使用來 自兩個不同亞組的測試結(jié)果完全單獨地計算，因此ROC圖獨立于疾病在 樣品中的優(yōu)勢，ROC曲線的每個點代表對應(yīng)于特定判斷閾值的敏感性/特 異性對.具有完美分辨力的測試(在結(jié)果的兩種分布之間無重疊)具有通過 左上角的ROC曲線，其中真陽性分?jǐn)?shù)為1.0或100%(完美的敏感性)，而 假陽性分?jǐn)?shù)為O(完美的特異性)。無分辨力的測試的理論曲線(兩個組結(jié)果 的分布相同)為從左下角到右上角的45。對角線。多數(shù)曲線落在這兩個極端 之間。(如果ROC曲線完全落在45。對角線以下，可以容易地通過將"陽性" 標(biāo)準(zhǔn)由"高于，，轉(zhuǎn)變?yōu)?低于，，來進(jìn)行校正，反之亦然。)定性地講，曲線與左 上角越接近，測試的總體準(zhǔn)確率就越高。
量化實驗室測試的診斷準(zhǔn)確率的一個便利的目標(biāo)是通過單個數(shù)字表達(dá)其性能。最普遍的總體度量是ROC曲線下的面積。常規(guī)上該面積總是^ 0.5(如果不是，可以通過倒轉(zhuǎn)判斷原則來使其達(dá)到)。數(shù)值在l.O(兩個組測 試值的完美分離)和0.5(兩個組的測試值之間沒有明顯的分布差異)之間。該 面積不僅僅取決于曲線的特定部分(如最接近對角線或90%特異性處的敏 感性的點)，而是取決于整個曲線。這是ROC曲線有多接近完美曲線(面積 =l.O)的定量描述性表達(dá)。
要求保護(hù)的還有基本如上文所述、特別是參閱以下實施例的方法、用 途和試劑盒。
提供以下實施例、參考文獻(xiàn)、序列表和圖表用于輔助理解本發(fā)明，本 發(fā)明的真正范圍在附帶的權(quán)利要求書中公開。應(yīng)該理解，可以對所公開的 方法進(jìn)行修飾而不背離本發(fā)明的精神。
實施例
實施例1
通過分析0脈內(nèi)皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)來鑒定胰烏素耐受性的候選內(nèi) 皮標(biāo)志蛋白
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記和與DNA微陣列雜交
基于將來自胰島素耐受性患者的血漿中蛋白質(zhì)水平與來自對照的血漿 進(jìn)行比較的分析，很明顯在胰島素耐受性個體中可以以更高水平檢測到內(nèi) 皮活化的標(biāo)志物。最近的文獻(xiàn)支持了這些發(fā)現(xiàn)(如Meigs等，JAMA 291 (2004) 1978 ff)。因此，帶有靶向它們而用于外排的信號序列的高表達(dá)的內(nèi) 皮蛋白或者帶有通過單跨膜序列錨定在膜上的大胞外結(jié)構(gòu)域的1型膜蛋白 都是內(nèi)皮活化的潛在新標(biāo)志蛋白。為了鑒定候選蛋白，在計算機(jī)芯片上分 析了胞外蛋白的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。筒言之，將靜脈的血洗 凈，接著灌注分散酶溶液(Roche，目錄號295 825，在DMEM中以1:10稀 釋)。將血管兩端封閉，在37'C溫育30分鐘。接著收集分離的內(nèi)皮細(xì)胞， 并用PBS洗滌臍靜脈一次。將細(xì)胞以320xg離心10分鐘，重懸于PO培養(yǎng) 基M199(Sigma目錄號M7528)+ 20%胎牛血清+ 1%青霉素/鏈霉素+ 1%谷氨酰胺+ 100jig/ml ECGS (Sigma目錄號E2759) + 100pg/ml肝素 (Sigma目錄號H3149) + 1/500體積慶大霉素(Roche目錄號1 059 467)。 24 小時后，洗下紅細(xì)胞，用新鮮P9培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。再溫育24小時后， 培養(yǎng)基更換為pl培養(yǎng)基:M199 (Sigma目錄號M7528 + 20%胎牛血清+ 1%青霉素/鏈霉素+ 1%谷氨酰胺+ 50pg/ml ECGS (Sigma目錄號 E2759) + 100>ig/ml肝素(Sigma目錄號H3149)。
將HUVEC在pl培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。48小時后，通過刮除來)|^ 細(xì)胞并用RNA-BeeTM提取細(xì)胞總RNA。對于每個樣品，取10將細(xì)胞總 RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(Invitrogen， U.S.)、標(biāo)記(Ambion， U.S.)并使用市售試劑盒 按照提供商的說明進(jìn)行處理。堿性熱斷裂和其后cDNA與U133A和B GeneChip陣列雜交的方法為微芯片生產(chǎn)商(Affymetrix, U.S.)提供的標(biāo)準(zhǔn) 方法。
用共焦激光掃描儀(Hewlett Packard, U.S.)記錄陣列中細(xì)胞的強(qiáng)度值， 使用GeneChip v3.1軟件(Affymetrix， U.S.)分析數(shù)據(jù)。以熒光強(qiáng)度與錯配寡 核苷酸雜交相比的歸一化平均差異來計算每個基因的表達(dá)水平，表達(dá)為平 均差異(A.D.)。該實驗以一式三份進(jìn)行，以解決生物學(xué)變異。
通過在計算機(jī)芯片上分析mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集來鑒定高表達(dá)的胞外蛋白質(zhì)
選擇了在上述數(shù)據(jù)蓋中顯示最高的mRNA水平(最高的A.D.值)的200 個基因。通過慣用的以概率方式預(yù)測信號和膜錨定序列的軟件工具分析相 應(yīng)的蛋白序列。簡言之，該軟件工具展示來自SwissProt或真核基因組中 預(yù)測的蛋白質(zhì)的信號肽或膜錨定預(yù)測。它基于一組專門的人工輔助的隱蔽 馬爾可夫模型(HMM),其試圖識別信號肽或錨各自的共有序列特征(Sean
R. Eddy, HMMER 2.3.2， httD:〃hmmer.wustl.edu)。由于并不能可靠地預(yù)測 這些信號序列，因此對任何給定輸入序列的"信號"和"錨"評分要在第二個 分析步驟中提交支持向量機(jī)(Support Vector Machine)(SVM)(Cristianini N， Shawe曙Taylor J. 《An Introduction to Support Vector Machines and other Kernel-based Learning Methods》.Cambridge University Press, Cambridge, England, 2000) 。 SVM為兩個類別對真實實例集合進(jìn)刊哨練。 在該訓(xùn)練集合中，SVM在三個訓(xùn)練集合(信號-錨-都不)中得到以下結(jié)果。 對預(yù)測為胞外("信號"或"錨")的蛋白質(zhì)進(jìn)一步評估器官特異性。進(jìn)行了對 編碼候選蛋白的公共結(jié)構(gòu)域表達(dá)序列標(biāo)簽的搜索，并按照組織來源進(jìn)行分 組。僅保留在血管中表達(dá)而且不在其他分泌器官(如肝、胰)中顯示強(qiáng)烈表 達(dá)的那些蛋白質(zhì).
實施例2
產(chǎn)生針對胰島素耐受性標(biāo)志物CD99的抗體
產(chǎn)生了針對胰島素耐受性標(biāo)志物CD99的多克隆抗體，以將抗體進(jìn)一 步用于通過免疫檢測測定(如Western印跡和ELISA)測量CD99的血清和 血漿和血液水平。
;U^桿菌中的重組蛋白表達(dá)
為了產(chǎn)生CD99的抗體，進(jìn)行蛋白質(zhì)的重組表達(dá)以獲得免疫原。應(yīng)用 RTS100表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌的組合來完成表達(dá).在笫一步中，分析DNA 序列并使用"ProteoExpert RTS E.coli HY，，系統(tǒng)獲得高產(chǎn)量cDNA沉默突 變變體及其各自PCR引物序列的推薦。這是基于商業(yè)網(wǎng)絡(luò)的服務(wù) (www.proteoexpert.com)。使用推薦的引物對，使用"RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His誦tag" (Roche Diagnostics GmbH， Mannheim， Germany, Cat.No. 3186237)系統(tǒng)由cDNA產(chǎn)生線性PCR模板并用于體外轉(zhuǎn) 錄和表達(dá)編碼CD99蛋白的核苷酸序列。為了進(jìn)行Western印跡檢測和其
后的純化，表達(dá)的蛋白質(zhì)含有His標(biāo)簽。鑒定表達(dá)最佳的變體。按照生產(chǎn) 商的說明進(jìn)行從PCR到表達(dá)和檢測的所有步驟。按照生產(chǎn)商的說明將含有 所有必需T7調(diào)節(jié)區(qū)(啟動子、核糖體結(jié)合位點和T7終止子)的各個PCR產(chǎn) 物克隆進(jìn)pBAD TOPO⑧栽體(Invitrogen， Karlsruhe, Germany,目錄號K 4300/01)。為了使用T7調(diào)節(jié)序列進(jìn)行表達(dá)，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL 21(DE3)(Studier， F.W.，等，Methods Enzymol. 185 (19卯)60-89),并以1升 的批次培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌用于蛋白質(zhì)表達(dá)。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法在Ni-螯合柱上完成His-CD99融合蛋白的純化。簡言之， 通過離心沉淀含有His-CD99融合蛋白表達(dá)載體的1升細(xì)菌培養(yǎng)物。將細(xì) 胞沉淀物重懸于含有磷酸鹽，pH8.0、 7M氯化胍、咪唑和巰甘油的裂解緩 沖液中，接著使用111&3-1110^乂@進(jìn)行勻漿。通過高速離心沉淀不溶物質(zhì)并 將上清液應(yīng)用于Ni-螯合層析柱。用幾倍柱床體積的裂解緩沖液^a,接著 用含有磷酸鹽,pH 8.0和尿素的緩沖液洗滌.fe^使用含有SDS的磷酸緩 沖^酸性條件下洗脫結(jié)合的抗原。
產(chǎn)生針對蛋白質(zhì)CD99的單克隆抗體
a) 免疫小鼠
用100將CD99皿內(nèi)最初免疫12周齡的A/J小鼠。6周后以一個月 的間隔進(jìn)一步腹膜內(nèi)免疫兩次。在這個過程中，對每個小鼠施用100叫吸 附在氫氧化鋁上的CD99以及109個百日咳博德特氏菌(5onfete/te pert"柳's)細(xì)菌.其后在融合前第3天和第2天^^吏用PBS中的100將CD99 通過靜脈內(nèi)進(jìn)行后兩次免疫。
b) 融合和克隆
Galfre， G.和Milstein， C.， Methods in Enzymology 73 (1981) 346 將按照a)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合。在該過程中，將免疫小鼠 的約lx108個脾細(xì)胞與2xl07個骨髄瘤細(xì)胞(P3X63-Ag8-653， ATCC CRL1580)混合并離心(4。C， 300 g， 10分鐘)。接著用無胎牛血清(FCS)的
RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，并在50 ml錐形管中以400 g再次離心。 棄去上清液，輕敲將細(xì)胞沉淀打散，加入lmlPEG(分子量4000, Merck， Darmstadt)并吹打混合。37。C水浴1分鐘后，室溫下在4-5分鐘的時間內(nèi) 逐滴加入5 ml無FCS的RPMI 1640。其后在約1分鐘內(nèi)逐滴加入含10% FCS的5 ml RPMI 1640，徹底混合，用培養(yǎng)基(RPMI 1640+10% FCS)補 足50 ml，接著在4。C以400 g離心10分鐘。將沉淀細(xì)胞置于含有10 % FCS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并接種在次黃噤呤-偶氮絲氨酸選擇培養(yǎng)基(RPMI 1640中的100 mmol/1次黃噪呤、1將/ml偶氮次黃噪—10% FCS)中。在 培養(yǎng)基中以100 U/ml加入白細(xì)胞介素6作為生長因子。約10天后，對原 代培養(yǎng)物測試特異性抗體。使用熒光激活細(xì)胞M儀將CD99陽性原代培 養(yǎng)物克隆進(jìn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。在此過程中，在培養(yǎng)基中再加入IOO U/ml 的白細(xì)胞介素6作為生長添加劑。
c)從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中分離免疫球蛋白
以每ml lxl()S個細(xì)胞的密度將得到的雜交瘤細(xì)胞接種到含有10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，并在發(fā)酵罐(Thermodux Co.， Wertheim/Main， ModelMCS-104XL，訂購號144-050)中增殖7天。平均來說，在培養(yǎng)物上 清液中得到每ml 100嗎濃度的單克隆抗體。通過蛋白質(zhì)化學(xué)常規(guī)方法從 培養(yǎng)物上清液中純化該抗體(如按照Bruck， C.，等，Methods in Enzymology 121 (1986) 587-695)。
產(chǎn)生多克隆抗體 a)免疫
為進(jìn)行免疫，制M白質(zhì)溶液(100 jig/ml蛋白質(zhì)CD99)和弗氏完全佐 劑l:l比例的新鮮乳劑。在第l、 7、 14和30、 60和90天用1 ml乳劑免 疫每只兔子。抽血并使用得到的抗CD99血清進(jìn)行如實施例3和4所述的 其他實驗.
b)通過用辛酸和硫酸銨進(jìn)行連續(xù)沉淀從兔血清中純化IgG(免疫球蛋白G) 用4倍體積的乙酸緩沖液(60mM， pH4.0)稀釋一倍體積的兔血清。用 2 M Tris-base將pH調(diào)整至4.5。在劇烈攪拌下逐滴加入辛酸(25 jil/ml稀釋 樣品)。30分鐘后離心樣品(13000xg, 30分鐘，4。C)，棄去沉淀并收集上清 液。通過加入2 M Tris-base將上清液的pH調(diào)整至7.5并過濾(0.2 nm)。在 劇烈攪拌下通過逐滴加入4 M硫酸銨溶液至終濃度2 M來沉淀上清液中的 免疫球蛋白。通過離心收集沉淀的免疫球蛋白(8000xg， 15分鐘，4°C)。
棄去上清液。將沉淀溶于10 mM NaH2P04/NaOH， pH 7.5、 30 mM NaCl并充分透析。離心透析物(13000xg， 15分鐘，4'C)并過濾(0.2 jim)。
多克隆兔IgG的生物素化
將多克隆兔IgG用10 mM NaH2P04/NaOH、 pH 7.5, 30 mM NaCl 調(diào)節(jié)到10 mg/ml。在每ml IgG溶液中加入50 jil生物素-N-羥基琥珀酰亞 胺(DMSO中3.6 mg/ml)。室溫30分鐘后，在Superdex 200 (10 mM NaH2P04/NaOH， pH 7.5、 30 mM NaCl)上層析樣品。收集含有生物素化 IgG的級分。單克隆抗體已按照同一方法進(jìn)行生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黃毒苷化
將多克隆兔IgG用10 mM NaH2P04/NaOH、 pH 7.5, 30 mM NaCl 調(diào)節(jié)到10 mg/ml。每ml IgG溶'紗入50 pi洋地黃毒苷-3-0-甲基絲-s-4RJ^己^"N-羥^t珀酰亞胺酯(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, 目錄號1 333 054)(DMSO中3.8 mg/ml)。室溫30分鐘后，在Superdex 200 (10 mM NaH2P04/NaOH， pH7.5、 30 mM NaCl)上層析樣品。收集含有洋 地黃毒苷化IgG的級分。單克隆抗體已按照同一方法用洋地黃毒苷標(biāo)記。
實施例3
Western印跡
將通過肝素柱從培養(yǎng)基中富集并分離(如上文所述)的蛋白質(zhì)樣品溶于
由10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 150 mM NaCl、 0.05 % Tween 20、 1 % SDS 組成的樣品緩沖液，并在4。C以12000 g離心10分鐘。使用建立自一系列 已知牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過Bradford測量上清液的蛋白質(zhì) 濃度。將樣品與樣品緩沖液(60 mM Tris-HCl、 2% SDS、 0.1%溴酚藍(lán)、25% 甘油和14.4 mM 2-巰基乙醇，pH 6.8)混合并在70卩溫育5分鐘后，通過 12.5 %均相ExcelGel SDS凝膠(Amersham Bioscience)分離樣品并電轉(zhuǎn)移至 硝酸纖維素膜上。在封閉液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5、 150 mM NaCI、0.05% Tween 20和5%脫脂乳粉)中溫育后，將膜分別與兔抗大鼠抗體在室溫下溫 育2小時。用洗滌溶液(tris緩沖鹽水中0.3% Tween 20)洗滌三次，每次10 ^紳后，室溫下將膜分別與級^^根過氧化物酶的抗兔IgG(H+L)、抗小鼠 IgGi 和抗'J、鼠 IgG2a (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL)溫育1小時。洗膜10分鐘3次，按照生產(chǎn)商的方案通過 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Western Lightning TM， PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA)在X光膠片上使抗原-抗體復(fù)合體顯色。
實施例4
用于測量人血清和血漿樣品中CD99的ELISA
為了檢測人血清或血漿中的CD99而開發(fā)了夾層ELISA。為了捕獲和 檢測抗原，將抗CD99多克隆抗體(參閱實施例2)的等分試樣分別與生物素
和洋地黃毒苷綴合。
將包被鏈霉抗生物素蛋白的96孔微量滴定板與10 mM磷酸，pH 7.4, 1% BSA, 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中的100 pi 10 jig/ml的生物素化 抗CD99多克隆抗體溫育60分鐘。溫育后，用0.9。/。NaCl ， 0.1% Tween 20洗滌平板三次。接著將孔與作為標(biāo)準(zhǔn)抗原的重組蛋白(參閱實施例2)連 續(xù)稀釋液或來自患者的稀釋血漿樣品溫育2小時。結(jié)合CD99之后，用0.9%NaCl , 0.1% Tween 20洗滌平板三次。為了特異性檢測結(jié)合的CD99,將 孔與10 mM磷酸，pH 7.4， 1% BSA， 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中的 100 fil 10 ng/ml的洋地黃毒苷化抗CD99多克隆抗體溫育60分鐘。其后洗 滌平板三次以去除未結(jié)合的抗體。在下一步驟中，在10mM磷酸，pH7.4， 1% BSA, 0.9% NaCl和0.1% Tween 20中將孔與20 mU/ml抗洋地黃毒苷 -POD綴合物(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,目錄號 1633716)溫育60分鐘。其后用同一緩沖液洗滌平板三次。為了檢測抗原-抗體復(fù)合體，將孔與100 pi ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,目錄號11685767)溫育并在30-60分鐘后用ELISA 讀數(shù)器測量405 nm處的OD。
實施例5
患者數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析
新標(biāo)志物CD99的臨床實用性通過測量其在IO名依賴外源胰島素注射 的糖尿病患者中的水平并將該水平與表明為正常^細(xì)胞功能的IO名患者中 測量的水平進(jìn)行比較來評估.通過標(biāo)準(zhǔn)斯氏t檢,估進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析， 認(rèn)為<0.05的值是顯著的.
權(quán)利要求
1.監(jiān)測糖尿病發(fā)展的方法，所述方法包括以下步驟a)提供得自個體的液體樣品，b)將所述樣品與CD99的特異性結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和CD99之間形成復(fù)合體的條件下接觸，和c)將(b)中形成的復(fù)合體的量與胰島素耐受性中形成的復(fù)合體的量相關(guān)聯(lián)。
2. 監(jiān)測糖尿病療效的方法，所述方法包括以下步驟a) 提供得自針對糖尿病進(jìn)行治療的患者的液體樣品，b) 將所述樣品與CD99的特異性結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和CD99 之間形成復(fù)務(wù)沐的M下接觸，和c) 將(b)中形成的復(fù)合本的量與無治療時形成的復(fù)合體的量相關(guān)聯(lián)。
3. 診斷胰島素耐受性的方法，所述方法包括以下步驟a) 提供得自個體的液,品，b) 將所述樣品與CD99的特異性結(jié)合劑在適于所述結(jié)合劑和CD99 之間形成復(fù)合體的務(wù)ff下接觸，和c) 將(b)中形成的復(fù)合體的量與胰島素耐受性診斷相關(guān)聯(lián)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其特M在于所述樣品為血清o
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其特M在于所述樣品為 血漿。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其特M在于所述樣品為 全血，
7. 蛋白質(zhì)CD99作為標(biāo)志分子的用途，用于從得自個體的液體樣品 診斷胰島素耐受性。
8. 蛋白質(zhì)Endoglin作為標(biāo)志分子的用途，用于從得自個體的液^# 品早期診斷II型糖尿病。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中用來自患有葡萄糖耐受不良的患者 的樣品進(jìn)行早期診斷。
10. 蛋白質(zhì)CD99用于監(jiān)測糖尿病尤艮的用途。
11. 蛋白質(zhì)CD99用于監(jiān)測糖尿病療效的用途。
12. 蛋白質(zhì)CD99作為胰島素耐受性的標(biāo)志分子的用途，與胰島素耐 受性的至少一種其他標(biāo)志分子組合用于從得自個體的液體樣品診斷胰島素 耐受性。
13. 免疫試劑盒，其包含CD99的至少一種特異性結(jié)合劑以及用于測 量CD99的輔助試劑。
14. 篩選與CD99相互作用的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a) 將蛋白質(zhì)CD99與一種或多種化合物在允許所述一種或多種化合 物與CD99相互作用的條件下接觸；和b) 檢測所述一種化合物或多種化合物與所述多肽之間的相互作用.
15. 篩選可以預(yù)防和/或抑制和/或減弱胰島素耐受性的化合物的方法， 所述方法包括以下步驟a) 將化合物與蛋白質(zhì)CD99接觸；b) 測量蛋白質(zhì)CD99的活性；其中抑制蛋白質(zhì)CD99活性的化合物為可以預(yù)防和/或抑制胰島素耐受 性的化合物。
16. 權(quán)利要求14和15任一項的方法，所述方法還包括在步驟a)之前 或步驟a)和b)之間固定化蛋白質(zhì)CD99的步驟。
17. 篩選預(yù)防和/或抑制和/或延緩胰島素耐受性的化合物的方法，所述 方法包括檢測在存在或不存在所述化合物的情況下從宿主分泌的可溶性 CD99的步驟，其中預(yù)防和/或抑制和/或^胰島素耐受性的化合物為改變 宿主分泌的CD99水平的化合物。
18. 蛋白質(zhì)CD99作為乾標(biāo)和/或標(biāo)志物的用途，用于篩選預(yù)防和/或抑 制胰島素耐受性的化合物。
19. 基本如上文所述、特別是參考上述實施例描述的方法、用途和試 劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過測量液體樣品中的CD99水平來監(jiān)測疾病發(fā)展和診斷胰島素耐受性，以及篩選用于預(yù)防和/或治療糖尿病的新化合物。
文檔編號G01N33/566GK101099084SQ200580046397
公開日2008年1月2日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者E·謝伯科娃, M·L·馬丁, M·豐圖拉基斯, P·伯恩特, S·埃弗斯, S·福瑟爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司