專利名稱：葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)試劑條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)食品及飲用水中葡萄球菌腸毒素的試劑條。
背景技術(shù)：
葡萄球菌腸毒素(SE)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種毒性蛋白質(zhì)，已報(bào)道有A，B，C，D，E，F(xiàn)(又稱TSST-1)以及G，H，I等血清型。各型腸毒素均可引起食物中毒和院內(nèi)感染。其中以A型最多見，B型和D型次之，葡萄球菌腸毒素是一種很強(qiáng)的促分裂原和超抗原，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，且其性質(zhì)穩(wěn)定，易于大量生產(chǎn)和制成氣溶膠，已成為重要的生物戰(zhàn)劑。目前對(duì)于葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)主要是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，即通過前增菌、選擇性增菌、分離鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)等步驟最終得到檢測(cè)結(jié)果。其整個(gè)過程需要10天左右，耗時(shí)費(fèi)力，不能滿足快速檢測(cè)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于食品中葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)的試劑條。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)試劑條，包括試劑、試劑條和微量移液管，由此形成能夠快速檢測(cè)葡萄球菌腸毒素的試劑條。
試劑所含的成分為細(xì)胞破碎液；所含的成分為標(biāo)記的抗體或抗原以溶液形式保存，在檢測(cè)前滴加到樣品墊靠近層析膜一端。
試劑條上至少應(yīng)載有20μL的特異性的抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的質(zhì)控抗原以及相應(yīng)質(zhì)控抗原的抗體。
上述試劑可以通過下述方法獲得1.免疫方法選6～8周，雌性BALB/c小鼠，以15mg/L SE加弗氏完全佐劑腹腔注射，然后分別以15μL，20μL加弗氏不完全佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫各1次，間隔2～3周，末次免疫后5天試血，以瓊脂擴(kuò)散方法測(cè)定抗SE，滴度達(dá)1∶8時(shí)可準(zhǔn)備融合，融合前3天從尾靜脈注入20mg/L SE。
2.細(xì)胞融合，篩選及克隆小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞復(fù)蘇后按常規(guī)方法進(jìn)行融合。脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的數(shù)量比約為5∶1，融合劑為50％聚乙二醇溶液，融合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng)，第10～17天改用HT培養(yǎng)基，17天后改用普通的RPMI-1640培養(yǎng)基，待雜交瘤細(xì)胞明顯生長后，取其上清以間接ELISA法篩選陽性克隆。對(duì)檢出的陽性孔以有限稀釋法進(jìn)行克隆化3～4次，100％陽性后，擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存細(xì)胞株。
3.腹水制備采用常規(guī)法，在預(yù)先1星期注射石蠟油的BALB/C小鼠腹腔注射已建株的雜交瘤細(xì)胞約2×106CFU，10天后誘生腹水收集瓶離心腹水得上清。-20℃保存。
4.膠體金標(biāo)記抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體復(fù)合物是這樣制備的取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加熱至沸騰，加入8mL 1％檸檬酸三鈉水溶液，煮沸5分鐘，出現(xiàn)橙紅色膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為200nm。取50mL膠體金一份，用0.1mol/L碳酸鐘調(diào)PH至8.0，攪拌下將膠體金溶液分別與免疫親和純化的抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇20000水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品6000g離心45分鐘，離心后，沉淀物生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存；5.將按上述方法制備的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體分別噴撒在厚度1mm的三張玻璃纖維紙上，凍干密封保存。
本發(fā)明的特點(diǎn)是制成快速檢測(cè)葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)試劑條，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，其檢測(cè)過程只需8分鐘左右的時(shí)間，操作程序簡單，使用方便。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 本發(fā)明的檢測(cè)試劑條是由待測(cè)樣品注入口、查看窗口和檢測(cè)線、質(zhì)控線組成。試劑條的支持物為硝酸纖維膜，其分為三個(gè)區(qū)域，兩端分別為樣品區(qū)和廢液區(qū)，中部為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)區(qū)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)區(qū)有兩個(gè)帶有試劑標(biāo)記的條帶，兩條帶上含有膠體金標(biāo)記的抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體，膠體金標(biāo)記的質(zhì)控抗原以及相應(yīng)質(zhì)控抗原的抗體。上述三種試劑的使用量為100μL，濃度均為1∶100u。在各條帶的標(biāo)記完成后，用1％小牛血清白蛋白封閉硝酸纖維膜，最后用鋁箔袋干燥封裝。
實(shí)施例2 四種試劑的使用量為80μL，濃度均為1∶100u。其它內(nèi)容均與實(shí)施例1的相同。
實(shí)施例3 四種試劑的使用量為90μL，濃度均為1∶120u。其它內(nèi)容均與實(shí)施例1的相同。
實(shí)施例4 四種試劑的使用量為110μL，濃度均為1∶150u。其它內(nèi)容均與實(shí)施例1的相同。
實(shí)施例5 四種試劑的使用量為120μL，濃度均為1∶180u。其它內(nèi)容均與實(shí)施例1的相同。
使用本試劑條檢測(cè)時(shí)，取100μL富集培養(yǎng)液加到試劑條上的長方形注入孔中，樣品通過毛細(xì)管作用沿載體移動(dòng)，如果樣品中存在抗原則會(huì)結(jié)合到金標(biāo)記抗體上形成抗原抗體復(fù)合物，并于檢測(cè)線A區(qū)呈現(xiàn)一條紅色帶線，為陽性結(jié)果，余下的樣品繼續(xù)遷移到載體末端最終沉淀于廢液池中。如樣品中無待測(cè)抗原，則在檢測(cè)線A區(qū)無任何色條出現(xiàn)，即為陰性結(jié)果.兩種情況下，質(zhì)控線B區(qū)皆出現(xiàn)紅色帶線，表示檢測(cè)有效。如B區(qū)無帶線，無論A區(qū)有無紅色帶線，都表示檢測(cè)無效。
權(quán)利要求
1.葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)試劑條，包括試劑、試劑條和微量移液管，由此形成能夠快速檢測(cè)葡萄球菌腸毒素的試劑條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑條，其特征在于試劑所含的成分為細(xì)胞破碎液；所含的成分為標(biāo)記的抗體或抗原以溶液形式保存，在檢測(cè)前滴加到樣品墊靠近層析膜一端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑條，其特征在于試劑條上至少應(yīng)載有20μL的特異性的抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的質(zhì)控抗原以及相應(yīng)質(zhì)控抗原的抗體。
全文摘要
本發(fā)明的屬于一種適用于食品中葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)的試劑條。葡萄球菌腸毒素快速檢測(cè)試劑條，包括試劑、試劑條和微量移液管，由此形成能夠快速檢測(cè)葡萄球菌腸毒素的試劑條。試劑所含的成分為細(xì)胞破碎液；所含的成分為標(biāo)記的抗體或抗原以溶液形式保存，在檢測(cè)前滴加到樣品墊靠近層析膜一端。試劑條上至少應(yīng)載有20μL的特異性的抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體、膠體金標(biāo)記的質(zhì)控抗原以及相應(yīng)質(zhì)控抗原的抗體。本發(fā)明大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，其檢測(cè)過程只需8分鐘左右的時(shí)間，操作程序簡單，使用方便。
文檔編號(hào)G01N33/558GK1955739SQ20051004758
公開日2007年5月2日 申請(qǐng)日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者吳斌, 李曉嵐, 秦成 申請(qǐng)人:吳斌, 李曉嵐, 秦成