專利名稱：作為PPARδ調(diào)節(jié)標(biāo)志的PDK的制作方法
過氧化物增殖物激活受體(PPAR)是核激素受體超家族成員。PPAR是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和控制多種代謝途徑的配體激活型轉(zhuǎn)錄因子。已描述了三種PPAR亞型，它們是PPARα、PPARδ(也稱作PPARβ)和PPARγ。PPARδ是普遍表達(dá)的。PPARα主要表達(dá)于肝、腎和心臟。至少有兩種主要的PPARγ的同工型。PPARγ1在大多數(shù)組織中表達(dá)，而另一個更長的同工型PPARγ2近乎專一性的在脂肪組織中表達(dá)。PPAR調(diào)節(jié)多種生理反應(yīng)，其包括葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂類穩(wěn)態(tài)和代謝的調(diào)節(jié)、能量平衡、細(xì)胞分化、炎癥和心血管事件。
接近半數(shù)的冠狀動脈疾病患者的血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度低。在約25年前首次強(qiáng)調(diào)了HDL的抗動脈粥樣硬化功能，并且激起了對影響HDL水平的遺傳和環(huán)境因素的研究。HDL的保護(hù)性功能來自它在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用。HDL介導(dǎo)了從外周組織細(xì)胞，包括動脈壁的動脈粥樣硬化損傷中的那些細(xì)胞移走膽固醇。隨后，HDL將其中的膽固醇遞送到肝臟和固醇代謝器官，以便使其轉(zhuǎn)化為膽汁和清除。來自Framingham的研究數(shù)據(jù)顯示，HDL-C水平是患冠狀動脈疾病風(fēng)險的預(yù)示，該患病風(fēng)險不依賴于LDL-C(低密度脂蛋白膽固醇)水平(Gordon等人，Am.J.Med.1977，62，707-714)。據(jù)估計(jì)，在HDL-C小于35mg/dl的20歲及20歲以上的美國人當(dāng)中，年齡調(diào)整的患病人數(shù)是16％(男性)和5.7％(女性)。目前，可以使用多種制劑中的煙酸治療實(shí)現(xiàn)HDL-C的實(shí)質(zhì)性增長。然而，相當(dāng)大的副作用限制了該方法的治療潛力。
在美國，被診斷為2型糖尿病的1400萬患者中，有90％的人超重或肥胖，而且高比例的2型糖尿病患者脂蛋白濃度異常?？偰懝檀迹?40mg/dl的患病人數(shù)在男性糖尿病患者中是37％，在女性中是44％。對于LDL-C＞160mg/dl患病人數(shù)，男女患者的各自比率分別是31％和44％，對于HDL-C＜35mg/dl，分別是28％和11％。糖尿病是由于對胰島素作用的響應(yīng)發(fā)生部分損傷導(dǎo)致患者對血液中葡萄糖水平的控制能力下降的疾病。II型糖尿病(T2D)又稱為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)，在發(fā)達(dá)國家80-90％的糖尿病患者為II型糖尿病。在T2D中，胰腺的郎格漢島持續(xù)產(chǎn)生胰島素。然而，胰島素作用的靶器官(主要是肌肉、肝臟和脂肪組織)對胰島素刺激表現(xiàn)出完全的抗性。身體通過產(chǎn)生非生理性高水平的胰島素持續(xù)補(bǔ)償，在疾病晚期由于胰腺的胰島素產(chǎn)生能力耗盡和衰退使胰島素水平最終下降。因此T2D是伴有包括胰島素抵抗、血脂異常、高血壓、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和炎性動脈粥樣硬化在內(nèi)的多種共病的心血管代謝綜合征。
用于血脂異常和糖尿病的一線治療通常包括低脂和低糖飲食、運(yùn)動和減輕體重。然而，順應(yīng)性可以是適度的，隨著疾病發(fā)展，需要使用諸如用于血脂異常的他汀類和貝特類脂調(diào)節(jié)劑和諸如用于胰島素抵抗的磺酰尿或二甲雙胍的低血糖藥物治療多種代謝缺陷。近來引入的一類有前景的新藥能夠恢復(fù)患者對其自身胰島素的敏感性(胰島素致敏劑)，由此使血糖和甘油三酯水平恢復(fù)正常，并且在很多情況下避免或減少對外源胰島素的需要。吡格列酮(ActosTM)和羅格列酮(AvandiaTM)屬于噻唑烷二酮(TZD)類PPARγ激動劑并且是該類藥物中第一個在多個國家獲準(zhǔn)用于治療NIDDM的藥物。然而，這些化合物受到包括少見但嚴(yán)重的肝毒性(如使用曲格列酮所見)在內(nèi)的副作用的影響。它們還會增加患者體重。因此，急需新的、更有效的并且具有更高的安全性和更低的副作用發(fā)生率的藥物。近來研究提供證據(jù)表明，PPARδ的激動作用將使化合物具有提高的治療潛力(即此類化合物應(yīng)該能夠改善脂譜)、與當(dāng)前所用治療相比對HDL-C增加具有更好的影響以及對胰島素水平正常化具有額外積極的影響(Oliver等人；Proc Nat Acad Sci USA 2001；985306-11)。新近觀察還表明，PPARδ激動劑除了具有眾所周知的降低甘油三酯的功能之外，還對胰島素致敏具有不依賴于PPARα介導(dǎo)的的影響(Guerre-Millo等人；J BiolChem 2000；27516638-16642)。因此，選擇性的PPARδ激動劑或具有額外的PPARα活性的PPARδ激動劑具有更好的治療功效而沒有在使用PPARγ激動劑時所出現(xiàn)的體重增加的副作用。
本發(fā)明涉及PPARδ調(diào)節(jié)的標(biāo)志以及用于診斷與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病的方法、用于監(jiān)測對患有PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病的患者的治療情況的方法和用于鑒定調(diào)節(jié)PPARδ活性的化合物的方法。
編碼丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4(PDK4)的基因被鑒定為PPARδ的直接靶基因，而且該基因可以用作PPARδ的生物標(biāo)志。PDK4涉及對禁食的代謝反應(yīng)。
PDK4曾經(jīng)作為PPARα的靶基因被描述過(Sugden等人，Diabetes.2001；50(12)2729-2736)。然而新近研究提出，在某些組織和細(xì)胞中PPARδ對PDK4基因的作用至少與PPARα同樣大。特別是在肌細(xì)胞中PDK4基因主要由PPARδ激活。
本發(fā)明提供PDK4用作檢測或監(jiān)測PPARδ調(diào)節(jié)的標(biāo)志的用途。優(yōu)選地，PDK4用作檢測或監(jiān)測肌細(xì)胞中PPARδ調(diào)節(jié)的標(biāo)志。PDK4還可以用于確定肌細(xì)胞中的毒性。肌細(xì)胞可以是骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞。
如本文所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”涉及PPARδ轉(zhuǎn)錄活性的激活或抑制。因此，PDK4可以作為PPARδ活性調(diào)節(jié)的標(biāo)志。
如本文所用的術(shù)語“標(biāo)志”意指核酸或多肽。
本發(fā)明還涉及將PDK4作為診斷涉及PPARδ活性調(diào)節(jié)異常的疾病諸如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的標(biāo)志。因此，PDK4可以作為檢測PPARδ活性調(diào)節(jié)的標(biāo)志。
本發(fā)明還提供了檢測或監(jiān)測宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4 mRNA的表達(dá)水平。代表性的小鼠PDK4 cDNA示于SEQ.IDNO1。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的mRNA表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它能夠進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄(包括體外轉(zhuǎn)錄)的生物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照可以是不同宿主的PDK4 mRNA表達(dá)水平。
此外，本發(fā)明提供了確定測試化合物是否調(diào)節(jié)宿主中PPARδ活性的方法，其包括a)將宿主暴露于測試化合物，和b)定量PDK4的mRNA表達(dá)水平。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的mRNA表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄(包括體外轉(zhuǎn)錄)的生物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照是未處理宿主中的PDK4 mRNA表達(dá)水平，該宿主可以是處理前的上述宿主或不同的宿主和/或經(jīng)過適當(dāng)時間處理后達(dá)到處理前正?；降纳鲜鏊拗?。在上文所述方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)PPARδ活性的化合物是拮抗物或者激動劑。
本發(fā)明還提供了用于監(jiān)測對患有與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病例如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的患者的治療情況的方法，其包括步驟a)從分離自使用PPARδ活性調(diào)節(jié)物所治療患者的肌細(xì)胞純化mRNA，和b)測定PDK4的mRNA表達(dá)。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的mRNA表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄(包括體外轉(zhuǎn)錄)的生物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照是未處理宿主中的PDK4 mRNA表達(dá)水平，該宿主可以是處理前的上述宿主或不同的宿主和/或經(jīng)過適當(dāng)時間處理后達(dá)到處理前正?；降纳鲜鏊拗?。
本發(fā)明還涉及通過上文所述方法鑒定的化合物以及涉及通過上文所述方法所鑒定化合物在制備治療與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的藥物中的用途。
可以使用用于測定PDK4 mRNA表達(dá)水平的多種方法。諸如Northern印跡和通過光密度測定對條帶定量是本技術(shù)領(lǐng)域所熟知的，盡管它們可能不夠精確，但可以使用。其它方法包括使用基因芯片、微列陣分析、斑點(diǎn)印跡或不同的定量PCR的方法。優(yōu)選使用Taqman或?qū)崟r定量PCR。所轉(zhuǎn)錄的PDK4序列的任何部分都可以用作探針。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDK4的mRNA表達(dá)水平通過使用表2所列正向引物和反向引物(SEQ.ID NO4和5)的實(shí)時定量PCR確定。優(yōu)選對肌細(xì)胞中的PDK4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量。
本發(fā)明還提供了檢測或監(jiān)測宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4蛋白的表達(dá)水平。SEQ.ID NO3顯示小鼠PDK4的蛋白質(zhì)序列。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯(包括體外翻譯)的生物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照是不同宿主中的PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
此外，本發(fā)明提供了確定測試化合物是否調(diào)節(jié)宿主中PPARδ活性的方法，其包括c)將宿主暴露于測試化合物，和d)定量PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它可以進(jìn)行可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯(包括體外翻譯)的生物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照是未處理宿主中的PDK4蛋白質(zhì)表達(dá)水平，該宿主可以是處理前的上述宿主或不同的宿主和/或經(jīng)過適當(dāng)時間處理后達(dá)到處理前正?；降纳鲜鏊拗鳌Ｋ拗骺梢杂幂d體處理。該載體可以是能夠溶解或重懸化合物的溶劑。在上文所述方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)PPARδ活性的化合物是拮抗物或者激動劑。
此外，本發(fā)明還提供了用于監(jiān)測對患有與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的患者的治療情況的方法，其包括步驟a從分離自使用PPARδ活性調(diào)節(jié)物所治療患者的肌細(xì)胞純化蛋白質(zhì)，和b)測定PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)。
在上文所述方法的一個實(shí)施方案中，PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平是相對于對照確定的。
宿主可以是動物、組織、細(xì)胞或任何其它可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯(包括體外翻譯)的物系統(tǒng)。優(yōu)選地，動物是非人動物。對照是未處理宿主中的PDK4蛋白質(zhì)表達(dá)水平，該宿主可以是處理前的上述宿主或不同的宿主和/或經(jīng)過適當(dāng)時間處理后達(dá)到處理前的正?；降纳鲜鏊拗?。
可以使用用于測定PDK4蛋白質(zhì)表達(dá)水平的幾種方法。這些方法包括但不限于二維凝膠分離、質(zhì)譜分析、抗體結(jié)合技術(shù)(ELISA、western印跡)和免疫沉淀。優(yōu)選地，對肌細(xì)胞中的PDK4蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行定量。
本發(fā)明還涉及通過上文所述方法鑒定的化合物以及涉及通過上文所述方法所鑒定化合物在制備治療與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的藥物中的用途。
現(xiàn)已大體描述了本發(fā)明，通過參考具體的實(shí)施例并結(jié)合附圖將能夠更好地理解本發(fā)明，除非另外說明，本文所包括的這些實(shí)施例僅旨在闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。


圖1使用Affymetrix芯片檢測的由表1中的PPAR配體(A300μM、B100nM、C500nM)誘導(dǎo)C2C12小鼠肌細(xì)胞中PDK4基因表達(dá)改變倍數(shù)的圖示。PDK4丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4[PPARδ活性標(biāo)志]，A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸)[PPARα激動劑]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸[PPARδ-α共激動劑]，C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸[PPARδ激動劑]。
圖2使用qPCR檢測的由表3中的PPAR配體(A300μM、B100nM、C500nM、D500nM)誘導(dǎo)的C2C12小鼠肌細(xì)胞中PDK4基因表達(dá)改變倍數(shù)的圖示。PDK4丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4[PPARδ活性標(biāo)志]，A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸)[PPARα激動劑]，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸[PPARS-α共激動劑]，C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸[PPARδ激動劑]，D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-乙酸[PPARδ-α共激動劑]。
實(shí)施例除非另外指出，實(shí)施例中涉及的商業(yè)可得試劑根據(jù)產(chǎn)品說明書使用。
實(shí)施例1微列陣實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)C2C12細(xì)胞(ATCCCRL1772)細(xì)胞在添加了10％熱滅活胎牛血清(FCS)的DMEM(5mM葡萄糖)中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基在使用前經(jīng)過0.2μm孔過濾。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合時，使用血清減少的培養(yǎng)基(DMEM高葡萄糖、2％FCS)在六孔皿中進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。而后細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃、90％濕度和95％-空氣-5％-CO2的無菌環(huán)境中孵育5天使其分化。
將PPAR配體溶解于100％DMSO并加入培養(yǎng)液調(diào)整DMSO終濃度為0.1％(v/v)，并且將細(xì)胞與配體在正常生長條件下孵育20小時。每種條件下進(jìn)行三個重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
RNA提取用Qiagen QIAschredder和RNeasy試劑盒進(jìn)行RNA提取。
將沉淀的每一樣品大約1×106個細(xì)胞重懸于350μl含有RLT的硫氰酸胍。將樣品加入到QIAshredder柱并全速離心2分鐘使裂解液均質(zhì)化。向流過液中加入350μl乙醇以獲得更好的結(jié)合條件，之后樣品加入到Rneasy spin柱中。對于第一次洗滌步驟，吸取350μl RW1緩沖液加入到柱中。然后將10μl DNase溶液與70μl RDD緩沖液輕輕混合后加于柱中并于室溫孵育15分鐘以除去基因組DNA。用350μl RW1緩沖液洗去DNase。通過加入500μl RPE緩沖液進(jìn)行兩次洗滌純化步驟。RNA用水洗脫并保存于-70℃。
cDNA合成使用Roche Diagnostics提供的cDNA合成系統(tǒng)試劑盒并按照產(chǎn)品說明書合成cDNA。整個合成過程在冰上進(jìn)行。
對于第一鏈合成，將2μl Oligo d(T7)T24引物(5’GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-(T)24VN 3’，200pmol/μl)和重蒸水加入到多達(dá)20μg的RNA中，最終反應(yīng)體積為21μl在熱循環(huán)器中于70℃溫育10分鐘并且引物雜交至RNA之后，加入2μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶和4μl dNTP混合物(10mM)。向混合物中補(bǔ)加8μl RT緩沖液、4μlDTT(0.1 mM)和1μl RNase抑制劑。隨后在42℃溫育60分鐘。
將合成第二鏈的試劑直接加入到第一鏈反應(yīng)管中。將6.5μl的第二鏈酶混合物加入到混合物中，該酶混合物含有用于在DNA/RNA雜合體的RNA上插入缺口的RNase。這為DNA聚合酶I提供了3’OH引物，DNA聚合酶I和大腸桿菌(E.coli)連接酶一起存在于第二鏈酶混物中。另外加入1.5μl dNTP混合物、30μl第二鏈緩沖液和72μl重蒸水并輕輕混合。反應(yīng)混合物在16℃溫育2小時。添加20μl T4聚合酶以保證于16℃溫育5分鐘之后cDNA末端是平端。隨后將樣品用RNase處理以除去RNA模板(于37℃下30分鐘)并用蛋白酶K處理(37℃，30分鐘)。
cDNA純化使用Quiagen提供的QIAquick PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。
將850μl PB緩沖液加入到cDNA反應(yīng)管并混合。將樣品加入到QIAquick柱中并于13000轉(zhuǎn)/分離心30秒。將750μl PE緩沖液加入到柱中以洗滌cDNA。隨后在最大速度離心使柱子完全干燥。為了洗脫DNA，向膜中心加入50-80μl EB緩沖液(10mM Tris-Cl，pH8.5)并將樣品于13000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢查cDNA質(zhì)量。
出現(xiàn)從100bp到＞10000bp的成片條帶。通過用分光光度計(jì)測量260nm和280nm下的吸光度來確定所合成cDNA的量和純度。
如下計(jì)算濃度c[μg/ml]＝A260×50×D，(50dsDNA的特定系數(shù)，D稀釋系數(shù))。cDNA的A260/A280的比值為1.8-2.1。
體外轉(zhuǎn)錄(IVT)使用Ambion的MEGAscript T7試劑盒開展本步驟。
從每種樣品取5μg cDNA作為模板并將其與ATP、GTP、CTP、UTP(Ambion)和生物素化的CTP(Bio-11-CTP，ENZO)、生物素化的UTP(Bi0-15-UTP，ENZO)混合。用T7酶混合物于37℃進(jìn)行RT反應(yīng)4小時。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用Qiagen的RNeasy試劑盒按照與RNA提取相同的步驟純化，樣品不經(jīng)過任何DNase處理。
IVT產(chǎn)物的片段化將來自IVT的15μgRNA在小體積(20-30μl)的200mM Tris-乙酸鹽pH8.1、500mM KOAc、150mM MgOAc中于95℃片段化35分鐘。芯片處理(參考DNA Microarray Protocols V3-200.1.M Wilhelm-Seiler，UCerta)首先將預(yù)處理溶液(6.25μl乙?；疊SA(20μg/μl)、12.5μl鮭精DNA(10μg/μl)、125μl2×MES雜交緩沖液、106.25μl水)應(yīng)用于基因芯片。將基因芯片在回轉(zhuǎn)式烤爐中以60轉(zhuǎn)/分的速度于40℃溫育15分鐘。
用于雜交的樣品制備如下將15μg片段化的RNA與2.5μl對照母液混合，母液含有BioB、BioC、BioD、Cre(內(nèi)參照)、2.5μl鮭精DNA(10μg/μl)、6.25μl乙?；疊SA(20μg/μl)、125μl2×MES雜交緩沖液、91.25μl水。然后將芯片在回轉(zhuǎn)式烤爐中于45℃旋轉(zhuǎn)(60轉(zhuǎn)/分)溫育過夜。
將樣品移出并保存于-20℃。用6×SSPE以射流技術(shù)洗滌芯片5分鐘。然后用230μl MES洗滌緩沖液洗滌已于45℃以60轉(zhuǎn)/分溫育30分鐘的芯片。
將芯片與下列溶液溫育15分鐘進(jìn)行染色，所述溶液為125μl 2×染色緩沖液、91.25μl乙酰化BSA、2.5μl鏈霉抗生物素蛋白(1mg/ml)。
移去染色液，將芯片用6×SSPE以射流技術(shù)洗5分鐘后用擴(kuò)增溶液處理，擴(kuò)增溶液為125μl 2×染色緩沖液、99μl水、1μl生物素化的抗-鏈霉抗生物素蛋白(500μg/ml)、25μl乙?；疊SA(20μg/μl)。在回轉(zhuǎn)式烤爐中于40℃以60轉(zhuǎn)/分溫育30分鐘。用6×SSPE以射流技術(shù)洗滌芯片之后，將芯片與藻紅蛋白溶液(125μl 2×染色緩沖液、91.25μl水、31.25 μl乙?；疊SA、2.5μl藻紅蛋白(1mg/ml))于40℃以60轉(zhuǎn)/分溫育。
溶液12×MES母液 70.4g MES游離酸一水合物、193.3g MES鈉鹽，調(diào)節(jié)pH至6.6，加三蒸水至1000ml2×MES雜交緩沖液 8.3ml 12×MES母液、17.7ml 5M NaCl、4ml 0.5MEDTA、0.1ml 10％吐溫20、19.9ml三蒸水MES洗滌緩沖液 83.3ml 12×MES母液、5.2ml 5M NaCl、1ml 10％吐溫20、加三蒸水至1000ml6×SSPE吐溫 300ml 20×SSPE、1ml 10％吐溫20，加三蒸水至1000ml2×染色緩沖液 41.7ml 12×MES母液、92.5ml 5M NaCl、2.5ml
10％吐溫20、113.3ml三蒸水用Affymetrix掃描儀進(jìn)行掃描，用Affymetrix的基因芯片軟件得到結(jié)果。
芯片數(shù)據(jù)分析使用Race A軟件(Bioinformatic Roche)分析數(shù)據(jù)。對于每種條件使用三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并計(jì)算出每種條件下相對于對照(未處理細(xì)胞樣品)的比較。對于每一基因的分析，要考慮幾個標(biāo)準(zhǔn)每一條件下的p值、調(diào)用平均數(shù)(Call average)、總平均差、變化系數(shù)和離散度，以獲得受到所研究化合物調(diào)節(jié)的、最有統(tǒng)計(jì)地相關(guān)性的基因。
結(jié)果使用Affymetrix微列陣實(shí)驗(yàn)鑒定新的選擇性的PPARδ生物標(biāo)志基因(見圖1)PDK4(丙酮酸脫氫酶同工酶4)(SEQ.ID NO2)。該標(biāo)志基因使得可以區(qū)分PPARα與PPARδ的活性。
測試的配體是PPARα激動劑(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸))、PPARδ激動劑(C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸)和PPARδ-α共激動劑(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸)。
如表1和圖1所示，所鑒定標(biāo)志基因PDK4對PPARδ激動劑(C)和PPARδ-α共激動劑(B)的反應(yīng)大于對PPARα特異性配體(A)的反應(yīng)。
表1使用Affymetrix芯片測量的由PPAR配體(A300μM、B100nM、C500nM)引起的C2C12小鼠肌細(xì)胞中PDK4基因表達(dá)倍數(shù)的改變。(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸)是PPARα激動劑，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸是PPARδ-α共激動劑，C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸是PPARδ激動劑)

實(shí)施例2定量PCR如實(shí)施例1所述進(jìn)行C2C12小鼠肌細(xì)胞的培養(yǎng)、RNA提取、cDNA合成和純化。
PCR引物設(shè)計(jì)使用PE Applied Biosystems的軟件Primer express 1.0基于Medline的mRNA/cDNA序列設(shè)計(jì)引物對。對每一引物的標(biāo)準(zhǔn)是長度為19-21個核苷酸、60±1℃的熔解溫度、40-60％的G/C含量以及避免形成二級結(jié)構(gòu)如發(fā)夾或引物二聚體。此外，由于較短的擴(kuò)增子比較長的擴(kuò)增子更有效擴(kuò)增并且對反應(yīng)條件有更大的寬容度，因此要控制擴(kuò)增子的長度(一般～100bp)。將引物溶解于DEPC處理水(Ambion)中得到100μM的濃溶液，保存于-20℃。
表2S12基因(內(nèi)參照)和PDK4基因的正向引物和反向引物

使用Corbett RG3000和ABI 7000進(jìn)行的qPCR使用Qiagen的Quantitech SYBR Green試劑盒按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行RT-PCR。將每種成分(25μl預(yù)混液、0.16μl每種引物(100μM貯存液)、22.7μl水和2μl cDNA)加入96孔板。
熒光染料SYBR green I結(jié)合于雙鏈DNA的小溝，使得可以對每次循環(huán)的DNA的量進(jìn)行檢測。該程序由三個不同步驟組成模板的起始變性和Taq DNA聚合酶的熱激活(95℃、15分鐘)、循環(huán)(95℃變性、60℃引物-模板退火、72℃延伸、熒光獲取)和最后的熔解(熔解曲線從55-95℃，每上升0.5℃測量一次)。通過熔解曲線可以區(qū)分特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(引物二聚體)。
使用實(shí)時PCR進(jìn)行的相對定量相對定量是基于相對于參考基因的靶基因的相對表達(dá)量。域值熒光的概念被定義為熒光高于背景熒光之上且能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行精確和可重復(fù)性定量的點(diǎn)。到達(dá)域值熒光時的循環(huán)數(shù)被稱為ct值。在擴(kuò)增反應(yīng)的指數(shù)階段，ct值和起始分子對數(shù)值之間的關(guān)系為線性的。因此在該階段的定量是可靠的并且將不受成分的任何限制性作用的影響。相對于內(nèi)參ct值的靶基因的相對ct值在對照或未處理樣品中表示為Δct對照＝ct內(nèi)參對照-ct靶基因?qū)φ?，在處理的未知樣品中表示為Δct樣品＝ct內(nèi)參樣品-ct靶基因樣品。
理論的PCR反應(yīng)表示為N＝N0×2n(N擴(kuò)增后的分子數(shù)，N0起始分子數(shù)，n擴(kuò)增循環(huán)數(shù))，其中底數(shù)2代表最佳效率(每一循環(huán)則倍增一次)。該方程式使得可以闡明mRNA拷貝數(shù)的差異表達(dá)而不是ct值得到具有理論效率的指數(shù)值2Δct。
核蛋白體蛋白S12基因表達(dá)作為定量研究的內(nèi)參。它在所有樣品中以相同的水平組成型表達(dá)。熒光域值的設(shè)定由光循環(huán)軟件確定。將獲得的ct值(對于一個樣品兩次重復(fù)，對于每種條件取兩個樣品)輸出到微軟Excel中并且進(jìn)行如上所述的分析。
結(jié)果由Affymetrix的芯片實(shí)驗(yàn)鑒定出的新的選擇性的PPARδ生物標(biāo)志基因(SEQ.ID.NO2)(見圖1)用qPCR(定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))進(jìn)行確定。
所檢測的配體是PPARα激動劑(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸))、PPARδ激動劑(C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸)和兩種PPARδ-α共激動劑(B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸和D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基}-苯氧基)-乙酸)。
如表3和圖2所示，PDK4標(biāo)志基因?qū)PARδ激動劑(C)和PPARδ-α共激動劑(B和D)的反應(yīng)大于對PPARα特異性配體(A)的反應(yīng)。
表3使用qPCR測量的由PPAR配體(A300μM、B100nM、C500nM、D500nM)誘導(dǎo)的C2C12小鼠肌細(xì)胞中PDK4基因表達(dá)倍數(shù)的改變。(A2-[4-(4-氯苯甲酰)-苯氧基]-2-甲基丙酸(非諾貝酸)是PPARα激動劑，B{2-甲基-4-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲硫基]-苯氧基}-乙酸是PPARδ-α共激動劑，C[外消旋]-(4-{環(huán)戊基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基]-甲硫基}-萘基-1-基氧)-乙酸是PPARδ激動劑，D(2-甲基-4-{甲基-[4-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-噻唑-5-基甲基]-氨基]-苯氧基)-乙酸是PPARδ-α共激動劑)。

序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche)<120>作為PPARδ調(diào)節(jié)標(biāo)志的PDK<130>22518<160>7<170>Patent In版本3.2<210>1<211>3499<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(3499)<223>UniGene ID Mm.235547基因的代表性cDNA(完整cds)(到2004年3月25日為止為BC026134)<400>1ccacgcgtcc gaacccttca cccaggctcg agcacccggg accctgggac cacaacgcac 60ttgctccctc tcgaccgcgc tcctgacccg cagccctcgc caaccctacg gatcctaacc120accgccagcc taggtgggcg tcaggatgaa ggcagcccgc ttcgtgatgc gcagcgccag180ctcgctgagc agcgccagcc tggtccccag ggaggtcgag ctgttctccc gctacagccc240gtccccgctg tccatgaagc agctgctgga ctttggttca gaaaatgcct gtgaaagaac300gtcctttgct tttctgcggc aagagctgcc cgtccgcctg gccaatatcc tgaaggagat360tgacatcctg cctgaccgct tagtgaacac tccttcggtg cagctggtga agagctggta420tatccagagc ctgatggatt tggtggagtt ccatgagaag agcccagaag accagaaagc480cctgtcagag tttgtagaca cgctggtcaa agttcgaaac agacatcata atgtggtccc540tacaatggct caaggcatcc tggagtataa agacacctgc acagtggacc ccgttaccaa600tcaaaatctt cagtattttt tagaccggtt ttacatgaac cgcatttcta ctcggatgct660catgaatcag cacatcctca tattcagtga ctcaaagacg ggaaacccaa gccacattgg720aagtatcgac ccaaactgtg atgtggtagc agtagtccaa gatgcctttg agtgtgcaaa780gatgctctgc gaccagtatt atctaacatc gccagaatta aacctcacac aagtcaatgg840aaaatttcca ggccaaccaa tccacattgt gtacgttcct tcacaccttc accacatgct900cttcgaactc ttcaagaatg ccatgagggc cacggtcgag catcaagaaa accgtccttc960
cttgacccca gtagaggcca ctgtcgtctt gggaaaagaa gaccttacaa tcaagatttc 1020tgaccgagga ggcggtgttc ctctgaggat tactgaccgc ctctttagtt acacgtactc 1080cactgctcca acacctgtga tggacaattc ccggaatgcc cctttggctg gttttggtta 1140tggcttgcca atttctcgtc tctacgccaa gtattttcaa ggagatctga atctctactc 1200tatgtcaggt tatgggacag acgctatcat ctacttaaag gctttatctt ctgagtctgt 1260agaaaagctc ccagtcttta acaagtcagc cttcaaacat tatcagatga gctccgaagc 1320tgatgactgg tgtatcccaa gcagggaacc gaagaacctg gcgaaggaga agctggcagt 1380gtgaagcgga tgacgcctga cattttacgg gatcaaagtg ggtctgtggc attgctgctt 1440cgtgaatgtg tgtggactct agtttccgca aaacaacgca acacaaaacc aagcaagcaa 1500aacacaaaca cgagtacaaa ccttgacctg atgagggaca gagcttggtt ggatgacccg 1560ggagaagtca gggcagggct ccaggggata acaggtgtcc tgcttctcct ttggcaatgc 1620aaaatgactc ctgactgttc caaatactga aaagaagtct gcctctgagt tacagctctt 1680tctcaacaag tacagagttt gaggcttgca gttgcaacag ctggatgttt ggtggttctt 1740gctgccagcc aaataaattg gtgtttagtg aacattttca gtgtttcccc gccatgcaaa 1800gcttggcgcc ttgggagaaa tgtgtgtaaa tgtacattgt ataggtatta gtgtgctcta 1860gaaaggacag gatggaagga atcaaagcac tttatcgagc ttgtggctga gcattgcagc 1920ctatgtgcaa acccagagga aaagtatctc tgtcaagaca gctccagtat catgcagctt 1980tttatgtttg cactcaaaaa gccagtgcct tctggctggt gccgaggctt gggtgaaatg 2040ttaaatatgc actgacctca gaaagtcgag ttcaaaaggg agataaaatt gccaaagtga 2100tccaaggatt gtgcatgttg ggaaacccat atgagagaaa ggattctcat acttagaact 2160ttcctatgaa gaaatggtgg taaactttct ctacctagaa gtagtggaaa tttcaaggtc 2220atcttaaaaa agatgtgcgt tgtatatttt aactacattc tctacactct aacattaaca 2280tatctattca aatttgtcta gttgccaatt gtcttcagag tgtgaaaatt taaatccttc 2340ttgaagtatc tttcgtgaga gtagtatgga agtaaaacgt tctcatatca ggaggatgtc 2400atttgtgaag catggggaca tcatgaacta gtgatgtgcg tgaggcttgg gaggctgaag 2460ggtaaggatc agcgggaggc catccatgta ggagagagaa ttaaaacgag gagcgaggga 2520agcaatggag agagggaagc aagaaaggaa ccagaaggct ggcatcatcc tatttcccac 2580aggctaaccc aagggatgct ctgtgccttt cctggggagg gaaggggatg aactggtaga 2640tttgaaagca gtatggcttc ttctgtgggt ctccctctta ctagacaagg tgaaatgata 2700
attcgtgtca aattaatgtg aaattttttt cctgcattgt aatattatga ggcctgagtc 2760gcagttgagt ttgaaatttg tatttaattt cacagtgacc tagagctaag gtgctcccgg 2820ttgtggcaat aggagccaca agtattttct ttctttcttt cgttctttct ttctttcttt 2880ctttctttct ttctttcttt ctttctttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 2940ccttccttcc ttcttccttt ccttttcttt tctcttctct tcttttcttt tttctgtttc 3000tttttctttt tttgcattgt agatgttgtc cttaaaagat cagggcagtg actttcacag 3060caggactttg actcccacat tggttgatca cacaaaactg tcagcatttg ggtaatctga 3120tgtatagttg ttttgttgct gatgtttcca ttgaaatttc agctctgagt ttgtgcacat 3180gaatacttac ttgtgtttac caaaggtcta aggcatttgg ttacttaacc caaatatcct 3240gaactgtgcg taaagtaata gagaaaagct ttagggtctc aatagtgtca cctgtgtaaa 3300tcaaatcaaa atagccttcc ctattattta tgaacccatg ggagacttta aactcttgta 3360gatagatgct aaatgcccag gcccacttaa cttattaatg tgtgaattac atttatgttt 3420ttagtttata tgcaaagaat tgtgataatt ttataataaa tatttttatt ataaaaaaaa 3480aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3499<210>2<211>3449<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(3449)<223>UniGene ID Mm.235547基因的代表性cDNA(到2004年3月25日為止為NM_013743)<400>2gagcacccgg gaccctggga ccacaacgca cttgctccct ctcgaccgcg ctcctgaccc 60gcagccctcg ccaaccctac ggatcctaac caccgccagc ctaggtgggc gtcaggatga 120aggcagcccg cttcgtgatg cgcagcgcca gctcgctgag cagcgccagc ctggtcccca 180gggaggtcga gctgttctcc cgctacagcc cgtccccgct gtccatgaag cagctgctgg 240actttggttc agaaaatgcc tgtgaaagaa cgtcctttgc ttttctgcgg caagagctgc 300ccgtccgcct ggccaatatc ctgaaggaga ttgacatcct gcctgaccgc ttagtgaaca 360ctccttcggt gcagctggtg aagagctggt atatccagag cctgatggat ttggtggagt 420tccatgagaa gagcccagaa gaccagaaag ccctgtcaga gtttgtagac acgctggtca 480aagttcgaaa cagacatcat aatgtggtcc ctacaatggc tcaaggcatc ctggagtata 540
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<221>丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4(PDK4)<222>(1)..(412)<223>UniGene ID Mm.235547基因的蛋白質(zhì)序列(到2004年3月25日為止為070571)<400>3Met Lys Ala Ala Arg Phe Val Met Arg Ser Ala Ser Ser Leu Ser Ser1 5 10 15
Ala Ser Leu Val Pro Arg Glu Val Glu Leu Phe Ser Arg Tyr Ser Pro20 25 30Ser Pro Leu Ser Met Lys Gln Leu Leu Asp Phe Gly Ser Glu Asn Ala35 40 45Cys Glu Arg Thr Ser Phe Ala Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg50 55 60Leu Ala Asn Ile Leu Lys Glu Ile Asp Ile Leu Pro Asp Arg Leu Val65 70 75 80Asn Thr Pro Ser Val Gln Leu Val Lys Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu85 90 95Met Asp Leu Val Glu Phe His Glu Lys Ser Pro Glu Asp Gln Lys Ala100 105 110Leu Ser Glu Phe Val Asp Thr Leu Val Lys Val Arg Asn Arg His His115 120 125Asn Val Val Pro Thr Met Ala Gln Gly Ile Leu Glu Tyr Lys Asp Thr130 135 140Cys Thr Val Asp Pro Val Thr Asn Gln Asn Leu Gln Tyr Phe Leu Asp145 150 155 160Arg Phe Tyr Met Asn Arg Ile Ser Thr Arg Met Leu Met Asn Gln His165 170 175Ile Leu Ile Phe Ser Asp Ser Lys Thr Gly Asn Pro Ser His Ile Gly180 185 190Ser Ile Asp Pro Asn Cys Asp Val Val Ala Val Val Gln Asp Ala Phe195 200 205Glu Cys Ala Lys Met Leu Cys Asp Gln Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Glu210 215 220Leu Asn Leu Thr Gln Val Asn Gly Lys Phe Pro Gly Gln Pro Ile His225 230 235 240Ile Val Tyr Val Pro Ser His Leu His His Met Leu Phe Glu Leu Phe
245 250 255Lys Asn Ala Met Arg Ala Thr Val Glu His Gln Glu Asn Arg Pro Ser260 265 270Leu Thr Pro Val Glu Ala Thr Val Val Leu Gly Lys Glu Asp Leu Thr275 280 285Ile Lys Ile Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Ile Thr Asp290 295 300Arg Leu Phe Ser Tyr Thr Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Val Met Asp305 310 315 320Asn Ser Arg Asn Ala Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile325 330 335Ser Arg Leu Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Asn Leu Tyr Ser340 345 350Met Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser355 360 365Ser Glu Ser Val Glu Lys Leu Pro Val Phe Asn Lys Ser Ala Phe Lys370 375 380His Tyr Gln Met Ser Ser Glu Ala Asp Asp Trp Cys Ile Pro Ser Arg385 390 395 400Glu Pro Lys Asn Leu Ala Lys Glu Lys Leu Ala Val405 410<210>4<211>19<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>PDK4的正向引物<222>(1)..(19)<400>4ttcagtgttt ccccgccat19<210>5
<211>21<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>PDK4的反向引物<222>(1)..(21)<400>5tcccaacatg cacaatcctt g 21<210>6<211>21<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>S12的正向引物<222>(1)..(21)<400>6tgaaccagat gcaccgctta g 21<210>7<211>20<212>DNA<213>小家鼠<220>
<221>S12的反向引物<222>(1)..(20)<400>7ttcttctttt gcacgtggcc 20
權(quán)利要求
1.PDK4，其作為確定PPARδ活性的生物標(biāo)志。
2.PDK4，其作為確定肌肉中PPARδ活性的生物標(biāo)志。
3.PDK4，其作為診斷涉及PPARδ活性調(diào)節(jié)異常的疾病的標(biāo)志。
4.檢測或監(jiān)測宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4 mRNA表達(dá)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的mRNA表達(dá)水平的步驟。
6.確定測試化合物是否調(diào)節(jié)宿主中PPARδ活性的方法，其包括a)將宿主暴露于測試化合物，和b)定量PDK4的mRNA表達(dá)水平。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的mRNA表達(dá)水平。
8.用于監(jiān)測對患有與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病的患者的治療情況的方法，其包括步驟a)從分離自使用PPARδ活性調(diào)節(jié)物所治療患者的肌細(xì)胞純化RNA，和b)測定PDK4的mRNA表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的mRNA表達(dá)水平。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任意一項(xiàng)所述方法鑒定的化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任意一項(xiàng)所述方法鑒定的化合物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療涉及PPARδ活性調(diào)節(jié)異常的疾病。
12.檢測或監(jiān)測宿主中PPARδ活性的方法，其包括定量PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的步驟。
14.確定測試化合物是否調(diào)節(jié)宿主中的PPARδ活性的方法，其包括a)將宿主暴露于測試化合物，和b)定量PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
16.用于監(jiān)測對患有與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病的患者的治療情況的方法，其包括步驟a)從分離自使用PPARδ活性調(diào)節(jié)物所治療患者的肌細(xì)胞純化蛋白質(zhì)，和b)測定PDK4的蛋白質(zhì)表達(dá)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其包括確定PDK4相對于對照的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)所述方法鑒定的化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)所述方法鑒定的化合物在制備藥物中的用途，該藥物用于治療涉及PPARδ活性調(diào)節(jié)異常的疾病。
20.PDK4的用途，其作為確定PPARδ活性的生物標(biāo)志。
21.PDK4的用途，其作為確定肌肉中PPARδ活性的生物標(biāo)志。
22.PDK4的用途，其作為診斷涉及PPARδ活性調(diào)節(jié)異常的疾病的標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明涉及PDK4作為PPARδ活性的生物標(biāo)志的用途，以及用于診斷與PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病如血脂異常、肥胖或胰島素抵抗的方法、用于監(jiān)測對患有PPARδ活性調(diào)節(jié)異常相關(guān)疾病患者的治療情況的方法和用于鑒定調(diào)節(jié)PPARδ活性的化合物的方法。
文檔編號G01N33/50GK1938432SQ200580010738
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日
發(fā)明者R·G·克萊爾, C·加爾德, M·邁耶, M·B·賴特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司