專利名稱：一種采用液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種中藥分析領域。具體涉及一種液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法。
背景技術：
阿膠為著名的中藥，是由動物驢的皮，經(jīng)煎熬后與輔料制成的膠劑。阿膠主要由膠原蛋白及其降解產(chǎn)物組成，如多肽和各種氨基酸(脂肪族、堿性、酸性、芳香族、雜環(huán)類氨基酸)，其分子量分布范圍廣，分子極性范圍大；另外還含有甾醇類等眾多其它成分，很難進行定性分析和質(zhì)量控制。騾馬皮，牛皮以及其它動物的皮，亦可用于熬制膠類制劑，其外觀性狀和化學成分與阿膠非常相似，用常規(guī)方法難以將它們加以鑒別。尤其是阿膠與騾馬皮膠，來源于同科屬(馬科Equidae馬屬Eqnns)動物的皮，它們之間的成分更加類似，鑒別更加困難。因此，多年來阿膠的真?zhèn)舞b別一直未能得到有效解決。
目前，阿膠的真?zhèn)舞b別主要采用傳統(tǒng)方法和經(jīng)驗鑒別，如2005年版藥典采用薄層法鑒別阿膠，只檢測其中的甘氨酸，專屬性不強，無法監(jiān)控其內(nèi)在質(zhì)量。阿膠鑒別方法的現(xiàn)代研究，主要包括光譜鑒別(紅外、紫外、圓二色譜等)，色譜鑒別(PC，TLC，HPLC，電泳等)等。光譜法因不具備分離功能，測定的混合物光譜為疊加光譜，成分越多、越復雜，得到的光譜信息越簡單，用于阿膠等膠類的鑒別，鑒別特征不明顯。色譜法雖具有分離功能，但針對阿膠復雜的成分體系，采用現(xiàn)有的樣品預處理方法和色譜條件，不能達到理想的分離效果。分離效果不好，數(shù)量較少的特征性成分就會被眾多的非特征性成分所掩蓋，所測各種膠的色譜將非常類似，阿膠的真?zhèn)螌㈦y以判斷。
鑒于此，為了對阿膠進行有效的鑒別和內(nèi)在質(zhì)量控制，非常有必要建立一種對阿膠進行明確鑒別和綜合質(zhì)量分析的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種采用液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法，并將阿膠高效液相色譜作為阿膠真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制的指標之一。
本發(fā)明涉及的采用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法，主要步驟如下1、阿膠樣品溶液的制備方法a、精密稱取過4號篩的阿膠樣品粉末，置玻璃容器中，加入中間相溶劑，振搖1～3分鐘，置超聲清洗器中超聲15～20分鐘使之溶解，制成20mg/ml的溶液；然后將所述中間相溶液沿壁緩緩加入盛有重相溶劑的容器中，再沿壁緩緩加入輕相溶劑，使輕相∶中間相∶重相的體積比為1∶1∶1或1∶1∶2或2∶1∶1或1∶2∶1或2∶1∶2；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行三相分離，將輕、重相萃取液分別置水浴上蒸干，殘渣分別加無水乙醇溶解并定容，作為樣品輕、重相供試液；將經(jīng)輕、重兩相溶劑萃取過的中間相溶液，以3000～4000轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，取分離后的上清液作為樣品中間相供試液；
或方法b、精密稱取過4號篩的阿膠樣品粉末，置玻璃容器中，加入中間相溶劑，振搖1～3分鐘，置超聲清洗器中超聲15～20分鐘使之溶解，制成20mg/ml的溶液；將輕相溶劑沿壁緩緩加入盛有中間相溶液的容器中，使輕相中間相的體積比為1∶1或2∶1或1∶2；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行兩相分離，輕相萃取液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容，作為樣品的輕相供試液；將被輕相溶劑萃取過的中間相溶液，沿壁緩緩加入盛有重相溶劑的容器中，使中間相溶液∶重相的體積比為1∶1或1∶2或2∶1；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行兩相分離，重相萃取溶液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容，作為樣品的重相供試液；將先后分別被輕、重相溶劑萃取過的中間相溶液，以3000～4000轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，取分離后的上清液作為樣品的中間相供試液；2、對照品溶液的制備取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸，分別加無水乙醇或水配制成5μg/ml的溶液，作為中間相供試液色譜的對照品溶液；取膽紅素加無水乙醇制成1μg/ml的溶液，作為輕相供試液色譜的對照品溶液；取槲皮素加無水乙醇制成5μg/ml的溶液，作為重相供試液色譜的對照品溶液；3、黃明膠和雜皮膠樣品溶液的制備同阿膠樣品溶液的制備。
4、阿膠樣品三相供試液的高效液相色譜測定(1)、色譜條件色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為乙腈-水，梯度洗脫(中間相、輕相、重相供試液采用的洗脫梯度分別為0min→20min→100min，乙腈(V/V)1％→1％→10％；0min→5min→10min→20min→40min→60min→110min，乙腈(V/V)50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0min→10min→20min→30min→40min→100min→120min，乙腈(V/V)30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％)；柱溫30℃；檢測波長為205nm；(2)、色譜測定分別精密吸取輕相、中間相、重相供試液及其對照品溶液，以不同的流動相梯度，按照高效液相色譜法測定，記錄100或120分鐘的色譜圖和三維譜圖。
5、黃明膠和雜皮膠樣品三相供試液高效液相色譜測定同阿膠樣品三相供試液高效液相色譜測定。
6、HPLC色譜解析對三種膠的HPLC圖譜進行對比分析，取同相供試液的色譜圖，觀察色譜圖、三維圖整體特征；找出每種膠在一定保留時間范圍內(nèi)的色譜峰數(shù)、列出每種膠在一定保留時間范圍內(nèi)的三維圖譜數(shù)據(jù)(僅具紫外末端吸收光譜的色譜峰不計)。
阿膠、黃明膠、雜皮膠中間相供試液的HPLC圖譜中，在10～100分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為42、50、54個。在25～95分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為13、7、18個，其中阿膠三維圖譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為26.71min，λmax274nm，λmin238nm；37.97min，λmax270nm，λmin250nm；38.74min，λmax274nm、222nm，λmin258nm、214nm；44.20min，λmax250nm，λmin222nm；54.27min，λmax262nm，λmin234nm；57.06min，λmax274nm，λmin242nm 69.51min，λmax246nm，λmin234nm；71.33min，λmax254nm，λmin226nm；75.85min，λmax254nm，λmin226nm；76.86min，λmax274nm，λmin242nm；81.86min，λmax270nm，λmin242nm；89.05min，λmax262nm，λmin234nm；92.28min，λmax262nm，λmin242nm；阿膠、黃明膠、雜皮膠輕相供試液的HPLC圖譜中，在10～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為51、51、56個；在50～65分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為19、11、18個，其中阿膠三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為50.39min，λmax236nm，λmin212nm；51.19min，λmax232nm，λmin208nm；51.94min，λmax232nm，λmin204nm；52.73min，λmax232nm，λmin204nm；54.13min，λmax276nm、232nm，λmin272nm、212nm；54.37min，λmax268nm、232nm，λmin264nm、212nm；54.69min，λmax232nm，λmin204nm；55.06min，λmax280nm、228nm，最λmin256nm、216nm；56.53min，λmax232nm；57.77min，λmax308nm，272nm、230nm，λmin284nm、216nm；58.63min，λmin232nm，λmin204nm；59.15min，λmax276nm，λmin232nm；59.77min，λmax276nm，λmin224nm；60.43min，λmax276nm，λmin232nm；61.56min，λmax為276nm，λmin228nm；62,09min，λmax222nm，λmin216nm；62.57min，λmax276nm、224nm，λmin264nm、216nm；63.87min，λmax276nm、220nm，λmin256nm、216nm；64.67min，λmax224nm，λmin212nm；阿膠、黃明膠、雜皮膠重相供試液的HPLC圖譜中，在25～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為48、44、48個。在25～100分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為12、15、24個，其中阿膠三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為25.98min，λmax252nm，λmin240nm；61.72min，λmax324nm、228nm，λmin268nm、216nm；79.12min，λmax224nm，λmin220nm；86.12min，λmax284nm、240nm，λmin272nm、212nm；90.04min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；90.44min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；91.58min，λmax216nm，λmin212nm；92.24min，λmax212nm，最λmin208nm；93.66min，λmax212nm，λmin208nm；94.51min，λmax256nm、212nm，λmin248nm、208nm；95.91min，λmax212nm，λmin208nm；97.11min，λmax272nm、220nm，λmin248nm、212nm；如上所述，利用三相供試液的圖譜和數(shù)據(jù)或任意兩相供試液的圖譜和數(shù)據(jù)或任意一相供試液的圖譜和數(shù)據(jù)，均可對阿膠的真?zhèn)巫龀雒鞔_的判斷。
在上述的采用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法中，所述的阿膠是任何一種藥劑學上所說的阿膠劑型。
在上述的采用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法中，所述的阿膠供試品溶液的制備也包括用中間相與輕相組成的兩相靜態(tài)萃取體系制備的中間相、輕相供試液和中間相與重相組成的兩相靜態(tài)萃取體系制備的中間相、重相供試液。
在上述的采用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法中，所述的輕相溶劑是正己烷或環(huán)己烷或戊烷或庚烷或石油醚或乙醚；中間相溶劑是水或體積百分比為1％～50％乙醇或1％～50％甲醇或1％～50％乙腈；重相溶劑是氯仿或二氯甲烷或異戊醇。
其中，所述的輕相溶劑優(yōu)選是正己烷或環(huán)己烷；中間相溶劑優(yōu)選是水；重相溶劑優(yōu)選是氯仿。
在上述的采用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法中，所述的輕相∶中間相∶重相的體積比優(yōu)選為1∶1∶1或1∶1∶2。所述的靜置萃取時間優(yōu)選是20小時～30小時。所述萃取過的中間相溶液，優(yōu)選以3000轉(zhuǎn)/分離心6分鐘的條件進行分離。
在上述的應用三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法中，結果判定標準，以阿膠、黃明膠、雜皮膠為例，其中間相供試液的HPLC圖譜中，在10～100分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為42、50、54個；在25～95分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為13、7、18個；其輕相供試液的HPLC圖譜中，在10～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為51、51、56個；在50～65分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為19、11、18個；其重相供試液的HPLC圖譜中，在25～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為48、44、48個；在25～100分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)分別為12、15、24個。
本發(fā)明的原理是鑒于阿膠成分的多樣性和復雜性，采用通常的液——液萃取方法會產(chǎn)生嚴重的乳化現(xiàn)象，難以分層和相分離，容易造成色譜分離度及重現(xiàn)性差，致使鑒別工作無法完成的情況而采用的一種樣品預處理方法——液——液——液三相靜態(tài)萃取法。根據(jù)相似相溶原理和分子擴散作用，將樣品溶于中間相溶劑，由中間相溶液與重相和輕相溶劑組成三相萃取體系，在靜止狀態(tài)下，不同極性的分子被相應極性的溶劑所萃取。假設視三種溶劑萃取物互為雜質(zhì)，那么通過萃取，即可得到三種極性不同的“純凈”組分，這樣不僅巧妙解決了樣品的精制和純化問題、也有效消除了通常萃取方法產(chǎn)生的嚴重乳化現(xiàn)象。對三相萃取物的HPLC色譜測定，相當于延長了有效保留時間、提高了檢測靈敏度、改善了色譜峰的分離度和對稱性，可使特征峰充分分離出來，以達到圖譜美觀、鑒別特征明顯之目的。
本發(fā)明的優(yōu)點如下1、阿膠樣品輕相、中間相、重相萃取物的高效液相色譜，代表了阿膠主要活性成分。對三相溶劑萃取物進行色譜測定，就能實現(xiàn)在更寬的極性范圍和更長的保留時間內(nèi)尋找發(fā)現(xiàn)阿膠的特征性成分，以三相溶劑萃取物的三種色譜圖，能夠準確地對阿膠進行真?zhèn)舞b別并綜合性地表達其內(nèi)在質(zhì)量。因此，采用液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠。
2、采用三相靜態(tài)萃取法制備樣品溶液，是基于阿膠復雜的化學組成，在分析測試前對不同極性成分采取的分離、富集方法。將阿膠樣品溶解于中間相，通過中間相與重相和輕相的界面，阿膠中的非極性分子向輕相擴散，弱極性分子向重相擴散，極性分子則留在中間相。假設阿膠的三相溶劑萃取物互為雜質(zhì)，亦即把其中任何兩相萃取物均可看作是另一相萃取物色譜測定的干擾物質(zhì)，那么通過三相萃取，即相當于三相溶劑萃取物中的每一相都得到精制，因此可極大幅度減少色譜測定的干擾物質(zhì)。通過對樣品的三相萃取物的色譜測定，可使各相萃取物中的組分在色譜中得到充分分離。這樣，有利于建立理想的色譜條件，提高檢測靈敏度、改善色譜峰的分離度和對稱性、降低基線漂移和減少不規(guī)則峰的數(shù)量，獲得鑒別特征顯著的、整體面貌美觀的色譜圖。


圖1.1阿膠樣品中間相萃取物HPLC譜圖(15～100分鐘)圖1.2黃明膠樣品中間相萃取物HPLC譜圖(15～100分鐘)圖1.3雜皮膠樣品中間相萃取物HPLC譜圖(15～100分鐘)圖1.4對照品HPLC譜圖。左DL-酪氨酸；右DL-β-苯丙氨酸(參照物)圖1.5阿膠樣品中間相萃取物HPLC三維譜圖(15～95分鐘)圖1.6黃明膠樣品中間相萃取物HPLC三維譜圖(15～95分鐘)圖1.7雜皮膠樣品中間相萃取物HPLC三維譜圖(15～95分鐘)圖2.1阿膠樣品輕相萃取物HPLC三維譜圖(50～65分鐘)圖2.2黃明膠樣品輕相萃取物HPLC三維譜圖(50～65分鐘)圖2.3雜皮膠樣品輕相萃取物HPLC三維譜圖(50～65分鐘)圖3.1阿膠樣品重相萃取物HPLC三維譜圖(25～100分鐘)圖3.2黃明膠樣品重相萃取物HPLC三維譜圖(25～100分鐘)圖3.3雜皮膠樣品重相萃取物HPLC三維譜圖(25～100分鐘)具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明，下述實施例僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。
實施例1 阿膠HPLC圖譜的測定1儀器與試藥1.1儀器安捷倫1100高效液相色譜儀；安捷倫DAD二極管陣列紫外檢測器；安捷倫化學工作站。
1.2試藥DL-β-苯丙氨酸、DL-酪氨酸、膽紅素對照品，層析純，購自山東省醫(yī)藥公司；槲皮素標準品，購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈(進口)，色譜純；高純水；氯仿、正己烷、無水乙醇，均為分析純；阿膠、黃明膠和雜皮膠系山東省聊城市藥檢所提供。
2色譜條件色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為乙腈-水，梯度洗脫(中間相、輕相、重相供試液采用的洗脫梯度分別為0min→20min→100min，乙腈(V/V)1％→1％→10％；0min→5min→10min→20min→40min→60min→110min，乙腈(V/V)50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0min→10min→20min→30min→40min→100min→120min，乙腈(V/V)30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％)；柱溫30℃；檢測波長為205nm；理論塔板數(shù)以DL-β-苯丙氨酸峰計算，應不低于2500。
3阿膠色譜測定3.1阿膠樣品溶液的制備3.1.1樣品溶解取過4號篩的阿膠粉末200mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加水(中間相溶劑)至刻度，置超聲清洗儀中超聲15分鐘使溶解。
3.1.2萃取精密量取氯仿(重相溶劑)20ml，置50ml錐形分液漏斗中，先沿壁緩緩加入上述溶解好的阿膠水溶液，再沿壁緩緩加入20ml正己烷(輕相溶劑)，靜置萃取30小時。
3.1.3樣品溶液制備靜置萃取后，進行相分離，將重相萃取溶液和輕相萃取溶液分別置水浴上蒸干，殘渣分別加入無水乙醇溶解并定容至1ml，即得樣品的重相和輕相供試液；將中間相溶液置離心管中，3000轉(zhuǎn)離心6分鐘，取上清液作為中間相供試液。
3.2黃明膠和雜皮膠樣品溶液的制備同上述阿膠樣品溶液的制備。
3.3對照品溶液的制備3.3.1中間相供試液測定用對照品溶液取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸各適量，分別加水制成每1ml中含5.0mg的溶液。
3.3.2輕相供試液測定用對照品溶液取膽紅素適量，加無水乙醇制成每1ml中含1.0mg的溶液。
3.3.3重相供試液測定用對照品溶液取槲皮素適量，加無水乙醇制成每1ml中含5.0mg的溶液。
3.4阿膠色譜測定3.4.1中間相供試液的測定，精密吸取阿膠樣品中間相供試液及對照品溶液，照高效液相色譜法測定(流動相梯度起始和終止體積比為1∶99和90∶10)，記錄100分鐘的色譜圖和三維譜圖。選用DL-β-苯丙氨酸為參照物(S)。以DL-β-苯丙氨酸的色譜峰(S峰)的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間。
3.4.2輕相供試液的測定，精密吸取阿膠樣品輕相供試液及對照品溶液，照高效液相色譜法測定，記錄120分鐘的色譜圖和三維譜圖。選用膽紅素為參照物(S)。以膽紅素的色譜峰(S峰)的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間。
3.4.3重相供試液的測定，精密吸取阿膠樣品重相供試液及對照品溶液，照高效液相色譜法測定，記錄120分鐘的色譜圖和三維譜圖。選用槲皮素為參照物(S)。以槲皮素的色譜峰(S峰)的相對保留時間為1計算其它色譜峰的相對保留時間。
4黃明膠和雜皮膠色譜測定同阿膠色譜測定。
5阿膠色譜解析通過阿膠、黃明膠、雜皮膠色譜的測定，比較其色譜圖，列出色譜和三維圖譜數(shù)據(jù)，見表1～表3。
表1阿膠、黃明膠、雜皮膠中間相萃取物三維圖譜數(shù)據(jù)(25～95分鐘)


表2 阿膠、黃明膠、雜皮膠輕相萃取物三維圖譜數(shù)據(jù)(50～65分鐘)


表3阿膠、黃明膠、雜皮膠重相萃取物三維圖譜數(shù)據(jù)


結果判定阿膠中間相供試液的HPLC圖譜中，在10～100分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)為42個。在25～95分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)為13個，其色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為26.71min，λmax274nm，λmin238nm；37.97min，λmax270nm，λmin250nm；38.74min，λmax274nm、222nm，λmin258nm、214nm；44.20min，λmax250nm，λmin222nm；54.27min，λmax262nm，λmin234nm；57.06min，λmax274nm，λmin242nm；69.51min，λmax246nm，λmin234nm；71.33min，λmax254nm，λmin226nm；75.85min，λmax254nm，λmin226nm；76.86min，λmax274nm，λmin242nm；81.86min，λmax270nm，λmin242nm；89.05min，λmax262nm，λmin234nm；92.28min，λmax262nm，λmin242nm；阿膠輕相供試液的HPLC圖譜中，在10～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)為51個；在50～65分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)為19個，其三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為50.39min，λmax236nm，λmin212nm；51.19min，λmax232nm，λmin208nm；51.94min，λmax232nm，λmin204nm；52.73min，λmax232nm，λmin204nm；54.13min，λmax276nm、232nm，λmin272nm、212nm；54.37min，λmax268nm、232nm，λmin264nm、212nm；54.69min，λmax232nm，λmin204nm；55.06min，λmax280nm、228nm，最λmin256nm、216nm；56.53min，λmax232nm；57.77min，λmax308nm，272nm、230nm，λmin284nm、216nm；58.63min，λmax232nm，λmin204nm；59.15min，λmax276nm，λmin232nm；59.77min，λmax276nm，λmin224nm；60.43min，λmax276nm，λmin232nm；61.56min，λmax為276nm，λmin228nm；62,09min，λmax222nm，λmin216nm；62.57min，λmax276nm、224nm，λmin264nm、216nm；63.87min，λmax276nm、220nm，λmin256nm、216nm；64.67min，λmax224nm，λmin212nm；阿膠重相供試液的HPLC圖譜中，在25～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)為48個。在25～100分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)(僅具紫外末端吸收光譜的峰不計)為12個，其三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為25.98min，λmax252nm，λmin240nm；61.72min，λmax324nm、228nm，λmin268nm、216nm；79.12min，λmax224nm，λmin220nm；86.12min，λmax284nm、240nm，λmin272nm、212nm；90.04min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；90.44min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；91.58min，λmax216nm，λmin212nm；92.24min，λmax212nm，最λmin208nm；93.66min，λmax212nm，λmin208nm；94.51min，λmax256nm、212nm，λmin248nm、208nm；95.91min，λmax212nm，λmin208nm；97.11min，λmax272nm、220nm，λmin248nm、212nm；6色譜重現(xiàn)性實驗以阿膠為供試品(N＝5)，參照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，分別對共有峰相對保留時間及有規(guī)定的共有峰(有規(guī)定的共有峰即超過總峰面積10％的指紋峰)的相對峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。結果見表27色譜精密度實驗參照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，以阿膠為供試品，取1份，連續(xù)進樣5次，分別對共有峰相對保留時間及有規(guī)定的共有峰(有規(guī)定的共有峰即超過總峰面積10％的指紋峰)的相對峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。
8色譜穩(wěn)定性實驗參照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，以阿膠為供試品，考察24小時溶液穩(wěn)定，分別對共有峰相對保留時間及有規(guī)定的共有峰(有規(guī)定的共有峰即超過總峰面積10％的指紋峰)的相對峰面積進行統(tǒng)計，RSD％不超過3％。供試品24小時穩(wěn)定。
實施例2 阿膠HPLC圖譜的測定除與實施例1中3.1.2萃取不同外，其余均相同。
實施例2的萃取方法為將溶解好的中間相溶液，置50ml錐形分液漏斗中，沿壁緩緩加入20ml環(huán)己烷，密封、靜置萃取50小時。萃取完成后，進行相分離，將輕相萃取液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容至濃度為1g/ml，作為樣品的輕相供試液；將被輕相溶劑萃取過的中間相溶液沿壁緩緩加入另一盛有20ml二氯甲烷的50ml錐形分液漏斗中，密封、靜置萃取55小時。萃取后進行相分離，重相萃取溶液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容至濃度為1g/ml，作為樣品的重相供試液；將被輕、重相溶劑萃取過的中間相溶液，置離心管中，3500轉(zhuǎn)離心8分鐘，取上清液作為中間相供試液。
權利要求
1.一種采用液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法，其特征是，主要步驟如下第一步，阿膠HPLC圖譜測定(1)阿膠供試品溶液的制備方法a、精密稱取過4號篩的阿膠樣品粉末，置玻璃容器中，加入中間相溶劑，振搖1～3分鐘，置超聲清洗器中超聲15～20分鐘使之溶解，制成20mg/ml的溶液；然后將所述中間相溶液沿壁緩緩加入盛有重相溶劑的容器中，再沿壁緩緩加入輕相溶劑，使輕相∶中間相∶重相的體積比為1∶1∶1或1∶1∶2或2∶1∶1或1∶2∶1或2∶1∶2；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行三相分離，將輕、重相萃取液分別置水浴上蒸干，殘渣分別加無水乙醇溶解并定容，作為樣品輕、重相供試液；將經(jīng)輕、重兩相溶劑萃取過的中間相溶液，以3000～4000轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，取分離后的上清液作為樣品中間相供試液；或方法b、精密稱取過4號篩的阿膠樣品粉末，置玻璃容器中，加入中間相溶劑，振搖1～3分鐘，置超聲清洗器中超聲15～20分鐘使之溶解，制成20mg/ml的溶液；將輕相溶劑沿壁緩緩加入盛有中間相溶液的容器中，使輕相∶中間相的體積比為1∶1或2∶1或1∶2；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行兩相分離，輕相萃取液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容，作為樣品的輕相供試液；將被輕相溶劑萃取過的中間相溶液，沿壁緩緩加入盛有重相溶劑的容器中，使中間相溶液∶重相的體積比為1∶1或1∶2或2∶1；密封、靜置萃取6小時～60小時；萃取后進行兩相分離，重相萃取溶液置水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇溶解并定容，作為樣品的重相供試液；將先后分別被輕、重相溶劑萃取過的中間相溶液，以3000～4000轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，取分離后的上清液作為樣品的中間相供試液；(2)對照品溶液的制備取DL-β-苯丙氨酸和DL-酪氨酸，分別加無水乙醇或水配制成5μg/ml的溶液，作為中間相供試液色譜的對照品溶液；取膽紅素加無水乙醇制成1μg/ml的溶液，作為輕相供試液色譜的對照品溶液；取槲皮素加無水乙醇制成5μg/ml的溶液，作為重相供試液色譜的對照品溶液；(3)色譜條件色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為乙腈-水，梯度洗脫，中間相、輕相、重相供試液采用的洗脫梯度分別為0min→20min→100min，乙腈(V/V)1％→1％→10％；0min→5min→10min→20min→40min→60min→110min，乙腈(V/V)50％→50％→60％→70％→85％→95％→95％；0min→10min→20min→30min→40min→100min→120min，乙腈(V/V)30％→30％→35％→35％→40％→90％→90％；柱溫30℃；檢測波長為205nm；(4)測定分別精密吸取中間相、輕相、重相供試液及與之對應的對照品溶液，按照高效液相色譜法測定，記錄100或120分鐘的色譜圖和三維譜圖；第二步，以與上述阿膠HPLC圖譜測定相同的方法分別測定黃明膠和雜皮膠的HPLC圖譜；第三步，對阿膠、黃明膠、雜皮膠的同相供試液的HPLC圖譜進行對比分析，觀察色譜圖、三維圖整體形狀的差異；列出每種膠在一定保留時間內(nèi)的三維圖譜數(shù)據(jù)，其中，色譜峰的紫外吸收光譜僅有末端吸收的不計。
2.如權利要求1所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的阿膠是任何一種藥劑學上所說的阿膠的劑型。
3.如權利要求1所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的阿膠供試品溶液的制備也包括采用中間相與輕相組成的兩相靜態(tài)萃取體系制備的中間相、輕相供試液和采用中間相與重相組成的兩相靜態(tài)萃取體系制備的中間相、重相供試液。
4.如權利要求1～3之一所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的輕相萃取溶劑是己烷或環(huán)己烷或戊烷或庚烷或石油醚或乙醚；中間相萃取溶劑是水或1％～50％乙醇或1％～50％甲醇或1％～50％乙腈；重相萃取溶劑是氯仿或二氯甲烷或異戊醇。
5.如權利要求1或3所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的三相溶劑萃取相比即輕相∶中間相∶重相體積的比值是1∶1∶1或1∶1∶2。
6.如權利要求1所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的靜置萃取，萃取時間為20小時～30小時。
7.如權利要求1所述的阿膠鑒別方法，其特征在于所述的阿膠、黃明膠、雜皮膠中間相供試液的HPLC圖譜中，在10～100分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為42、50、54個；在25～95分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)，其中僅具紫外末端吸收光譜的峰不計，分別為13、7、18個，其中阿膠三維圖譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為26.71min，λmax274nm，λmin238nm；37.97min，λmax270nm，λmin250nm；38.74min，λmax274nm、222nm，λmin258nm、214nm；44.20min，λmax250nm，λmin222nm；54.27min，λmax262nm，λmin234nm；57.06min，λmax274nm，λmin242nm；69.51min，λmax246nm，λmin234nm；71.33min，λmax254nm，λmin226nm；75.85min，λmax254nm，λmin226nm；76.86min，λmax274nm，λmin242nm；81.86min，λmax270nm，λmin242nm；89.05min，λmax262nm，λmin234nm；92.28min，λmax262nm，λmin242nm；所述的阿膠、黃明膠、雜皮膠輕相供試液的HPLC圖譜中，在10～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為51、51、56個；在50～65分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)，其中僅具紫外末端吸收光譜的峰不計，分別為19、11、18個，其中阿膠三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為50.39min，λmax236nm，λmin212nm；51.19min，λmax232nm，λmin208nm；51.94min，λmax232nm，λmin204nm；52.73min，λmax232nm，λmin204nm；54.13min，λmax276nm、232nm，λmin272nm、212nm；54.37min，λmax268nm、232nm，λmin264nm、212nm；54.69min，λmax232nm，λmin204nm；55.06min，λmax280nm、228nm，最λmin256nm、216nm；56.53min，λmax232nm；57.77min，λmax308nm，272nm、230nm，λmin284nm、216nm；58.63min，λmax232nm，λmin204nm；59.15min，λmax276nm，λmin232nm；59.77min，λmax276nm，λmin224nm；60.43min，λmax276nm，λmin232nm；61.56min，λmax為276nm，λmin228nm；62,09min，λmax222nm，λmin216nm；62.57min，λmax276nm、224nm，λmin264nm、216nm；63.87min，λmax276nm、220nm，λmin256nm、216nm；64.67min，λmax224nm，λmin212nm；所述的阿膠、黃明膠、雜皮膠重相供試液的HPLC圖譜中，在25～110分鐘保留時間內(nèi)，色譜峰數(shù)分別為48、44、48個；在25～100分鐘保留時間內(nèi)的三維圖譜色譜峰數(shù)，其中僅具紫外末端吸收光譜的峰不計，分別為12、15、24個，其中阿膠三維圖譜色譜峰的保留時間(min)及其紫外最大吸收波長(λmax)和最小吸收波長(λmin)數(shù)據(jù)為25.98min，λmax252nm，λmin240nm；61.72min，λmax324nm、228nm，λmin268nm、216nm；79.12min，λmax224nm，λmin220nm；86.12min，λmax284nm、240nm，λmin272nm、212nm；90.04min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；90.44min，λmax276nm、224nm，λmin260nm、216nm；91.58min，λmax216nm，λmin212nm；92.24min，λmax212nm，最λmin208nm；93.66min，λmax212nm，λmin208nm；94.51min，λmax256nm、212nm，λmin248nm、208nm；95.91min，λmax212nm，λmin208nm；97.11min，λmax272nm、220nm，λmin248nm、212nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用液——液——液三相靜態(tài)萃取高效液相色譜鑒別阿膠的方法。即采用三種不同極性和不同比重的溶劑，以非極性溶劑為輕相、極性溶劑為中間相(將阿膠預先溶于該相)、弱極性溶劑為重相組成三相萃取體系，在靜態(tài)下對阿膠進行萃取，相分離后制成三種極性萃取物供試液并對三種供試液分別以不同的流動相梯度，按照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖和三維譜圖。對黃明膠、雜皮膠采用與阿膠相同的方法進行實驗。通過對三種膠在相同條件下測定的同相萃取物HPLC圖譜進行對比分析。該法鑒別阿膠，檢測靈敏度高，分離度、對稱性、重現(xiàn)性好，鑒別特征明顯，能夠準確鑒別阿膠真?zhèn)尾⒂行Э刂破鋬?nèi)在質(zhì)量。
文檔編號G01N30/06GK1773277SQ200510104389
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月31日 優(yōu)先權日2005年10月31日
發(fā)明者程秀民 申請人:山東大學