專利名稱：增強皮內(nèi)隔室中的免疫反應(yīng)的方法和其中使用的化合物的制作方法
本申請要求2003年12月5日提交的美國臨時申請?zhí)?0/527,999的優(yōu)先權(quán)利益，其在這里整體引作參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其用于與一種或多種賦形劑相組合的抗原性或免疫原性試劑的皮膚輸送。本發(fā)明的免疫原性組合物包含抗原性或免疫原性試劑和至少一種賦形劑，一旦輸送到受試者皮膚的皮膚隔室中，無論是皮內(nèi)的還是表皮的，該賦形劑能起佐劑作用，即增強對所述抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種賦形劑，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明施用給皮膚的皮內(nèi)隔室時，其能表現(xiàn)出佐劑活性?；蛘?，本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種賦形劑，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明施用給皮膚的表皮隔室時，其能表現(xiàn)出佐劑活性。本發(fā)明的免疫原性組合物具有增強的功效，因為組合物的賦形劑會造成無癥狀的皮膚刺激，并將抗原呈遞細胞召集到皮膚隔室中，從而增強抗原性或免疫原性試劑向抗原呈遞細胞的呈遞和/或可用性。使用比常規(guī)使用更低劑量的抗原性或免疫原性試劑，且不需要加強免疫，在單次皮膚給藥后，本發(fā)明的免疫原性組合物的增強的功效可以導(dǎo)致治療上和/或預(yù)防上有效的免疫反應(yīng)。
2.發(fā)明背景藥物劑型含有活性成分和稱作賦形劑的無活性成分。劑型的性質(zhì)取決于工藝參數(shù)以及各種賦形劑和它們對活性成分的影響之間的相互關(guān)系。因此，使用賦形劑來實現(xiàn)各種特征，后者能改善劑型的性質(zhì)，以實現(xiàn)更好的功效。例如，在藥物制劑中使用賦形劑，以實現(xiàn)更高的穩(wěn)定性，更好的對生物或化學(xué)降解的抗性，更高的溶解度和/或減少的表面張力，以容易輸送。
佐劑是能增強免疫原性制劑(例如，疫苗)的功效和保護性免疫反應(yīng)的試劑。傳統(tǒng)地，通過將佐劑包含在制劑中，來提高疫苗制劑的免疫原性。最初，Ramon(1924，Ann.Inst.Pasteur，381)將免疫佐劑描述為“與特定抗原組合使用的物質(zhì)，其能產(chǎn)生比單獨的抗原更強的免疫反應(yīng)”。佐劑不同于常規(guī)的賦形劑，因為它們能直接增強免疫原性制劑中的活性成分的功效，即免疫原性。
已經(jīng)將各種各樣的(生物的和合成的)物質(zhì)用作佐劑。但是，盡管在許多年中廣泛地評價了大量的候選物，目前被美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)的唯一的佐劑是基于鋁的礦物質(zhì)(類名為明礬(Alum))。明礬具有可爭議的安全記錄(見，例如，Malakoff，2000，Science，2881323)，且對比研究證實，它是對于蛋白亞基的抗體誘導(dǎo)的弱佐劑，和是細胞介導(dǎo)的免疫的差佐劑。此外，明礬佐劑可以誘導(dǎo)IgE抗體應(yīng)答，且已經(jīng)在一些受試者中與過敏反應(yīng)相關(guān)聯(lián)(見，例如，Gupta等，1998，Drug Deliv.Rev.32155-72；Relyveld等，1998，Vaccine 161016-23)。自從明礬的開發(fā)以來，許多實驗佐劑已經(jīng)發(fā)展到臨床實驗階段，且有些已經(jīng)表現(xiàn)出高效力，但是也已經(jīng)證實對人類中的治療用途存在太大的毒性。
此外，佐劑的功效隨用于輸送疫苗的受試者中的靶隔室而變，因而必須根據(jù)疫苗的預(yù)期的靶隔室來證實每種佐劑。盡管已經(jīng)針對皮內(nèi)隔室以外的空間，例如，肌肉內(nèi)、皮下，發(fā)現(xiàn)并證實了數(shù)百種佐劑或潛在佐劑，但是在本發(fā)明之前，僅僅存在有限數(shù)目的能表現(xiàn)出在皮內(nèi)隔室中的前途的傳統(tǒng)佐劑，特別是沒有報道具有在皮內(nèi)隔室中的佐劑活性的賦形劑。因此，仍然需要能有效地增強由皮內(nèi)施用的免疫原觸發(fā)的免疫反應(yīng)的佐劑。
3.發(fā)明簡述本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)，即皮內(nèi)輸送抗原性或免疫原性試劑和一種或多種預(yù)選的賦形劑，會產(chǎn)生增強的對該抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法和免疫原性組合物中使用的賦形劑以前沒有與佐劑活性相關(guān)聯(lián)。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法和免疫原性組合物中使用的賦形劑以前沒有與皮內(nèi)空間中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)。盡管不希望受特定作用機理的約束，當(dāng)以根據(jù)本發(fā)明的方法的濃度和輸送途徑施用本發(fā)明的賦形劑時，它們會表現(xiàn)出非特異性的佐劑活性，即不通過特定的細胞受體，但是可能通過促進機械損傷，溫和刺激，或皮膚伸展。本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑的增強的功效部分地基于發(fā)明人的評價和認可，即皮內(nèi)隔室能提供理想的免疫空間以便抗原性或免疫原性試劑能直接接近其中存在的免疫細胞。實際上，很少有效地靶向皮內(nèi)隔室，作為抗原性或免疫原性試劑的輸送位點，至少部分地是由于特異性地且可再現(xiàn)地輸送抗原性或免疫原性試劑的困難，即準(zhǔn)確地將針頭置于皮內(nèi)空間中和合適的輸送壓力。
本發(fā)明的優(yōu)點也適用于其它的皮膚隔室中，包括但不限于皮膚的表皮隔室。盡管不希望受任何特定作用機理的約束，皮膚代表著有吸引力的用于輸送疫苗和基因治療劑的靶位點。在(基因的和常規(guī)的)疫苗的情況下，皮膚是有吸引力的輸送位點，這是由于在該組織中發(fā)現(xiàn)的高濃度的抗原呈遞細胞(APC)和APC前體，尤其是表皮朗氏細胞(LC)和皮內(nèi)隔室中的免疫細胞。
利用皮膚疫苗制劑，包括用于皮內(nèi)和表皮輸送的制劑，可以實現(xiàn)本發(fā)明的制劑的增強的功效。在有些實施方案中，本發(fā)明的皮膚疫苗制劑(包括表皮和皮內(nèi)制劑)包含抗原性或免疫原性試劑，和至少一種賦形劑，其能增強抗原性或免疫原性試劑向免疫細胞的呈遞和/或可用性，免疫細胞例如為皮內(nèi)隔室的免疫細胞(例如抗原呈遞細胞)或表皮隔室的免疫細胞(例如表皮朗氏細胞(LC))，從而產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)，優(yōu)選保護性的免疫反應(yīng)。在一個具體的實施方案中，該分子起延長抗原性或免疫原性試劑向皮膚隔室的免疫細胞的暴露的作用，所述免疫細胞例如為抗原呈遞細胞，表皮朗氏細胞(LC)，從而產(chǎn)生增強的保護性的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明包括用于皮膚輸送(包括皮內(nèi)和表皮輸送)的免疫原性組合物，其包含抗原性或免疫原性試劑和至少一種賦形劑，后者能增強針對該抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑通過將抗原呈遞細胞召集到注射位點，允許將抗原性或免疫原性試劑暴露于皮內(nèi)隔室的免疫細胞，產(chǎn)生增強的對該抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。
與其它常規(guī)的免疫原性組合物的輸送方式(包括肌肉內(nèi)的和皮下的輸送)相比，本發(fā)明的方法和組合物不但能提供增強的免疫反應(yīng)，增強的治療和/或預(yù)防功效，而且能在注射位點提供減少的刺激，增強的平均滴度抗體生產(chǎn)，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的；增強的中間抗體滴度，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的；增強的血清保護率和增強的血清轉(zhuǎn)化率，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的。本發(fā)明的制劑能減少，優(yōu)選避免溶血作用，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的。本發(fā)明的制劑也能避免膠凝作用和與改變的粘度相關(guān)的其它并發(fā)現(xiàn)象，其可以妨礙貯藏、制備和施用。
可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑包括但不限于，穩(wěn)定劑，防腐劑，溶劑，表面活性劑或去污劑，懸浮劑，張力劑，載體和生長培養(yǎng)基的成分?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的非限制性的列表是，醋酸，檸檬酸，富馬酸，鹽酸，硝酸，醋酸鈉，纖維素，木炭，明膠，氨溶液，碳酸銨，單-、二-或三-乙醇胺，氫氧化鉀，硼酸鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，三乙醇胺，氮氣，抗壞血酸，棕櫚酸抗壞血酸酯，丁基化羥基茴香醚，丁基化羥基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，沒食子酸丙酯，抗壞血酸鈉，亞硫酸氫鈉，甲醛合次硫酸氫鈉，偏亞硫酸氫鈉，亞硫酸鈉，甘氨酸，偏磷酸鉀，磷酸鉀，一堿價醋酸鈉，無水或二水合檸檬酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，乙二胺四乙酸，甘油，丙二醇和山梨醇，兩性霉素B，苯甲酸，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸鈉和丙酸鈉，氨普立糖，苯扎氯銨、苯索氯銨，芐醇，β丙醇酸內(nèi)酯，鯨蠟基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，慶大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，鏈霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯，制霉菌素，水，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，異丙醇，礦物油，油酸，花生油，純化水，注射用水，無菌的注射用水，苯扎氯銨，硬脂酸鎂，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F-68)、237、388、403(P123)或407(Lutrol F-127)，聚山梨酯20(吐溫TM20)，聚山梨酯80(吐溫TM80)，月桂基硫酸鈉，失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，瓊脂，膨潤土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纖維素鈉，明膠，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，高嶺土，甲基纖維素，黃芪膠，veegum，羧甲基纖維素鈉，明膠或甲基纖維素，右旋糖，葡萄糖，氯化鈉，玉米油，礦物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化鈉，抑菌的水，氨基酸，細菌用蛋白胨(bactopeptone)，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5細胞蛋白，卵白蛋白，維生素，酵母蛋白，脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，消泡劑例如polydimethyl silozone，硅，胎球蛋白(一種血清蛋白)，羥基乙酸(一種皮膚片狀剝落物(skinexfoliate))，過氧化氫(一種解毒劑)，乳糖(一種填充劑)，甘露糖和尿素。
本發(fā)明還包括其它的化合物或試劑，其以前沒有與任何組織空間中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)，當(dāng)與免疫原性或抗原性試劑皮內(nèi)地共同施用時，其能增強由免疫原性或抗原性試劑觸發(fā)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明特別地包括以前沒有與皮內(nèi)隔室中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)的化合物或試劑。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度取決于使用的具體賦形劑。在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10％(v/v)。在其它實施方案中，使用的賦形劑的濃度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度大于約30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。許多前述的賦形劑可以用于制備和生產(chǎn)免疫原性組合物。在這樣的情況下，可以在最后的免疫原性組合物中發(fā)現(xiàn)從組合物的生產(chǎn)或制備留下的賦形劑的殘留濃度。但是，這樣的殘留濃度太低，不會產(chǎn)生用本發(fā)明的免疫原性組合物觀察到的佐劑活性。
可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑包括來自動物、植物、細菌、原生動物、寄生物、病毒或其組合的抗原?？乖曰蛎庖咴栽噭┛梢允窃醋圆《镜娜我獾牟《镜碾?、蛋白質(zhì)、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素，單純皰疹病毒蛋白，例如單純皰疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。在本發(fā)明的組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑可以是致病病毒的抗原，例如，下述病毒的抗原腺病毒科(例如，哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬)，皰疹病毒科(例如，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，單純皰疹病毒5，和單純皰疹病毒6)，輕小病毒科(例如，輕小病毒屬，腸細菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎動物痘病毒亞科，副痘病毒屬，禽痘病毒屬，山羊痘病毒屬，野兔痘病毒屬，豬痘病毒屬，軟體動物痘病毒屬，和昆蟲痘病毒屬)，乳頭多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒屬和乳頭狀瘤病毒屬)，副粘病毒科(例如，副粘病毒屬，副流感病毒1，麻疹病毒屬(例如，麻疹病毒)，德國麻疹病毒屬(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒屬，人呼吸道合胞病毒)，metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如腸道病毒屬，鼻病毒屬，肝病毒屬(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒屬，和口蹄疫病毒屬(apthovirus)，呼腸孤病毒科(例如，正呼腸孤病毒屬(orthoreovirus)，環(huán)狀病毒屬，輪狀病毒屬，質(zhì)型多角體病毒屬，斐濟病毒屬，植物呼腸孤病毒屬，和水稻病毒屬(oryzavirus))，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如哺乳動物B型反轉(zhuǎn)錄病毒，哺乳動物C型反轉(zhuǎn)錄病毒，禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒，D型反轉(zhuǎn)錄病毒組，BLV-HTLV反轉(zhuǎn)錄病毒)，慢病毒屬(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒屬，黃病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒屬(例如，新培斯病毒)和風(fēng)疹病毒屬(例如，風(fēng)疹病毒))，彈狀病毒科(例如，水泡病毒屬，狂犬病病毒屬，短時熱病毒屬(ephemerovirus)，胞質(zhì)彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)，和胞核彈狀病毒屬(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒屬，淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，Ippy virus，和拉薩病毒)，和冠狀病毒科(例如，冠狀病毒屬和曲狀病毒屬(torovirus))。本發(fā)明的制劑也可以提高針對流感，HIV，脊髓灰質(zhì)炎，登革熱，Streppneumo，百日咳(Pertusis)，皰疹，和衣原體疾病的預(yù)防。
可選擇地，本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑可以是癌癥或腫瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，磷酸前列腺酸酯，前列腺特異性的抗原，黑素瘤相關(guān)抗原p97，黑素瘤抗原gp75，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)，前列腺特異性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原，例如CEA，TAG-72，CO17-1A；GICA19-9，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B-淋巴瘤抗原-CD20，CD33，黑素瘤特異性的抗原，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3，腫瘤特異性的移植類型的細胞表面抗原(TSTA)，例如病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括DNA腫瘤病毒的T-抗原和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如結(jié)腸的CEA，膀胱腫瘤瘤胚抗原，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20，纖維肉瘤的抗原，人白血病T細胞抗原-Gp37，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生長因子受體)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)，惡性人淋巴細胞抗原-APO-1，分化抗原例如在胎紅細胞、原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在成年紅細胞、植入前的胚胎中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)，在乳腺上皮中發(fā)現(xiàn)的M18、M39，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1，在結(jié)腸直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3，在胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的Y半抗原、Ley，在A431細胞中發(fā)現(xiàn)的TL5(血型A)、EGF受體，在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的FC10.2，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10，在A431細胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的CO-43(血型Leb)、G49，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2(血型ALeb/Ley)，在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-細胞階段胚胎中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4，和來自皮膚T細胞淋巴瘤的T細胞受體衍生肽。
用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑可以是能在合適的條件下在受試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)，包括但不限于，多肽，肽，蛋白質(zhì)，糖蛋白，脂類，核酸和多糖。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以確定本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑的濃度，其取決于抗原性或免疫原性試劑的效力和性質(zhì)。在本發(fā)明的增強的輸送系統(tǒng)下，抗原性或免疫原性試劑的濃度優(yōu)選地低于當(dāng)使用可選擇的給藥途徑和可選擇的組合物時使用的常規(guī)量。在本發(fā)明的組合物中使用的免疫原性試劑也可以是破碎的病毒粒子。
在形成針對抗原性或免疫原性試劑(需要針對它們的免疫反應(yīng))的迅速且高水平的免疫性時，本發(fā)明的免疫原性組合物是特別有利的。本發(fā)明的免疫原性組合物利用低劑量的抗原性或免疫原性試劑，可以實現(xiàn)保護水平的全身免疫性。在有些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物利用劑量是為了得到有效的免疫反應(yīng)而常規(guī)使用的抗原性或免疫原性試劑劑量的60％、優(yōu)選50％、更優(yōu)選40％的抗原性或免疫原性試劑，產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)，因而轉(zhuǎn)化為劑量的減少。在其它實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物利用劑量比為了得到有效的免疫反應(yīng)而常規(guī)使用的抗原性或免疫原性試劑劑量小至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍的抗原性或免疫原性試劑，產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含劑量低于使用常規(guī)的輸送模式，例如肌肉內(nèi)和皮下，和常規(guī)的組合物，即在沒有本發(fā)明的賦形劑的情況下，在本領(lǐng)域中使用的常規(guī)劑量(例如，Physician′s Desk Reference中推薦的劑量)的抗原性或免疫原性試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物在單次皮內(nèi)給藥后，會產(chǎn)生治療上或預(yù)防上有效的免疫反應(yīng)。對于每年的免疫，可以皮內(nèi)地施用本發(fā)明的免疫原性組合物。
與目前可以得到的制劑相比，本發(fā)明的免疫原性組合物具有增強的治療功效、安全性和毒性特性。本發(fā)明的免疫原性組合物賦予的益處和優(yōu)點部分地是由于特殊的制劑和它們在靶向皮膚的皮內(nèi)隔室中的效用。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物可以提供更大的和更持久的保護，特別是對于不能較好地對免疫作出響應(yīng)的高危群體(例如，老年人，嬰兒，無免疫應(yīng)答的人)。
用于本發(fā)明的方法和組合物中的、在皮內(nèi)空間中具有佐劑性質(zhì)的賦形劑具有需要的免疫增強和組織相容性屬性，如使用本領(lǐng)域已知的和本文公開的標(biāo)準(zhǔn)方法所測得的。本發(fā)明的優(yōu)選的賦形劑具有由大于0.125的斜率(m)值定義的皮內(nèi)空間中的通常工作特性(profile)。圖35描繪了用于確定最佳工作特性的一個示例性的方案。斜率代表相對于皮內(nèi)隔室中的組織深度的最大工作濃度的變化。具體地，如圖35所示，從第一和第二賦形劑濃度和皮內(nèi)隔室中的第一和第二組織深度，衍生出斜率值。皮內(nèi)空間中的第一參考點是更淺的輸送，其中賦形劑表現(xiàn)出免疫增強性質(zhì)，其draize得分為2或更小。第一參考點的賦形劑濃度是在最淺輸送深度的最高濃度，其允許draize得分為2或更小。皮內(nèi)空間中的第二參考點是最深的輸送，其中賦形劑表現(xiàn)出免疫增強性質(zhì)，其draize得分為2或更小。第二參考點的賦形劑濃度是在最深輸送深度的最高濃度，其允許draize得分為2或更小。例如，第一和第二輸送深度之間的距離可以是相隔2mm，具體地，1mm和3mm輸送。下式可以描述工作斜率(m)
C2-C1D2-D1=m]]>其中C2等于在D2的C無窮；其中C1等于在D1的最大賦形劑濃度，draize得分為2或更??；其中Dn表示輸送深度。
盡管斜率標(biāo)準(zhǔn)具有許多應(yīng)用，但當(dāng)選擇用于疫苗輸送的賦形劑時，它具有特別的效用。例如，初步地和優(yōu)先地在1.0-1.5mm的淺深度篩選賦形劑，其中通過水泡可以容易地證實ID輸送。具有靶斜率值作為清楚的目標(biāo)，可以減少后續(xù)的在更深的組織深度的篩選，減少實驗、時間和成本。更重要地，斜率值允許制劑科學(xué)家鑒別具有更大的免疫增強潛力的賦形劑。
本發(fā)明包括用于施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的組合物，其包含賦形劑，從而當(dāng)輸送給皮內(nèi)隔室時，該組合物會表現(xiàn)出佐劑活性和等于或小于2的draize得分。
本發(fā)明還包括用于施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的組合物，其包含賦形劑，其中組合物的活性可以表征為，當(dāng)以具有佐劑活性和小于或等于2的Draize得分的濃度施用該組合物時，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中的第一和第二組織深度處的第一和第二賦形劑濃度，其中第一和第二組織深度相隔至少2mm。
在有些實施方案中，本發(fā)明的賦形劑具有狹窄的工作范圍，即它們在該范圍內(nèi)具有皮內(nèi)隔室中的佐劑活性，同時具有等于或小于2的draize得分。在其它實施方案中，本發(fā)明的賦形劑具有寬的工作范圍，即它們在該范圍內(nèi)具有皮內(nèi)隔室中的佐劑活性，同時具有等于或小于2的draize得分。
本發(fā)明包括在受試者，優(yōu)選動物，更優(yōu)選人中引起增強的對抗原性或免疫原性組合物的免疫反應(yīng)的方法，包括將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含抗原性或免疫原性試劑和賦形劑。在一個具體的實施方案中，免疫原性組合物是疫苗。
本發(fā)明還包括鑒定能增強對免疫原性或抗原性試劑的免疫反應(yīng)的化合物的方法。在一個實施方案中，鑒定能增強對抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)的化合物的方法包括將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，測量免疫反應(yīng)的水平，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物，且其中免疫反應(yīng)針對該抗原性或免疫原性試劑。本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文公開的方法，通過測定體液的和/或細胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，來測量免疫反應(yīng)的水平。一旦確定了免疫反應(yīng)的水平，將其與標(biāo)準(zhǔn)水平相比較，其中測量的水平升高表明該化合物是佐劑。
本發(fā)明還包括試劑盒，其包含本文所述的本發(fā)明的皮內(nèi)施用裝置和免疫原性組合物。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的免疫原性組合物的藥物包或試劑盒。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含一個或多個裝有一種或多種本發(fā)明的免疫原性組合物組分例如(抗原性或免疫原性試劑、賦形劑)的容器。在另一個具體的實施方案中，試劑盒包含2個容器，一個含有抗原性或免疫原性試劑，另一個含有賦形劑。這樣的容器可以伴有由規(guī)范藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定的形式的公告，該公告反映了由生產(chǎn)、使用或銷售的管理機構(gòu)對于人類施用所作出的批準(zhǔn)。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含如本文所述的本發(fā)明的皮內(nèi)施用裝置和皮內(nèi)疫苗制劑。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含皮膚施用裝置和如本文所述的本發(fā)明的皮膚疫苗制劑。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含表皮施用裝置和如本文所述的本發(fā)明的表皮疫苗制劑。
3.1定義如本文使用的，除非另有說明，術(shù)語″賦形劑″指藥物組合物中的成分或添加劑，其自身不具有組合物所要達到的藥理學(xué)或生物學(xué)活性，且在本發(fā)明之前，不知其在根據(jù)本發(fā)明施用到皮膚的皮內(nèi)隔室時，能直接增強或改變這樣的藥理學(xué)或生物學(xué)活性。在本發(fā)明的方法中使用的賦形劑是預(yù)選的賦形劑。如本文使用的，″預(yù)選的″賦形劑包括傳統(tǒng)的、非傳統(tǒng)的賦形劑，和當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法輸送給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，具有佐劑活性的所有其它賦形劑。
如本文使用的，″傳統(tǒng)的″賦形劑是添加到組合物中作為稀釋劑或載體的或多或少具有惰性的物質(zhì)。或者，可以使用傳統(tǒng)的賦形劑，為組合物提供形狀或稠度。這樣的傳統(tǒng)賦形劑的實例是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中，見，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Pub.Co.，N.J.，現(xiàn)行版；它們都在本文中整體引作參考。
如本文使用的，″傳統(tǒng)的″佐劑是添加到組合物中增強組合物中的活性成分的抗原性的物質(zhì)，例如，礦物質(zhì)懸浮液，其上面吸收著抗原性或免疫原性試劑，或油包水乳液，其中抗原性試劑乳化在礦物油中(例如，弗氏不完全佐劑)，有時包含殺死的分枝桿菌，以進一步增強抗原性試劑的抗原性。
將血清轉(zhuǎn)化率定義為，對于每種疫苗菌株，血清血凝素抑制(HI)滴度在疫苗接種后具有至少4-倍增加的受者的百分比。將轉(zhuǎn)化系數(shù)定義為，對于每種疫苗株系，血清HI幾何平均滴度在疫苗接種后的倍數(shù)增加。將保護率或血清保護率定義為，在疫苗接種后血清HI滴度等于或大于1∶40的受者的百分比，且一般接受為指示性保護。
如本文使用的，術(shù)語“佐劑”指能輔助或改善試劑的作用的任何化合物，包括但不限于免疫學(xué)佐劑，其能增加或多樣化對抗原的免疫反應(yīng)。該術(shù)語也包括，當(dāng)添加到免疫原性或抗原性試劑時，在暴露于混合物后，能非特異性地增強對受者宿主中的試劑的免疫反應(yīng)的化合物。佐劑包括能“免疫調(diào)控”細胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而上調(diào)免疫反應(yīng)的化合物。與該免疫調(diào)控相伴的是，還要選擇哪種T-細胞，Th1或Th2，會主導(dǎo)該免疫反應(yīng)。Th1反應(yīng)會引起補體結(jié)合性抗體和強烈的遲發(fā)型過敏反應(yīng)(其與IL-2和γ-干擾素相關(guān)聯(lián))。CTL反應(yīng)的誘導(dǎo)，似乎與Th1反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。Th2反應(yīng)與高水平的IgE和細胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10相關(guān)聯(lián)。術(shù)語佐劑包括這樣的化合物，即當(dāng)施用給個體或體外測試時，其能增強施用了抗原的受試者中的對抗原的免疫反應(yīng)，或增強來自免疫系統(tǒng)的細胞的某些活性。一些抗原在單獨施用時是弱免疫原性的，或在能引起受試者中有用的免疫反應(yīng)的濃度下對受試者是有毒性的。通過使抗原具有更強的免疫原性，佐劑可以增強受試者針對抗原的免疫反應(yīng)。佐劑效應(yīng)也可以產(chǎn)生施用較低劑量的抗原在受試者中達到有用的免疫反應(yīng)的能力。
如本文使用的，術(shù)語″抗原″指含有一個或多個表位的分子，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明呈遞抗原時，所述表位能刺激宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生細胞抗原特異性免疫反應(yīng)，或體液抗體反應(yīng)。抗原單獨地或當(dāng)與另一種分子一起存在時，可以引起細胞的或體液的反應(yīng)。一般地，表位會包含約3-15、優(yōu)選約5-15和更優(yōu)選約7-15個氨基酸。使用本領(lǐng)域眾所周知的許多表位作圖技術(shù)，可以鑒定出給定蛋白質(zhì)的表位。見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J.。例如，通過在固體支持物上同時合成大量的肽，所述肽對應(yīng)著蛋白質(zhì)分子的部分，并使肽與抗體反應(yīng)，同時使肽仍然結(jié)合在支持物上，可以確定線性表位。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且記載在如下文獻中，例如，美國專利號4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23709-715，它們都在這里整體引作參考。同樣地，通過確定氨基酸的空間構(gòu)象，例如通過x-射線晶體學(xué)和2-維核磁共振，可以容易地鑒定出構(gòu)象表位。見，例如Epitope Mapping Protocols，同上。如本文使用的，術(shù)語″抗原″指兩種亞組抗原，即從抗原天然伴隨的完整生物分離和分開的抗原，以及殺死的、減毒的、破碎的或滅活的細菌、病毒、寄生物或其它微生物。同樣地，能體內(nèi)表達治療性或免疫原性蛋白質(zhì)或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如在基因治療和核酸免疫應(yīng)用中，也包含在本文的抗原定義中。而且，為了本發(fā)明的目的，抗原可以源自若干種已知的病毒、細菌、寄生物和真菌中的任意，以及各種腫瘤抗原中的任意。而且，為了本發(fā)明的目的，“抗原”指蛋白質(zhì)，其包含對天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常在性質(zhì)上是保守的)，只要蛋白質(zhì)能維持引起免疫學(xué)反應(yīng)的能力。這些修飾可以是故意的，例如通過定位誘變，或可以是偶然的，例如通過能產(chǎn)生抗原的宿主的突變。
如本文使用的，對抗原或組合物的“免疫學(xué)反應(yīng)”或“免疫反應(yīng)”這一術(shù)語，是受試者對存在于目標(biāo)組合物中的分子的體液和/或細胞免疫反應(yīng)的形成。為了本發(fā)明的目的，“體液免疫反應(yīng)”指由抗體分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而“細胞免疫反應(yīng)”是由T-淋巴細胞和/或其它的白細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。細胞免疫的一個重要的方面包含溶細胞性T-細胞(″CTL″)的抗原特異性反應(yīng)。CTL具有對與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼、且表達在細胞表面上的蛋白一起呈遞的肽抗原的特異性。CTL能輔助誘導(dǎo)和促進細胞內(nèi)微生物的胞內(nèi)破壞，或感染了這樣的微生物的細胞的裂解。細胞免疫的另一個方面包含輔助T-細胞的抗原特異性反應(yīng)。輔助T-細胞的作用是輔助刺激功能，和聚集非特異性的效應(yīng)細胞針對能在它們的表面上與MHC分子相關(guān)聯(lián)地顯示肽抗原的細胞的活性?！凹毎庖叻磻?yīng)”也指內(nèi)源性細胞因子、趨化因子和由活化的T-細胞和/或其它白細胞生產(chǎn)的其它這樣的分子的產(chǎn)生，包括源自CD4+和CD8+T-細胞的那些。
如本文使用的，除非另有說明，術(shù)語“增強的免疫反應(yīng)”指，當(dāng)將本發(fā)明的抗原性或免疫原性試劑與一種或多種本發(fā)明的佐劑共同施用時，與單獨施用相同量的抗原性或免疫原性試劑的受試者相比，在接受這樣的施用的受試者中，存在增強的抗體形成，如使用本領(lǐng)域已知的和下面5.4部分所述的標(biāo)準(zhǔn)方法所測得的。優(yōu)選地，增強的免疫反應(yīng)指抗體形成的約10％、20％、30％、50％、70％、或100％或更大的增加。
或者，如本文使用的，術(shù)語“增強的免疫反應(yīng)”指，當(dāng)將本發(fā)明的抗原性或免疫原性試劑與一種或多種本發(fā)明的佐劑化合物共同施用時，與單獨施用抗原性或免疫原性試劑的受試者相比，可以使用更小量的抗原性或免疫原性試劑，在受試者中達到相同水平的抗體形成。優(yōu)選地，當(dāng)與本發(fā)明的佐劑化合物一起施用時，可以以沒有本發(fā)明的佐劑化合物時施用的相同試劑的量的約90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或更小這樣的量來施用抗原性或免疫原性化合物，在受試者中達到相同水平的抗體形成。
4.附圖簡述

圖1.血清反應(yīng)。對Flu抗原外殼的血清反應(yīng)(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐劑的Flu疫苗和非免疫(吐溫80和氨普立糖實施例)圖2.血清反應(yīng)。對Flu抗原外殼的血清反應(yīng)(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐劑的Flu疫苗和非免疫(細菌用蛋白胨和亞硫酸鈉)(都ID輸送)圖3.血清反應(yīng)。對Flu抗原外殼的血清反應(yīng)(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐劑的Flu疫苗和非免疫(TritonX-100)(都ID輸送)圖4A.血清反應(yīng)。對Flu抗原外殼的血清反應(yīng)(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐劑的Flu疫苗和非免疫(山梨醇和兩性霉素B)(都ID輸送)圖4B.六個點ELISA測定，證實了山梨醇能使Fluzone三價疫苗增加3倍。
圖5.血清反應(yīng)。對Flu抗原外殼的血清反應(yīng)(1∶123Dil)接受Flu疫苗的Balb/c小鼠vs.具有佐劑的Flu疫苗和非免疫(尿素和Triton N-101)(都ID輸送)圖6.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了胎球蛋白的pDNA(2ndTB，1∶123稀釋度)圖7.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了甲基纖維素、明膠、細菌用蛋白胨和磷酸三正丁酯的pDNA(1stTB，1∶370稀釋度)圖8.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了明膠、尿素和抑蛋白酶肽的pDNA(1stTB，1∶123稀釋度)圖9.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了ETOH和山梨醇的pDNA(1stTB，1∶123稀釋度)圖10.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了亞硫酸鈉的pDNA(1stTB，1∶370稀釋度)圖11.血清反應(yīng)。對Flu抗原的血清反應(yīng)Flu pDNA免疫原vs.補充了甘露糖、脫鐵運鐵蛋白、羥基乙酸和吐溫2O的pDNA(1stTB，1∶370稀釋度)圖12.針裝置。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的針組合件的分解透視圖。
圖13.針裝置。圖12的實施方案的部分剖面視圖。
圖14.針裝置。連接到注射器體上而形成注射裝置的圖13的實施方案。
圖15A-B.微磨蝕器裝置。
A.優(yōu)選的實施方案的手柄端的俯視圖B.微磨蝕器的優(yōu)選的實施方案的側(cè)視16A-B.微磨蝕器裝置。
A.15A和15B的微磨蝕器裝置的透明透視圖B.圖15B的微磨蝕器裝置的剖面視17.微磨蝕器裝置。在受試者皮膚上的圖15A、15B、16A和16B的微磨蝕器裝置的磨蝕表面的側(cè)視圖。
圖18.微磨蝕器裝置。
A.圖17的實施方案的磨蝕表面的透視圖。
B.磨蝕器表面的剖面?zhèn)纫晥D。
圖19.微磨蝕器裝置圖17的實施方案的磨蝕器表面的底視圖。
圖20.微磨蝕器裝置經(jīng)磨蝕的皮膚凹痕(furrow)的部分剖面的透視圖。
圖21.ID空間中的吐溫(Tween)80的佐劑性質(zhì)。在一項研究中，5％的吐溫80導(dǎo)致100％血清轉(zhuǎn)化。
圖22.在注射位點的DRAIZE打分。在豬皮膚刺激研究中，在ID空間中，能較好地耐受5％吐溫80。
圖23.ID和IM輸送流感疫苗的比較(鼠科動物模型)。與IM輸送的市售三價疫苗相比，和三價疫苗一起ID輸送的吐溫80(0.9％V/V)能產(chǎn)生更高的平均滴度、更高的中間滴度和更高的血清轉(zhuǎn)化。
圖24.吐溫80和山梨醇的比較。不能較好地耐受10％W/V的吐溫80。相反地，能較好地耐受10％W/V山梨醇。
圖25.隨針深度而變的皮膚相容性變化特性。施用后20-24小時的豬數(shù)據(jù)證實了，當(dāng)用1.0mm、1.5mm、2.0mm和3.0mm針輸送時，如何耐受2％吐溫80溶液。皮膚反應(yīng)隨深度而提高。更深的組織是更耐受的。具有更大佐劑強度的更高濃度的吐溫80可以用于更深的組織。
圖26.補充了明膠的FLUZONE的免疫原性IM輸送對ID輸送。ID輸送補充了明膠的Fluzone三價配方，并IM輸送原樣的Fluzone。0.45％w/v的明膠能增強血清轉(zhuǎn)化和中間滴度。
圖27.皮膚相容性研究如通過Draize得分分析揭示的，豬能耐受每次給藥高達600ng/100ul或1200ng/200ul總兩性霉素。施用后1小時，測定Draize得分。
圖28.補充了脫氧膽酸鹽的FLUZONE的免疫反應(yīng)ID對IM輸送(ID+/-脫氧膽酸鹽)。當(dāng)輸送到ID空間時，脫氧膽酸鹽具有免疫增強特征。在IM輸送中，5只動物中只有1只在免疫后21天發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。但是，在ID輸送中，5只動物中有5只發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。ID輸送能產(chǎn)生最好的中間滴度。
圖29.隨針深度而變的皮膚相容性變化特性。在1.5mm深度，不能耐受0.5％w/v和更高濃度的脫氧膽酸鹽。施用后1小時，測定Draize得分。
圖30.細菌用蛋白胨的皮膚相容性變化特性。最后一次注射后，立即進行皮膚呈現(xiàn)。賦形劑，細菌用蛋白胨，具有平息(calming)作用。
圖31.用5.0％V/V吐溫80增強的豚鼠模型中的FLUZONE免疫原性。對比在有或沒有吐溫80的情況下，F(xiàn)luzone的IM和ID輸送。在用三價抗原(New Caledonia，Panama，B-Hong Kong)進行的HAI測定中，補充了吐溫80的Fluzone的ID輸送勝過沒有補充物的ID輸送的Fluzone和沒有補充物的IM輸送的Fluzone。
圖32.用0.1％W/V脫氧膽酸鈉增強的豚鼠模型中的FLUZONE免疫原性。對比在有或沒有脫氧膽酸鹽的情況下，F(xiàn)luzone的IM和ID輸送。在用三價抗原(New Caledonia，Panama，B-Hong Kong)進行的HAI測定中，補充了脫氧膽酸鈉的Fluzone的ID輸送勝過沒有補充物的ID輸送的Fluzone和沒有補充物的IM輸送的Fluzone。
圖33.各種不同的賦形劑在Hartley豚鼠中的DRAIZE打分。在豚鼠中，能較好地耐受在指定濃度測試的賦形劑。
圖34.各種不同的賦形劑在Yorkshire豬中的DRAIZE打分。在豬中，能較好地耐受在指定濃度測試的賦形劑。
圖35.理想的賦形劑性質(zhì)。賦形劑A具有需要的特性。通過施用給更深的皮內(nèi)組織，從而具有得到進一步的免疫益處的潛力，可以實質(zhì)上增加在1mm深度耐受的最大濃度。具有大于或等于0.125的斜率(最大可接受的濃度/組織深度)的賦形劑是優(yōu)選的。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于皮內(nèi)輸送的免疫原性組合物，其包含抗原性或免疫原性試劑，和至少一種賦形劑，后者能增強對抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。在有些實施方案中，免疫原性組合物會產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。盡管不希望受特定作用機理的約束，當(dāng)以根據(jù)本發(fā)明的方法的濃度和輸送途徑施用本發(fā)明的賦形劑時，它們會表現(xiàn)出非特異性的佐劑活性，即不通過特定的細胞受體，但是可能通過促進機械損傷，溫和刺激，或皮膚伸展?；蛘撸M管不希望受特定作用機理的約束，賦形劑一旦被輸送至受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，它們可以起皮膚刺激劑的作用，導(dǎo)致將抗原呈遞細胞召集到注射位點的皮內(nèi)隔室中，從而起佐劑的作用，即增強對免疫原性組合物的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法和免疫原性組合物中使用的賦形劑以前沒有與佐劑活性相關(guān)聯(lián)。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法和免疫原性組合物中使用的賦形劑以前沒有與皮內(nèi)空間中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)。
與其它常規(guī)的輸送免疫原性組合物的方式(包括肌肉內(nèi)的和皮下的輸送)相比，本發(fā)明的方法和組合物不但能提供增強的免疫反應(yīng)，增強的治療和/或預(yù)防功效，而且能在注射位點提供減少的刺激，增強的平均滴度抗體生產(chǎn)，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的；增強的中間抗體滴度，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的；增強的血清轉(zhuǎn)化率和血清保護率，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的；減少的溶血作用，如使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法所測量的，減少的在貯藏和制備過程中的膠凝。
可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑包括但不限于，穩(wěn)定劑，防腐劑，溶劑，表面活性劑或去污劑，懸浮劑，張力劑，載體和生長培養(yǎng)基的成分?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的非限制性的列表是，醋酸，檸檬酸，富馬酸，鹽酸，硝酸，醋酸鈉，纖維素，木炭，明膠，氨溶液，碳酸銨，單-、二-或三-乙醇胺，氫氧化鉀，硼酸鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉，三乙醇胺，氮氣，抗壞血酸，棕櫚酸抗壞血酸酯，丁基化羥基茴香醚，丁基化羥基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，沒食子酸丙酯，抗壞血酸鈉，亞硫酸氫鈉，甲醛合次硫酸氫鈉，偏亞硫酸氫鈉和亞硫酸鈉，甘氨酸，偏磷酸鉀，磷酸鉀，一堿價醋酸鈉，無水或二水合檸檬酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，乙二胺四乙酸，甘油，丙二醇，山梨醇，兩性霉素B，苯甲酸，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸鈉和丙酸鈉，氨普立糖，苯扎氯銨、苯索氯銨，芐醇，β丙醇酸內(nèi)酯，鯨蠟基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，慶大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，鏈霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯，制霉菌素，水，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，異丙醇，礦物油，油酸，花生油，純化水，注射用水，無菌的注射用水，苯扎氯銨，硬脂酸鎂，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F-68)、237、388或407(Lutrol F-127)，聚山梨酯20(吐溫TM20)，聚山梨酯80(吐溫TM80)，月桂基硫酸鈉，失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，瓊脂，膨潤土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纖維素鈉，明膠，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，高嶺土，甲基纖維素，黃芪膠和veegum，羧甲基纖維素鈉，明膠或甲基纖維素，右旋糖，葡萄糖，氯化鈉，玉米油，礦物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化鈉，抑菌的水，氨基酸，細菌用蛋白胨，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5細胞蛋白，卵白蛋白，維生素，酵母蛋白，脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，消泡劑例如polydimethyl silozone，硅，胎球蛋白(一種血清蛋白)，羥基乙酸(一種皮膚片狀剝落物(skin exfoliate))，過氧化氫(一種解毒劑)，乳糖(一種填充劑)，甘露糖和尿素。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度取決于使用的具體賦形劑。在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10.0％(v/v)。在其它實施方案中，使用的賦形劑的濃度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度大于約30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。賦形劑可以用于制備和生產(chǎn)免疫原性組合物。在這樣的情況下，可以在最后的免疫原性組合物中發(fā)現(xiàn)從組合物的生產(chǎn)或制備留下的賦形劑的殘留濃度。這樣的殘留濃度太低，不會產(chǎn)生用本發(fā)明的免疫原性組合物觀察到的佐劑活性。
用于本發(fā)明的方法和組合物中的、在皮內(nèi)空間中具有佐劑性質(zhì)的賦形劑具有需要的免疫增強和組織相容性屬性，如使用本領(lǐng)域已知的和本文公開的標(biāo)準(zhǔn)方法所測得的。本發(fā)明的優(yōu)選的賦形劑具有由大于0.125的斜率(m)值定義的皮內(nèi)空間中的通常工作特性(profile)。圖35描繪了用于確定最佳工作特性的一個示例性的方案。斜率代表相對于皮內(nèi)隔室中的組織深度的最大工作濃度的變化。具體地，如圖35所示，從第一和第二賦形劑濃度和皮內(nèi)隔室中的第一和第二組織深度，衍生出斜率值。皮內(nèi)空間中的第一參考點是更淺的輸送，其中賦形劑表現(xiàn)出免疫增強性質(zhì)，其draize得分為2或更小。第一參考點的賦形劑濃度是在最淺輸送深度的最高濃度，其允許draize得分為2或更小。皮內(nèi)空間中的第二參考點是最深的輸送，其中賦形劑表現(xiàn)出免疫增強性質(zhì)，其draize得分為2或更小。第二參考點的賦形劑濃度是在最深輸送深度的最高濃度，其允許draize得分為2或更小。例如，第一和第二輸送深度之間的距離可以是相隔2mm，具體地，1mm和3mm輸送。下式可以描述工作斜率(m)C2-C1D2-D1=m]]>其中C2等于在D2的C無窮；其中C1等于在D1的最大賦形劑濃度，draize得分為2或更小；其中Dn表示輸送深度。
本發(fā)明包括用于施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的組合物，其包含賦形劑，從而當(dāng)輸送給皮內(nèi)隔室時，該組合物會表現(xiàn)出佐劑活性和等于或小于2的draize得分。
本發(fā)明還包括用于施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的組合物，其包含賦形劑，其中組合物的活性可以表征為，當(dāng)以具有佐劑活性和小于或等于2的Draize得分的濃度施用該組合物時，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中的第一和第二組織深度處的第一和第二賦形劑濃度，其中第一和第二組織深度相隔至少2mm。
在有些實施方案中，本發(fā)明的賦形劑具有狹窄的工作范圍，即它們在該范圍內(nèi)具有皮內(nèi)隔室中的佐劑活性，同時具有等于或小于2的draize得分。在其它實施方案中，本發(fā)明的賦形劑具有寬的工作范圍，即它們在該范圍內(nèi)具有皮內(nèi)隔室中的佐劑活性，同時具有等于或小于2的draize得分。
可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑包括來自動物、植物、細菌、原生動物、寄生物、病毒或其組合的抗原?？乖曰蛎庖咴栽噭┛梢允窃醋圆《镜娜我獾牟《镜碾?、蛋白質(zhì)、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素，單純皰疹病毒蛋白，例如單純皰疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。在本發(fā)明的組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑可以是致病病毒的抗原，例如，下述病毒的抗原腺病毒科(例如，哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬)，皰疹病毒科(例如，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，單純皰疹病毒5，和單純皰疹病毒6)，輕小病毒科(例如，輕小病毒屬，腸細菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎動物痘病毒亞科，副痘病毒屬，禽痘病毒屬，山羊痘病毒屬，野兔痘病毒屬，豬痘病毒屬，軟體動物痘病毒屬，和昆蟲痘病毒屬)，乳頭多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒屬和乳頭狀瘤病毒屬)，副粘病毒科(例如，副粘病毒屬，副流感病毒1，麻疹病毒屬(例如，麻疹病毒)，德國麻疹病毒屬(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒屬，人呼吸道合胞病毒)，metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如腸道病毒屬，鼻病毒屬，肝病毒屬(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒屬，和口蹄疫病毒屬(apthovirus)，呼腸孤病毒科(例如，正呼腸孤病毒屬(orthoreovirus)，環(huán)狀病毒屬，輪狀病毒屬，質(zhì)型多角體病毒屬，斐濟病毒屬，植物呼腸孤病毒屬，和水稻病毒屬(oryzavirus))，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如哺乳動物B型反轉(zhuǎn)錄病毒，哺乳動物C型反轉(zhuǎn)錄病毒，禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒，D型反轉(zhuǎn)錄病毒組，BLV-HTLV反轉(zhuǎn)錄病毒)，慢病毒屬(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒屬，黃病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒屬(例如，新培斯病毒)和風(fēng)疹病毒屬(例如，風(fēng)疹病毒))，彈狀病毒科(例如，水泡病毒屬，狂犬病病毒屬，短時熱病毒屬(ephemerovirus)，胞質(zhì)彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)，和胞核彈狀病毒屬(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒屬，淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，Ippy virus，和拉薩病毒)，和冠狀病毒科(例如，冠狀病毒屬和曲狀病毒屬(torovirus))。
可選擇地，本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑可以是癌癥或腫瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原，卵巢癌抗原(CA125)，磷酸前列腺酸酯，前列腺特異性的抗原，黑素瘤相關(guān)抗原p97，黑素瘤抗原gp75，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)，前列腺特異性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原，例如CEA，TAG-72，CO17-1A；GICA19-9，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19，人B-淋巴瘤抗原-CD20，CD33，黑素瘤特異性的抗原，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3，神經(jīng)節(jié)苷脂GM2，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3，腫瘤特異性的移植類型的細胞表面抗原(TSTA)，例如病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括DNA腫瘤病毒的T-抗原和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如結(jié)腸的CEA，膀胱腫瘤瘤胚抗原，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20，纖維肉瘤的抗原，人白血病T細胞抗原-Gp37，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生長因子受體)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)，惡性人淋巴細胞抗原-APO-1，分化抗原例如在胎紅細胞、原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在成年紅細胞、植入前的胚胎中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)，在乳腺上皮中發(fā)現(xiàn)的M18、M39，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1，在結(jié)腸直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3，在胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的Y半抗原、Ley，在A431細胞中發(fā)現(xiàn)的TL5(血型A)、EGF受體，在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的FC10.2，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10，在A431細胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的CO-43(血型Leb)、G49，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2(血型ALeb/Ley)，在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-細胞階段胚胎中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4，和來自皮膚T細胞淋巴瘤的T細胞受體衍生肽。
用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑可以是能在合適的條件下在受試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)，包括但不限于，多肽，肽，蛋白質(zhì)，糖蛋白，脂類，核酸和多糖。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以確定本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑的濃度，其取決于抗原性或免疫原性試劑的效力和性質(zhì)。在本發(fā)明的增強的輸送系統(tǒng)下，抗原性或免疫原性試劑的濃度優(yōu)選地低于當(dāng)使用可選擇的給藥途徑和可選擇的組合物時使用的常規(guī)量。
本發(fā)明還包括其它的化合物或試劑，其以前沒有與任何組織空間中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)，當(dāng)與免疫原性或抗原性試劑皮內(nèi)地共同施用時，其能增強由該免疫原性或抗原性試劑觸發(fā)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明特別地包括以前沒有與皮內(nèi)隔室中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)的化合物或試劑。
本發(fā)明包括向受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中皮內(nèi)輸送本文所述的和示例的本發(fā)明的免疫原性組合物的方法，優(yōu)選地通過直接地和選擇性地靶向皮內(nèi)隔室。使用在1999年10月14日提交的美國專利申請?zhí)?9/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的國際公開號EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它們都在這里整體引作參考)中公開的任一種皮內(nèi)裝置和方法，施用本發(fā)明的免疫原性組合物。
本發(fā)明的免疫原性組合物靶向皮內(nèi)空間的實際方法不是至關(guān)重要的，只要它能穿透受試者的皮膚達到皮內(nèi)空間內(nèi)的所需要的目標(biāo)深度，而不透過它。實際的最佳穿透深度隨受試者皮膚的厚度而變。在大多數(shù)情況下，穿透皮膚到約0.5-2mm的深度。無論具體的皮內(nèi)裝置和輸送方法如何，皮內(nèi)輸送優(yōu)選地將本發(fā)明的免疫原性組合物靶向至至少0.3mm、更優(yōu)選至少0.5mm的深度，到不超過2.0mm、更優(yōu)選不超過1.7mm的深度。在某些情況下，將免疫原性組合物輸送到剛好在角質(zhì)層下且包括表皮和上部真皮(upper dermis)的目標(biāo)深度，例如約0.025mm至約2.5mm。為了靶向皮膚內(nèi)的特異細胞，優(yōu)選的靶深度取決于被靶向的特定細胞和特定受試者的皮膚厚度。例如，為了靶向人皮膚的皮膚空間中的朗氏細胞，輸送需要至少部分地包括通常為約0.025mm至約0.2mm的人表皮組織深度。
本發(fā)明提供了治療和預(yù)防的方法，其包括向受試者，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人，施用本發(fā)明的免疫原性組合物，以治療、控制或改善與疾病或病癥有關(guān)的癥狀，尤其是傳染性的疾病或癌癥。受試者優(yōu)選地是哺乳動物，例如非靈長類動物，例如奶牛、豬、馬、貓、狗、大鼠、小鼠，和靈長類動物，例如，猴例如獼猴(Cynomolgous monkey)和人。在一個優(yōu)選的實施方案中，受試者是人。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物是疫苗組合物。
本發(fā)明包括免疫和/或刺激受試者中的免疫反應(yīng)的方法，包括給受試者，優(yōu)選人，皮內(nèi)輸送單劑量的本發(fā)明的組合物。在有些實施方案中，本發(fā)明包括一次或多次加強免疫。本發(fā)明的免疫原性組合物能特別有效地刺激和/或上調(diào)抗體反應(yīng)至大于在常規(guī)的免疫原性組合物(例如疫苗)和給藥方案中看到的水平。本發(fā)明的免疫原性組合物能特別有利地用于形成針對抗原性或免疫原性試劑(需要對其產(chǎn)生免疫反應(yīng))的迅速且高水平的免疫性。本發(fā)明的免疫原性組合物利用低劑量的抗原性或免疫原性試劑，可以達到保護水平的全身免疫性。在有些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物利用劑量是為了得到有效的免疫反應(yīng)而常規(guī)使用的抗原性或免疫原性試劑劑量的60％、優(yōu)選50％、更優(yōu)選40％的抗原性或免疫原性試劑，產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含劑量低于使用常規(guī)的輸送模式，例如肌肉內(nèi)和皮下，和常規(guī)的組合物，即在沒有本發(fā)明的賦形劑的情況下，在本領(lǐng)域中使用的常規(guī)劑量(例如，Physician′s Desk Reference中推薦的劑量)的抗原性或免疫原性試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物在單次皮內(nèi)給藥后，會產(chǎn)生治療上或預(yù)防上有效的免疫反應(yīng)。對于每年的免疫，可以皮內(nèi)地施用本發(fā)明的免疫原性組合物。
與目前可以得到的制劑相比，本發(fā)明的免疫原性組合物具有增強的治療功效、安全性和毒性特性。本發(fā)明的免疫原性組合物賦予的益處和優(yōu)點部分地是由于特殊的制劑和它們在靶向皮膚的皮內(nèi)隔室中的效用。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物可以提供更大的和更持久的保護，特別是對于不能較好地對免疫作出響應(yīng)的高危群體。
本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定本發(fā)明的免疫原性組合物的功效的方法。確定本發(fā)明的免疫原性組合物的功效的測定法，可以是基于體外的測定法或基于體內(nèi)的測定法，包括基于動物的測定法。在有些實施方案中，本發(fā)明包括檢測和/或定量從已經(jīng)被施用了本發(fā)明的免疫原性組合物的受試者得到的樣品(例如，血清)中的針對本發(fā)明的組合物的抗原性或免疫原性試劑的體液免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的免疫原性組合物的體液免疫反應(yīng)與從已經(jīng)被施用了對照制劑(例如，僅僅包含抗原性或免疫原性試劑的制劑)的相同受試者得到的對照樣品進行比較。
在其它的實施方案中，本發(fā)明包括通過測量細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，來確定本發(fā)明的組合物的功效的方法。測量細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中。在有些實施方案中，可以測量T細胞免疫反應(yīng)，以定量受試者中的免疫反應(yīng)，例如通過使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的普通方法，包括但不限于來自組織培養(yǎng)物上清液的ELISA，離體的或體外培養(yǎng)一段時間后的細胞的基于流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)細胞因子染色，和基于細胞因子小珠陣列流式細胞術(shù)(cytokine bead array flow cytometry)的測定法，來測量細胞因子生產(chǎn)。在其它實施方案中，本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的普通方法，包括但不限于基于鉻的釋放測定法，使用已知的CTL表位的基于流式細胞術(shù)的四聚體或二聚體染色測定法，來測量T細胞特異性的反應(yīng)。
本發(fā)明還包括鑒定能增強對免疫原性或抗原性試劑的免疫反應(yīng)的化合物的方法。在一個實施方案中，鑒定能增強對抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)的化合物的方法包括將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，測量免疫反應(yīng)的水平，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物，且其中免疫反應(yīng)針對該抗原性或免疫原性試劑。本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文公開的方法，通過確定體液的和/或細胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，來測量免疫反應(yīng)的水平。一旦確定了免疫反應(yīng)的水平，將其與標(biāo)準(zhǔn)水平相比較，其中測量的水平升高表明該化合物是佐劑。
在一個具體的實施方案中，鑒別能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法包括(a)將免疫原性組合物輸送進第一個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物；(b)測量從第一個受試者的血清得到的樣品中的抗體反應(yīng)；(c)將免疫原性組合物輸送進第二個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含沒有該化合物的免疫原性或抗原性試劑，且其中第一個和第二個受試者是相同的物種；(d)測量從第二個受試者的血清得到的樣品中的抗體反應(yīng)；(e)確定從第一個受試者得到的反應(yīng)是否大于從第二個受試者得到的反應(yīng)。如果從第一個受試者得到的樣品中的反應(yīng)大于第二個受試者，則將該化合物表征為可以用于本發(fā)明的組合物中的賦形劑，(f)證明候選制劑會穿過顯微針，和(g)證實能提供佐劑性質(zhì)的試劑的濃度是能產(chǎn)生可接受的draize分數(shù)的濃度。當(dāng)與抗原性或免疫原性試劑共同施用進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，通過本發(fā)明的篩選方法鑒定出的化合物可以用于引起增強的針對該抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。具體地，這些化合物可以用于疫苗組合物中。
本發(fā)明還包括試劑盒，其包含本文所述的本發(fā)明的皮內(nèi)施用裝置和免疫原性組合物。在有些實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的免疫原性組合物的藥物包或試劑盒。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含一個或多個裝有一種或多種本發(fā)明的免疫原性組合物組分(例如抗原性或免疫原性試劑、賦形劑)的容器。在另一個具體的實施方案中，試劑盒包含2個容器，一個含有抗原性或免疫原性試劑，另一個含有賦形劑。這樣的容器可以伴有由規(guī)范藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定的形式的公告，該公告反映了由生產(chǎn)、使用或銷售的管理機構(gòu)對于人類施用所作出的批準(zhǔn)。
5.1免疫原性組合物本發(fā)明的免疫原性組合物設(shè)計用于靶向輸送抗原性或免疫原性試劑(優(yōu)選，選擇性地和特異地)到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中。在有些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物直接靶向皮膚的皮內(nèi)隔室。本發(fā)明的免疫原性組合物包含抗原性或免疫原性試劑和至少一種賦形劑，后者能增強抗原性或免疫原性試劑向免疫細胞(例如皮內(nèi)隔室的免疫細胞)的呈遞和/或可用性，產(chǎn)生增強的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的免疫原性組合物可以增強細胞介導(dǎo)的和/或體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)?？梢杂杀景l(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑調(diào)控的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)包括，例如，Th1或Th2 CD4+T-輔助細胞介導(dǎo)的或CD8+細胞毒性T-淋巴細胞介導(dǎo)的反應(yīng)。
可以用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的賦形劑包括但不限于，穩(wěn)定劑，防腐劑，溶劑，表面活性劑或去污劑，懸浮劑，張力劑，載體和生長培養(yǎng)基的成分?？梢栽诒景l(fā)明的組合物和方法中使用的賦形劑的實例，在本文中公開在5.1.1部分，且示例在實施例6.1-6.3中。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度取決于使用的具體賦形劑(見5.1.1部分和實施例6.1-6.3)。在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的濃度可以是0.000002％-58％(w/v)和0.05％-10.0％(v/v)。在其它實施方案中，使用的賦形劑的濃度可以是至少10％(w/v)，至少15％(w/v)，至少20％(w/v)，至少25％(w/v)，或至少30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度大于約30％(w/v)。在其它實施方案中，賦形劑的濃度是至少0.1％(w/v)，至少0.5％(w/v)，至少1％(w/v)，至少5％(w/v)，或至少10％(w/v)。賦形劑可以用于制備和生產(chǎn)免疫原性組合物。在這樣的情況下，可以在最后的免疫原性組合物中發(fā)現(xiàn)從組合物的生產(chǎn)或制備留下的賦形劑的殘留濃度。但是，這樣的殘留濃度太低，不會產(chǎn)生用本發(fā)明的免疫原性組合物觀察到的佐劑活性。
在有些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種或多種添加劑，包括但不限于，傳統(tǒng)的佐劑，傳統(tǒng)的賦形劑，穩(wěn)定劑，滲透促進劑，和粘膜或生物粘附劑。傳統(tǒng)的賦形劑是添加到組合物中作為稀釋劑或載體的或多或少具有惰性的物質(zhì)。或者，可以使用傳統(tǒng)的賦形劑，從而為組合物提供形狀或稠度。這樣的傳統(tǒng)賦形劑的實例是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中，見，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.，現(xiàn)行版；它們都在本文中整體引作參考。傳統(tǒng)的佐劑是添加到組合物中增強組合物中的活性成分的抗原性的物質(zhì)，例如，礦物質(zhì)懸浮液，其上面吸收著抗原性或免疫原性試劑，或油包水乳液，其中抗原性試劑乳化在礦物油中(例如，弗氏不完全佐劑)，有時包含殺死的分枝桿菌，以進一步增強抗原性試劑的抗原性。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物還可以包含一種或多種其它的藥學(xué)上可接受的載體，包括任何合適的稀釋劑或賦形劑。優(yōu)選地，藥學(xué)上可接受的載體自身不能誘導(dǎo)生理反應(yīng)，例如免疫反應(yīng)。最優(yōu)選地，藥學(xué)上可接受的載體不能產(chǎn)生任何負面的或不希望的副作用，和/或不能產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)亩拘浴Ｓ糜诒景l(fā)明的免疫原性組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于，鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、無菌的等滲含水緩沖液和其組合。Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.，現(xiàn)行版；它們都在本文中整體引作參考)提供了藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的其它實例。
在特殊的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物也可以含有濕潤劑，乳化劑，或pH緩沖劑。本發(fā)明的免疫原性組合物可以是固體，例如適用于重配的凍干的粉末，液體溶液，懸浮液，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放制劑，或粉末。
本發(fā)明的免疫原性組合物可以是適于皮內(nèi)輸送的任何形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物是穩(wěn)定的制劑，其經(jīng)歷最低的至沒有可檢測水平的抗原性或免疫原性試劑的降解和/或聚集，且可以貯藏延長的一段時間，而不損失生物活性，例如，抗原性試劑的抗原性或免疫原性。
5.1.1賦形劑本發(fā)明部分地基于發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)，即皮內(nèi)輸送與一種或多種賦形劑相組合的抗原性或免疫原性試劑，會導(dǎo)致增強的對該抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。如本文使用的，除非另有說明，“賦形劑”是指藥物組合物中的成分或添加劑，其自身不具有組合物所要達到的藥理學(xué)或生物學(xué)活性，且在本發(fā)明之前，不知其在根據(jù)本發(fā)明施用到皮膚的皮內(nèi)隔室時，能直接增強或改變這樣的藥理學(xué)或生物學(xué)活性。在本發(fā)明的方法中使用的賦形劑是預(yù)選的賦形劑。如本文使用的，″預(yù)選的″賦形劑包括傳統(tǒng)的、非傳統(tǒng)的賦形劑，和當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法輸送給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，具有佐劑活性的所有其它賦形劑。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，這些賦形劑當(dāng)與抗原性或免疫原性試劑共同施用給皮內(nèi)隔室時，會起佐劑的作用，即與接受沒有賦形劑的組合物的受試者相比，增強接受這樣的組合物的受試者中的對抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的免疫原性組合物和方法中使用的賦形劑以前沒有與佐劑活性相關(guān)聯(lián)。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的免疫原性組合物和方法中使用的賦形劑以前沒有與皮內(nèi)隔室中的佐劑活性相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明的免疫原性組合物尤其會產(chǎn)生這樣的優(yōu)點，即與傳統(tǒng)的輸送模式(包括IM)相比，更高的平均血清抗體反應(yīng)、更高的抗體滴度、更高的血清轉(zhuǎn)化率和血清保護率。這樣的參數(shù)的測量，在本領(lǐng)域的技術(shù)水平內(nèi)，且本文示例了這樣的方法。
盡管不希望受特定作用機理的約束，當(dāng)以根據(jù)本發(fā)明的方法的濃度和輸送途徑施用本發(fā)明的賦形劑時，它們會表現(xiàn)出非特異性的佐劑活性，即不通過特定的細胞受體，但是可能通過促進機械損傷，溫和刺激，或皮膚伸展?；蛘?，盡管不希望受特定作用機理的約束，賦形劑一旦根據(jù)本發(fā)明以一定的濃度被輸送至受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，它們可以起皮膚刺激劑的作用，導(dǎo)致將抗原呈遞細胞召集到注射位點的皮內(nèi)隔室中，從而起佐劑的作用，即增強對免疫原性組合物的免疫反應(yīng)。
如本文使用的，當(dāng)賦形劑起刺激劑的作用時，它會通過在接觸位點的化學(xué)作用，對皮膚組織造成可逆的無癥狀的炎性效應(yīng)，但不是腐蝕性的。在注射位點的炎性效應(yīng)包括注射位點的血液流入，且可以具有腫脹、發(fā)紅、熱和/或疼痛的特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用例如Codeof Federal Regulation(標(biāo)題16，第2卷；6CFR 1500.41，其在本文中整體引作參考)公開的方法，可以確定賦形劑是否是皮膚刺激劑。根據(jù)6CFR 1500.41，如果當(dāng)通過16CFR 1500.41的方法暴露4小時，或通過其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，在白化兔的完整皮膚上進行測試時，會產(chǎn)生5或更大的實驗得分，則化學(xué)藥品是皮膚刺激劑。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中使用的賦形劑具有5或更小的得分，更優(yōu)選4或更小的得分，和最優(yōu)選3或更小的得分。當(dāng)將本發(fā)明的賦形劑表征為皮膚刺激劑時，可以在免疫原性組合物中使用不是皮膚刺激劑的一種或多種其它的賦形劑，以減少皮膚刺激。在一個具體的實施方案中，為了確定一旦將免疫原性組合物(例如，疫苗)輸送到受試者(例如，動物)皮膚的皮內(nèi)隔室時，本發(fā)明的免疫原性組合物是否會產(chǎn)生皮膚刺激，在免疫1小時內(nèi)、24小時和21天時，以視覺檢查注射位點。記錄下除了在數(shù)小時內(nèi)消退的最初的“水泡”以外的所有觀察。在一個具體的實施方案中，當(dāng)將DNA免疫原劑(例如，pDNA-HA)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，在免疫(初次或加強)的1小時內(nèi)、此后24小時、即將加強前的第21天、加強后24小時和加強后21天(實際上是方案的第42天)，檢查注射位點。
根據(jù)它們的功能，通常將賦形劑分成亞類。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑可以具有一種或多種功能。幾個亞類的賦形劑是本領(lǐng)域已知的，且包含在本發(fā)明中。見，例如，Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery System，第6版，第110-133頁，Williams & Wilkins(1995)，其在本文中整體引作參考。例如，可以將賦形劑歸類成穩(wěn)定劑，防腐劑，溶劑，表面活性劑或去污劑，懸浮劑，張力劑或載體。在疫苗的情況下，經(jīng)常將用于促進或維持免疫原的生長的生長培養(yǎng)基成分用作賦形劑。一些賦形劑具有不止一個功能，且可以用于多個目的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能明白，這些亞類并非所有可得到的賦形劑的窮盡列表，因而也可以根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和方法使用其它類型的賦形劑。Handbookof Pharmaceutical Excipients，2003(第4版，AmericanPharmaceutical Association，London)(其整體引作參考)中提供了賦形劑的其它類別和實例。
在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是穩(wěn)定劑。如本文使用的，穩(wěn)定劑是能提高藥物組合物的穩(wěn)定性的化學(xué)試劑。如本文使用的，穩(wěn)定的組合物指能經(jīng)歷最低的至沒有可檢測水平的抗原性或免疫原性試劑的降解和/或聚集的組合物，且其可以貯藏延長的一段時間，而不損失生物活性，例如，抗原性試劑的抗原性或免疫原性。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物能在2℃-8℃的溫度范圍，優(yōu)選4℃表現(xiàn)出穩(wěn)定性至少2年，如通過高效尺寸排阻層析(HPSEC)所評定的。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物在貯藏經(jīng)過上述的確定的時間后，具有低的至不可檢測的水平的抗原性或免疫原性試劑的聚集和/或降解。優(yōu)選地，如通過HPSEC測量的，在貯藏經(jīng)過上述的確定的時間后，不超過5％、不超過4％、不超過3％、不超過2％、不超過1％、和最優(yōu)選地不超過0.5％的抗原性或免疫原性分子形成聚集體或降解。在最優(yōu)選的實施方案中，如通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法所評定的，在上述條件下的長期貯藏過程中，本發(fā)明的免疫原性組合物會表現(xiàn)出幾乎沒有損失抗原性或免疫原性試劑的生物活性。在貯藏經(jīng)過上述時間后，本發(fā)明的免疫原性組合物能保留超過80％，超過85％，超過90％，超過95％，超過98％，超過99％，或超過99.5％的貯藏之前的初始生物活性。
根據(jù)賦形劑穩(wěn)定組合物的機理，可以將穩(wěn)定劑進一步分類成酸化劑或堿化劑、吸附劑、空氣排代劑、抗氧化劑、緩沖劑、螯合劑或潤濕劑，它們都包含在本發(fā)明中。如本文使用的酸化劑能通過為組合物中的活性成分(即否則在堿性條件下不穩(wěn)定的抗原性或免疫原性試劑)提供酸性介質(zhì)，來穩(wěn)定藥物組合物。酸化劑的實例包括但不限于，醋酸，檸檬酸，富馬酸，鹽酸，硝酸和醋酸鈉。堿化劑能通過為組合物中的活性成分(即在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定的抗原性或免疫原性試劑)提供堿性介質(zhì)，來穩(wěn)定組合物。堿化劑的實例包括但不限于，氨溶液，碳酸銨，單-、二-或三-乙醇胺，氫氧化鉀，硼酸鈉，碳酸鈉，氫氧化鈉和三乙醇胺。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是吸附劑。如本文所使用的吸附劑是能通過物理的和/或化學(xué)的手段將其它分子粘附或吸附到它的表面上的試劑。吸附劑的實例包括但不限于，纖維素、木炭和明膠。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是明膠。優(yōu)選地，以約0.01-約2％(重量/體積組合物)的濃度施用明膠，且更優(yōu)選地，以約0.03-約0.6％(重量/體積組合物)。在另一個具體的實施方案中，以約0.0-0.225％(重量/體積)的濃度施用明膠。
在有些實施方案中，本發(fā)明包括是抗氧化劑的賦形劑。盡管不希望受具體的作用機理的約束，抗氧化劑能通過抑制氧化，從而防止組合物被氧化過程破壞，來穩(wěn)定藥物組合物。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗氧化劑的實例包括但不限于，抗壞血酸，棕櫚酸抗壞血酸酯，丁基化羥基茴香醚，丁基化羥基甲苯，次磷酸，一硫代甘油，沒食子酸丙酯，抗壞血酸鈉，亞硫酸氫鈉，甲醛合次硫酸氫鈉，偏亞硫酸氫鈉和亞硫酸鈉。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是抗氧化劑。在一個更具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是亞硫酸氫鈉。優(yōu)選地，以約0.1-約8.0％(重量/體積組合物)和更優(yōu)選約0.3-約3.0％(重量/體積組合物)的濃度，使用亞硫酸氫鈉。
本發(fā)明還包括是緩沖劑的賦形劑。盡管不希望受具體的作用機理的約束，緩沖劑能通過提供對pH改變的抗性，例如，依靠稀釋或添加酸或堿，來穩(wěn)定藥物組合物?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的緩沖劑的實例包括但不限于，甘氨酸，偏磷酸鉀，磷酸鉀，一堿價醋酸鈉，和無水或二水合檸檬酸鈉。
本發(fā)明還包括用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的螯合劑。盡管不希望受特定作用機理的約束，螯合劑能通過與一種或多種金屬(例如重金屬)形成穩(wěn)定的水溶性的復(fù)合物，來穩(wěn)定藥物組合物。通常，重金屬對于蛋白酶的酶促活性是至關(guān)重要的，因而螯合劑會通過螯合它們的酶促活性所必需的金屬而限制了蛋白酶的活性?？梢杂糜诒景l(fā)明的組合物中的螯合劑的實例包括但不限于，乙二胺四乙酸二鈉和乙二胺四乙酸。
在有些實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是潤濕劑。潤濕劑是能通過保持水分來預(yù)防制品變干的試劑?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的潤濕劑的實例包括但不限于，甘油、丙二醇和山梨醇。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是潤濕劑。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是山梨醇。優(yōu)選地，以約1-約100％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約2.5-約70％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約5-約20％(重量/體積組合物)的濃度，施用山梨醇。
本發(fā)明還包括是防腐劑的賦形劑。盡管不希望受具體的作用機理的約束，防腐劑是能阻止藥物組合物中的外來生物的生長的物質(zhì)。防腐劑包括例如，抗真菌劑，即能阻止真菌的生長的試劑，和抗微生物劑，即能阻止微生物(包括病毒)的生長的試劑?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物和方法中使用的抗真菌劑的實例包括但不限于，兩性霉素B，苯甲酸，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯，苯甲酸鈉和丙酸鈉。在對羥基苯甲酸酯的情況下，眾所周知當(dāng)組合使用它們時，通常會提高有效性。可以在本發(fā)明的免疫原性組合物和方法中使用的抗微生物劑的實例包括但不限于，氨普立糖，苯扎氯銨，苯索氯銨，芐醇，β丙醇酸內(nèi)酯，鯨蠟基氯化吡啶，氯代丁醇，金霉素，EDTA，甲醛，慶大霉素，卡那霉素，新霉素，酚，苯氧基乙醇，苯乙醇，硝酸苯汞，多粘菌素B，鏈霉素，硫柳汞，磷酸三正丁酯。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是抗真菌劑。在一個更具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是兩性霉素B。優(yōu)選地，以約0.5-約600ng/mL、更優(yōu)選約30-約100ng/mL的濃度，使用兩性霉素B。在其它實施方案中，以約0.1ng/200uL-1200ng/200uL的濃度，使用兩性霉素B。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑可以是兼性的或多烯的(polyenic)抗菌素?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的兼性抗生素的實例包括但不限于兩性霉素B和制霉菌素。
在另一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的組合物中使用的賦形劑是抗微生物劑。在一個更具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是氨普立糖或磷酸三正丁酯。優(yōu)選地，以0.1-約0.9％w/v的濃度，使用氨普立糖。優(yōu)選地，以0.04-約0.325％w/v的濃度，使用磷酸三正丁酯。
本發(fā)明包括是溶劑的賦形劑，即用于將另一種藥物物質(zhì)溶解到本發(fā)明的組合物制品中的試劑?？梢允褂萌軇﹣砣芙饪乖曰蛎庖咴栽噭?。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的溶劑可以是水性的或非水性的。在一些實施方案中，在本發(fā)明的組合物中使用共溶劑，例如，水和醇。為了制備可注射的組合物，優(yōu)選地使用無菌溶劑。可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的溶劑的實例包括但不限于，醇，尤其是乙醇，玉米油，棉籽油，甘油，異丙醇，礦物油，油酸，花生油，純化水，注射用水，和無菌的注射用水。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是溶劑。在一個更具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是乙醇。在其它具體的實施方案中，以約0.01-約2.0％(體積/體積組合物)、優(yōu)選約0.05-約0.45％(體積/體積組合物)的濃度，使用乙醇。在一些具體的實施方案中，在較深的皮內(nèi)深度，例如在大于1mm的深度，乙醇濃度可以是2.0％v/v。
本發(fā)明還包括作為用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的賦形劑的表面活性劑，即表面活性的試劑。盡管不希望受具體的作用機理的約束，表面活性劑能聚集到表面或界面上，并減小表面或界面張力。表面活性劑可以用作濕潤劑、去污劑或乳化劑。
可以在本發(fā)明的組合物中使用的表面活性劑的實例包括但不限于，苯扎氯銨，硬脂酸鎂，壬苯醇醚10，oxtoxynol 9(Triton N-101)，泊洛沙姆例如泊洛沙姆124、188(Lutrol F 68)、237、388或407(Lutrol F 127)，聚山梨酯20(吐溫20)，聚山梨酯80(吐溫80)，月桂基硫酸鈉，失水山梨糖醇單棕櫚酸酯和Triton X-100。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是表面活性劑。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是Lutrol F 127，Triton N-101，Triton X-100，吐溫20或吐溫80。
本發(fā)明包括非離子型表面活性劑賦形劑，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法輸送到ID隔室時，其會起佐劑的作用。盡管不希望受特定作用機理的約束，能在皮內(nèi)隔室中產(chǎn)生佐劑性質(zhì)的這樣的去污劑的濃度范圍是狹窄的，這與其中這樣的去污劑已經(jīng)用于一般的疫苗生產(chǎn)目的的文獻所報道的寬范圍相反。優(yōu)選的工作濃度隨針深度(1.00mm vs.1.5mm vs.2.0mm vs.3.00mm)而變。本發(fā)明包括使用非離子型表面活性劑賦形劑，其在使用范圍內(nèi)能表現(xiàn)出佐劑性質(zhì)，同時避免或最少化組織刺激，對組織沒有毒性或損傷。在最優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)將這樣的賦形劑輸送到ID隔室時，存在增強的免疫反應(yīng)，如例如通過增強的血清轉(zhuǎn)化、增強的平均抗體滴度或增強的中間抗體滴度所測量的(使用熟練的技術(shù)人員已知的和本文示例的方法)。商業(yè)上，經(jīng)常將非離子型表面活性劑作為濃縮的液體儲液提供。Sigma-Aldrich Company products；Cat.T-6878，Cat.303135，Cat.P-8074，Cat.P7949或類似濃度和純度的產(chǎn)品可以用于實現(xiàn)本發(fā)明。
在一個具體的優(yōu)選的實施方案中，使用的Triton N-101的濃度是約0.05-約5％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.1-約1.5％(重量/體積組合物)。本發(fā)明包括在較深的皮內(nèi)深度(例如，在大于2.5mm的深度)使用濃度高達5％的Triton N-101。
在一個具體的優(yōu)選的實施方案中，使用的Triton X-100的濃度是約0.00003-約5％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.0001-約0.0009％(重量/體積組合物)。本發(fā)明包括在較深的皮內(nèi)深度(例如，在大于2.5mm的深度)使用濃度高達5％的Triton X-100。
在一個具體的優(yōu)選的實施方案中，使用的吐溫80的濃度是約0.03-約3％(重量/體積組合物)(w/v)，或約0.03-約5％w/v，0.01-約10％w/v，更優(yōu)選約0.1-約0.9％(重量/體積組合物)。在另一個優(yōu)選的具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，以約1.1-2.0％v/v的濃度使用吐溫80。在另一個優(yōu)選的具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，以約1.1-5.0％v/v的濃度使用吐溫80。更具體地，在1.0-1.5mm深度以1.1-2.5％V/V，在1.6-2mm深度以1.1-5.0％V/V，在2.1-2.5mm深度以1.1-7.5％V/V，在2.6-3mm深度以1.1-10.0％V/V，使用吐溫。
在一個具體的優(yōu)選的實施方案中，以約0.003-0.03％w/v、約0.003-0.3％w/v和0.003-3.0％w/v的濃度，使用吐溫20。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達為V/V，以約0.003-0.03％v/v、約0.003-0.3％v/v和0.003-3.0％v/v的濃度，使用吐溫20。
在另一個具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，以約2.0-10％w/v的濃度使用山梨醇。在另一個優(yōu)選的具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，以約2-20％w/v的濃度使用山梨醇。通常，將表面活性劑用于制備和生產(chǎn)免疫原性組合物，尤其是疫苗。在這樣的情況下，可以在最后的免疫原性組合物中發(fā)現(xiàn)從組合物的制備和生產(chǎn)留下的表面活性劑的殘留濃度。這樣的殘留濃度太低，不會產(chǎn)生用本發(fā)明的免疫原性組合物觀察到的佐劑活性。這樣的表面活性劑的實例是辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，TritonTM系列)，聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(例如，吐溫TM系列)，和聚氧乙烯酯或醚；辛基苯氧基聚氧乙醇和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯包括叔辛基苯氧基聚氧乙醇；和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯包括聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯；Triton X-45，TritonX-102，Triton X-114，Triton X-165，Triton X-205，Triton X-305，Triton N-57，Triton N-101，Triton N-128，Breij 35，Laureth-9，Steareth-9，吐溫80TM(關(guān)于表面活性劑的列表，見，例如，Surfactant Systems，Attwood和Florence編，1983，Chapman andHall，其在本文中整體引作參考)。
本發(fā)明包括用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的賦形劑，其是懸浮劑。盡管不希望受特定作用機理的約束，懸浮劑能通過例如減小分散在它們不溶的載體中的顆粒的沉降速度，來增加組合物的粘度?？梢栽诒景l(fā)明的組合物中使用的懸浮劑的實例包括但不限于，瓊脂，膨潤土，卡波姆(例如，卡波普)，羧甲基纖維素鈉，明膠，羥乙基纖維素羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，高嶺土，甲基纖維素，黃芪膠和veegum。
在一個實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是懸浮劑。在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明的賦形劑是明膠或甲基纖維素。優(yōu)選地，使用的甲基纖維素的濃度是約0.02-約0.5％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.06-約0.18％(重量/體積組合物)。
本發(fā)明包括張力劑，其作為用于本發(fā)明的組合物中的賦形劑。在本發(fā)明的免疫原性組合物中特別需要張力劑，因為它們能為溶液提供類似于生理流體的滲透特征，因而對于本發(fā)明的可注射的組合物是最佳的?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的張力劑的實例包括但不限于，右旋糖，葡萄糖和氯化鈉。
本發(fā)明還包括是載體的賦形劑。如本文使用的，載體是藥物組合物中的物質(zhì)的承載物質(zhì)。載體經(jīng)常用于配制各種經(jīng)口和腸胃外施用的組合物。用于本發(fā)明的方法和免疫原性組合物中的載體可以是水性的或油性的載體?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物中使用的載體的實例包括但不限于，玉米油，礦物油，花生油，芝麻油，抑菌的氯化鈉注射液和抑菌的水。
生長培養(yǎng)基成分可以用作本發(fā)明的免疫原性組合物中的賦形劑。當(dāng)組合物是疫苗時，生長培養(yǎng)基成分是特別有用的?？梢栽诒景l(fā)明的免疫原性組合物和方法中使用的生長培養(yǎng)基成分的實例包括但不限于，氨基酸，細菌用蛋白胨，牛白蛋白，牛血清，卵蛋白，人血清白蛋白，小鼠血清蛋白，MRC-5細胞蛋白，卵白蛋白，維生素和酵母蛋白。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是生長培養(yǎng)基成分。在一個更具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中的賦形劑是細菌用蛋白胨。優(yōu)選地，以約0.03-約3％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.1-約1.5％(重量/體積組合物)的濃度，使用細菌用蛋白胨。
本發(fā)明包括尚不知道具有佐劑活性(尤其是在皮內(nèi)隔室中)的其它的化合物或試劑。這些化合物的實例包括但不限于，血清蛋白(例如脫鐵運鐵蛋白，胎球蛋白)，抑蛋白酶肽，羥基乙酸(一種皮膚片狀剝落物)，甘露糖和尿素。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法使用并輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室時，任何補充的蛋白質(zhì)可以具有佐劑活性。補充的蛋白質(zhì)特別可用作DNA免疫原的佐劑。根據(jù)本發(fā)明，預(yù)期與尿素有關(guān)的化合物(例如尿酸)也能適用。
在一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羥基乙酸，甘露糖或尿素。優(yōu)選地，使用的尿素的濃度是約0.02-約40％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.2-約20％(重量/體積組合物)。優(yōu)選地，使用的脫鐵運鐵蛋白的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物、更優(yōu)選約60μg/mL-約600μg/mL組合物。優(yōu)選地，使用的抑蛋白酶肽的濃度是約1μg/mL-約180μg/mL組合物、更優(yōu)選約5μg/mL-約60μg/mL組合物。優(yōu)選地，使用的胎球蛋白的濃度是約0.05μg/mL-約7.5μg/mL組合物、更優(yōu)選約0.2μg/mL-約2.4μg/mL組合物。優(yōu)選地，使用的甘露糖的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物、更優(yōu)選約60μg/mL-約600ug/mL組合物。優(yōu)選地，使用的羥基乙酸的濃度是約0.05-約3.0％(重量/體積組合物)、更優(yōu)選約0.1-約1.0％(重量/體積組合物)。
在另一個具體的實施方案中，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑是膽汁酸或其衍生物，包括但不限于脫氧膽酸鹽(DOC)，膽酸，鵝脫氧膽酸，石膽酸，豬脫氧膽酸和熊脫氧膽酸。在另一個具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，使用的脫氧膽酸鹽的濃度是約0.07-0.15％w/v，或0.01-0.3％w/v。在另一個優(yōu)選的具體的實施方案中，當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，使用的脫氧膽酸鹽的濃度是約0.07-0.15％w/v，或0.01-0.6％w/v。更具體地，1mm-1.5mm深度時DOC的優(yōu)選范圍是0.07-0.15％w/v，1.6mm-2.0mm深度時DOC的優(yōu)選范圍是0.07-0.3％w/v，2.1mm-2.5mm深度時DOC的優(yōu)選范圍是0.07-0.45％w/v，2.6mm-3.0mm深度時DOC的優(yōu)選范圍是0.07-0.6％w/v。
本發(fā)明包括制劑，其包含與需要的工作特性相匹配的任意的賦形劑，如本文定義的和圖35示例的，具有大于或等于0.125的斜率。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑可以以液體或固體形式存在。而且，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能容易地明白，可以單獨地或與其它賦形劑組合地使用這些賦形劑。具體地，可以組合使用2種或更多種賦形劑，以達到額外的或協(xié)同的效應(yīng)。賦形劑在本發(fā)明的免疫原性組合物中的濃度不包括在根據(jù)本發(fā)明的方法制備免疫原性組合物之前，可能由于組合物的制備或生產(chǎn)而存在的賦形劑的殘留濃度。
5.1.2免疫原性或抗原性試劑可以在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑包括來自動物、植物、細菌、原生動物、寄生物、病毒或其組合的抗原。用于本發(fā)明的免疫原性組合物的抗原性或免疫原性試劑可以是能在合適的條件下在受試者中產(chǎn)生免疫反應(yīng)的任意物質(zhì)，包括但不限于，多肽，肽，蛋白質(zhì)，糖蛋白，脂類，核酸和多糖。
本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含一種或多種抗原性或免疫原性試劑。在本發(fā)明的組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑的量可以隨抗原性或免疫原性試劑的化學(xué)性質(zhì)和效力而改變。通常，本發(fā)明的組合物中的抗原性或免疫原性試劑的起始濃度是使用常規(guī)的給藥方式(例如，肌肉內(nèi)注射)常規(guī)地用于引起需要的免疫反應(yīng)的量。然后，通過例如使用稀釋劑進行稀釋，來調(diào)節(jié)本發(fā)明的組合物中的抗原性或免疫原性試劑的濃度，從而實現(xiàn)有效的保護性的免疫反應(yīng)，如使用本領(lǐng)域已知的和本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法所評定的。
抗原性或免疫原性試劑可以是源自病毒的任意的病毒的肽、蛋白質(zhì)、多肽或其片段，包括但不限于，RSV-病毒蛋白，例如，RSV F糖蛋白、RSV G糖蛋白，流感病毒蛋白，例如，流感病毒神經(jīng)氨酸酶、流感病毒血凝素，單純皰疹病毒蛋白，例如，單純皰疹病毒糖蛋白，包括例如gB、gC、gD和gE。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑可以是致病病毒的抗原，作為實例包括但不限于腺病毒科(例如，哺乳動物腺病毒屬和禽腺病毒屬)，皰疹病毒科(例如，單純皰疹病毒1，單純皰疹病毒2，單純皰疹病毒5，和單純皰疹病毒6)，輕小病毒科(例如，輕小病毒屬，腸細菌phase MS2，allolevirus)，痘病毒科(例如，脊椎動物痘病毒亞科，副痘病毒屬，禽痘病毒屬，山羊痘病毒屬，野兔痘病毒屬，豬痘病毒屬，軟體動物痘病毒屬，和昆蟲痘病毒屬)，乳頭多瘤空泡病毒科(例如多瘤病毒屬和乳頭狀瘤病毒屬)，副粘病毒科(例如，副粘病毒屬，副流感病毒1，麻疹病毒屬(例如，麻疹病毒)，德國麻疹病毒屬(rubulavirus)(例如，腮腺炎病毒)，pneumonovirinae(例如肺病毒屬，人呼吸道合胞病毒)，和metapneumovirus(例如，禽肺病毒和人metapneumovirus)，小RNA病毒科(例如腸道病毒屬，鼻病毒屬，肝病毒屬(例如人甲型肝炎病毒)，心病毒屬，和口蹄疫病毒屬(apthovirus)，呼腸孤病毒科(例如，正呼腸孤病毒屬(orthoreovirus)，環(huán)狀病毒屬，輪狀病毒屬，質(zhì)型多角體病毒屬，斐濟病毒屬，植物呼腸孤病毒屬，和水稻病毒屬(oryzavirus))，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如哺乳動物B型反轉(zhuǎn)錄病毒，哺乳動物C型反轉(zhuǎn)錄病毒，禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒，D型反轉(zhuǎn)錄病毒組，BLV-HTLV反轉(zhuǎn)錄病毒)，慢病毒屬(例如人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2)，泡沫病毒屬，黃病毒科(例如，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，披膜病毒科(例如，甲病毒屬(例如，新培斯病毒)和風(fēng)疹病毒屬(例如，風(fēng)疹病毒))，彈狀病毒科(例如，水泡病毒屬，狂犬病病毒屬，短時熱病毒屬(ephemerovirus)，胞質(zhì)彈狀病毒屬(cytorhabdovirus)，和胞核彈狀病毒屬(necleorhabdovirus))，沙粒病毒科(例如，沙粒病毒屬，淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒，Ippyvirus，和拉薩病毒)，和冠狀病毒科(例如，冠狀病毒屬和曲狀病毒屬(torovirus))。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑可以是傳染病試劑，包括但不限于，流感病毒血凝素(Genbank登記號JO2132；Air，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 787639-7643；Newton等，1983，Virology 128495-501)，人呼吸道合胞病毒G糖蛋白(Genbank登記號Z33429；Garcia等1994，J.Virol.；Collins等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817683)，登革熱病毒的核心蛋白、基質(zhì)蛋白或任何其它蛋白(Genbank登記號M19197；Hahn等1988，Virology 162167-180)，麻疹病毒血凝素(Genbank登記號M81899；Rota等，1992，Virology 188135-142)，單純皰疹病毒2型糖蛋白gB(Genbank登記號M14923；Bzik等，1986，Virology 155322-333)，脊髓灰質(zhì)炎病毒I VP1(Emini等，1983，Nature 304699)，HIV I的包膜糖蛋白(Putney等，1986，Science2341392-1395)，乙型肝炎表面抗原(Itoh等，1986，Nature 30819；Neurath等，1986，Vaccine 434)，白喉毒素(Audibert等，1981Nature 289543)，鏈球菌24M表位(Beachey，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185193)，淋球菌菌毛蛋白(Rothbard和Schoolnik，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185247)，假狂犬病病毒g50(gpD)，假狂犬病病毒II(gpB)，假狂犬病病毒gIII(gpC)，假狂犬病病毒糖蛋白H假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質(zhì)蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38，豬細小病毒衣殼蛋白，豬痢疾小蛇菌(Serpulina hydodysenteriae)保護性抗原，牛病毒性腹瀉糖蛋白55，新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經(jīng)氨酸酶，口蹄疫病毒，豬瘟病毒，豬流感病毒，非洲豬瘟病毒，豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)，傳染性牛鼻氣管炎病毒(例如，傳染性牛鼻氣管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)，或傳染性喉氣管炎病毒(例如，傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I)，LaCrosse病毒的糖蛋白(Gonzales-Scarano等，1982，Virology 12042)，初生小牛腹瀉病毒(Matsuno和Inouye，1983，Infection andImmunity 39155)，委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Mathews和Roehrig，1982，Immunol.1292763)，punta toro病毒(Dalrymple等，1981，Replication of Negative Strand Viruses，Bishop和Compans(編)，Elsevier，NY，p.167)，鼠白血病病毒(Steeves等，1974，J.Virol.14187)，小鼠乳腺瘤病毒(Massey和Schochetman，1981，Virology11520)，乙型肝炎病毒核心蛋白和/或乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物(見，例如，1980年6月4日公開的英國專利公開號GB2034323A；Ganem和Varmus，1987，Ann.Rev.Biochem.56651-693；Tiollais等，1985，Nature 317489-495)，馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原(例如，馬流感病毒A/Alaska 91型神經(jīng)氨酸酶，馬流感病毒A/Miami 63型神經(jīng)氨酸酶，馬流感病毒A/Kentucky 81型神經(jīng)氨酸酶，馬皰疹病毒1型糖蛋白B，和馬皰疹病毒1型糖蛋白D，牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒的抗原(例如，牛呼吸道合胞病毒附著蛋白(BRSV G)，牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)，牛呼吸道合胞病毒核殼蛋白(BRSV N)，牛副流感病毒3型融合蛋白，和牛副流感病毒3型血凝素神經(jīng)氨酸酶)，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48或糖蛋白53。
本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑也可以是癌抗原或腫瘤抗原。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物，可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任意的癌癥或腫瘤抗原，包括但不限于，KS 1/4胰腺癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)，卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.51(2)468-475)，磷酸前列腺酸酯(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)，前列腺特異性的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli等，1993，Cancer Res.53227-230)，黑素瘤相關(guān)抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)445-446)，黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)，高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer5955-63；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.862136-2144)，前列腺特異性的膜抗原，癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13294)，多形上皮粘蛋白抗原，人乳脂肪球抗原，結(jié)腸直腸腫瘤相關(guān)抗原，例如CEA，TAG-72(Yokata等，1992，Cancer Res.523402-3408)，CO17-lA(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer 53751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2135)，CTA-1和LEA，伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13，CD19(Ghetie等，1994，Blood 831329-1336)，人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood 83435-445)，CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34422-430)，黑素瘤特異性的抗原，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)，神經(jīng)節(jié)苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.，36373-380)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM2(Livingston等，1994，J.Clin.Oncol.121036-1044)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3(Hoon等，1993，Cancer Res.535244-5250)，腫瘤特異性的移植類型的細胞表面抗原(TSTA)，例如病毒誘導(dǎo)的腫瘤抗原，包括DNA腫瘤病毒的T-抗原和RNA腫瘤病毒的包膜抗原，瘤胚抗原-α-胎蛋白，例如結(jié)腸的CEA，膀胱腫瘤瘤胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer.Res.452210-2188)，分化抗原，例如人肺癌抗原L6、L20(Hellstrom等，1986，Cancer Res.463917-3923)，纖維肉瘤的抗原，人白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988J.of Immunospecifically.1411398-1403)，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原例如EGFR(表皮生長因子受體)，HER2抗原(p185HER2)，多形上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，Trends in Bio.Chem.Sci.17359)，惡性人淋巴細胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，Science 245301-304)，分化抗原(Feizi，1985，Nature 31453-57)，例如在胎兒紅細胞、原內(nèi)胚層中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在成年紅細胞、植入前的胚胎中發(fā)現(xiàn)的I抗原，在胃腺癌中發(fā)現(xiàn)的I(Ma)，在乳腺上皮中發(fā)現(xiàn)的M18、M39，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的SSEA-1，在結(jié)腸直腸癌中發(fā)現(xiàn)的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)的F3，在胃癌中發(fā)現(xiàn)的AH6，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的Y半抗原、Ley，在A431細胞中發(fā)現(xiàn)的TL5(血型A)、EGF受體，在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)的E1系列(血型B)，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的FC10.2，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中發(fā)現(xiàn)的NS-10，在A431細胞的EGF受體中發(fā)現(xiàn)的CO-43(血型Leb)、G49，在結(jié)腸腺癌中發(fā)現(xiàn)的MH2(血型ALeb/Ley)，在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的19.9，在骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑素瘤中發(fā)現(xiàn)的R24，在胚胎癌性細胞中發(fā)現(xiàn)的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，和在4至8-細胞階段胚胎中發(fā)現(xiàn)的SSEA-3和SSEA-4。在一個實施方案中，抗原是來自皮膚T細胞淋巴瘤的T細胞受體衍生肽(見，Edelson，1998，TheCancer Journal 462)。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原性或免疫原性試劑可以包含需要針對它產(chǎn)生免疫反應(yīng)的病毒。在某些情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物包含重組的或嵌合的病毒。在其它情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物包含減毒的病毒。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，可以進行重組的、嵌合的和減毒的病毒的生產(chǎn)。本發(fā)明也包括要根據(jù)本發(fā)明進行配制的活的重組病毒疫苗或滅活的重組病毒疫苗?；钜呙缈梢允莾?yōu)選的，因為在宿主中的增殖會導(dǎo)致與自然感染時發(fā)生的類似類型和量級的延長的刺激，因此提供實質(zhì)的持久的免疫。使用常規(guī)的方法，包括在細胞培養(yǎng)物或雞胚胎的尿囊中繁殖病毒，然后純化，可以實現(xiàn)這樣的活重組病毒疫苗制劑的生產(chǎn)。
重組的病毒對于其要施用至的受試者可以是非致病的。在這點上，用于疫苗目的的基因工程改造的病毒的使用可能需要在這些株系中存在減毒特征。將合適的突變(例如，缺失)導(dǎo)入用于轉(zhuǎn)染的模板中，可以提供具有減毒特征的新病毒。例如，可以在缺失突變中產(chǎn)生與溫度敏感性或冷適應(yīng)性有關(guān)的特定錯義突變。這些突變應(yīng)當(dāng)比與冷或溫度敏感的突變體有關(guān)的點突變更穩(wěn)定，且回復(fù)頻率極低。
或者，對于在本發(fā)明的組合物中的使用，可以構(gòu)建具有“自殺”特征的嵌合病毒。這樣的病毒在宿主中僅僅經(jīng)歷一個或幾個回合的復(fù)制。當(dāng)用作疫苗時，該重組病毒會經(jīng)歷有限的復(fù)制循環(huán)，并誘導(dǎo)足夠水平的免疫反應(yīng)，但是它不會進一步在人宿主中存活和造成疾病。
或者，可以根據(jù)本發(fā)明配制滅活的(殺死的)病毒。使用常規(guī)的技術(shù)來“殺死”嵌合病毒，可以制備出滅活的疫苗制劑。滅活的疫苗是“死的”，其含義是它們的感染性已經(jīng)被破壞。理想地，病毒的感染性被破壞，而未影響它的免疫原性。為了制備滅活的疫苗，可以使嵌合病毒在細胞培養(yǎng)物或雞胚胎的尿囊中生長，通過區(qū)帶超速離心進行純化，用甲醛或β-丙醇酸內(nèi)酯滅活，并收集。
完全外來的表位，包括源自其它病毒或非病毒病原體的抗原，也可以構(gòu)建進用于本發(fā)明的組合物中的病毒之中。例如，無關(guān)病毒例如HIV的抗原(gp160，gp120，gp41)，寄生物抗原(例如，瘧疾)，細菌或真菌抗原或者腫瘤抗原可以構(gòu)建進減毒的株系中。生產(chǎn)和制備疫苗的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中。通常，這樣的方法包括接種含胚卵，收獲尿囊液，濃縮、純化和分離完整的病毒，以多種組合使用例如區(qū)帶離心、超速離心、超濾和色譜法。這樣的方法包括使用各種化學(xué)藥品，例如裂解試劑(例如非離子型表面活性劑，膽汁酸和其衍生物，烷基糖苷和其衍生物，?；?，穩(wěn)定劑，溶劑，等。在這樣的情況下，可以在最后的免疫原性組合物中發(fā)現(xiàn)從疫苗組合物的生產(chǎn)和制備留下的這些化學(xué)藥品的殘留濃度。但是，這樣的殘留濃度不足以在將疫苗組合物輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時導(dǎo)致疫苗組合物的佐劑活性。應(yīng)當(dāng)指出，本文所述的本發(fā)明的賦形劑的濃度大于在制備和生產(chǎn)疫苗組合物的過程中可能存在的這樣的化學(xué)藥品的殘留濃度。
實際上，可以將任意的異源基因序列構(gòu)建進用于本發(fā)明的免疫原性組合物的嵌合病毒中。優(yōu)選地，異源基因序列是能起生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物作用的部分和肽。優(yōu)選地，能誘導(dǎo)對各種病原體中的任一種的保護性免疫反應(yīng)的表位，或能結(jié)合中和抗體的抗原，可以由嵌合病毒表達，或作為其一部分。例如，可以構(gòu)建進嵌合病毒中的異源基因序列包括但不限于，流感和副流感血凝素神經(jīng)氨酸酶和融合糖蛋白，例如人PIV3的HN和F基因。另外，可以構(gòu)建進嵌合病毒中的異源基因序列包括能編碼具有免疫調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)的那些。免疫調(diào)節(jié)蛋白的實例包括但不限于，細胞因子，1型干擾素，γ干擾素，集落刺激因子，白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12，和這些試劑的拮抗劑。
其它異源序列可以源自腫瘤抗原，且得到的嵌合病毒可以用于產(chǎn)生針對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)的腫瘤退化。根據(jù)本發(fā)明，可以構(gòu)建重組的病毒，以表達腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，包括但不限于，由T細胞識別的人腫瘤抗原(Robbins和Kawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8628-636，其在這里整體引作參考)；黑素細胞系蛋白，包括gp100，MART-1/MelanA，TRP-1(gp75)和酪氨酸酶；腫瘤特異性的廣泛共享的抗原，例如MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-1，N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶V和p15；腫瘤特異性的突變的抗原，例如β-連環(huán)蛋白，MUM-1和CDK4；乳腺、卵巢、子宮頸和胰腺癌的非黑素瘤抗原，HER-2/neu，人乳頭狀瘤病毒-E6、-E7，MUC-1。
用于本發(fā)明的免疫原性組合物的抗原性或免疫原性試劑可以包含一種或多種選擇試劑和毒素，其由疾病控制中心(Center for DiseaseControl)鑒定。在某些情況下，用于本發(fā)明的免疫原性組合物的選擇試劑可以包含一種或多種來自如下的抗原葡萄球菌腸毒素B，肉毒桿菌毒素，對于炭疽的保護性抗原和鼠疫耶爾森氏桿菌。表I列出了用于本發(fā)明的免疫原性組合物的選擇試劑和毒素的非限制性的實例表I選擇試劑
5.1.3流感病毒抗原用于皮內(nèi)輸送的本發(fā)明的優(yōu)選的疫苗輸送系統(tǒng)是流感病毒疫苗，其可以包含一種或多種流感病毒抗原。優(yōu)選地，在本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑中使用的流感病毒抗原是表面抗原，包括但不限于，血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原或其組合。流感病毒抗原可以形成完整的流感疫苗制劑的一部分?；蛘?，流感病毒抗原可以作為純的或基本上純的抗原存在。用于分離和純化流感病毒抗原的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中。適合用于本發(fā)明的組合物中的血凝素/神經(jīng)氨酸酶制品的一個實例是Evans Medical Limited of Speke，Merseyside，United Kingdom生產(chǎn)和銷售的“Fluvirin”產(chǎn)品，也可參見S.Renfrey和A.Watts，1994 Vaccine，12(8)747-752；其在本文中整體引作參考。
在本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑中使用的流感疫苗可以是任意的市場上可買到的流感疫苗，優(yōu)選三價亞單位疫苗，例如，F(xiàn)LUZONETM減毒的流感疫苗(Aventis Pasteur，Inc.Swiftwater，PA)。在優(yōu)選的實施方案中，通過以低于肌肉內(nèi)輸送流感疫苗而使用的常規(guī)劑量，將流感疫苗輸送到皮內(nèi)隔室中，來達到等同的治療效果。本發(fā)明的流感疫苗制劑包含一種如本文公開的或通過本發(fā)明的方法鑒定出的賦形劑。當(dāng)將這樣的制劑輸送到皮內(nèi)隔室時，它們會產(chǎn)生比常規(guī)的給藥方式或沒有賦形劑的情況更高的抗體滴度。在有些實施方案中，與常規(guī)的給藥方式或沒有賦形劑的情況相比，本發(fā)明的流感疫苗制劑能使抗體滴度增加2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一個具體的實施方案中，當(dāng)與等量的輸送到皮內(nèi)隔室的Fluzone相比較時，添加了山梨醇的Fluzone會使血清滴度成為當(dāng)施用沒有山梨醇的Fluzone時的3倍(見圖12)。盡管不希望受任何作用機理的約束，這樣的由佐劑驅(qū)動的增強能提供減少免疫原的濃度的選擇，因此，通過增強免疫反應(yīng)，可以減少免疫原的量。在有些實施方案中，免疫原的量減少了至少20％，至少30％，至少40％，或至少50％。
在本發(fā)明中使用的流感疫苗可以是使用本領(lǐng)域已知的普通方法制備的非活流感抗原制品，優(yōu)選裂解的流感或亞單位抗原制品。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的流感疫苗是三價疫苗。本發(fā)明包括流感疫苗制劑，其包含從活病毒制備的非活流感抗原制品，優(yōu)選裂解的流感制品或亞單位抗原制品。最優(yōu)選地，流感抗原制品是裂解的流感抗原制品。
本發(fā)明的流感疫苗制劑可以含有來自單個病毒株或多個病毒株的流感病毒抗原。例如，流感疫苗制劑可以含有取自高達3種或更多種病毒株的抗原。純粹作為實例，流感疫苗制劑可以含有來自一個或多個流感A的株系的抗原以及來自一個或多個流感B的株系的抗原。流感株系的實例是流感A/Texas/36/91，A/Nanchang/933/95和B/Harbin/7/94的株系。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的流感疫苗制劑包含市場上可買到的流感疫苗，F(xiàn)LUZONETM，它是減毒的流感疫苗(ConnaughtLaboratories，Swiftwater，Pa.)。FLUZONETM是三價亞病毒粒子疫苗，其包含15μg/劑的來自流感A/Texas/36/91(NINI)、A/Beijing/32/92(H3N2)和B/Panama，45/90病毒的每種HA。
優(yōu)選地，本發(fā)明的流感疫苗制劑具有比常規(guī)疫苗更少量的血凝素，且以更少的體積施用。在有些實施方案中，每株流感的血凝素量是約1-7.5μg，更優(yōu)選約3μg或約5μg，其分別是在肌肉內(nèi)施用的常規(guī)疫苗中使用的血凝素劑量的約1/5或1/3。
根據(jù)本發(fā)明的流感疫苗制劑的每劑的體積是0.025mL-1.0mL、更優(yōu)選約0.05mL或約0.25mL。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明包括100μl的流感疫苗每劑體積。0.1mL劑量是常規(guī)的肌肉內(nèi)流感疫苗每劑體積的約1/5?？梢云?nèi)施用的液體的體積部分地取決于注射位點。例如，對于三角肌區(qū)中的注射，0.1mL是最優(yōu)選的體積，而在腰部，可以施用大體積例如約0.2mL。
國際上使用標(biāo)準(zhǔn)來測量流感疫苗的功效。下表說明了關(guān)于針對流感的有效疫苗的歐盟官方標(biāo)準(zhǔn)。理論上，為了滿足歐盟的要求，并從而獲準(zhǔn)在歐盟銷售，對于包含在疫苗中的所有流感株系，流感疫苗必須滿足下表中的標(biāo)準(zhǔn)之一。但是，在實際上，對于所有株系，尤其是對于投放市場的新疫苗，需要滿足至少2項或更多項，可能是所有3項標(biāo)準(zhǔn)。在有些情況下，2項標(biāo)準(zhǔn)可能足夠。例如，可以接受所有株系滿足3項標(biāo)準(zhǔn)中的2項，一些而不是所有株系(例如，3個株系中的2個)滿足第三項標(biāo)準(zhǔn)。對于成年群體(18-60歲)和老年群體(＞60歲)，要求是不同的。
表II關(guān)于有效的流感疫苗的歐盟標(biāo)準(zhǔn)
血清轉(zhuǎn)化率定義為，對于每種疫苗菌株，在疫苗接種后血清血凝素抑制(HI)滴度增加了至少4-倍的受者的百分比。轉(zhuǎn)化系數(shù)定義為，對于每種疫苗株系，在疫苗接種后血清HI幾何平均滴度的倍數(shù)增加。保護率或血清保護率定義為，在疫苗接種后血清HI滴度等于或大于1∶40的受者的百分比，且一般接受為指示性保護。
本發(fā)明的流感疫苗制劑能滿足如上所述的流感疫苗的歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的一些或全部，所以該疫苗在歐洲可以被批準(zhǔn)。優(yōu)選地，對于存在于疫苗中的流感株系或所有流感株系，能滿足3項歐盟標(biāo)準(zhǔn)中的至少2項。更優(yōu)選地，所有株系能滿足至少2項標(biāo)準(zhǔn)，且所有株系或至少除了一個株系以外的所有株系能滿足第3項標(biāo)準(zhǔn)。更優(yōu)選地，存在的所有株系能滿足所有3項標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)選地，本發(fā)明的流感疫苗制劑還滿足關(guān)于當(dāng)前的流感疫苗的聯(lián)邦藥品管理局(Federal DrugAdministration)和/或USPHS要求的一些或全部標(biāo)準(zhǔn)。
5.2免疫原性組合物的制備5.2.1皮內(nèi)免疫原性組合物的制備通過任意的能產(chǎn)生穩(wěn)定的、無菌的、可注射的制劑的方法，可以制備出本發(fā)明的免疫原性組合物。優(yōu)選地，制備本發(fā)明的免疫原性組合物的方法包括提供賦形劑的溶液；提供抗原性或免疫原性試劑的溶液；和合并賦形劑的溶液和抗原性或免疫原性試劑的溶液，形成接種物，例如，要注射進皮內(nèi)隔室中的溶液。
在一個實施方案中，可以將微粒形式的賦形劑溶于抗原性或免疫原性試劑的溶液中，從而形成穩(wěn)定的、無菌的、可注射的制劑?；蛘?，抗原性或免疫原性試劑可以是微粒，且溶解在賦形劑溶液中，從而形成穩(wěn)定的、無菌的、可注射的制劑。為了增強本發(fā)明的免疫原性組合物的性能，抗原性或免疫原性試劑應(yīng)當(dāng)均勻地分散在組合物中。
在一個實施方案中，在施用給受試者之前，混合賦形劑和抗原性或免疫原性試劑?；蛘?，可以在施用過程中，在輸送裝置中混合賦形劑和抗原性或免疫原性試劑。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的抗原性或免疫原性試劑的量可以隨使用的抗原性或免疫原性試劑和特定的賦形劑的化學(xué)性質(zhì)和效力而異。通常，在本發(fā)明的組合物中的抗原性或免疫原性試劑的起始濃度是使用常規(guī)的給藥方式(例如肌肉內(nèi)注射)常規(guī)地用于引起需要的免疫反應(yīng)的量。然后，通過例如使用稀釋劑進行稀釋，來調(diào)節(jié)本發(fā)明的皮內(nèi)疫苗制劑中的抗原性或免疫原性試劑的濃度，從而實現(xiàn)有效的保護性的免疫反應(yīng)，如使用本領(lǐng)域已知的和本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法所評定的。
在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的賦形劑的量可以隨使用的賦形劑和特定的抗原性或免疫原性試劑的化學(xué)性質(zhì)而異。某些優(yōu)選濃度的上面5.1.1部分所述的賦形劑通?？梢耘c許多抗原性或免疫原性試劑一起有效地使用。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠明白，根據(jù)各賦形劑和抗原性或免疫原性試劑，使用基本上等同于上面公開的用于確定抗原性或免疫原性試劑的有效量的方法，以及本領(lǐng)域常規(guī)地已知的其它方法，可以調(diào)節(jié)賦形劑的量。
可以將本發(fā)明的免疫原性組合物制備成單位劑型。每小瓶的單位劑量可以含有0.1mL-1mL、優(yōu)選0.1-0.5mL制劑。在有些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物的單位劑型可以含有50μL-100μL，150μL-200μL，或250μL-500μL制劑。如果需要，通過向每個小瓶中加入無菌的稀釋劑，可以將這些制品調(diào)節(jié)至需要的濃度。本發(fā)明的免疫原性組合物能更有效地引起需要的免疫反應(yīng)，因而皮內(nèi)輸送的總體積可以小于常規(guī)使用的體積。
在有些實施方案中，將本發(fā)明的免疫原性組合物的組分，例如抗原性或免疫原性試劑和賦形劑，分開地或一起混合地提供在單位劑型中，例如，作為在標(biāo)明了活性試劑(例如抗原性或免疫原性試劑)的量的密閉容器(例如，安瓿或小袋)中的凍干的粉末或無水的濃縮物。在其它實施方案中，可以提供一安瓿的無菌稀釋劑，以便可以在施用前混合組分。在一個具體的實施方案中，可以在即將施用前，將賦形劑與抗原性或免疫原性試劑混合。在另一個具體的實施方案中，可以在施用過程中，將賦形劑與抗原性或免疫原性試劑在皮內(nèi)輸送裝置中混合。
本發(fā)明還提供了免疫原性組合物，其包裝在標(biāo)明了組分的量的密閉容器例如安瓿或小袋中。在一個實施方案中，將免疫原性組合物提供為液體，在另一個實施方案中，作為密閉容器中的干燥的、滅菌的、凍干的粉末或無水的濃縮物，可以用例如水或鹽水重配至用于施用給受試者的合適的濃度。在一個可選擇的實施方案中，將免疫原性組合物提供為在標(biāo)明了組分的量和濃度的密閉容器中的液體形式。通過能產(chǎn)生穩(wěn)定的、無菌的、可注射的制劑的任意的方法，可以制備出本發(fā)明的免疫原性組合物。
本發(fā)明的免疫原性組合物特別適用于將抗原性或免疫原性試劑皮內(nèi)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室。優(yōu)選地，使用在1999年10月14日提交的美國專利申請?zhí)?9/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的國際公開號EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它們都在這里整體引作參考)中公開的皮內(nèi)裝置和方法之中的任一種，施用本發(fā)明的免疫原性組合物。
將本發(fā)明的免疫原性組合物施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，從而滲透入而不穿過受試者皮膚的皮內(nèi)空間。優(yōu)選地，將免疫原性組合物施用給約1.0-3.0mm深度、最優(yōu)選1.0-2.0mm深度的皮內(nèi)空間。與疫苗制劑的常規(guī)給藥方式(例如，肌肉內(nèi))相比，用于皮內(nèi)輸送的本發(fā)明的免疫原性組合物能提供無痛的且侵入性更低的給藥方式，因此是更有利的，例如在受試者的順從性方面。
在有些實施方案中，在制備之后，例如從凍干的粉末重配之后，在12小時內(nèi)，優(yōu)選6小時內(nèi)，5小時內(nèi)，3小時內(nèi)，或1小時內(nèi)，施用本發(fā)明的免疫原性組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，在即將皮內(nèi)施用前，制備用于皮內(nèi)施用給受試者的本發(fā)明的免疫原性組合物，也就是將抗原性或免疫原性試劑與賦形劑混合。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法施用時，本發(fā)明的免疫原性組合物具有較少的或沒有短期和/或長期毒性。在有些實施方案中，當(dāng)皮內(nèi)地施用時，本發(fā)明的免疫原性組合物在注射位點具有不希望的反應(yīng)，例如皮膚刺激、腫脹、皮疹、壞死、皮膚敏感化。在這些具體的實施方案中，除了已經(jīng)使用的賦形劑以外，在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用一種或多種其它的賦形劑，其能導(dǎo)致消除或減少注射位點的不希望的反應(yīng)。在其它實施方案中，當(dāng)皮內(nèi)地施用時，本發(fā)明的免疫原性組合物在注射位點沒有不希望的反應(yīng)。
5.2.2表皮的免疫原性組合物的制備通過任意的能產(chǎn)生穩(wěn)定的、無菌的制劑的方法，例如本領(lǐng)域已知的和在分別于2001年10月29日、2001年11月27日、2000年5月22日和2002年10月29日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/330,713,60/333,162和美國申請系列號09/576,643，美國申請系列號10/282,231(它們都在這里整體引作參考)中公開的方法，可以制備本發(fā)明的表皮的免疫原性組合物。尤其是，可以將它們以干粉、凝膠、溶液、懸浮液和乳膏的形式輸送。
可以將表皮的免疫原性組合物以任意的藥學(xué)上可接受的形式輸送進皮膚的表皮隔室中。在一個實施方案中，將表皮的免疫原性組合物應(yīng)用于皮膚，然后在皮膚和物質(zhì)上來回地移動或摩擦磨蝕裝置。優(yōu)選地，使用最小量的磨蝕，以產(chǎn)生需要的結(jié)果。確定用于所選擇的組合物的適當(dāng)量的磨蝕，在本領(lǐng)域的普通知識范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，可以在應(yīng)用前，將免疫原性組合物以干燥的形式施加至輸送裝置的磨蝕表面。在該實施方案中，將重配液體應(yīng)用于輸送位點的皮膚，并將裹覆了制劑的磨蝕裝置應(yīng)用于重配液體的位點處的皮膚。然后，在皮膚上來回地移動或摩擦它，使免疫原性組合物溶解于皮膚表面上的重配液體中，并在磨蝕的同時進行輸送?；蛘?，可以將重配液體包含在磨蝕裝置中，并在將裝置應(yīng)用于皮膚以進行磨蝕時，釋放出來從而溶解免疫原性組合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些疫苗制劑也可以以凝膠形式包被在磨蝕裝置上。
5.3免疫原性組合物的施用5.3.1皮內(nèi)施用方法本發(fā)明包括將本文所述和示例的本發(fā)明的免疫原性組合物皮內(nèi)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的方法，優(yōu)選地通過直接地和選擇性地靶向皮內(nèi)隔室。一旦根據(jù)上面5.2部分所述的方法制備了免疫原性組合物，通常將接種物轉(zhuǎn)移到用于皮內(nèi)輸送的注射裝置，例如注射器中。優(yōu)選地，在制備1小時內(nèi)，將接種物施用給受試者皮膚的皮內(nèi)隔室。使用在1999年10月14日提交的美國專利申請?zhí)?9/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的國際公開號EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；2002年1月10日公布的WO02/02179(它們都在這里整體引作參考)中公開的皮內(nèi)裝置和方法之中的任一種，施用本發(fā)明的免疫原性組合物。示例裝置顯示在圖12-14。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明包括圖12-14公開的藥物輸送裝置。圖12-14圖示了可以用于實現(xiàn)本發(fā)明的方法的藥物輸送裝置的一個實例，以進行圖12-14所示的皮內(nèi)注射。在圖12-14中圖示的裝置10包含針組合件20，其可以連接到注射器筒60上。可以使用其它形式的輸送裝置，包括美國專利號5,279,586，美國專利申請系列號09/027,607和PCT申請?zhí)朩O 00/09135(其內(nèi)容在這里整體引作參考)公開的類型的筆。針組合件20包含針座22，其支撐著針套管24。限制器26容納針座22的至少一部分，從而限制器26通常圍繞著針套管24，如在圖13中最佳地觀察到的。
針座22的一端30能固定到注射器的接收器32上?？梢詫⒃O(shè)計的針組合件與多種注射器類型一起使用，所述注射器類型用于含有要根據(jù)本發(fā)明進行皮內(nèi)輸送的物質(zhì)，下面給出了幾個實例。針座22的另一端優(yōu)選地包括延伸段34，其容納在限制器26內(nèi)的鄰接表面36上。優(yōu)選地，在限制器26上提供了多個肋骨38，以提供結(jié)構(gòu)完整性，并有利于操縱針組合件20。通過適當(dāng)?shù)卦O(shè)計組成部件的大小，可以嚴格地控制針24的前端或頂端40和限制器26上的皮膚接合表面42之間的距離″d″。距離″d″的范圍優(yōu)選地是約0.5mm至約3.0mm，最優(yōu)選地約1.5mm±0.2mm至0.3mm。當(dāng)針套管24的前端40延伸而超過皮膚接合表面42的距離位于該范圍內(nèi)時，可以確保皮內(nèi)注射，因為針不能進一步穿透動物的典型的真皮層。通常，外面的皮膚層，即表皮，具有50-200微米的厚度，而真皮，即內(nèi)部的且更厚的皮膚層，具有1.5-3.5mm的厚度。真皮層下面依次是皮下組織(有時也稱作皮下層)和肌肉組織。
如從圖13可以最好地看出的，限制器26包含孔44，針套管24的前端40從其中伸出。根據(jù)特定情形的要求，可以控制孔44和前端40之間的空間關(guān)系。在該圖示的實施方案中，皮膚接合表面42通常是平面的或平坦的且連續(xù)的，以使針組合件20穩(wěn)定地放置在動物皮膚上。盡管未具體地圖解說明，它可以有利地具有通常平面的皮膚接合表面42，包括肋骨形式的凸起部分或槽形式的凹陷部分，以增強穩(wěn)定性或促進針護罩向針頂端40的附著。另外，沿著限制器26的側(cè)面的肋骨38可以延伸超出皮膚接合表面42的平面。
無論皮膚接合表面42的形狀或輪廓如何，優(yōu)選的實施方案包含足夠的能接觸皮膚的通常為平面的或平坦的表面區(qū)域，以有利于相對于受試者皮膚來穩(wěn)定注射器。在最優(yōu)選的布置中，皮膚接合表面42有利于將注射器維持在相對于皮膚表面通常垂直的方向上，和有利于在注射過程中對皮膚施加壓力。因而，在優(yōu)選的實施方案中，限制器具有至少5mm的尺寸或外徑。主要尺寸取決于用途和包裝限制，但是方便的直徑是小于15mm或更優(yōu)選11-12mm。
重要的是注意到，盡管圖12和13圖示了兩件式組合件，其中使針座22與限制器26分離，但是根據(jù)本發(fā)明使用的裝置不限于這樣的布置。從單塊塑料完整地形成針座22和限制器26，是圖12和13所示的實施例的替代方案。另外，可以以圖12所述的位置，將針座22粘附或固定到限制器26上，裝配后使針組合件20變成單件單元。
具有針座22和限制器26，可以提供使得皮內(nèi)針能實際用于生產(chǎn)的優(yōu)點。優(yōu)選的針大小是小規(guī)格皮下針，通常稱作30號或31號針。具有這樣的小直徑針，代表著使針足夠短以預(yù)防不適當(dāng)?shù)卮┩竸游锏闹逼拥奶魬?zhàn)。限制器26和針座22有利于使用針24，其具有遠遠大于針的有效長度的總長度，其在注射過程中能穿透個體的組織。利用根據(jù)本文設(shè)計的針組合件，可以提高生產(chǎn)，因為在生產(chǎn)和裝配過程中，可以操縱更大長度的針，同時仍然得到用于完成皮內(nèi)注射目的的短針的優(yōu)點。
圖13圖示了針組合件20，其固定到藥物容器例如注射器60上，以形成裝置10。通常為圓柱形的注射器體62可以由塑料或玻璃制成，如本領(lǐng)域已知的。注射器體62能提供儲存室64，用于容納要在注射過程中施用的物質(zhì)。柱塞桿66在一端具有用手作用的凸緣68，在另一端具有塞子70，如本領(lǐng)域已知的。根據(jù)需要，用手使柱塞桿66通過儲存室64運動，迫使儲存室64內(nèi)的物質(zhì)排出針的末端40。
針座22可以以多種已知的方式固定到注射器體62上。在一個實施例中，在針座22的內(nèi)部和注射器體62的出口部分72的外部之間提供干涉配合。在另一個實施例中，提供了常規(guī)的Luer配合布置，以將針座22固定到注射器60的一端。如從圖14可以看出的，這樣設(shè)計的針組合件能容易地適用于各種各樣的常規(guī)注射器類型。
本發(fā)明通過特異地和選擇性地、優(yōu)選直接地靶向皮內(nèi)空間，提高了本文所述的免疫原性組合物的臨床應(yīng)用性和治療功效。本發(fā)明的免疫原性組合物可以作為推注(bolus)或通過灌注而輸送到皮內(nèi)空間。除了用本發(fā)明的賦形劑增強本發(fā)明的組合物的免疫原性外，通過選擇性地靶向受試者皮膚的皮內(nèi)隔室來輸送本發(fā)明的免疫原性組合物，可以提高免疫原性或抗原性試劑向駐留在皮膚中的免疫細胞(例如，抗原呈遞細胞)的可用性，以實現(xiàn)針對該免疫原性組合物的抗原特異性的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法允許通過皮內(nèi)途徑施用更小劑量的免疫原性組合物。
皮內(nèi)施用方法包括基于顯微針的注射和灌注系統(tǒng)或能準(zhǔn)確靶向皮內(nèi)空間的任何其它手段。皮內(nèi)施用方法不僅包括基于顯微裝置的注射方式，還包括其它輸送方法，例如將流體或粉末無針地或沒有針地彈道注射進皮內(nèi)空間，Mantoux型皮內(nèi)注射，增強的通過顯微裝置的離子電滲療法，和將流體、固體或其它給藥形式直接儲存進皮膚中。
使用Mantoux型皮內(nèi)注射，可以將本發(fā)明的免疫原性組合物施用到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中，見，例如，F(xiàn)lynn等，1994，Chest 1061463-5，其在本文中整體引作參考。具體地，使用下面的示例性方法，可以將免疫原性組合物輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中。在一個具體的實施方案中，將根據(jù)上面5.3部分公開的方法制備的本發(fā)明的免疫原性組合物抽入注射器，例如，1mL無膠乳的具有20號針頭的注射器；裝載注射器后，將其替換為用于皮內(nèi)施用的30號針頭。針尖斜面朝上，以最淺的可能的角度，接近受試者(例如，小鼠)的皮膚，且拉緊皮膚。然后，經(jīng)5-10秒，緩慢地推進注射體積，形成典型的“水泡(bleb)”，隨后緩慢地移出針頭。優(yōu)選地，僅僅使用一個注射位點。更優(yōu)選地，注射體積不超過100μL，這部分地由于下述事實，即較大的注射體積可能增加向周圍組織空間(例如，皮下空間)的溢出。
本發(fā)明包括使用所有已知類型的常規(guī)的注射針頭、導(dǎo)管或顯微針，其單獨地或以多針陣列使用。在優(yōu)選的實施方案中，針陣列用于將較大的體積輸送到皮內(nèi)隔室。例如可以經(jīng)幾個位點同時地分開較大的注射體積，例如500μL，從而允許導(dǎo)入更大的體積，而不超過皮內(nèi)隔室。如本文使用的，術(shù)語″針″和″針頭″意在包括所有這樣的針狀結(jié)構(gòu)。如本文使用的，術(shù)語“顯微針”意在包括小于約30號的結(jié)構(gòu)，當(dāng)這樣的結(jié)構(gòu)在性質(zhì)上是圓柱形時，通常為約31-50號。因此，由術(shù)語顯微針?biāo)ǖ姆菆A柱形結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)闹睆?，且包括棱錐體形的、矩形的、八角形的、楔形的和其它的幾何形狀。
本發(fā)明的免疫原性組合物的皮內(nèi)輸送可以使用彈道流體注射裝置，粉末噴射輸送裝置，壓電的、電動的、電磁的輔助輸送裝置，氣體-輔助的輸送裝置，其能直接穿透皮膚以將本發(fā)明的疫苗制劑直接輸送到皮膚空間內(nèi)的靶位置。
本發(fā)明的免疫原性組合物靶向皮內(nèi)空間的實際方法不是至關(guān)重要的，只要它能穿透受試者的皮膚達到皮內(nèi)空間內(nèi)的所需要的目標(biāo)深度，而不透過它。實際的最佳穿透深度隨受試者皮膚的厚度而變。在大多數(shù)情況下，穿透皮膚到約0.5-2mm的深度。無論具體的皮內(nèi)裝置和輸送方法如何，皮內(nèi)輸送優(yōu)選地將本發(fā)明的免疫原性組合物靶向至至少0.3mm、更優(yōu)選至少0.5mm的深度，到不超過2.0mm、更優(yōu)選不超過1.7mm的深度。
在某些情況下，將免疫原性組合物輸送到剛好在角質(zhì)層下且包括表皮和上部真皮的目標(biāo)深度，例如約0.025mm至約2.5mm。為了靶向皮膚內(nèi)的特定細胞，優(yōu)選的靶深度取決于被靶向的特定細胞和特定受試者的皮膚厚度。例如，為了靶向人皮膚的皮膚空間中的朗氏細胞，輸送需要至少部分地包括通常為約0.025mm至約0.2mm的人表皮組織深度。
在免疫原性組合物需要全身循環(huán)的情況下，優(yōu)選的靶深度是至少約0.4mm、和最優(yōu)選地至少約0.5mm，至不超過約2.5mm、更優(yōu)選地不超過約2.0mm、和最優(yōu)選地不超過約1.7mm的深度。
用于實現(xiàn)本發(fā)明的皮內(nèi)施用方法包括向受試者，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人，推注和灌注輸送免疫原性組合物。推注劑量是經(jīng)相對較短的時間段，通常小于約10分鐘，在單個體積單位中輸送的單劑量。灌注施用包括，經(jīng)相對更長的時間段，通常大于約10分鐘，以恒定的或變化的選定的速度施用流體。
免疫原性組合物向皮內(nèi)空間中的皮內(nèi)輸送，可以被動地進行，無需向待輸送的疫苗制劑施加外部壓力或其它的驅(qū)動手段，和/或主動地進行，施加壓力或其它驅(qū)動手段。優(yōu)選的壓力產(chǎn)生手段的實例包括泵，注射器，彈性體膜，氣體壓力，壓電的、電動的、電磁的泵吸，或盤形彈簧或墊圈或其組合。如果需要，通過壓力產(chǎn)生手段，可以變化地控制本發(fā)明的免疫原性組合物的輸送速度。
根據(jù)本發(fā)明輸送或施用的免疫原性組合物包括其在藥學(xué)上可接受的稀釋劑或溶劑中的溶液，懸浮液，凝膠，懸浮的或分散的微粒，例如微米和納米顆粒，以及它們的原位形成的載體。
本發(fā)明也包括改變本發(fā)明的免疫原性組合物的目標(biāo)輸送深度。操作人員可以手工地控制免疫原性組合物的目標(biāo)輸送深度，用或不用指示器輔助以指示何時達到需要的深度。但是，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的裝置具有用于控制皮膚穿透到皮內(nèi)空間中的需要深度的結(jié)構(gòu)工具。使用1999年10月14日提交的美國專利申請?zhí)?9/417,671；2000年6月29日提交的09/606,909；2001年6月29日提交的09/893,746；2001年12月28日提交的10/028,989；2001年12月28日提交的10/028,988；或2001年4月18日公布的國際公開號EP 10922 444；2002年1月10日公布的WO 01/02178；和2002年1月10日公布的WO 02/02179(它們都在這里整體引作參考)所述的方法中的任一種，可以改變目標(biāo)輸送深度。
本發(fā)明的免疫原性組合物的劑量取決于組合物中的抗原性或免疫原性試劑。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的免疫學(xué)方法，例如通過首先鑒定能有效地引起預(yù)防或治療性免疫反應(yīng)的劑量，例如，通過測量相對于對照制劑(例如，僅由抗原性或免疫原性試劑組成的制劑，其沒有本文公開的賦形劑)的抗原特異性的免疫球蛋白的血清滴度，可以確定免疫原性組合物的劑量。優(yōu)選地，在用于人之前，在動物模型中確定有效劑量。最優(yōu)選地，在其皮膚厚度非常接近人皮膚的動物(例如，豬)中，確定最佳劑量。
也可以按照給藥時間表施用本發(fā)明的免疫原性組合物，例如，最初施用免疫原性組合物，隨后進行加強施用。在某些情況下，在初次施用后大概2周至1年、優(yōu)選1-6個月中的任意時間，施用第二劑免疫原性組合物。另外，可以在第二次給藥后，和在初次施用后3個月至2年或更長，優(yōu)選4 6個月，或6個月至1年，施用第三次。在某些情況下，不需要加強免疫。
5.3.2表皮施用表皮施用方法包括本領(lǐng)域已知的用于準(zhǔn)確靶向表皮隔室的任何方法和裝置，例如分別在2001年10月29日、2001年11月27日、2000年5月22日和2002年10月29日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/330,713,60/333,162和美國申請系列號09/576,643，美國申請系列號10/282,231中公開的那些，它們都在這里整體引作參考。本發(fā)明包括用于準(zhǔn)確地靶向表皮空間的微磨蝕裝置。這些裝置可以具有實心的或中空的微突起。微突起可以具有高達約500微米的長度。合適的微突起具有約50至500微米的長度。優(yōu)選地，微突起具有約50至300微米的長度，更優(yōu)選地在約150至250微米的范圍內(nèi)，180-220微米是最優(yōu)選的。
可以在本發(fā)明的方法中使用的微磨蝕器裝置優(yōu)選地是能磨蝕皮膚的裝置，例如在圖15-20中示例的那些。在優(yōu)選的實施方案中，該裝置能磨蝕皮膚，從而穿透角質(zhì)層而不刺穿角質(zhì)層。
在此使用時，“穿透”指進入角質(zhì)層，且未完全地穿過角質(zhì)層并進入相鄰層。這并不是說，不能完全穿透角質(zhì)層而顯示皮膚的下層的界面。另一方面，刺穿指完全穿過角質(zhì)層，并進入角質(zhì)層下的相鄰層。在此使用時，術(shù)語″磨蝕″指去除至少一部分角質(zhì)層，以增加皮膚的滲透性，而不造成多余的皮膚刺激，或損害對感染因子的皮膚屏障。在此使用時，術(shù)語″磨蝕過程″指破壞皮膚的外層，例如通過刮削或摩擦，產(chǎn)生受損的角質(zhì)層區(qū)域。這與“穿孔”不同，后者能產(chǎn)生透過角質(zhì)層的離散孔，孔之間是未破壞的角質(zhì)層區(qū)域。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法用于表皮輸送的裝置能穿透而不刺穿角質(zhì)層。在磨蝕前、磨蝕的同時或磨蝕后，可以將待使用本發(fā)明的方法進行施用的組合物應(yīng)用到皮膚上。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明包括將免疫原性組合物輸送進患者皮膚的方法，其包括以下步驟用制劑涂布患者的外皮層或微磨蝕器2(見圖15B)，并使微磨蝕器2沿著患者皮膚移動以提供磨蝕，產(chǎn)生足以允許制劑進入患者的活表皮的凹痕。由于微磨蝕器2的結(jié)構(gòu)設(shè)計，微磨蝕器2的前緣首先伸展患者的皮膚，然后微磨蝕器2的頂部表面磨蝕外部保護性皮膚層以使制劑進入患者。初步磨蝕外部保護性皮膚層后，微磨蝕器2的后緣和前緣可以摩擦經(jīng)磨蝕的區(qū)域的表面，使制劑進入經(jīng)磨蝕的皮膚區(qū)域，從而提高它的醫(yī)學(xué)效果。如圖15B、16A和16B所示，微磨蝕器2包含基板4，其上面可以安裝磨蝕表面5?；蛘撸ノg表面可以與基板構(gòu)成整體，并制造成單一的2組分部件。優(yōu)選地，基板4是實心的模鑄件。在一個實施方案中，基板4具有蘑菇樣的冠4b，其向上彎曲，且在頂部截短?；?的頂部通常是平坦的，磨蝕表面5安裝在其上面，或者與其構(gòu)成整體?；蛘?，截短的頂部可以具有用于容納磨蝕表面5的凹進。在所有實施方案中，磨蝕表面5包含一個平臺，其具有微突起陣列，該微突起陣列截短的頂部上延伸。在微磨蝕器的另一個實施方案中，手柄、基板和磨蝕表面可以彼此構(gòu)成整體，且制成單一的三組分裝置。通過用足夠的壓力使微磨蝕器2沿著受試者皮膚移動，來將微磨蝕器2應(yīng)用到受試者上，以使磨蝕表面5能夠打開受試者的外部保護性皮膚或角質(zhì)層。施加到基板上的向內(nèi)壓力造成微磨蝕器2壓進受試者皮膚中。因此，當(dāng)使用微磨蝕器2時，傾斜的蘑菇樣的冠4b的高度優(yōu)選地足以阻止所應(yīng)用的物質(zhì)流出和流到小平面4c上。如下面將描述的，磨蝕表面5包含微突起陣列。
手柄6連接到基板4，或可以與基板4構(gòu)成整體。如圖16A所示，手柄的上端6a與基板4的內(nèi)周側(cè)壁4a之間可以是搭扣配合或摩擦配合。或者，如圖15A和16A所示，手柄6可以粘(例如，用環(huán)氧樹脂)到基板4的下側(cè)4c?；蛘?，手柄和基板可以制作(例如，注射模鑄)到一起，成為單一的2組分部件。手柄的直徑可以小于基板的直徑，或可以與基板的直徑類似?；?的下側(cè)4c可以與蘑菇樣的冠4b齊平，或伸出蘑菇樣的冠。手柄6的下端6b可以比手柄6的軸6c更寬，或可以與軸的直徑類似。下端6b可以包括壓痕6d，其用作施用物質(zhì)和移動微磨蝕器2的人的拇指放置處。另外，突起8形成在手柄6的外側(cè)，以便在將其在患者皮膚上或沿著皮膚移動時，輔助使用者牢固地抓緊手柄6。
如圖16B中的圖15B的剖面所示，下端6b可以是圓柱形的。微磨蝕器2可以由透明材料制成，如圖16A所示。壓痕6d排列在圓柱形下端6b的兩側(cè)，以輔助使用微磨蝕器2的人抓緊它。也就是說，可以由手或手指提供微磨蝕器2的運動。微磨蝕器的手柄6以及基板4優(yōu)選地由塑料或類似的材料模鑄成。優(yōu)選地，廉價地生產(chǎn)微磨蝕器2，以便在一位患者上使用后，可以處置整個微磨蝕器和磨蝕表面。
將磨蝕表面5設(shè)計成，當(dāng)微磨蝕器2沿著患者皮膚移動時，產(chǎn)生的磨蝕過程能穿透角質(zhì)層。磨蝕表面5可以涂布有希望輸送到患者的活表皮的制劑。
為了達到需要的磨蝕，微磨蝕器2應(yīng)當(dāng)在患者的皮膚上移動至少一次?？梢砸越惶娴姆较騺砟ノg患者的皮膚。根據(jù)本發(fā)明的微磨蝕器的結(jié)構(gòu)設(shè)計，使制劑能更有效地被吸收，從而允許較少的制劑施加到患者的皮膚上或涂布磨蝕表面5。磨蝕表面5可以涂布有希望輸送給患者的制劑。在一個實施方案中，制劑可以是置于磨蝕表面5上的粉末。在另一個實施方案中，可以在將微磨蝕器2施加到患者的皮膚上并移動之前，將待輸送的制劑直接施加到患者的皮膚上。
參考圖17，本發(fā)明的微磨蝕器裝置10包括基本上平面的主體或磨蝕表面支持物12，后者具有許多從支持物的底表面伸出的微突起14。支持物通常具有足以允許表面附著到微磨蝕器裝置的基板上、從而允許容易地操縱裝置的厚度，如圖15B、16A和16B所示?；蛘撸梢詫⒉煌氖直蜃ゾo裝置連接到磨蝕表面支持物12的頂部表面上，或與后者構(gòu)成整體。磨蝕表面支持物12的尺寸可以隨微突起的長度、在給定區(qū)域中的微突起的數(shù)目和要施用給患者的制劑的量而變。通常，磨蝕表面支持物12具有約1-4cm2的表面積。在優(yōu)選的實施方案中，磨蝕表面支持物12具有約1cm2的表面積。
如圖17、18A和B和19所示，微突起14從磨蝕表面支持物12的表面伸出，且基本上與磨蝕表面支持物12的平面垂直。在圖示說明的實施方案中的微突起以許多行和列的形式排列，且優(yōu)選地間隔均勻的距離。微突起14具有通常的棱錐體形狀，側(cè)面16延伸到頂端18。當(dāng)從剖面觀看時，所示的側(cè)面16具有通常為凹形的輪廓，且形成從磨蝕表面支持物12延伸至頂端18的彎曲表面。在圖示說明的實施方案中，微突起由4個基本上相同形狀和大小的側(cè)面16形成。如圖18B和19所示，微突起14的每個側(cè)面16具有與相鄰側(cè)面連接的相對的側(cè)緣，并形成從磨蝕表面支持物12向外延伸的刮削邊22。刮削邊22定義了通常為三角形或梯形的刮削表面，其與側(cè)面16的形狀相對應(yīng)。在其它的實施方案中，可以用更少或更多的側(cè)面形成微突起14。
優(yōu)選地，微突起14在鈍頂端18終止。通常，頂端18是基本上平的，且與支持物14平行。當(dāng)頂端是平的時，微突起的總長度不能穿透皮膚；因而，微突起的長度大于所述微突起穿透所述皮膚的總深度。頂端18優(yōu)選地形成邊界明確的銳邊20，它在此邊緣處與側(cè)面16相接。邊緣20基本上與磨蝕表面支持物12平行地延伸，并定義了另一個刮削邊緣。在其它的實施方案中，邊緣20可以稍圓，形成從側(cè)面16到頂端18的平滑過渡。優(yōu)選地，微突起是截頭圓錐體的或截頭棱錐體的形狀。
微磨蝕器裝置10和微突起可以由與待施用的物質(zhì)不反應(yīng)的塑料制成。合適的塑料的非包括性的列表包括，例如，本領(lǐng)域已知的聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺，聚苯乙烯，聚酯，和聚碳酸酯?；蛘?，微突起可以由金屬制成，例如不銹鋼，鎢鋼，鎳合金，鉬，鉻，鈷，鈦，和其合金，或其它材料例如硅，陶瓷和玻璃聚合物。如本領(lǐng)域已知的，使用類似于硅片的照相平版印刷蝕刻術(shù)的各種技術(shù)，或者使用采用金剛石綴尖的磨機的顯微機械加工，可以生產(chǎn)金屬微突起。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過硅片的照相平版印刷蝕刻術(shù)，也可以生產(chǎn)微突起。通過注射模鑄工藝，例如這里引作參考的2002年7月12日提交的美國申請系列號10/193,317所述，也可以用塑料生產(chǎn)它們。
基于待施用的具體物質(zhì)和裝置要應(yīng)用的位置的角質(zhì)層的厚度，選擇微突起的長度和厚度。優(yōu)選地，微突起能穿透角質(zhì)層，而基本上不刺穿或穿過角質(zhì)層。微突起可以具有至多約500微米的長度。合適的微突起具有約50至500微米的長度。優(yōu)選地，微突起具有約50至約300微米的長度，更優(yōu)選在約150至250微米的范圍內(nèi)，180-220微米是最優(yōu)選的。在舉例說明的實施方案中的微突起具有通常為棱錐體形的形狀，且與裝置的平面垂直。這些形狀具有確保在需要的深度發(fā)生磨蝕的特別的優(yōu)點。在優(yōu)選的實施方案中，微突起是實心成員。在替代實施方案中，微突起可以是中空的。
如圖16和18所示，微突起優(yōu)選地以均勻間隔的行和列排列，形成在磨蝕過程中接觸皮膚和穿透角質(zhì)層的陣列。微突起之間的間隔可以隨施用到皮膚表面或皮膚組織內(nèi)的物質(zhì)而變。通常，以一定距離排列微突起的行，以提供每毫米(mm)約2-約10個的密度。通常，以基本上等于陣列中的微突起的間隔的距離，排列行或列，以提供每mm2約4-約100個微突起的微突起密度。在另一個實施方案中，微突起可以排列成圓形圖案。在另一個實施方案中，微突起可以排列成隨機圖案。當(dāng)以列和行排列時，微突起的中心之間的距離優(yōu)選地是微突起長度的至少2倍。在一個優(yōu)選的實施方案中，微突起的中心之間的距離是微突起長度(110微米)的2倍。也包括更寬的間隔，高達微突起長度的3、4、5和更多倍。另外，如上所述，微突起的構(gòu)型可以是這樣的，即微突起的高度可以大于這些突起會穿透的皮膚深度。截頭圓錐體形的或截頭棱錐體形的微突起的平坦上表面通常寬10-100、優(yōu)選30-70和最優(yōu)選35-50微米。
制備皮膚上的輸送位點的方法，將微磨蝕器置于在所需位置的患者皮膚28上。將微磨蝕器輕壓到皮膚上，然后在皮膚上或沿皮膚移動。微磨蝕器沖程長度可以隨需要的輸送位點大小(由需要的輸送區(qū)域定義)而變。選擇輸送位點的面積，以達到想要的結(jié)果，且可以隨待輸送的物質(zhì)和其形式而變。例如，輸送位點可以覆蓋大區(qū)域以用于治療皮疹或皮膚病。通常，將微磨蝕器移動約2-15厘米(cm)。在本發(fā)明的一些實施方案中，移動微磨蝕器，產(chǎn)生具有約4cm2-約300cm2的表面積的經(jīng)磨蝕的位點。
然后，從皮膚抬起微磨蝕器，暴露經(jīng)磨蝕的區(qū)域，并可以將合適的輸送裝置、貼劑或局部制劑應(yīng)用到經(jīng)磨蝕的區(qū)域?；蛘?，可以在磨蝕之前或同時，將待施用的物質(zhì)施加到皮膚表面。
在角質(zhì)層上的磨蝕程度取決于在移動過程中施加的壓力和微磨蝕器的重復(fù)次數(shù)。在一個實施方案中，在完成第一次移動后，從皮膚上抬起微磨蝕器，并以基本上相同的地方和位置，放回起始位置。然后，微磨蝕器以相同的方向和相同的距離移動第二次。在另一個實施方案中，微磨蝕器以交替的方向，重復(fù)移動經(jīng)過相同的位點，在完成第一次移動后不從皮膚上抬起。通常，使用微磨蝕器移動2次或更多次。
在其它的實施方案中，微磨蝕器可以僅僅以同一方向，以網(wǎng)格樣的圖案、圓形圖案或一些其它的圖案，來回撞擊足以磨蝕角質(zhì)層至能增強所需物質(zhì)的輸送的合適深度的時間。微磨蝕器在皮膚28上的一個方向的線性移動，會去除一些組織，形成槽26，其被基本上與每行微突起相對應(yīng)的在皮膚28中的峰27分開，如圖16所示。微突起的邊緣20、22和鈍頂端18能提供刮削或磨蝕作用，以去除一部分角質(zhì)層，在皮膚中形成槽或凹痕，而不是簡單的切割作用。微突起14的鈍頭18的邊緣20能刮削和去除槽26底部的一些組織，并使它們保持開口，從而允許物質(zhì)進入槽中，以便由身體吸收。優(yōu)選地，微突起14的長度足以穿透角質(zhì)層和形成槽26，槽26的深度足以允許施加到經(jīng)磨蝕的區(qū)域的物質(zhì)的吸收，而不引起患者的疼痛或不必要的不適。優(yōu)選地，槽26不會刺穿角質(zhì)層，但是可以在其中延伸。棱錐體形狀的微突起14的邊緣22形成刮削邊，其從磨蝕表面支持物12延伸到頂端18。鄰近磨蝕表面支持物12的邊緣22形成微突起之間的刮削表面，其能刮削和磨蝕由槽26之間的皮膚形成的峰27。在槽之間形成的峰27通常被輕微地磨蝕。
在本發(fā)明的方法中，可以使用本領(lǐng)域已知的用于通過磨蝕破壞角質(zhì)層的任何裝置。它們包括例如，具有短顯微針或微突起的陣列的微機電(MEMS)裝置、砂紙樣裝置、刮刀等。本發(fā)明的表皮疫苗制劑靶向表皮空間的實際方法不是至關(guān)重要的，只要它能穿透受試者的皮膚達到需要的目標(biāo)深度。在此討論的微磨蝕器最初將本發(fā)明的制劑存放在0.0-0.025mm的皮膚深度，優(yōu)選地不超過角質(zhì)層。
5.4治療功效的測定本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定本發(fā)明的免疫原性組合物的功效的方法。用于確定本發(fā)明的免疫原性組合物的功效的測定法，可以是基于體外的測定法或基于體內(nèi)的測定法，包括基于動物的測定法。在有些實施方案中，本發(fā)明包括檢測和/或定量從已經(jīng)施用了本發(fā)明的免疫原性組合物的受試者得到的樣品(例如，血清或粘膜洗液)中的針對本發(fā)明組合物的抗原性或免疫原性試劑的體液免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的免疫原性組合物的體液免疫反應(yīng)與在施用本發(fā)明的制劑前或在已經(jīng)給個體施用對照制劑(例如，僅僅包含抗原性或免疫原性試劑的制劑)后從相同受試者得到的對照樣品相比較。
本發(fā)明的方法提供了基本原理和準(zhǔn)則，由此可以確定將免疫原性組合物輸送到皮膚隔室(包括表皮和皮內(nèi)隔室)的最佳參數(shù)，其中與使用常規(guī)輸送方式(包括肌肉內(nèi)的和皮下的輸送)來輸送相同制劑時相比，賦形劑具有最佳的佐劑性質(zhì)，且本發(fā)明的制劑具有增強的功效。本發(fā)明提供了方法，其中本發(fā)明的制劑已經(jīng)被篩選成具有用于輸送到皮內(nèi)隔室的最佳深度的最佳濃度范圍，從而它們具有佐劑性質(zhì)，產(chǎn)生一種或多種下述的性質(zhì)最小至沒有皮膚刺激，如通過可視方法例如Draize打分(關(guān)于典型的draize打分分析，見下表)，以常規(guī)的皮膚反應(yīng)分析方式所測定和評價的；最小至沒有溶血作用，如使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定的；和增強的免疫反應(yīng)，如通過增強的血清轉(zhuǎn)化和/或增強的抗體滴度測量的。
表ADraize打分
在有些實施方案中，本發(fā)明包括檢測和/或定量從已經(jīng)施用了本發(fā)明的免疫原性組合物的受試者得到的樣品(例如，血清)中的針對本發(fā)明免疫原性組合物的抗原性或免疫原性試劑的體液免疫反應(yīng)。將本發(fā)明的免疫原性組合物的體液免疫反應(yīng)與從施用了對照制劑(例如，僅僅包含抗原性或免疫原性試劑的制劑)的相同受試者得到的對照樣品相比較。
用于測量體液免疫反應(yīng)的測定法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如，見，Coligan等，(編)，1997，Current Protocols in Immunology，JohnWiley and Sons，Inc.Section 2.1。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括但不限于ELISA測定法，可以檢測和/或定量體液免疫反應(yīng)。通過檢測和/或定量能特異性地識別已經(jīng)用本發(fā)明的免疫原性組合物治療的受試者血清中的抗原性或免疫原性試劑的抗體相對于未治療的受試者中的抗體量的相對量，可以測量體液免疫反應(yīng)。ELISA測定法可以用于測定從用本發(fā)明組合物治療的受試者得到的樣品中的總抗體滴度。在其它實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法，可以使用ELISA測定法來測定對于中和表位的特異的抗體同種型和抗體的水平。
基于ELISA的測定法包括制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，添加含有抗原特異性抗體的測試和對照樣品，添加與酶(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合的對測試和對照樣品中的抗體特異的檢測抗體，并孵育一段時間，用產(chǎn)色底物檢測抗原的存在。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到那些可以修改從而增強檢測到的信號的參數(shù)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其它變量。關(guān)于ELISA的進一步討論，見，例如，Ausubel等，編，1994，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.1，John Wiley & Sons，Inc.，New York，在11.2.1.
在免疫原性組合物包含流感抗原的情況下，用于檢測和/或定量針對流感抗原的抗體反應(yīng)的本領(lǐng)域已知的任何方法，都包含在本發(fā)明的方法中。用于檢測針對流感抗原的抗體反應(yīng)的一個示例性的方法可以包括用流感抗原包被微量滴定板(Nunc平板)；將來自用本發(fā)明的流感疫苗制劑處理的受試者的血清加入平板；將抗血清(含有第二抗體)加入平板，并孵育足夠的時間，以允許形成復(fù)合物，即血清和抗血清中的抗體之間的復(fù)合物。然后，使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測復(fù)合物。關(guān)于用于測量流感特異性抗體反應(yīng)的示例性測定法，見，例如，Newman等，1997，Mechanism of Aging & Development，93189-203；Katz等，2000，Vaccine，182177-87；Todd等，(Brown和Haaheim，編)，1998，Modulation of the Immune Response to Vaccine Antigens，Dev.Biol.Stand.Basel，Karger，92341-51；Kendal等，1982，Concepts and Procedures for Laboratory-based InfluenzaSurveillance，AtlantaCDC，B17-35；Rowe等，1999，J.Clin.Micro.37937-43；Todd等，1997，Vaccine 15564-70；WHO CollaboratingCenters for Reference and Research on Influenza，Coneepts andProcedures for Laboratory-based Influenza Surveillance，1982，p.B-23；它們都在這里整體引作參考。
此外，當(dāng)疫苗制劑包含流感抗原時，本領(lǐng)域已知的用于檢測和/或定量具有血凝活性的抗體的水平的任何方法，都包含在本發(fā)明內(nèi)。血凝抑制測定法基于流感病毒的凝集紅細胞的能力和特異的HA抗體的抑制凝集的能力。本領(lǐng)域已知的任何血凝抑制測定法，都包含在本發(fā)明的方法中，例如公開在這里整體引作參考的Newman等，1997，Mechanism of Aging & Development，93189-203；Kendal等，1982，Concepts and Procedures for Laboratory-based InfluenzaSurveillance，AtlantaCDC，B 17-35中的那些。
一個示例性的血凝抑制測定法包括將來自用本發(fā)明的流感疫苗制劑處理的受試者的血清加入微量滴定板；將含有8個HA單位的HI-抗原制品加入平板；通過輕柔地敲打平板來均勻混合該混合物，并在4℃孵育約1小時；將紅細胞懸浮液(例如，0.5％雞紅細胞)加入微量滴定板，通過輕柔地敲打平板來均勻混合這些內(nèi)容物；在4℃進一步孵育平板，直到細胞對照顯示出正常沉淀的扣狀體(對照僅僅含有PBS)。優(yōu)選地，用抑制劑(例如神經(jīng)氨酸酶或高碘酸鉀)處理血清樣品以防止血清因子對凝集的非特異性抑制。HI滴度定義為，能完全抑制血凝的最高稀釋度的血清的稀釋倍數(shù)。這可以通過傾斜平板并觀察以與對照細胞相同的速度流動的淚珠狀細胞流來確定。
本發(fā)明包括通過測量細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，來測定本發(fā)明的組合物的功效的方法。測量細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，且包含在本發(fā)明中。在有些實施方案中，可以測量T細胞免疫反應(yīng)，以定量受試者中的免疫反應(yīng)，例如，通過使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的普通方法，包括但不限于來自組織培養(yǎng)物上清液的ELISA，離體或在體外培養(yǎng)一段時間后的細胞的基于流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)細胞因子染色，和基于細胞因子小珠陣列流式細胞術(shù)的測定法，來測量細胞因子產(chǎn)生。在其它實施方案中，本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域已知的普通方法，包括但不限于基于鉻的釋放測定法，使用已知的CTL表位的基于流式細胞術(shù)的四聚體或二聚體染色測定法，來測量T細胞特異性的反應(yīng)。
5.5預(yù)防和治療應(yīng)用本發(fā)明提供了治療和預(yù)防方法，其包括將本發(fā)明的免疫原性組合物施用給受試者，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人，以治療、控制或改善與疾病或病癥有關(guān)的癥狀，尤其是傳染性的疾病或癌癥。受試者優(yōu)選地是哺乳動物，例如非靈長類動物，例如，奶牛、豬、馬、貓、狗、大鼠、小鼠，和靈長類動物，例如，猴例如獼猴和人。在一個優(yōu)選的實施方案中，受試者是人。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫原性組合物是疫苗組合物。
本發(fā)明包括免疫和/或刺激受試者中的免疫反應(yīng)的方法，包括給受試者，優(yōu)選人，皮內(nèi)輸送單劑量的本發(fā)明的組合物。在有些實施方案中，本發(fā)明包括一次或多次加強免疫。本發(fā)明的免疫原性組合物能特別有效地刺激和/或上調(diào)抗體反應(yīng)，至大于在常規(guī)的免疫原性組合物(例如疫苗)和給藥方案中觀察到的水平。例如，本發(fā)明的免疫原性組合物可以引起抗體反應(yīng)，包含產(chǎn)生一種或多種抗體類型，例如IgM，IgG，和/或IgA。最優(yōu)選地，包括疫苗制劑在內(nèi)的本發(fā)明的免疫原性組合物能刺激全身免疫反應(yīng)，其能保護受試者免受至少一種病原體的侵害。包括疫苗組合物在內(nèi)的本發(fā)明的免疫原性組合物可以提供全身的、局部的或粘膜的免疫或其組合。
5.5.1目標(biāo)疾病本發(fā)明包括皮內(nèi)疫苗輸送系統(tǒng)，以治療和/或預(yù)防受試者(優(yōu)選人)中的傳染病。本發(fā)明的方法可以治療或預(yù)防的傳染病是由傳染因子造成的，包括但不限于，病毒，細菌，真菌，原生動物，蠕蟲，和寄生物。
已經(jīng)在人類中發(fā)現(xiàn)且可以用本發(fā)明的疫苗輸送系統(tǒng)治療的病毒的實例包括但不限于，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也稱作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分離物，例如HIV-LP)；小RNA病毒科(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒；腸道病毒屬，人柯薩奇病毒，鼻病毒屬，艾柯病毒)；嵌杯狀病毒科(Calciviridae)(例如，會造成胃腸炎的株系)；披膜病毒科(例如，馬腦炎病毒，風(fēng)疹病毒)；黃病毒科(例如，登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如，冠狀病毒屬)；彈狀病毒科(例如，水泡性口炎病毒，狂犬病病毒)；線狀病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；Bungaviridae(例如，漢坦病毒，bunga病毒，白蛉熱病毒屬和內(nèi)羅病毒屬)；沙粒病毒科(例如，出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如，呼腸孤病毒屬，環(huán)狀病毒屬和輪狀病毒屬)；雙RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；小DNA病毒科(小DNA病毒屬)；乳頭多瘤空泡病毒科(乳頭狀瘤病毒屬，多瘤病毒屬)；腺病毒科(大多數(shù)腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)1和2，水痘帶狀皰疹病毒，巨細胞病毒(CMV)，皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如海綿狀腦病的病原因子，δ肝炎的因子(認為是乙型肝炎病毒的缺陷型衛(wèi)星)，非甲型、非乙型肝炎的因子(1類＝內(nèi)部傳遞；2類＝腸胃外傳遞，例如，丙型肝炎；諾沃克病毒和相關(guān)病毒，和星狀病毒。
能在動物和人中產(chǎn)生傳染病且可以用本發(fā)明的輸送系統(tǒng)和方法治療和/或預(yù)防的反轉(zhuǎn)錄病毒包括簡單的反轉(zhuǎn)錄病毒和復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒。簡單的反轉(zhuǎn)錄病毒包括B-型反轉(zhuǎn)錄病毒、C-型反轉(zhuǎn)錄病毒和D-型反轉(zhuǎn)錄病毒的亞群。B-型反轉(zhuǎn)錄病毒的一個實例是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型反轉(zhuǎn)錄病毒包括下列亞群，C-型A群(包括勞斯肉瘤病毒(RSV)，禽類白血病病毒(ALV)，和禽類成髓細胞性白血病病毒(AMV))和C-型B群(包括鼠白血病病毒(MLV)，貓白血病病毒(FeLY)，鼠肉瘤病毒(MSV)，長臂猿白血病病毒(GALV)，脾壞死病毒(SNV)，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))。D-型反轉(zhuǎn)錄病毒包括摩-傅猴病毒(MPMV)和猿猴反轉(zhuǎn)錄病毒1型(SRV-1)。復(fù)雜的反轉(zhuǎn)錄病毒包括慢病毒屬、T-細胞白血病病毒和泡沫病毒的亞群。慢病毒屬包括HIV-1，但是也包括HIV-2，SIV，綿羊髓鞘脫落病毒，貓免疫缺陷病毒(FIV)，和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。T-細胞白血病病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿猴T-細胞白血病病毒(STLV)，和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
是脊椎動物中的抗原的RNA病毒的實例包括但不限于呼腸孤病毒科的成員，包括正呼腸孤病毒屬(哺乳動物和禽類反轉(zhuǎn)錄病毒的多種血清型)，環(huán)狀病毒屬(藍舌病病毒，Eugenangee病毒，克麥羅沃(Kemerovo)病毒，非洲馬瘟病毒，和科羅拉多蜱傳熱病毒)，輪狀病毒屬(人輪狀病毒，內(nèi)布拉斯加小牛腹瀉病毒，鼠輪狀病毒，猿猴輪狀病毒，?；蜓蜉啝畈《?，禽輪狀病毒)；小RNA病毒科，包括腸道病毒屬(脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒A和B，人類腸道致細胞病變孤兒(ECHO)病毒，甲型肝炎病毒，猿猴腸道病毒，鼠腦脊髓炎(ME)病毒，鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒，牛腸道病毒，豬腸道病毒，心病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)，曼哥病毒)，鼻病毒屬(人鼻病毒，包括至少113種亞型；其它鼻病毒)，口蹄疫病毒屬(口蹄疫病毒(FMDV)；嵌杯狀病毒科，包括豬水皰疹病毒，圣米格爾海獅病毒，貓小RNA病毒和諾沃克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒屬(東方馬腦炎病毒，塞姆利基森林病毒，新培斯病毒，基孔貢亞病毒，奧尼永尼永病毒，羅斯河病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，圣路易腦炎病毒，墨累山谷腦炎病毒，西尼羅病毒，庫京(Kunjin)病毒，中歐蜱傳病毒，遠東蜱傳病毒，庫阿撒魯爾森林病毒，跳躍III病毒，玻瓦散病毒，鄂木斯克出血熱病毒)，風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)，瘟病毒屬(粘膜病病毒，豬瘟病毒，邊界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒屬(布尼奧羅病毒和相關(guān)病毒，加利福尼亞腦炎組病毒)，白蛉熱病毒屬(白蛉熱西西里島病毒，立夫特山谷熱病毒)，內(nèi)羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒，內(nèi)羅畢綿羊病病毒)，和烏庫病毒屬(吳孔尼米蜱傳病毒和相關(guān)病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(流感病毒A型，許多人亞型)；豬流感病毒，和禽和馬流感病毒；流感B型(許多人亞型)，和流感C型(可能是分開的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺病毒，致血細胞吸附病毒，副流感病毒2-5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化性全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠的肺病毒)；森林病毒，新培斯病毒，基孔貢亞病毒，奧尼永尼永病毒，羅斯河病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳黃熱病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，圣路易腦炎病毒，墨累山谷腦炎病毒，西尼羅病毒，庫京病毒，中歐蜱傳病毒，遠東蜱傳病毒，庫阿撒魯爾森林病毒，跳躍III病毒，玻瓦散病毒，鄂木斯克出血熱病毒)，風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)，瘟病毒屬(粘膜病病毒，豬瘟病毒，邊界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒屬(布尼奧羅病毒和相關(guān)病毒，加利福尼亞腦炎組病毒)，白蛉熱病毒屬(白蛉熱西西里島病毒，立夫特山谷熱病毒)，內(nèi)羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒，內(nèi)羅畢綿羊病病毒)，和烏庫病毒屬(吳孔尼米蜱傳病毒和相關(guān)病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(流感病毒A型，許多人亞型)；豬流感病毒，和禽和馬流感病毒；流感B型(許多人亞型)，和流感C型(可能是分開的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺病毒，致血細胞吸附病毒，副流感病毒2-5型，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒，亞急性硬化性全腦炎病毒，犬瘟病毒，牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠的肺病毒)；彈狀病毒科，包括水泡病毒屬(VSV)，錢德普病毒，F(xiàn)landers-Hart Park病毒)，狂犬病病毒屬(狂犬病病毒)，魚彈狀病毒，和2種可能的彈狀病毒(馬堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒復(fù)合物，和拉薩病毒；冠狀病毒科，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人腸道冠狀病毒，和貓傳染性腹膜炎(貓冠狀病毒)。
是脊椎動物中的抗原的示例性DNA病毒包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒屬(大天花，類天花，猴痘痘苗，牛痘，水牛痘，兔痘，缺肢畸形)，野兔痘病毒屬(粘液瘤，纖維瘤)，禽痘病毒屬(禽痘，其它禽痘病毒)，山羊痘病毒屬(綿羊痘，山羊痘)，豬痘病毒屬(豬痘)，副痘病毒屬(觸染性postular皮炎病毒，假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲豬瘟病毒，蛙病毒2和3，魚淋巴囊腫病病毒)；皰疹病毒科，包括α-皰疹病毒(單純皰疹1和2型，水痘帶狀皰疹，馬流產(chǎn)病毒，馬皰疹病毒2和3，假狂犬病病毒，傳染性牛角膜結(jié)膜炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒)，β-皰疹病毒(人巨細胞病毒以及豬、猴和嚙齒動物的巨細胞病毒)；γ-皰疹病毒(EB病毒(EBV)，馬立克病病毒，松鼠猴皰疹，珠猴皰疹病毒，豚鼠皰疹病毒，Lucke瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳動物腺病毒屬(人亞群A，B，C，D，E和未分群的；猿猴腺病毒(至少23種血清型)，傳染性犬肝炎，和牛、豬、綿羊、蛙和許多其它物種的腺病毒)，禽腺病毒屬(禽腺病毒)；和不可培養(yǎng)的腺病毒；Papoviridae科，包括乳頭狀瘤病毒屬(人乳頭狀瘤病毒，牛乳頭狀瘤病毒，兔乳頭狀瘤病毒，和其它物種的各種病原性乳頭狀瘤病毒)，多瘤病毒屬(多瘤病毒，猿猴空泡形成因子(SV-40)，兔空泡形成因子(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，和其它靈長類動物多瘤病毒例如淋巴營養(yǎng)性乳頭狀瘤病毒)；小DNA病毒科包括腺伴隨病毒屬，小DNA病毒屬(貓泛白細胞減少癥病毒，牛細小病毒，犬細小病毒，水貂阿留申病病毒，等)。最后，DNA病毒可以包含不能歸入上述科的病毒，例如庫魯病和Creutzfeldt-Jacob病病毒和慢性傳染性神經(jīng)病因子。
可以通過本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的細菌感染或疾病是由細菌造成的，包括但不限于，在它的生命周期中具有細胞內(nèi)階段的細菌，例如分枝桿菌(例如，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis)，牛分枝桿菌(M.bovis)，鳥分枝桿菌(M.avium)，或非洲分枝桿菌(M.africanum))，立克次氏體，支原體，衣原體，和軍團菌。所考慮的細菌感染的其它實例包括但不限于革蘭氏陽性芽孢桿菌(例如李斯忒氏菌屬(Listeria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)例如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)，丹毒絲菌屬(Erysipelothrix))造成的感染，革蘭氏陰性芽孢桿菌(例如，巴爾通氏體屬(Bartonella)，布魯氏菌屬(Brucella)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)，腸桿菌屬(Enterobacter)，埃希氏菌屬(Escherichia)，弗朗西絲氏菌屬(Francisella)，嗜血菌屬(Hemophilus)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，摩根氏菌屬(Morganella)，變形菌屬(Proteus)，普羅威登斯菌屬(Providencia)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，沙門氏菌屬(Salmonella)，沙雷氏菌屬(Serratia)，志賀氏菌屬(Shigella)，弧菌屬(Vibrio)，和耶爾森氏菌屬(Yersinia))，螺旋體細菌(例如，疏螺旋體屬(Borrelia)，包括會造成萊姆病的布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi))，厭氧細菌(例如，放線菌屬(Actinomyces)和梭菌屬(Clostridium))，革蘭氏陽性和陰性的球菌，腸球菌屬(Enterococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，肺炎球菌屬(Pneumococcus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，奈瑟氏球菌屬(Neisseria)。傳染性細菌的具體實例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋體，嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)，結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)，戈登分枝桿菌(M.gordonae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，單核細胞增生李斯忒氏菌(Listeria monocytogenes)，化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(A群鏈球菌)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B群鏈球菌)，綠色鏈球菌(Streptococcus viridans)，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)，炭疽芽孢桿菌，白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringers)，破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多殺巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)，蒼白密螺旋體(Treponemapallidium)，極細密螺旋體(Treponema pertenue)，鉤端螺旋體屬(Leptospira)，立克次氏體屬(Rickettsia)，和衣氏放線菌(Actinomyces israelli)。
可以通過本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的真菌疾病包括但不限于曲霉病(aspergilliosis)，隱球菌病，孢子絲菌病，球孢子菌病，副球孢子菌病，組織胞漿菌病，芽生菌病，接合菌病，和念珠菌病。
可以通過本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的寄生物病包括但不限于阿米巴病(amebiasis)，瘧疾，利什曼原蟲，球蟲類，賈第蟲病，隱孢子蟲病，弓形體病，和錐蟲病。也包括各種蠕蟲引起的感染，例如但不限于蛔蟲病，鉤蟲病，鞭蟲病，類圓線蟲病，弓蛔蟲病(toxoccariasis)，旋毛蟲病，盤尾絲蟲病，絲蟲，和惡絲蟲病。也包括各種吸蟲引起的感染，例如但不限于血吸蟲病，肺吸蟲病，和支睪吸蟲病。基于它們是細胞內(nèi)的還是細胞外的，可以將能造成這些疾病的寄生物分類。如本文所使用的，″細胞內(nèi)的寄生物″是其整個生命周期都在細胞內(nèi)的寄生物。人細胞內(nèi)的寄生物的實例包括利什曼原蟲屬(Leishmania spp.)，瘧原蟲屬(Plasmodiumspp.)，克魯茲錐蟲(Trypanosoma cruzi)，鼠弓漿蟲(Toxoplasmagondii)，巴貝蟲屬(Babesia spp.)，和旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)。如本文所使用的，″細胞外的寄生物″是其整個生命周期都在細胞外的寄生物。能感染人的細胞外的寄生物包括痢疾內(nèi)變形蟲(Entamoeba histolytica)，吸吮賈第蟲(Giardia lamblia)，比氏腸胞蟲(Enterocytozoon bieneusi)，納氏蟲屬(Naegleria)和棘變形蟲屬(Acanthamoeba)以及大多數(shù)蠕蟲。另一類寄生物定義為主要是細胞外的，但是在它們的生命周期的關(guān)鍵階段具有專性的細胞內(nèi)的存在。這樣的寄生物在本文中稱作″專性的細胞內(nèi)的寄生物″。這些寄生物可以在它們生命的大部分或僅僅它們生命的小部分存在于細胞外環(huán)境中，但是它們都在它們的生命周期中具有至少一個專性的細胞內(nèi)的階段。該后一類寄生物包括羅德森錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)和岡比錐蟲(Trypanosoma gambiense)，等孢子蟲屬(Isospora spp.)，隱孢子蟲屬(Cryptosporidium spp.)，艾美蟲屬(Eimeria spp.)，新孢子蟲屬(Neospora spp.)，肉孢子蟲屬(Sarcocystis spp.)，和血吸蟲屬(Schistosoma spp.)。
本發(fā)明也包括用于治療和/或預(yù)防癌癥的疫苗組合物，包括但不限于，新生物，腫瘤，轉(zhuǎn)移，或特征在于失控的細胞生長的任何疾病或病癥。使用本發(fā)明的疫苗組合物，可以治療和/或預(yù)防例如但不限于與上面5.1.2部分列出的癌癥和腫瘤抗原有關(guān)的癌癥和腫瘤。
5.6鑒定賦形劑的篩選方法本發(fā)明還包括鑒定當(dāng)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法。在有些實施方案中，鑒定當(dāng)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法包括這樣的化合物的穩(wěn)定性測量。在一個具體的實施方案中，以不同的比例組合候選化合物或試劑和免疫原性或抗原性試劑，制備免疫原性組合物，并在實時和加速研究中，監(jiān)視得到的組合物相對于單獨的免疫原性或抗原性試劑的不穩(wěn)定跡象。使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的和本文公開的方法，可以評價組合物的穩(wěn)定性。
在其它的實施方案中，鑒定當(dāng)輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法包括將候選化合物輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室。在有些實施方案中，將候選化合物以不同的濃度輸送到皮內(nèi)隔室，并使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，監(jiān)視毒性的任何征候。然后，將在動物預(yù)實驗中無助于免疫原性或抗原性試劑的降解和/或毒性的候選化合物的濃度與免疫原性或抗原性試劑相結(jié)合，并使用本文公開的和示例的方法，評價在受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中的佐劑性質(zhì)。使用在5.4部分公開的任一種基于體液的或基于細胞的測定法，或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何其它方法，可以測定佐劑性質(zhì)。
在其它的實施方案中，為了鑒定這樣的化合物，將免疫原性或抗原性試劑與候選化合物一起施用進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室；測量由施用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)；將沒有候選化合物的相同免疫原性或抗原性試劑施用進第二個受試者(優(yōu)選相同物種)的皮內(nèi)隔室；使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法，測量由第二次施用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)；并對比第一次和第二次施用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。如果第二次施用的免疫反應(yīng)大于第一次施用，則將化合物表征為先導(dǎo)化合物，其中它具有佐劑活性。
使用本領(lǐng)域已知的任意方法或本文公開的方法，可以測定由施用免疫原性或抗原性試劑(有或沒有候選化合物)產(chǎn)生的受試者中的免疫反應(yīng)。用于檢測免疫反應(yīng)的測定法，可以是基于體外的測定法或基于體內(nèi)的測定法，包括基于動物的測定法。本發(fā)明包括使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法和上面5.4部分所述的方法，測量基于體液的和基于細胞的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，以高通量的方式，進行本發(fā)明的篩選測定法。
在一個具體的實施方案中，鑒定能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法包括(a)將免疫原性組合物輸送進第一個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物；(b)測量從第一個受試者的血清得到的樣品中的抗體反應(yīng)；(c)將免疫原性組合物輸送進第二個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含沒有該化合物的免疫原性或抗原性試劑，且其中第一個和第二個受試者是相同的物種；(d)測量從第二個受試者的血清得到的樣品中的抗體反應(yīng)；和(e)確定從第一個受試者得到的反應(yīng)是否大于從第二個受試者得到的反應(yīng)。如果從第一個受試者得到的樣品中的反應(yīng)大于第二個受試者，則將該化合物表征為可以用在本發(fā)明的組合物中的賦形劑。通過本發(fā)明的篩選方法鑒定出的化合物當(dāng)與抗原性或免疫原性試劑共同施用到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室時，可以用于引起針對該抗原性或免疫原性試劑的增強的免疫反應(yīng)。具體地，這些化合物可以用在疫苗組合物中。
在本文所述的測定法中使用的化合物可以是化合物文庫的成員。在一個具體的實施方案中，化合物選自化合物的組合文庫。在具體的實施方案中，化合物選自包含核酸、脂類、糖類的有機聚合物的組合文庫，其中具體的非限制性的實例是雜合分子的肽，例如糖蛋白。本發(fā)明也包括非有機的文庫和方法，象在WO 01/07642(其內(nèi)容在本文中整體引作參考)中公開的那些，可以用于管理大量的候選化合物。在某些實施方案中，集中篩選化合物。一旦鑒定出了陽性庫，則分別測試該庫中的各個化合物。在某些實施方案中，庫大小是至少2，至少5，至少10，至少25，至少50，至少75，至少100，至少150，至少200，至少250，或至少500種化合物。
5.7試劑盒本發(fā)明還包括試劑盒，其包含如本文所述的本發(fā)明的皮內(nèi)施用裝置和免疫原性組合物。在有些實施方案中，本發(fā)明還提供了藥物包或試劑盒，其包含本發(fā)明的免疫原性組合物。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含一個或多個裝有一種或多種本發(fā)明的免疫原性組合物組分(例如抗原性或免疫原性試劑、賦形劑)的容器。在另一個實施方案中，預(yù)填充的容器還包含皮內(nèi)輸送裝置。在另一個具體的實施方案中，試劑盒包含2個容器，一個含有抗原性或免疫原性試劑，另一個含有賦形劑。這樣的容器可以伴有由規(guī)范藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)所規(guī)定的形式的公告，該公告反映了由的生產(chǎn)、使用或銷售的管理機構(gòu)對于人類施用所作出的批準(zhǔn)。
6.實施例下面的非限制性的實施例解釋了本發(fā)明的方面。
6.1施用FLUZONETM引起的免疫反應(yīng)6.1.1FLUZONETM接種物的制備在制備各種制劑之前，檢查所有賦形劑儲液的pH為中性pH，即，7.0-7.4。如果需要，使用稀HCl或NaOH，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性。通過0.2微米Gelman Acrodisc PF注射器過濾器#4187，無菌過濾所有賦形劑儲液。
對于鼠科動物研究，通過添加175μL Aventis FluzoneTMYR 02/03和表1所示的終濃度的賦形劑，來制備接種物。使用Hanks緩沖鹽水溶液(HBSS)，使終體積到700μL。通過向175μL FluzoneTM添加HBSS，達到700μL終體積，來制備對照接種物。使用100μL制備的接種物，接種每只動物。對于非免疫對照，在免疫前從動物預(yù)抽血。當(dāng)每只小鼠接受25μl市售疫苗/接種物體積時，豚鼠接受50μl，大鼠接受10μl和100μl體積的市售疫苗/總接種物體積。
表1.在FLUZONE接種物中使用的賦形劑的一些濃度(免疫原性和組織相容性試驗)
6.1.2施用在制備后1小時內(nèi)，將接種物注射進Balb/c小鼠。從CharlesRiver Laboratories得到用于接種的4-8周齡的小鼠。在即將注射前，使用Conair電動剃須刀，將小鼠干燥剃毛。在接種前約15分鐘，每只小鼠接受腹膜內(nèi)注射氯胺酮/賽拉嗪/乙酰丙嗪混合物，進行鎮(zhèn)靜。下至中的背部用于注射。大鼠是Brown Norway品系，豚鼠是Hartley品系。二者通常為200g和更大。
將每種鼠接種物抽入1mL無膠乳的注射器(BD目錄309628)，其固定有20G針(BD目錄305179)。裝載注射器后，將20G針替換為用于皮內(nèi)(ID)施用的30G針。最初使用ID施用的Mantoux方法，從而拉緊皮膚，斜面朝上，以最淺的可能的角度，將針接近。經(jīng)5-10秒，緩慢地推進注射體積，形成典型的“水泡”，隨后緩慢地移出針。為了防止接種物溢出到周圍組織空間，僅僅使用一個注射位點，且每個位點的注射體積保持在100μL。在后面的研究中，有時增加注射體積。在更大的嚙齒動物研究中，動物接受更大的總接種物體積，以允許更高的市售疫苗百分比，但是，每個位點的注射體積不超過100μL。在后面的鼠科動物研究中，使用更有效的使用1.0mm×34g針的ID輸送，每個位點的最大注射體積是50μl。還使用1.0mm×34g針進行豚鼠和大鼠施用，最大注射位點體積是50μl。對于所有的研究，僅僅進行一次免疫。21天后，進行單次測試抽血。在施用后立即、接種后24小時、和當(dāng)3周后收集血樣時，監(jiān)視動物的局部和全身的毒性征候。在具有1.0-3mm輸送范圍的小鼠、大鼠、豚鼠和豬中，監(jiān)視施用位點毒性。在動物中沒有觀察到局部的或全身的毒性跡象。
6.1.3ELISA測定法通過用流感抗原(純化的/滅活的流感APR834，2mg/mL，獲自Charles River SPAFAS，或者來自Biodesign Inc.的New Caledonia，Panama，或B-Hong Kong裂解物)包被微量滴定板(具有MaxiSorp表面的96-孔Nunc Immuno-Plate)，測量對FluzoneTM的抗體反應(yīng)。包被溶液是在碳酸鹽緩沖液(Sigma Chemical Co.目錄C3041)中的約3.8μg/mL流感蛋白質(zhì)。在37℃，將包被抗原暴露于Nunc平板1小時。拋棄包被溶液，并替換為封閉溶液(含有吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS-TW20)；Sigma Chemical Co.目錄P-3563)和5％w/v脫脂奶粉。在37℃，將封閉溶液暴露于平板表面2小時。隨后，拋棄封閉溶液。
用PBS-TW20洗滌平板表面2次，加入來自對照組的血清?？梢詥蝹€地或集中地測定來自特定組中的所有動物的血清。
將初始抗體在包被且封閉的平板上孵育1小時，此后用PBS-TW20洗滌平板3次。加入抗小鼠辣根過氧化物酶綴合物庫的混合物，其由Sigma A4416，Southern Biotech 1090-05，Southern Biotech 1070-05，Southern Biotech 1080-05和Southern Biotech 1100-05組成。在最終的混合物中，所有綴合物都以1∶15,000稀釋度存在。在37℃，將辣根過氧化物酶第二抗體混合物在平板上孵育1小時。然后，用PBS-TW20洗滌平板3次。
為了顯色，加入Sigma T-8665(一種TMB底物)，在黑暗中顯色30分鐘。通過加入0.5摩爾硫酸，終止顯色，在TECAN SUNRISE平板閱讀儀上，在450nm閱讀平板。
6.1.4結(jié)果如圖1-5，21，23，26，28，31和32所示，與含有單獨的FluzoneTM的接種物或非免疫對照(預(yù)抽血)相比，含有本文列出的任一種賦形劑的接種物能產(chǎn)生更大的免疫反應(yīng)。該結(jié)果清楚地表明，當(dāng)與抗原性或免疫原性試劑一起施用進受試者的皮內(nèi)隔室時，這些賦形劑可以作為佐劑。
6.2施用包含編碼FLU血凝素的序列的質(zhì)粒DNA引起的免疫反應(yīng)6.2.1接種物的制備在制備各種制劑之前，檢查所有賦形劑儲液的pH為中性pH，即，7.0-7.4。如果需要，使用稀HCl或NaOH，調(diào)節(jié)溶液的pH至中性。通過0.2微米Gelman Acrodisc PF注射器過濾器#4187，無菌過濾所有賦形劑儲液。
通過添加350μg包含能編碼flu血凝素的序列的質(zhì)粒DNA(pDNA-HA)和如表2所示的終濃度的賦形劑，來制備接種物。使用HBSS，使終體積到700μL。通過向350μg pDNA-HA添HBSS，達到700μL終體積，來制備對照接種物。使用100μL制備的接種物，接種每只動物。對于非免疫對照，在免疫前從動物取血樣(預(yù)抽血)。僅僅在Balb/c小鼠中，進行pDNA免疫原研究。
表2.在用于DNA免疫原研究的接種物中使用的賦形劑的一些濃度
6.2.2施用在制備后1小時內(nèi)，將接種物注射進Balb/c小鼠。從CharlesRiver Laboratories得到用于接種的4-8周齡的小鼠。在即將注射前，使用Conair電動剃須刀，將小鼠干燥剃毛。在接種前約15分鐘，每只小鼠接受腹膜內(nèi)注射氯胺酮/賽拉嗪/乙酰丙嗪混合物，進行鎮(zhèn)靜。下至中的背部用于注射。
將每種接種物抽入1mL無膠乳的注射器(BD目錄309628)，其固定有20G針(BD目錄305179)。裝載注射器后，將20G針替換為用于皮內(nèi)(ID)施用的30G針。使用ID施用的Mantoux方法，從而拉緊皮膚，斜面朝上，以最淺的可能的角度，將針接近。經(jīng)5-10秒，緩慢地推進注射體積，形成典型的“水皰”，隨后緩慢地移出針。為了防止接種物溢出到周圍組織空間，僅僅使用一個注射位點，注射體積保持在100μL。
分別在第一次(最初)施用后立即、最初接種后24小時、分別在第21天施用和收集的加強和首次測試抽血后24小時，監(jiān)視動物的局部和全身的毒性征候。在加強后3周，第42天，當(dāng)進行第二次和最后一次測試抽血時，再次監(jiān)視動物。在動物中沒有觀察到局部的或全身的毒性跡象。
6.2.3用于DNA免疫原研究的ELISA測定法通過用流感抗原(純化的/滅活的流感APR834，2mg/mL，獲自Charles River SPAFAS)包被微量滴定板(具有MaxiSorp表面的96-孔Nunc Immuno-Plate)，測量對包含pDNA-HA的各種接種物的抗體反應(yīng)。包被溶液是在碳酸鹽緩沖液(Sigma Chemical Co.目錄C3041)中的3.8μg/mL流感蛋白。在37℃，將包被抗原暴露于Nunc平板1小時。拋棄包被溶液，并替換為封閉溶液(PBS-TW20)和5％w/v脫脂奶粉。在37℃，將封閉溶液暴露于平板表面2小時。隨后，拋棄封閉溶液。
用PBS-TW20洗滌平板表面2次，加入來自測試/對照組的血清。合并來自特定組中的所有小鼠的血清。在1∶123和1∶370稀釋度，測定合并的血清。
將初始抗體在包被且封閉的平板上孵育1小時，此后用PBS-TW20洗滌平板3次。加入抗小鼠辣根過氧化物酶綴合物庫的混合物，其由Sigma A4416，Southern Biotech 1090-05，Southern Biotech 1070-05，Southern Biotech 1080-05和Southern Biotech 1100-05組成。在最終的混合物中，所有綴合物都以1∶15,000稀釋度存在。在37℃，將辣根過氧化物酶第二抗體混合物在平板上孵育1小時。然后，用PBS-TW20洗滌平板3次。
為了顯色，加入Sigma T-8665(一種TMB底物)，在黑暗中顯色30分鐘。通過加入0.5摩爾硫酸，終止顯色，在TECAN SUNRISE平板閱讀儀上，在450nm閱讀平板。
6.2.4結(jié)果如圖6-11所示，與含有單獨的pDNA-HA的接種物或非免疫對照(預(yù)抽血)相比，含有本文列出的任一種賦形劑的所有接種物能在動物中引起增強的免疫反應(yīng)。這些結(jié)果清楚地表明，當(dāng)與抗原性或免疫原性試劑一起施用進皮內(nèi)隔室時，這些賦形劑可以作為佐劑。在分析首次測試抽血后，將一些試劑標(biāo)記為具有佐劑活性，且在分析第二次測試抽血后，標(biāo)記其它試劑。
6.3在小鼠中進行的尋找初始范圍的研究使用基本上等同于上面的6.1.1-2部分所述的方法，制備了含有FluzoneTM和各種賦形劑的接種物，并皮內(nèi)地施用進動物中。以能使每種接種物含有不同量的FluzoneTM和賦形劑的方式，制備接種物。使用基本上等同于上面的6.1.3部分所述的方法，測量免疫反應(yīng)。結(jié)果顯示在表3中。
表3.免疫反應(yīng)vs.賦形劑濃度
6.3.1.1在小鼠、大鼠和豚鼠研究中使用的血凝素抑制測定法雞紅細胞的制備雞紅細胞(cRBC，5ml包裝)獲自Charles RiverLaboratories(目錄#S8776)。將cRBC等量地分裝進4個FlaconBlue Max 50ml聚乙烯圓錐形管，在4℃，在1500rpm離心5-7分鐘。從cRBC去除運載緩沖液。以5ml增量，將氯化鈉溶液(0.9％)加入cRBC沉淀中，重新懸浮沉淀。合并來自2批第一次洗滌的重新懸浮的沉淀，用氯化鈉溶液(0.9％)將體積調(diào)節(jié)到45ml。在4℃，在1500rpm離心混合物5-7分鐘，拋棄上清液。再次，以5ml增量，將氯化鈉溶液(0.9％)加入cRBC沉淀中，重新懸浮沉淀。合并來自2批第二次洗滌的重新懸浮的沉淀，用氯化鈉溶液(0.9％)將體積調(diào)節(jié)到45ml。在4℃，在1500rpm離心混合物5-7分鐘，拋棄上清液。通過將最終的沉淀重新懸浮到10倍原始體積中，制備10％cRBC溶液。
流感抗原工作儲液的滴定，以證實HA含量在進行HA抑制測定法之前，必須驗證病毒裂解物工作儲液的HA滴度。工作儲液應(yīng)當(dāng)是8HA/50μl。每天制備新鮮的0.5％cRBC試劑。進行病毒裂解物的預(yù)定稀釋，以產(chǎn)生推測的8HA工作儲液。用氯化鈉溶液(0.9％)，制備稀釋液。
將氯化鈉溶液(0.9％，50μl)分配到Falcon非組織培養(yǎng)物處理的平板的孔中，96-孔，U-底，具有低蒸發(fā)性的蓋子。將推定的8HA/50μl工作儲液(100μl)分配進單行或單列的“起始孔”中。將半體積(50μl)儲液從起始孔轉(zhuǎn)移到第二孔中，形成1∶2稀釋液。使用1∶2稀釋液，重復(fù)該過程，直到完成稀釋度系列。完整的稀釋度組具有含有0.0625HA-8HA的孔。將cRBC試劑(0.5％，50μl)分配進每個含有一定水平的HA的孔中，在室溫，孵育測定物45分鐘，并確保平板不貼在一起。
解釋如果在稀釋液中存在太少的病毒裂解物HA來保證血凝反應(yīng)，cRBC會沉積在孔中。cRBC向孔底部部分地或全部地沉積的任何孔都是陰性的。cRBC徹底懸浮在溶液中的最后孔是病毒裂解物儲液的HA滴度。如果儲液確實是8HA/50μl儲液，那么然后依靠重新滴定，最后的陽性孔含有1HA。
通過HAI測量HA特異性的抗體滴度收集并使用血清作為測試樣品。
每天制備新鮮的cRBC試劑。將氯化鈉溶液(0.9％)加入Falcon非組織培養(yǎng)物處理的平板的孔中，96-孔，U-，具有低蒸發(fā)性的蓋子。將病毒裂解物儲液(8HA/50μl)加入孔中。將將適當(dāng)體積的測試血清加入單行或單列的“起始孔”中，通過將50μl血清稀釋液從起始孔轉(zhuǎn)移到相鄰孔中，形成1∶2稀釋液，來進行系列稀釋。當(dāng)結(jié)束時，孔含有系列血清稀釋液和恒定量的病毒裂解物抗原，是4HA/孔。將cRBC試劑(0.5％，50μl)加入每個孔中，包括不含有HA的陰性對照孔。在室溫，孵育測定物45分鐘，并確保平板不貼在一起。為了檢測，以70度的角度傾斜平板5分鐘，并在點亮的盒上觀察。
用A-New Caledonia(H1N1)，A-Panama(H3N2)和B-Hong Kong抗原作為單一測試抗原和三價庫，進行HAI測定法。
6.4用吐溫鑒定工作濃度和益處(有關(guān)的化合物)這些研究的目的是，確定將包含非離子型表面活性劑去污劑和有關(guān)的化合物的疫苗制劑輸送到皮內(nèi)隔室中的最佳濃度范圍。這些研究表明，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的方法輸送到ID隔室中時，非離子型表面活性劑賦形劑能起佐劑的作用。工作濃度隨針深度而變(1.00mm vs.1.5mmvs.2.0mm vs.3.00mm)。每種表面活性劑具有不同的工作范圍，其中能證實佐劑性質(zhì)，并避免或最小化組織刺激(≤2的Draize得分)。在文獻中對于這樣的試劑而引用的許多濃度范圍可以用于生產(chǎn)目的。當(dāng)輸送到ID隔室中時，這樣的試劑的生產(chǎn)濃度實際上對組織是有毒的和有損害的。在其它情況下，濃度太低而不能具有佐劑樣的作用。在此，吐溫80和其它的表面活性劑顯示出能增加血清轉(zhuǎn)化、平均滴度，并避免不可逆的組織損傷。
6.4.1結(jié)果吐溫80能增加血清轉(zhuǎn)化使用上面已經(jīng)描述的方法，5％吐溫80能導(dǎo)致圖21中的100％血清轉(zhuǎn)化。該研究使用Balb/c小鼠。采用使用PR8測試抗原的ELISA測定法，觀察到血清轉(zhuǎn)化的增加。通過ID途徑，給動物施用Fluzone+吐溫80，并同時作為比較未補充地IM施用Fluzone。ID組優(yōu)于IM組。
吐溫80能增加平均滴度如圖21所示，ID輸送的補充了5％吐溫80的Fluzone能產(chǎn)生1∶1395的平均滴度，而IM輸送的未補充的Fluzone具有1∶605的平均滴度。應(yīng)用t-檢驗，并指定小于0.05的p-值，表明具有顯著變化。ID輸送ID接種物——使用標(biāo)準(zhǔn)注射器和針的Mantoux。討論的所有免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)都是在Balb/c小鼠中產(chǎn)生。
吐溫80皮膚相容性用31號1.5mm長度的微型醫(yī)學(xué)針(micromedica needle)，進行豬皮膚相容性研究。吐溫80在ID空間被較好地耐受(圖22)。在該實驗中，豬接受單獨的5％V/V吐溫80和補充了5％V/V吐溫80的Fluzone。在施用后1小時，所有draize得分都是可接受的(≤2)。
吐溫80能提高ID輸送的性能超過IM與IM輸送的市售三價疫苗相比，與三價疫苗一起ID輸送的吐溫80(0.9％V/V)能產(chǎn)生更高的平均滴度、更高的中間滴度和更高的血清轉(zhuǎn)化(圖23)。雖然0.9％V/V吐溫80在免疫增強方面能相當(dāng)好地表現(xiàn)，但該濃度可能偶而失效。用于產(chǎn)生圖23中的ID數(shù)據(jù)的微型醫(yī)學(xué)針是34g×1mm針。使用鼠科動物模型。
吐溫80工作濃度vs.其它表面活性劑山梨醇和山梨醇衍生物例如吐溫80具有不同的皮膚相容性特性，尤其是在ID空間中。因此，必須分別確定每種試劑的功能范圍。例如，如該研究中所說明的，盡管當(dāng)輸送到1-2mm深度時，10％W/V吐溫80不能良好地被耐受；但是10％W/V山梨醇能良好地被耐受(圖24)。在施用后20-24小時，10％W/V吐溫80具有中等至嚴重的跨越初始水泡的紅斑，10％W/V山梨醇在針穿透位點僅僅造成輕微的紅斑。在Yorkshire豬中進行該研究。
吐溫80工作范圍隨組織深度而變化在該實驗中，吐溫80表現(xiàn)出隨針深度而變的不同的皮膚相容性特性。具體地，在施用后20-24小時的Yorkshire豬數(shù)據(jù)表明，當(dāng)以1.0mm，1.5mm，2.0mm和3.0mm針輸送時，如何耐受2％吐溫80溶液(圖25)。在施用后約20-24小時，3.0mm輸送產(chǎn)生了良好的皮膚結(jié)果，draize得分為0.0。特定濃度的吐溫80的皮膚反應(yīng)隨深度而提高。這些研究表明，隨著注射變淺，可視的刺激水平增加。
吐溫80優(yōu)選的濃度能避免溶血表面活性劑/去污劑可以裂解RBC。從接受6×200μl劑量(含有5.0％吐溫80)的Yorkshire豬收集血液。在全身循環(huán)立即采取的血液中，沒有觀察到溶血。在該研究中，使用31g×1.5mm針。
吐溫80能增強ID輸送的劑量節(jié)約特征，增強血清保護和血清轉(zhuǎn)化。當(dāng)通過顯微針I(yè)D輸送時，賦形劑吐溫80向市售疫苗制劑中的添加，能提供佐劑樣的性能。
使用顯微針(插入3.5″長的導(dǎo)管中的34號針，暴露1.0mm的針長度)，通過ID輸送，免疫雌性Brown Norway(BN)大鼠(n＝10/組)。通過顯微針的ID輸送，由2次手工快速濃注100μl到大鼠下背部的任一側(cè)并持續(xù)約10秒(每次快速濃注)組成，使用連接的1cc注射器。用2種不同劑量的2003/2004季的Fluzone(Ayentis Pasteur，Swiftwater，PA)中的任一種，免疫大鼠，每只大鼠共9μg(高劑量)或0.9μg(低劑量)血凝素(HA)，疫苗中的每個流感株系為3μg或0.3μg HA(A/New Caledonia/20/99 H1N1，A/Panama/2007/99 H3N2，和B/Hong Kong/1434/2002)。
免疫后21天，給大鼠抽血，并使用血凝抑制(HAI)測定法，分析它們的血清的中和抗體滴度，并通過ELISA分析流感特異性抗體滴度。針對Fluzone制劑中的H3N2流感株系，進行這2種測定，以表征免疫反應(yīng)。
表4通過使用顯微針以ID輸送低和高劑量的Fluzone進行免疫后，針對流感A/Panama/2007/99(H3N2)而測定的Brown Norway大鼠中的免疫反應(yīng)。
1HAI滴度≥402HAI滴度≥10當(dāng)通過顯微針進行ID輸送時，賦形劑吐溫80向Fluzone中的添加，能提供佐劑樣的作用。當(dāng)針對H3N2株系進行測定時，與ID輸送單獨的Fluzone達到的結(jié)果相比，5％吐溫80向低或高劑量的ID施用的Fluzone中的添加，能使平均HAI滴度增加5倍，平均ELISA滴度增加高達15倍(表4)。而且，吐溫80的添加，能使ID低劑量組的血清保護率從30％增加到90％，使ID高劑量組從90％增加到100％。同樣地，低劑量ID組的血清轉(zhuǎn)化率從90％升高到100％，高劑量ID組保持在100％不變(表4)。這樣的ID輸送和吐溫80的組合，對于通常不能對流感疫苗強烈地反應(yīng)的人群是特別有益的，例如，老年人、嬰兒和無免疫應(yīng)答的人。
吐溫80能增加對三價測試抗原的血凝素特異性滴度在使用Hartley豚鼠的研究中，ID輸送補充了5.0％V/V吐溫80的Fluzone接種物。經(jīng)補充的皮內(nèi)制劑優(yōu)于ID輸送的Fluzone(單獨的)和IM輸送的Fluzone(單獨的)。通過前面所述的HAI方法，測定血清樣品。三價測試抗原由New Caledonia、Panama和B-Hong Kong抗原組成。三價測試抗原用等部分的HA構(gòu)建。結(jié)果顯示在圖31中。在該研究中，使用34g×1.0mm針。
吐溫80具備優(yōu)選的賦形劑特性。圖35說明了根據(jù)本發(fā)明的為皮內(nèi)組織而選擇的賦形劑。吐溫80具有類似于圖中的″賦形劑-A″的特性，具有大于0.125的斜率。由此，吐溫80的5％v/v溶液在1.0mm深度是處于最大工作濃度，在3mm深度可以成功地使用10％v/v。
脫氧膽酸鹽DOC能增加對三價測試抗原的血凝素特異性滴度在使用Hartley豚鼠的研究中，ID輸送補充了0.1％w/v脫氧膽酸鈉的Fluzone接種物。經(jīng)補充的ID制劑優(yōu)于ID輸送的Fluzone(單獨的)和IM輸送的Fluzone(單獨的)。通過前面所述的HAI方法，測定血清樣品。三價測試抗原由New Caledonia、Panama和B-Hong Kong抗原組成。三價測試抗原用等部分的HA構(gòu)建。結(jié)果顯示在圖32中。在該研究中，使用34g×1.0mm針。
DOC能增強血清轉(zhuǎn)化。當(dāng)將脫氧膽酸鹽(一種病毒分裂劑)輸送到ID空間時，它表現(xiàn)出了免疫增強特征，如圖28所示。在這里，IM輸送三價疫苗(Fluzone)，沒有DOC，在免疫后21天，5只動物中僅有1只發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。但是，同一圖表明，通過ID途徑接受補充了DOC的Fluzone的5只動物中有5只發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。含有0.1％脫氧膽酸鈉的ID制劑給出了最好的中等滴度。該研究在Balb/c小鼠中進行。
DOC工作范圍隨組織深度而變。在Yorkshire豬中，評價了含有三價疫苗和不同濃度的脫氧膽酸鹽的接種物的皮膚相容性。含有0.05和0.1％+/-三價疫苗的接種物在1.5mm深度表現(xiàn)較好(圖29)。在以前的研究(未顯示數(shù)據(jù))中，在1.5mm深度不能耐受0.5％W/V和更高濃度的脫氧膽酸鹽。在這一點上，預(yù)期1.5mm輸送的優(yōu)選范圍是0.07-0.15％W/V，其次最好的范圍是0.01-0.3％w/v。如關(guān)于吐溫所述的，上限濃度可以隨更深的注射而增加。例如，3mm施用可以耐受高達0.6％w/v或更高的脫氧膽酸鹽。
鑒定其它賦形劑的工作濃度和益處。
這些研究的目的是，確定用于輸送包含賦形劑的疫苗制劑的最佳參數(shù)，包括濃度范圍，所述賦形劑傳統(tǒng)地用于生產(chǎn)工藝中，例如穩(wěn)定劑和防腐劑，其實例有明膠和兩性霉素-B，細菌用蛋白胨(培養(yǎng)基的一種組分)和磷酸三丁酯(與分裂劑一起使用的稀釋劑)。有時，殘余量的這些試劑可以帶進最終的疫苗制劑中，且可以具有意外的性質(zhì)。
6.4.2明膠具有佐劑性質(zhì)和良好流動特征的明膠制劑測定優(yōu)選的明膠范圍是0.01-0.225W/V。在室溫，尤其是在冷凍溫度，更高濃度的明膠會形成固體。使用國家處方級的明膠(豬來源)，進行這些觀察。0.225％w/v明膠能容易地穿過34號針，且能在1-3mm組織深度較好地被耐受。
明膠能增強血清轉(zhuǎn)化和中值在0.45W/V使用的明膠能增強目標(biāo)抗原的免疫原性。圖26表明，含有明膠的皮內(nèi)制劑優(yōu)于肌肉內(nèi)的制劑。ID輸送補充了明膠的Fluzone三價制劑，并IM輸送原樣的Fluzone。使用ELISA測定法，測試抗原是PR8。動物模型是Balb/c，針是34g×1mm。
6.4.3兩性霉素-BAmp-B皮膚相容性。在Yorkshire豬研究中，動物能耐受600ng/100ul或1200ng/200ul總劑量。如Draize分數(shù)分析所證實的(圖27)，當(dāng)單獨地和作為與Fluzone疫苗的混合物進行評價時，能較好地耐受Amp-B。在1.5mm深度進行分析。
6.4.4細菌用蛋白胨蛋白胨能減少可視的刺激。另一個意外的結(jié)果是能平息由疫苗自身和稀釋劑造成的刺激的賦形劑。已經(jīng)證實，細菌用蛋白胨賦形劑能遮蔽在施用位點經(jīng)常看到的刺激。如圖30所示，單獨的Hanks緩沖鹽水(稀釋劑)有時會造成輕微刺激。當(dāng)加入細菌用蛋白胨賦形劑時，其具有平息作用，能減少draize得分。當(dāng)在1.5％w/v使用細菌用蛋白胨時，該積極屬性特別明顯。在Yorkshire豬中進行實驗，組織深度是1.5mm。
6.5各種賦形劑的DRAIZE打分使用上面5.4部分所述的方法，確定各種賦形劑的紅斑Draize得分。在一個研究中，使用34號1.0mm針，給Hartley豚鼠施用吐溫80(5％)、脫氧膽酸鹽(0.1％)、D-山梨醇(5％)或Lutrol(15％)(每次注射50μl)，沒有抗原。如圖33所示，在指定的濃度，在豚鼠中相當(dāng)好地耐受了所有賦形劑，除了DOC以外，它產(chǎn)生了剛好超過可接受的draize得分的皮膚反應(yīng)。為了在該濃度可靠地使用脫氧膽酸鹽，必需更深地施用。從左向右依次是，施用后立即讀數(shù)、1-小時讀數(shù)和24-小時讀數(shù)。
在另一個研究中，使用31號1.5mm針，給Yorkshire豬施用吐溫80(5％)、脫氧膽酸鹽(0.1％)、D-山梨醇(5％)或Lutrol(15％)(每次注射200μl)，沒有抗原。如圖34所示，在指定的濃度，在豬中也相當(dāng)好地耐受了所有賦形劑，除了DOC以外，它產(chǎn)生了剛好超過可接受的draize分數(shù)的皮膚反應(yīng)。為了在該濃度可靠地使用脫氧膽酸鹽，必需更深地施用。1-小時讀數(shù)(左)和24-小時讀數(shù)(右)。
盡管已經(jīng)參考具體的實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員能明白，可以進行各種變化和改進，而不背離所附權(quán)利要求書闡明的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.引起免疫原性組合物在受試者中的增強的免疫反應(yīng)的方法，包括將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和預(yù)選的賦形劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中免疫原性組合物是疫苗。
3.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是吸收劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中吸收劑是明膠。
5.權(quán)利要求4的方法，其中明膠的濃度以重量/體積組合物計是約0.01-約2％。
6.權(quán)利要求5的方法，其中明膠的濃度是以重量/體積組合物計約0.03-約0.6％。
7.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是抗氧化劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中抗氧化劑是亞硫酸氫鈉。
9.權(quán)利要求8的方法，其中亞硫酸氫鈉的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約8％。
10.權(quán)利要求9的方法，其中亞硫酸氫鈉的濃度以重量/體積組合物計是約0.3-約3％。
11.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是潤濕劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中潤濕劑是山梨醇。
13.權(quán)利要求12的方法，其中山梨醇的濃度以重量/體積組合物計是約1-約100％。
14.權(quán)利要求13的方法，其中山梨醇的濃度以重量/體積組合物計是約2.5-約70％。
15.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是抗真菌劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中抗真菌劑是兩性霉素B。
17.權(quán)利要求16的方法，其中兩性霉素B的濃度是約0.5-約600ng/mL。
18.權(quán)利要求17的方法，其中兩性霉素B的濃度是約30-約100ng/mL。
19.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是溶劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中溶劑是乙醇。
21.權(quán)利要求20的方法，其中乙醇的濃度以體積/體積組合物計是約0.01-約2％。
22.權(quán)利要求21的方法，其中乙醇的濃度以體積/體積組合物計是約0.05-約0.45％。
23.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是表面活性劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中表面活性劑是Lutrol F 127，TritonN-101，Triton X-100，吐溫20或吐溫80。
25.權(quán)利要求24的方法，其中Triton N-101的濃度以重量/體積組合物計是約0.05-約5％。
26.權(quán)利要求24的方法，其中Triton N-101的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.5％。
27.權(quán)利要求24的方法，其中Triton X-100的濃度以重量/體積組合物計是約0.00003-約0.0027％。
28.權(quán)利要求24的方法，其中Triton X-100的濃度以重量/體積組合物計是約0.0001-約0.0009％。
29.權(quán)利要求24的方法，其中吐溫80的濃度以重量/體積組合物計是約0.03-約5％。
30.權(quán)利要求24的方法，其中吐溫80的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約10.0％。
31.權(quán)利要求24的方法，其中吐溫20的濃度以重量/體積組合物計是約0.003-約0.03％。
32.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是懸浮劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中懸浮劑是明膠或甲基纖維素。
34.權(quán)利要求33的方法，其中甲基纖維素的濃度以重量/體積組合物計是約0.02-約0.5％。
35.權(quán)利要求33的方法，其中甲基纖維素的濃度以重量/體積組合物計是約0.06-約0.18％。
36.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是生長培養(yǎng)基的成分。
37.權(quán)利要求36的方法，其中生長培養(yǎng)基的成分是細菌用蛋白胨。
38.權(quán)利要求37的方法，其中細菌用蛋白胨的濃度以重量/體積組合物計是約0.03-約3％。
39.權(quán)利要求37的方法，其中細菌用蛋白胨的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.5％。
40.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是抗微生物劑。
41.權(quán)利要求40的方法，其中抗微生物劑是氨普立糖或磷酸三正丁酯。
42.權(quán)利要求41的方法，其中氨普立糖的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約0.9％。
43.權(quán)利要求41的方法，其中磷酸三正丁酯的濃度以重量/體積組合物計是約0.04-約0.325％。
44.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羥基乙酸，甘露糖或尿素。
45.權(quán)利要求44的方法，其中尿素的濃度以重量/體積組合物計是約0.02-約40％。
46.權(quán)利要求44的方法，其中尿素的濃度以重量/體積組合物計是約0.2-約20％。
47.權(quán)利要求44的方法，其中脫鐵運鐵蛋白的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物，更優(yōu)選地脫鐵運鐵蛋白的濃度是約60μg/mL-600μg/mL。
48.權(quán)利要求44的方法，其中抑蛋白酶肽的濃度是約1μg/mL-約180μg/mL組合物，更優(yōu)選地抑蛋白酶肽的濃度是約5μg/mL-約60μg/mL。
49.權(quán)利要求44的方法，其中胎球蛋白的濃度是約0.05μg/mL-約7.5μg/mL組合物，更優(yōu)選地胎球蛋白的濃度是約0.2μg/mL-約2.4μg/mL。
50.權(quán)利要求44的方法，其中甘露糖的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物、更優(yōu)選地甘露糖的濃度是約60μg/mL-約600μg/mL。
51.權(quán)利要求44的方法，其中羥基乙酸的濃度以重量/體積組合物計是約0.05-約3％，更優(yōu)選地羥基乙酸的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.0％。
52.權(quán)利要求1的方法，其中在施用前，將免疫原性或抗原性試劑與賦形劑相混合。
53.權(quán)利要求1的方法，其中在施用過程中，將免疫原性或抗原性試劑與賦形劑在輸送裝置中相混合。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其中在混合前，免疫原性或抗原性試劑和賦形劑都是液體。
55.權(quán)利要求52或53的方法，其中在混合前，免疫原性試劑或賦形劑是粉末形式。
56.權(quán)利要求1的方法，其中免疫原性組合物包含兩種或更多種賦形劑。
57.鑒定能增強免疫原性或抗原性試劑的免疫原性的化合物的方法，所述方法包括a.將免疫原性組合物輸送進第一個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物；b.測量從第一個受試者的血清或組織或組織洗液得到的樣品中的抗體反應(yīng)；c.將免疫原性組合物輸送進第二個受試者的皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含沒有該化合物的免疫原性或抗原性試劑，且其中第一個和第二個受試者是相同的物種；d.測量從第二個受試者的血清得到的樣品中的抗體反應(yīng)；和e.確定從第一個受試者得到的反應(yīng)是否大于從第二個受試者得到的反應(yīng)，其中如果在第一個受試者中的反應(yīng)測量值大于在第二個受試者中測得的反應(yīng)，則該化合物是皮內(nèi)隔室中的佐劑。
58.引起免疫原性組合物在受試者中的增強的免疫反應(yīng)的方法，包括將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室，其中免疫原性組合物包含免疫原性試劑和通過權(quán)利要求57的方法鑒定出的化合物。
59.權(quán)利要求57的方法，其中所述化合物是氨普立糖，兩性霉素B，脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，細菌用蛋白胨，乙醇，胎球蛋白，明膠，羥基乙酸，Lutrol F 127，甘露糖，甲基纖維素，亞硫酸氫鈉，山梨醇，磷酸三正丁酯，Triton N-101，Triton X-100，吐溫20，吐溫80或尿素。
60.權(quán)利要求59的方法，其中免疫原性組合物是疫苗。
61.權(quán)利要求59的方法，其中組合使用兩種或更多種化合物。
62.權(quán)利要求1-56中的任一項的方法，其中受試者是人。
63.鑒定能增強對于抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)的化合物的方法，所述方法包括a.將免疫原性組合物輸送進受試者皮膚的皮內(nèi)隔室；和b.測量免疫反應(yīng)的水平；其中免疫原性組合物包含免疫原性或抗原性試劑和該化合物；且其中抗體反應(yīng)針對所述抗原性或免疫原性試劑。
60.權(quán)利要求63的方法，其中步驟(b)包括，將在步驟(b)中測得的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平相比較，其中測得的水平相對于標(biāo)準(zhǔn)水平有所升高表明該化合物是佐劑。
61.權(quán)利要求63的方法，其中在步驟(b)中測得的水平包含測量體液免疫反應(yīng)。
62.權(quán)利要求63的方法，其中在步驟(b)中測得的水平包含測量細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
63.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是吐溫80，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，吐溫80的濃度是約1.1-2.0％v/v。
64.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是吐溫80，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，吐溫80的濃度是約1.1-5.0％v/v。
65.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是山梨醇，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，山梨醇的濃度是約2-10％w/v。
66.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是山梨醇，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，山梨醇的濃度是約2-20％w/v。
67.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是膽汁鹽。
68.權(quán)利要求1的方法，其中膽汁鹽賦形劑是脫氧膽酸鹽，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更小的深度時，脫氧膽酸鹽的濃度是約0.07％-0.15％w/v。
69.權(quán)利要求1的方法，其中賦形劑是脫氧膽酸鹽，且其中當(dāng)將制劑輸送到皮膚的皮內(nèi)隔室中2mm或更大的深度時，脫氧膽酸鹽的濃度是約0.07％-0.15％w/v。
70.用于施用到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的包含賦形劑的組合物，從而當(dāng)施用到皮內(nèi)隔室時，組合物會表現(xiàn)出佐劑活性和等于或小于2的draize得分。
71.用于施用到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的包含賦形劑的組合物，其中組合物的活性可以表征為，當(dāng)以具有佐劑活性和小于或等于2的Draize得分的濃度施用組合物時，等于或大于0.125的斜率值，其中斜率值源自在受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中的第一和第二組織深度處的第一和第二賦形劑濃度，其中第一和第二組織深度相隔至少2mm。
72.用于施用到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室的組合物，其包含免疫原性或抗原性試劑和預(yù)選的賦形劑。
73.權(quán)利要求72的組合物，其中免疫原性組合物是疫苗。
74.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是吸收劑。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中吸收劑是明膠。
76.權(quán)利要求75的組合物，其中明膠的濃度以重量/體積組合物計是約0.01-約2％。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中明膠的濃度以重量/體積組合物計是約0.03-約0.6％。
78.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是抗氧化劑。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中抗氧化劑是亞硫酸氫鈉。
80.權(quán)利要求79的組合物，其中亞硫酸氫鈉的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約8％。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中亞硫酸氫鈉的濃度以重量/體積組合物計是約0.3-約3％。
82.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是潤濕劑。
83.權(quán)利要求82的組合物，其中潤濕劑是山梨醇。
84.權(quán)利要求83的組合物，其中山梨醇的濃度以重量/體積組合物計是約1-約100％。
85.權(quán)利要求84的組合物，其中山梨醇的濃度以重量/體積組合物計是約2.5-約70％。
86.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是抗真菌劑。
87.權(quán)利要求86的組合物，其中抗真菌劑是兩性霉素B。
88.權(quán)利要求87的組合物，其中兩性霉素B的濃度是約0.5-約600ng/mL。
89.權(quán)利要求88的組合物，其中兩性霉素B的濃度是約30-約100ng/mL。
90.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是溶劑。
91.權(quán)利要求90的組合物，其中溶劑是乙醇。
92.權(quán)利要求91的組合物，其中乙醇的濃度以體積/體積組合物計是約0.01-約2％。
93.權(quán)利要求92的組合物，其中乙醇的濃度以體積/體積組合物計是約0.05-約0.45％。
94.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是表面活性劑。
95.權(quán)利要求94的組合物，其中表面活性劑是Lutrol F 127，Triton N-101，Triton X-100，吐溫20或吐溫80。
96.權(quán)利要求95的組合物，其中Triton N-101的濃度以重量/體積組合物計是約0.05-約5％。
97.權(quán)利要求95的組合物，其中Triton N-101的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.5％。
98.權(quán)利要求95的組合物，其中Triton X-100的濃度以重量/體積組合物計是約0.00003-約0.0027％。
99.權(quán)利要求95的組合物，其中Triton X-100的濃度以重量/體積組合物計是約0.0001-約0.0009％。
100.權(quán)利要求95的組合物，其中吐溫80的濃度以重量/體積組合物計是約0.03-約5％。
101.權(quán)利要求95的組合物，其中吐溫80的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約10％。
102.權(quán)利要求95的組合物，其中吐溫20的濃度以重量/體積組合物計是約0.003-約0.03％。
103.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是懸浮劑。
104.權(quán)利要求103的組合物，其中懸浮劑是明膠或甲基纖維素。
105.權(quán)利要求104的組合物，其中甲基纖維素的濃度以重量/體積組合物計是約0.02-約0.5％。
106.權(quán)利要求104的組合物，其中甲基纖維素的濃度以重量/體積組合物計是約0.06-約0.18％。
107.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是生長培養(yǎng)基的成分。
108.權(quán)利要求107的組合物，其中生長培養(yǎng)基的成分是細菌用蛋白胨。
109.權(quán)利要求108的組合物，其中細菌用蛋白胨的濃度以重量/體積組合物計是約0.03-約3％。
110.權(quán)利要求108的組合物，其中細菌用蛋白胨的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.5％。
111.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是抗微生物劑。
112.權(quán)利要求111的組合物，其中抗微生物劑是氨普立糖或磷酸三正丁酯。
113.權(quán)利要求112的組合物，其中氨普立糖的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約0.9％。
114.權(quán)利要求112的組合物，其中磷酸三正丁酯的濃度以重量/體積組合物計是約0.04-約0.325％。
115.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是脫鐵運鐵蛋白，抑蛋白酶肽，胎球蛋白，羥基乙酸，甘露糖或尿素。
116.權(quán)利要求115的組合物，其中尿素的濃度以重量/體積組合物計是約0.02-約40％。
117.權(quán)利要求115的組合物，其中尿素的濃度以重量/體積組合物計是約0.2-約20％。
118.權(quán)利要求115的組合物，其中脫鐵運鐵蛋白的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物，更優(yōu)選地脫鐵運鐵蛋白的濃度是約60μg/mL-600μg/mL。
119.權(quán)利要求115的組合物，其中抑蛋白酶肽的濃度是約1μg/mL-約180μg/mL組合物，更優(yōu)選地抑蛋白酶肽的濃度是約5μg/mL-約60μg/mL。
120.權(quán)利要求115的組合物，其中胎球蛋白的濃度是約0.05μg/mL-約7.5μg/mL組合物，更優(yōu)選地胎球蛋白的濃度是約0.2μg/mL-約2.4μg/mL。
121.權(quán)利要求115的組合物，其中甘露糖的濃度是約20μg/mL-約1,800μg/mL組合物，更優(yōu)選地甘露糖的濃度是約60μg/mL-約600μg/mL。
122.權(quán)利要求115的組合物，其中羥基乙酸的濃度以重量/體積組合物計是約0.05-約3％，更優(yōu)選地羥基乙酸的濃度以重量/體積組合物計是約0.1-約1.0％。
123.權(quán)利要求72的組合物，其中賦形劑是膽汁鹽。
124.權(quán)利要求72的組合物，其中膽汁鹽賦形劑是脫氧膽酸鹽。
125.權(quán)利要求72的組合物，其中脫氧膽酸鹽的濃度以重量/體積組合物計是0.07-約0.15％。
126.權(quán)利要求72的組合物，其中脫氧膽酸鹽的濃度以重量/體積組合物計是0.07-約0.60％。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫原性組合物，其用于皮內(nèi)輸送與一種或多種賦形劑相組合的抗原性或免疫原性試劑。本發(fā)明的免疫原性組合物包含抗原性或免疫原性試劑和至少一種賦形劑，一旦輸送到受試者皮膚的皮內(nèi)隔室中，該賦形劑能起佐劑作用，即增強對抗原性或免疫原性試劑的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的免疫原性組合物包含賦形劑，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明施用給皮膚的皮內(nèi)隔室時，其能表現(xiàn)出佐劑活性。本發(fā)明的免疫原性組合物具有增強的功效，因為組合物的賦形劑會造成無癥狀的皮膚刺激，并將抗原呈遞細胞召集到皮內(nèi)隔室中，從而增強抗原性或免疫原性試劑向抗原呈遞細胞的呈遞和/或可用性。使用比常規(guī)使用更低劑量的抗原性或免疫原性試劑，且不需要加強免疫，在單次皮內(nèi)給藥后，本發(fā)明的免疫原性組合物的增強的功效可以導(dǎo)致治療上有效的免疫反應(yīng)。
文檔編號G01N33/53GK1905896SQ200480040762
公開日2007年1月31日 申請日期2004年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者R·卡姆貝爾, K·G·多蘭, J·阿拉肯, W·D·伍德雷, J·米克斯塔 申請人:貝克頓·迪金森公司