專利名稱：一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，可對蛋白質(zhì)樣品進行檢測、識別和鑒定，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。
蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是生物調(diào)控的基本單元，對于理解生物調(diào)控機制具有重要意義，是后基因組時代生命科學(xué)與其它學(xué)科交叉研究的熱點。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和識別在諸如生物催化、轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程中起著重要的作用。研究蛋白質(zhì)相互作用的方法很多，目前較普遍的生物化學(xué)與分子生物學(xué)方法包括免疫共沉淀(co-immnol precipitation，co-IP Moon and Lazarides 1983)、GST-pull down、Far Western分析、噬菌體展示和酵母雙雜交(Fields and Song 1989)等。這些技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)相互作用的研究提供了非常有效的手段。
但是，免疫共沉淀、GST-pull down和Far Western分析都是針對某一種蛋白質(zhì)相互作用的分析和鑒定，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高通量的要求；同時，免疫共沉淀和GST-pull down還需要針對目的蛋白質(zhì)特異性的抗體，因此在實踐上有許多限制；噬菌體展示和酵母雙雜交技術(shù)雖然可以對蛋白相互作用組進行大規(guī)模的篩選，但噬菌體展示技術(shù)更適合篩選較短的肽段，而較大蛋白質(zhì)分子由于很難得到噬菌體展示庫，因此對于篩選與其相互作用的蛋白質(zhì)有很大的局限性；酵母雙雜交是檢驗在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用的一種方法，它的局限性在于所研究的蛋白質(zhì)必須能夠進入細(xì)胞核同時該蛋白質(zhì)不是細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，使待測蛋白質(zhì)與多種蛋白質(zhì)的相互作用僅用一張芯片即可篩選鑒定，實現(xiàn)高通量、簡便快速的要求。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，首先制備具有共同結(jié)構(gòu)特性的一類蛋白質(zhì)的融合蛋白文庫，所述融合蛋白為帶有免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白。按照預(yù)先設(shè)計的順序?qū)⑷∽栽撐膸斓娜诤系鞍c印到芯片的基片上，使融合蛋白通過物理吸附作用與基片相連接，從而將融合蛋白固定在芯片基片上。待檢測的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段也制成具有免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白，將待測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)芯片進行雜交，檢測雜交結(jié)果，將顯示蛋白質(zhì)的相互作用情況，即在一張芯片表面即可篩選檢測出文庫中能與待測蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，其所涉及的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，采取下列步驟(1)將一類具有共同結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段分別制備成帶有免疫學(xué)標(biāo)簽的融和蛋白，組成融合蛋白質(zhì)文庫；(2)將所制備的各種融合蛋白按照預(yù)先設(shè)計的順序點印到芯片的基片上，使融合蛋白與基片相連接；(3)室溫放置24小時，待其自然干燥，密封包裝后存放于4℃待用。
一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，其所涉及的檢測方法為使用抗免疫學(xué)標(biāo)簽的單一抗體可同時對多種能夠發(fā)生相互作用的蛋白進行研究，其步驟為(1)在大腸桿菌中表達(dá)并純化待測蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段與免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白；(2)將蛋白質(zhì)芯片放入封閉液中，封閉芯片基片上剩余的活性基團；(3)將待測蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的融合蛋白加入封閉液中，使其終濃度為1nM-1uM，在溫度為4-25℃，相對濕度為70-85％的條件下輕搖孵育至反應(yīng)平衡；(4)洗滌芯片；(5)加入作為第一信號物質(zhì)的可與芯片捕獲蛋白的免疫學(xué)標(biāo)簽配對的檢測抗體，使兩個可相互作用的蛋白質(zhì)與抗體形成復(fù)合物；(6)洗滌芯片；(7)加入與酶連接的第二信號物質(zhì)，使其與前述復(fù)合物實現(xiàn)連接形成復(fù)合物；(8)洗滌芯片；(9)干燥后進行檢測。
本發(fā)明是在固態(tài)基片上有序排布融合蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)片段陣列，可對蛋白質(zhì)樣品問的相互作用進行檢測、篩選和鑒定?，F(xiàn)有的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法有的只是針對某一種蛋白質(zhì)相互作用的分析和鑒定；有的需要針對目的蛋白質(zhì)特異性的抗體；有的只適合篩選較短的肽段；有的對被研究蛋白質(zhì)的定位及性質(zhì)有所限定?？傊荒軡M足蛋白質(zhì)組學(xué)研究中簡便、快速、高通量的要求。而采用本發(fā)明的研究方法，則可以把大量的具有共同結(jié)構(gòu)特性的一類蛋白質(zhì)或蛋白結(jié)構(gòu)域片段同時點陣于一張芯片上，經(jīng)過簡單的檢測操作即可篩選鑒定出有相互作用的一對蛋白質(zhì)，大大提高了篩選鑒定的速度和效率，適用于多種蛋白質(zhì)相互作用的研究。
本發(fā)明的制備工藝簡單，操作安全快捷，尤其是每次檢測過程僅使用針對于免疫學(xué)標(biāo)簽的一種抗體即可完成操作，大大降低了研究成本，經(jīng)濟實用性強。


圖1是芯片上PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域的排布情況圖2是利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與betal-腎上腺素受體相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果3是芯片上PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域的排布情況圖4是利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與P2Y1R相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果5是芯片上WW蛋白結(jié)構(gòu)域的排布情況圖6是利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與Sam68相互作用的WW蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果圖具體實施方式
實施例1利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與betal-腎上腺素受體相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域(1)制備PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)文庫。將若干PDZ結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到His融合蛋白表達(dá)載體pET30a上，分別表達(dá)并純化His-PDZ融合蛋白；
(2)在作為芯片基片的硝酸纖維素膜上按照96孔板的的排列方式畫上96個方格，將所制備的各種融合蛋白(0.1M-1mM)按照預(yù)先設(shè)計的順序點印到膜上的各方格內(nèi)，使融合蛋白與硝酸纖維素膜相連接；(3)室溫放置24小時，待其自然干燥，密封包裝后存放于4℃待用。
(4)將betal-腎上腺素受體的羧基末端約30個氨基酸所對應(yīng)的核酸序列片段裝入蛋白質(zhì)表達(dá)載體pGEX-4T-1內(nèi)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)并純化GST融合蛋白GST-β1-AR-ct；(5)將蛋白質(zhì)芯片放入封閉液中于室溫輕搖30分鐘，封閉芯片基片上剩余的活性基團；封閉液包含2％脫脂奶粉，100mM NaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；(6)將融合蛋白GST-β1-AR-ct加入封閉液中，使其終濃度為100nM，于4℃輕搖過夜孵育；(7)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(8)加入與酶連接的可與芯片捕獲蛋白的免疫學(xué)標(biāo)簽GST配對的檢測抗體，即辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GST抗體，室溫孵育1h；(9)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(10)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理蛋白質(zhì)芯片3分鐘；(11)干燥后進行X-光片成像檢測。
芯片上各PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域的排布情況如圖1所示。
結(jié)果如圖2所示格子A5、A6、A10、B8、B10、C3、E10和G2內(nèi)的點代表陽性結(jié)果，其所對應(yīng)的PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白即為與β1-AR-ct有相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域。斑點的大小和深淺可反映相互作用的強弱。
實施例2利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與P2Y1R相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域(1)制備PDZ結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)文庫。將眾多PDZ結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到His融合蛋白表達(dá)載體pET30a上，分別表達(dá)并純化His-PDZ融合蛋白；(2)在作為芯片基片的硝酸纖維素膜上按照96孔板的的排列方式畫上96個方格，將所制備的各種融合蛋白(0.1M-1mM)按照預(yù)先設(shè)計的順序點印到膜上的各方格內(nèi)，使融合蛋白與硝酸纖維素膜相連接；(3)室溫放置24小時，待其自然干燥，密封包裝后存放于4℃待用。
(4)將P2Y1R的羧基末端所對應(yīng)的核酸序列片段裝入蛋白質(zhì)表達(dá)載體pGEX-4T-1內(nèi)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)并純化GST融合蛋白GST-P2Y1R-CT；(5)將蛋白質(zhì)芯片放入封閉液中于室溫輕搖30分鐘，封閉芯片基片上剩余的活性基團；封閉液包含2％脫脂奶粉，100mMNaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；(6)將融合蛋白GST-P2Y1R-CT加入封閉液中，使其終濃度為100nM，于4℃輕搖過夜孵育；(7)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(8)加入與酶連接的可與芯片捕獲蛋白的免疫學(xué)標(biāo)簽GST配對的檢測抗體，即辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GST抗體，室溫孵育1h；(9)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(10)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理蛋白質(zhì)芯片3分鐘；
(11)干燥后進行X-光片成像檢測。
芯片上蛋白的排布情況如圖3所示。
結(jié)果如圖4所示格子B5、B11內(nèi)的點代表陽性結(jié)果，其所對應(yīng)的PDZ結(jié)構(gòu)域融合蛋白即為與P2Y1R-CT有相互作用的PDZ蛋白結(jié)構(gòu)域。斑點的大小和深淺可反映相互作用的強弱。
實施例3利用蛋白質(zhì)芯片研究篩選與Sam68相互作用的WW蛋白結(jié)構(gòu)域(1)制備WW結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)文庫。將眾多WW結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建到His融合蛋白表達(dá)載體pET30a上，分別表達(dá)并純化His-WW融合蛋白；(2)在作為芯片基片的硝酸纖維素膜上按照96孔板的排列方式畫上96個方格，將所制備的各種融合蛋白(0.1M-1mM)按照預(yù)先設(shè)計的順序點印到膜上的各方格內(nèi)，使融合蛋白與硝酸纖維素膜相連接；(3)室溫放置24小時，待其自然干燥，密封包裝后存放于4℃待用。
(4)將編碼Sam68的核酸序列裝入蛋白質(zhì)表達(dá)載體pGEX-4T-1內(nèi)，在大腸桿菌Top10中表達(dá)并純化GST融合蛋白GST-Sam68；(5)將蛋白質(zhì)芯片放入封閉液中于室溫輕搖30分鐘，封閉芯片基片上剩余的活性基團；封閉液包含2％脫脂奶粉，100mM NaCl，10mM Tris pH7.4，0.1％Tween 20；(6)將融合蛋白GST-Sam68加入封閉液中，使其終濃度為100nM，于4℃輕搖過夜孵育；(7)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(8)加入與酶連接的可與芯片捕獲蛋白的免疫學(xué)標(biāo)簽GST配對的檢測抗體，即辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗GST抗體，室溫孵育1h；(9)封閉液洗滌芯片3次，每次5分鐘；(10)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理蛋白質(zhì)芯片3分鐘；(11)干燥后進行X-光片成像檢測。
芯片上蛋白的排布情況如圖5所示。
結(jié)果如圖6所示格子A12和C11內(nèi)的點代表陽性結(jié)果，其所對應(yīng)的WW結(jié)構(gòu)域融合蛋白即為與Sam68有相互作用的WW蛋白結(jié)構(gòu)域。斑點的大小和深淺可反映相互作用的強弱。
權(quán)利要求
1.一種利用蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，其特征在于制備具有共同結(jié)構(gòu)特性的一類蛋白質(zhì)的融合蛋白文庫，所述融合蛋白為帶有免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白。按照預(yù)先設(shè)計的順序?qū)⑷∽栽撐膸斓娜诤系鞍c印到芯片的基片上，使融合蛋白通過物理吸附作用與基片相連接，從而將融合蛋白固定在芯片基片上。待檢測的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段也制成具有免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白，將待測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)芯片進行雜交，檢測雜交結(jié)果，將顯示蛋白質(zhì)的相互作用情況，即在一張芯片表面即可篩選檢測出文庫中能與待測蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
2.如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于(1)將一類具有共同結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段分別制備成帶有免疫學(xué)標(biāo)簽的融和蛋白，組成融合蛋白質(zhì)文庫；(2)將所制備的各種融合蛋白按照預(yù)先設(shè)計的順序點印到芯片的基片上，使融合蛋白與基片相連接；(3)室溫放置24小時，待其自然干燥，密封包裝后存放于4℃待用。
3.如權(quán)利要求1、2所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述具有共同結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)是指具有相同的功能結(jié)構(gòu)域的一類蛋白質(zhì)；具有共同結(jié)構(gòu)特性的蛋白質(zhì)的片段是指具有相同功能的蛋白結(jié)構(gòu)域片段。
4.如權(quán)利要求1、2所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述帶有免疫學(xué)標(biāo)簽的融和蛋白是GST-融合蛋白、His-融合蛋白。
5.如權(quán)利要求1、2所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述融合蛋白質(zhì)文庫，是構(gòu)建待研究的一類蛋白質(zhì)的各個成員的融合蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)并分離純化后得到。
6.如權(quán)利要求1、2所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述點印的方法為一種與6、12、24、48、96或248孔板匹配的點樣器，同時從加好各融合蛋白樣品的6、12、24、48、96或248孔板中吸取融合蛋白溶液各1ul，直接點印于芯片的基片上，點印時加樣器頭與基片接觸。
7.如權(quán)利要求1、2所述蛋白質(zhì)芯片的制備方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)芯片的基片為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜。
8.應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)芯片研究蛋白質(zhì)的相互作用，其檢測方法的特征在于使用抗免疫學(xué)標(biāo)簽的單一抗體可同時對多種能夠發(fā)生相互作用的蛋白進行研究，其步驟為(1)在大腸桿菌中表達(dá)并純化待測蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段與免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白；(2)將蛋白質(zhì)芯片放入封閉液中，封閉芯片基片上剩余的活性基團；(3)將待測蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的融合蛋白加入封閉液中，使其終濃度為1nM-1uM，在溫度為4-25℃，相對濕度為70-85％的條件下輕搖孵育至反應(yīng)平衡；(4)洗滌芯片；(5)加入作為第一信號物質(zhì)的可與芯片捕獲蛋白的免疫學(xué)標(biāo)簽配對的檢測抗體，使兩個可相互作用的蛋白質(zhì)與抗體形成復(fù)合物；(6)洗滌芯片；(7)加入與酶連接的第二信號物質(zhì)，使其與前述復(fù)合物實現(xiàn)連接形成復(fù)合物；(8)洗滌芯片；(9)干燥后進行檢測。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述免疫學(xué)標(biāo)簽為GST、His。
10.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述封閉液配方為0.2-5％脫脂奶粉，10-1000mM NaCl，1-100mM Tris pH7.4，0.01-1％ Tween 20。
11.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述第二信號物質(zhì)為抗種屬免疫球蛋白G抗體。
12.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述檢測的方法為化學(xué)發(fā)光檢測法和熒光發(fā)光檢測法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以具有共同結(jié)構(gòu)特性的一類蛋白質(zhì)的融合蛋白文庫為基礎(chǔ)的用于多種蛋白質(zhì)相互作用分析研究的蛋白質(zhì)芯片、該芯片的制備方法及其檢測技術(shù)。該芯片是首先制備具有共同結(jié)構(gòu)特性的一類蛋白質(zhì)的融合蛋白文庫，按照預(yù)先設(shè)計的順序?qū)⑷∽栽撐膸斓娜诤系鞍c印到芯片的基片上，使融合蛋白通過物理吸附作用固定在芯片基片上。待檢測的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段也制成具有免疫學(xué)標(biāo)簽的融合蛋白，將待測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)芯片進行雜交，檢測雜交結(jié)果，即在一張芯片表面即可篩選檢測出文庫中能與待測蛋白相互作用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。該芯片在檢測時使用抗免疫學(xué)標(biāo)簽的單一抗體，運用通用的試劑，即可對多種能夠發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)進行研究，達(dá)到高通量、簡便快速的要求。
文檔編號G01N21/76GK1776425SQ20051010529
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者賀俊崎, 熊英, 張紅 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)