專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)測(cè)定半乳糖苷凝集素－3或者血小板反應(yīng)蛋白－2的水平鑒定具有發(fā)生心力衰竭風(fēng)險(xiǎn) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風(fēng)險(xiǎn)(如充血性心力衰竭)的受試者的方法。
充血性心力衰竭(HF)是一種常見(jiàn)但是嚴(yán)重和復(fù)雜的臨床綜合征，特別是在老年人中，特征為心臟收縮功能減退，運(yùn)動(dòng)承受力減弱，導(dǎo)致患者病情逐漸惡化，經(jīng)常產(chǎn)生心血管死亡。因此，大量患者在確診后的1到5年內(nèi)死亡。但是，盡管相當(dāng)多的患者逐漸出現(xiàn)危及生命的并發(fā)癥，其他患者可能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。
具有發(fā)生高血壓性終末器官損害例如心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的患者的早期鑒定可能防止病情迅速發(fā)展，因此最好在心力衰竭確實(shí)出現(xiàn)之前鑒定有可能出現(xiàn)心力衰竭的患者。此外，優(yōu)選地是能夠鑒定具有發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的患有心力衰竭的患者。
目前的方法可以可靠地排除心力衰竭但是不能可靠地證明心力衰竭的存在，也不能預(yù)測(cè)已經(jīng)存在的心力衰竭的結(jié)果，或者需要昂貴的儀器和經(jīng)過(guò)特殊訓(xùn)練的人員才能進(jìn)行預(yù)測(cè)。
因此需要簡(jiǎn)單可靠的方法，預(yù)測(cè)心力衰竭發(fā)生的可能性以及已經(jīng)出現(xiàn)的心力衰竭的結(jié)果。
本發(fā)明的目的是提供一種方法，通過(guò)這種方法可以鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害(例如心力衰竭)特別風(fēng)險(xiǎn)的患者，或者鑒定具有發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥特別風(fēng)險(xiǎn)的患者。在鑒定之后，例如可以在心力衰竭或者其并發(fā)癥出現(xiàn)之前對(duì)這些患者進(jìn)行治療，這具有巨大的臨床重要性。
這通過(guò)本發(fā)明，通過(guò)提供一種方法實(shí)現(xiàn)，該方法用于鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風(fēng)險(xiǎn)的受試者，包括以下的步驟(a)獲得所述受試者的生物樣品；(b)確定所述樣品中至少一種非肌細(xì)胞標(biāo)記的水平；(c)將所述標(biāo)記的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；以及(d)確定標(biāo)記的水平是否預(yù)示發(fā)生高血壓性終末器官損害的風(fēng)險(xiǎn)。
在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中確定了特異的標(biāo)記，這些標(biāo)記可以用于預(yù)測(cè)哪些肥厚的心臟有衰竭的傾向。
已知高血壓導(dǎo)致心臟肥厚，這是心力衰竭的最重要的風(fēng)險(xiǎn)因子之一。但是，不是所有的肥厚心臟最終都會(huì)衰竭。這些觀察結(jié)果提示除了導(dǎo)致肥厚的機(jī)制以外，在代償性心臟肥厚到衰竭的發(fā)展過(guò)程中還有其他機(jī)制在起作用。盡管最近的研究報(bào)導(dǎo)了導(dǎo)致心臟肥厚的許多分子和細(xì)胞的改變(Lorell BH等，Circulation 102470-479，2000；Panidis等，J Am Coll Cardiol.31309-1320，1984)，至今仍然不清楚導(dǎo)致心力衰竭的其他因素。
Boluyt及其同事已經(jīng)舉例證明了在具有心力衰竭的自發(fā)性高血壓大鼠中編碼胞外基質(zhì)組分的基因上調(diào)(Boluyt等，Cardiovasc Res.46239-249，2000；Hypertension 301362-1368，1997；Cardiovasc Res.30836-840，1995；Eur Heart J.16 suppl.N19-30，1995).但是并不清楚這些基因的過(guò)量表達(dá)先于心力衰竭顯著的臨床綜合征出現(xiàn)，還是只是已經(jīng)出現(xiàn)的活性衰竭過(guò)程的結(jié)果。
還使用了一些其他無(wú)偏方法確定心力衰竭的特異機(jī)制(Korstin S等，Circ Res.92715-724，2003；Hein S等，Circulation 107984-991，2003)。此外，最近的研究已經(jīng)顯示在衰竭的心臟中免疫機(jī)制被特異地激活(Vasan RS等，Circulation 1071486-1491，2003)。
但是這些以前的研究經(jīng)常將末期以及經(jīng)藥物治療的心肌與正常的心肌比較。因此得到的差異可能是衰竭及其治療引起的，因此這些研究沒(méi)有鑒定可能導(dǎo)致代償性肥厚心臟衰竭的因素，這些因素可用作鑒定具有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的患者的標(biāo)記。
在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中，將來(lái)自正在衰竭的肥厚心臟的大量基因的基因表達(dá)譜與仍然保持代償?shù)姆屎裥呐K(的基因)進(jìn)行比較。這樣鑒定了在正在衰竭的與代償性肥厚的心臟中差異表達(dá)的基因。特別地，本發(fā)明基于下列發(fā)現(xiàn)，即特殊的非肌細(xì)胞基因在患病的心臟組織中有異常表達(dá)(實(shí)施例1和2)。
根據(jù)本發(fā)明，使用非肌細(xì)胞(non-myocytical)標(biāo)記。即標(biāo)記來(lái)自非心肌細(xì)胞的細(xì)胞。這具有下列優(yōu)勢(shì)，即本發(fā)明的方法“探測(cè)”的是已知在應(yīng)激肌細(xì)胞中出現(xiàn)的肌細(xì)胞變化(myoctic change)以外的其他過(guò)程。這使得不僅僅有機(jī)會(huì)確診心臟衰竭，而且還可以連續(xù)監(jiān)測(cè)已知患有心臟衰竭的病人，即監(jiān)測(cè)是否出現(xiàn)有可能預(yù)示重大有害事件的不利的非肌細(xì)胞過(guò)程(例如炎癥、瘢痕化等等)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，自個(gè)體患者采取生物學(xué)樣品。接下來(lái)，通過(guò)眾所周知的技術(shù)測(cè)量在所述的樣品中一個(gè)或者多個(gè)標(biāo)記的水平。通常，將這一水平與標(biāo)準(zhǔn)的水平進(jìn)行比較，以確定標(biāo)記的水平是否是該個(gè)體可能出現(xiàn)心力衰竭的預(yù)示。標(biāo)準(zhǔn)水平基于所述標(biāo)記在健康受試者中的水平。如果標(biāo)記的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平相比升高，則受試者具有發(fā)生CHF或者發(fā)生心力衰竭并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。
生物樣品可以是體液例如血液、血漿、血清、尿等等或者組織樣品例如心臟活檢的任何樣品。但是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，生物學(xué)樣品是來(lái)自外周血的血漿樣品。外周血樣品可以很容易地取自患者，不需要復(fù)雜的侵入性步驟如導(dǎo)管插入?？梢愿鶕?jù)眾所周知的技術(shù)對(duì)生物學(xué)樣品進(jìn)行加工，制備用于檢測(cè)的樣品。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，標(biāo)記是一種蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單可靠的方法例如使用針對(duì)蛋白特異的抗體的免疫方法，容易地測(cè)定該蛋白質(zhì)的水平。
優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是半乳糖苷凝集素-3(galectin-3)，因?yàn)橐呀?jīng)證明在有衰竭傾向的心臟中半乳糖苷凝集素-3的水平有早期和特異的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，蛋白質(zhì)是血小板反應(yīng)蛋白-2。已經(jīng)證明TSP2提高的心臟表達(dá)鑒定了那些有向明顯心力衰竭發(fā)展傾向的肥厚的心臟。
可以通過(guò)任何眾所周知的適宜的方法測(cè)定標(biāo)記的水平。優(yōu)選地，標(biāo)記的水平通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)測(cè)定，這樣提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、可重復(fù)的可靠方法。
本發(fā)明還涉及使用一個(gè)或者多個(gè)非肌細(xì)胞標(biāo)記，鑒定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害例如充血性心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試者。根據(jù)本發(fā)明可以使用幾種非肌細(xì)胞標(biāo)記。優(yōu)選地，標(biāo)記是半乳糖苷凝集素-3和/或血小板反應(yīng)蛋白-2。
根據(jù)本發(fā)明確定的標(biāo)記還可以用于高血壓性終末器官損害的預(yù)防和/或治療，特別是用于充血性心力衰竭的預(yù)防和/或治療。例如，通過(guò)例如抗體抑制半乳糖苷凝集素-3，和/或通過(guò)適宜的調(diào)節(jié)劑激活TSP-2，可能有利于阻止心力衰竭的發(fā)生。因此本發(fā)明還涉及半乳糖苷凝集素-3和/或其調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，用于預(yù)防和/或治療高血壓性終末器官損害。本發(fā)明還涉及血小板反應(yīng)蛋白-2和/或其調(diào)節(jié)劑在制備藥物中的用途，用于預(yù)防和/或治療高血壓性終末器官損害。
本發(fā)明通過(guò)以下的實(shí)施例和附圖進(jìn)行進(jìn)一步闡釋。


圖1是流程圖，顯示實(shí)施以前報(bào)導(dǎo)的統(tǒng)計(jì)方法的步驟以及用于數(shù)據(jù)采集的綜合截止點(diǎn)(cutoff point)。多步驟的數(shù)據(jù)篩選將在心力衰竭易感大鼠中有差異表達(dá)的基因的數(shù)目縮減到49個(gè)。HF-S，心力衰竭易感大鼠；EST′s，延伸序列標(biāo)簽。
圖2顯示了實(shí)時(shí)PCR定量mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)的結(jié)果，mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來(lái)自10周大的大鼠心肌活檢物中四個(gè)選擇的基因，(a)那些以后出現(xiàn)迅速心臟失代償?shù)拇笫笈c那些在17周的研究時(shí)間段中仍然保持代償?shù)拇笫笙啾?，TSP2出現(xiàn)顯著過(guò)量表達(dá)，(b)骨活化素(Osteoactivin)的表達(dá)，(c)膠原蛋白VI的表達(dá)，(d)腦鈉肽的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)相對(duì)于持家基因親環(huán)素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。Comp，代償?shù)?；Decom，失代償?shù)?*，p＜0.01代償組對(duì)失代償組；#p＜0.05SD對(duì)Ren-2大鼠；每組n＝4。
圖3顯示在誘導(dǎo)心肌梗死之后小鼠的存活百分比。所有的TSP2缺失(TSP2-null)小鼠(虛線(xiàn))在手術(shù)后72小時(shí)內(nèi)死亡(n＝16)。除去手術(shù)以后的立即死亡，在野生型小鼠(實(shí)線(xiàn))中沒(méi)有觀察到死亡(n＝22)。
圖4是柱狀圖，其顯示了心肌梗死(MI)之后0天和48小時(shí)心肌膠原含量的光密度分析結(jié)果(每個(gè)切片10個(gè)隨機(jī)視野)。與野生型小鼠相比，在MI48小時(shí)之后TSP2-缺失小鼠不能進(jìn)行活性的纖維化。*，p＜0.01，野生型對(duì)缺失品系，MI48小時(shí)之后；#p＜0.01，野生型小鼠MI后第0天對(duì)48小時(shí)。
圖5顯示了梗死的左心室壁的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡照片。蘇木素/伊紅染色的切片顯示在血管周?chē)耐暾|(zhì)，在野生型小鼠中沒(méi)有間隙出血的跡象(a)。在TSP-/-小鼠中出現(xiàn)廣泛的組織損傷和間隙出血(b)。梗死的左心室壁電子顯微鏡照片(野生型品系)(c)。注意相對(duì)保持較好的血管和基質(zhì)結(jié)構(gòu)。TSP2缺失的小鼠的切片顯示了心肌基質(zhì)中廣布的損傷以及間隙區(qū)域的出血(*)(d)。
圖6顯示了HF-S、HF-R和ARB處理的大鼠的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)給服和沒(méi)有給服ARB(從7-11周，0.05mg/kg/天坎地沙坦(candesartan))的Ren-2轉(zhuǎn)基因大鼠進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定。A，LVW/BW(％)，左心室肥大的代表性測(cè)量。B，LW/BW(％)，表明了充血性心力衰竭的發(fā)生，以及C，LVEDP顯示了舒張期功能障礙的程度。HF-S和HF-R動(dòng)物都具有左心室肥厚。具有高纖維化評(píng)分的動(dòng)物具有更高的LW/BW和LVEDP。參數(shù)在處死之前測(cè)定。對(duì)于HF-S和HF-R每一種都是N＝4，對(duì)于ARB，N＝8。*，HF-S對(duì)HF-R和ARB，P＜0.05。
圖7顯示了苦味酸天狼猩紅(picrosiriusred)染色的大鼠心肌切片左心室膠原體積級(jí)分分析的結(jié)果。柱狀圖顯示了LV間隙膠原的定量。1，對(duì)照；2，HF-R；3，HF-S；4，ARB.每組N＝4-6；#，P＜0.01對(duì)對(duì)照；*，P＜0.05HF-S對(duì)HF-R；**，P＜0.05在HF-R對(duì)SD中。
圖8顯示了在Ren-2大鼠中差異表達(dá)的基因的斑點(diǎn)印跡。在HF-S，HF-R和ARB處理的大鼠組之間比較半乳糖苷凝集素-3mRNA的水平。斑點(diǎn)的密度和直徑與相比于SD對(duì)照的基因表達(dá)的水平直接相應(yīng)。A，Phsopho-imager掃描的分別來(lái)自HF-S，HF-R和ARB處理的大鼠圖像。畫(huà)圈的點(diǎn)代表半乳糖苷凝集素-3mRNA的表達(dá)。B，柱狀圖，顯示了用光密度單位定量的半乳糖苷凝集素-3的量。每組N＝2，每個(gè)樣品平行點(diǎn)兩個(gè)點(diǎn)。
圖9半乳糖苷凝集素-3，細(xì)胞周期蛋白D1和E2F-1的免疫印跡。大鼠心肌勻漿中半乳糖苷凝集素-3的表達(dá)水平A1，代表性印跡；A2，以對(duì)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化的以光密度單位進(jìn)行的定量；細(xì)胞周期蛋白D1:B1，代表性印跡；B2，以對(duì)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化的光密度單位進(jìn)行的定量。
圖10表明了半乳糖苷凝集素-3，巨噬細(xì)胞和MHC-II的免疫組化共定位。從HF-S大鼠心肌得到的平行切片使用A，用蘇木精復(fù)染的抗-半乳糖苷凝集素-3小鼠單克隆抗體；B，巨噬細(xì)胞特異的抗-CD68小鼠單克隆抗體；C，抗MHC-II抗原的OX-6小鼠單克隆抗體染色。不同的顯微鏡視野顯示了密集的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。D，HF-R動(dòng)物中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)很少見(jiàn)到(E)，以及在SD對(duì)照中保持完好的心肌形態(tài)，F(xiàn)。
圖11。人受試者中的LVH和HF的心電描記與超聲心動(dòng)描記評(píng)估和實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定心肌半乳糖苷凝集素-3基因表達(dá)。A，根據(jù)Skowlow和Lyon標(biāo)準(zhǔn)(SV1+RV5＞35mm)評(píng)價(jià)左心室的肥厚。小于55％的EF被認(rèn)為是失代償?shù)臓顟B(tài)。B，使用人半乳糖苷凝集素-3探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。描述了在人心肌活組織檢查中半乳糖苷凝集素-3基因表達(dá)。結(jié)果對(duì)持家基因親環(huán)素進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。N＝6，*，P＜0.05HF對(duì)LVH。
圖12顯示在10周的活組織檢查中的半乳糖苷凝集素-3mRNA表達(dá)。
實(shí)施例實(shí)施例1血小板反應(yīng)蛋白-2表達(dá)的增加鑒定有衰竭傾向的心肌肥厚心肌肥厚增加了心力衰竭(HF)的風(fēng)險(xiǎn)，但是至今為止很難預(yù)測(cè)哪種肥厚的心肌會(huì)迅速地發(fā)展為衰竭。根據(jù)本發(fā)明推理，除了與肥厚相關(guān)的基因以外，在衰竭明顯出現(xiàn)之前，有獨(dú)特的與衰竭相關(guān)的基因表達(dá)，這樣就可以對(duì)易于衰竭的肥厚的心臟進(jìn)行分子預(yù)測(cè)。在12-14周大、發(fā)展為HF的高血壓純合腎素過(guò)表達(dá)(Ren-2)大鼠心臟基因的表達(dá)(12336個(gè)克隆)，與到17周大時(shí)仍然保持代償?shù)耐C大鼠的基因表達(dá)進(jìn)行比較。在代償性肥厚階段(10周大)取心臟活檢物，使發(fā)明者能檢測(cè)所鑒定的基因表達(dá)的改變是否出現(xiàn)在后來(lái)向HF發(fā)展之前。鑒定了在HF大鼠的心肌中過(guò)表達(dá)的49個(gè)基因，其中基質(zhì)基因占最大一組。血小板反應(yīng)蛋白-2(TSP2)只在此后向HF發(fā)展的大鼠的活檢物中選擇性地過(guò)量表達(dá)，而腦鈉肽(BNP)在這個(gè)早期階段在所有大鼠中的表達(dá)都升高。為了檢測(cè)TSP2缺失對(duì)心臟基質(zhì)的影響，在TSP2缺失的小鼠中誘導(dǎo)心肌梗死(MI)；這個(gè)步驟導(dǎo)致所有TSP2缺失的小鼠中心臟破裂；但是野生型小鼠沒(méi)有一只出現(xiàn)心臟破裂。結(jié)論是，鑒定TSP2是心臟基質(zhì)完整性的新型和重要的調(diào)節(jié)物。
材料和方法轉(zhuǎn)基因大鼠和血液動(dòng)力學(xué)研究純合Ren-2大鼠獲自Max-Delbrück-Zentrum für MolekulareMedizin，Berlin，德國(guó)。對(duì)Sprague Dawley(SD)背景的30只雄性Ren-2大鼠和作為對(duì)照的9只年齡相當(dāng)?shù)腟D大鼠進(jìn)行研究。在30只Ren-2大鼠中，8只在10周大時(shí)處死，8只Ren-2大鼠自7-13周大使用0.05mg/kg/天的坎地沙坦進(jìn)行處理，坎地沙坦是一種血管緊張素II受體類(lèi)型I阻斷劑(ARB)。在剩下的14只未處理的Ren-2大鼠中，6只在13周發(fā)生心力衰竭臨床癥狀時(shí)處死，將其命名為HF-S大鼠。對(duì)剩下的8只Ren-2大鼠進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)，在17周時(shí)處死，這時(shí)它們?nèi)匀粵](méi)有出現(xiàn)衰竭的臨床癥狀。這些大鼠被稱(chēng)為HF-R大鼠。在處死前測(cè)定血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在處死之后測(cè)量心臟、肺臟重量和體重。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行管理和處理的步驟經(jīng)過(guò)學(xué)院的動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。
10周大的Ren-2大鼠的活檢物對(duì)另外一組12只Ren-2大鼠和4只SD大鼠進(jìn)行麻醉，在胸骨處剔下前胸上的毛。在自制的套環(huán)的幫助下將大鼠固定在位于溫暖襯墊之上的硬板上。將一個(gè)鈍的20號(hào)針頭插入氣管中作為氣管套管。套管與一個(gè)使用室內(nèi)空氣的容積循環(huán)式嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)(model 683，Harvard Apparatus，South Natick，MA)相連，潮氣量是2.5到3毫升，呼吸速率是80次呼吸/min。在顯微解剖鏡的視覺(jué)幫助下進(jìn)行其他的步驟。在左側(cè)第四個(gè)肋間隙切一個(gè)5mm的切口，以通到胸部。在清楚地看到心臟之后，使用與緩慢旋轉(zhuǎn)的鉆頭相連的0.35mm的定制針頭取活檢物。整個(gè)步驟持續(xù)大約15分鐘。在手術(shù)后存活的9只Ren-2大鼠中，5只在12到14周大時(shí)出現(xiàn)心力衰竭，而剩下的4只大鼠直至17周時(shí)仍然保持代償。
RNA分離以及逆轉(zhuǎn)錄使用RNeasy Mini Kit根據(jù) RNeasy Mini實(shí)驗(yàn)步驟(QIAGEN，Hilden，Germany)，從左心室分離RNA，儲(chǔ)存于-80℃。在2100Bioanalyser(Agilent Technologies，Amstelveen，The Netherlands)中使用Eukaryote Total RNA nano-assay檢測(cè)提取物的質(zhì)量。使用PicoPure RNA Isolation Kit(Arcturus，CA，USA)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，從10周大的大鼠心臟活檢物中分離RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶，250ng隨機(jī)引物(Invitrogen Life Technologies，Breda，The Netherlands)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。
cDNA微陣列選擇從標(biāo)準(zhǔn)化的大鼠cDNA文庫(kù)中分離cDNA克隆，用于使用Incyte GEM-2/GEM-3大鼠cDNA文庫(kù)(總共12336個(gè)基因)的微陣列分析。將PCR擴(kuò)增的每一個(gè)cDNA插入物以高密度陣列的形式印制在經(jīng)過(guò)處理的玻璃表面。在這些陣列元件上進(jìn)行一式兩份的雜交，使用3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的兩個(gè)SD和六個(gè)Ren-2大鼠心肌mRNA。對(duì)數(shù)值進(jìn)行Log轉(zhuǎn)化使數(shù)據(jù)均勻，只有表達(dá)差異大于1.7倍才認(rèn)為是有差異的表達(dá)。采用的數(shù)據(jù)采集和驗(yàn)證方案在以前有詳細(xì)描述(Tan等，Proc Natl Acad Sci.9911387-11392，2002；Bandman等，Ann NY Acad Sci.，97577-90，2002)。
用于宏陣列(macroarray)的測(cè)序、膜點(diǎn)樣(spotting)和cDNA雜交從Incyte genomics獲得通過(guò)微陣列鑒定的差異表達(dá)的基因的克隆，并使用5′-GGTGACACTATAGAAGAGC-3′引物(Eurogentec，Seraing，Belgium)測(cè)序。在通過(guò)測(cè)序?qū)π蛄羞M(jìn)行確證以后，使用5′-ACCATGATTACGCCAAGCTC-3′和3′-ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5′引物通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)質(zhì)粒插入物進(jìn)行擴(kuò)增。然后將每個(gè)克隆一式兩份點(diǎn)樣于尼龍膜上(宏陣列)。使用個(gè)人fx-phospho imager(Cyclone SystemPackard，Meriden，CO，USA)對(duì)點(diǎn)印跡進(jìn)行掃描。對(duì)每個(gè)雜交信號(hào)進(jìn)行鑒定，并且使用Quantity One，Version4.2.3軟件(BioRad，Munich，Germany)進(jìn)行光密度定量。選擇甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為持家基因用于印跡的內(nèi)標(biāo)。
生物信息學(xué)分析對(duì)選自微陣列分析和多步驟數(shù)據(jù)采集策略的49個(gè)HF特異候選基因的翻譯的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)對(duì)于這些蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的注釋?zhuān)x擇了三個(gè)候選基因用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，這三個(gè)基因以前沒(méi)有在心肌中發(fā)現(xiàn)，它們編碼基質(zhì)相關(guān)的蛋白。
引物、探針和實(shí)時(shí)PCR由GenBankTM中已有的大鼠序列設(shè)計(jì)引物和探針，使用PrimerExpress軟件(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)。由來(lái)自Ensembl-Mouse Genome Sequencing Consortium和Ensembl-Human Genome Browser的保守外顯子拼接位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，這樣防止檢測(cè)對(duì)任何可能污染的基因組DNA產(chǎn)生識(shí)別(表1)。發(fā)現(xiàn)對(duì)于TaqmanTM檢測(cè)最佳的PCR條件是12.5mL 2×PCR Master Mix，終濃度為5mM MgCl2，300nM每個(gè)引物，200nM探針以及10ng cDNA模板，總體積是25ml。使用ABI Prism 7700 Sequence DetectionSystem(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。相對(duì)于持家基因親環(huán)素A的表達(dá)水平報(bào)告PCR數(shù)據(jù)。
在TSP2-/-小鼠中的實(shí)驗(yàn)性心肌梗死以及形態(tài)測(cè)定法在22只野生型(129SvJ品系)的小鼠和16只TSP2缺失突變體(TSP2-/-)小鼠中，通過(guò)閉塞冠狀動(dòng)脈左前降支，誘導(dǎo)心肌梗死。兩只假手術(shù)小鼠作為對(duì)照。在乙醚麻醉之后，通過(guò)向腔靜脈中注射1ml 0.1M CdCl2殺死小鼠。用5％的緩沖福爾馬林灌注固定心臟10分鐘，在10％的緩沖福爾馬林中浸泡固定過(guò)夜。使用標(biāo)準(zhǔn)電子顯微鏡技術(shù)分析野生型和TSP2-/-小鼠的組織樣品。在每個(gè)切片中隨機(jī)選擇七個(gè)視野，進(jìn)行計(jì)算機(jī)化面積測(cè)量，對(duì)纖維化的程度進(jìn)行定量。每個(gè)視野代表了400μm2的面積。選擇性地定量左心室間質(zhì)的膠原面積，不包括血管周?chē)托耐饽さ哪z原。膠原面積分?jǐn)?shù)計(jì)算如下每個(gè)視野中苦味酸天狼猩紅染色的面積與總的心肌面積之比。以前對(duì)該步驟有詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)(Cherayil等，Proc Natl Acad Sci USA，877324-7328，1990；Cleutjens等，Am J pathol.，147325-338，1995)。
統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。使用單因素方差分析(ANOVA)與用于對(duì)多重比較進(jìn)行校正的Dunnett事后分析相組合，對(duì)每個(gè)研究組(坎地沙坦處理的和兩組未處理的腎素轉(zhuǎn)基因大鼠)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。使用SD大鼠作為內(nèi)部對(duì)照組。使用統(tǒng)計(jì)包SPSS10.0(Chicago，IL，USA)進(jìn)行分析。P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)顯著的。
結(jié)果在Ren-2大鼠亞組中出現(xiàn)向顯著心力衰竭的迅速轉(zhuǎn)化和死亡在10周大處死的8只大鼠中以及在較后的日期處死的其他未處理的大鼠中觀察到了肥厚的左心室和右心室。在SD對(duì)照中沒(méi)有觀察到LVH。使用安慰劑處理的14只Ren-2大鼠中有6只在12到14周齡之間迅速向顯著的臨床HF轉(zhuǎn)化，與在17周觀察期期間保持代償?shù)?只大鼠相比，這些大鼠的心臟功能指標(biāo)降低。在HF-S大鼠中觀察到胸膜積液和dP/dtmax的劇烈下降，在HF-R大鼠中這些改變不顯著(表2)。在13周對(duì)殺死的動(dòng)物進(jìn)行分析時(shí)，血管緊張素II阻斷完全防止了心臟肥厚和衰竭的產(chǎn)生(LV重量/體重％，2.52±0.36，dP/dtmax，8400±202)。
微陣列顯示了在心力衰竭易感的大鼠中有49個(gè)基因過(guò)表達(dá)。
對(duì)于微陣列分析，我們首先研究了HF-S和HF-R組之間基因表達(dá)的生物學(xué)變異性。在HF-S和HF-R兩個(gè)組中的大部分基因的表達(dá)水平非常相似。在研究表達(dá)的總共12336個(gè)基因中，多步數(shù)據(jù)采集(圖1)只獲得了49個(gè)基因，其在HF-S大鼠中過(guò)表達(dá)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)轉(zhuǎn)氫酶是在處于衰竭中的心肌中唯一表達(dá)降低的基因。顯著地，骨活化素、TSP2、幾個(gè)原膠原和血小板反應(yīng)蛋白-1的表達(dá)增加。所鑒定的基因中許多編碼具有已知功能的蛋白，而其他的是功能未知的基因，包括新基因和以前在心臟中沒(méi)有檢測(cè)出的基因。
針對(duì)三個(gè)新的心臟基質(zhì)相關(guān)基因的生物信息分析由于沒(méi)有關(guān)于在HF中許多過(guò)表達(dá)的基因功能的信息，我們對(duì)所有49個(gè)基因進(jìn)行了生物信息分析。起初，我們使用GeneFIND(基因家族鑒定網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)，Gene Family Identification Network Design)System(http//www-nbrf.georgetown.edu)對(duì)HF易感性基因作了廣泛的功能分類(lèi)，GeneFIND將幾個(gè)檢索/比對(duì)工具組合在一起提供了迅速和精確的基因家族。這一策略表明大多數(shù)過(guò)表達(dá)的基因編碼基質(zhì)相關(guān)蛋白。讓人關(guān)注的是，3個(gè)選出的易感性基因(骨活化素，血小板反應(yīng)蛋白-2和膠原VI)的功能以前在心肌中沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。
宏陣列顯示了HF易感性基因通過(guò)血管緊張素II阻滯的標(biāo)準(zhǔn)化為了確證在這個(gè)由血管緊張素驅(qū)動(dòng)的心力衰竭模型中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活的作用，在使用亞增壓(sub-pressor)劑量的坎地沙坦對(duì)Ren-2大鼠亞組從7周到13周進(jìn)行處理之后，我們對(duì)微陣列確定的靶基因的表達(dá)進(jìn)行了重新分析。除了改善血液動(dòng)力學(xué)以外，ARB處理阻止了所有HF-相關(guān)的候選基因的過(guò)表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在10周的心肌活檢顯示TSP-2在隨后迅速向HF發(fā)展的大鼠中上調(diào)。
為了評(píng)價(jià)在血液動(dòng)力學(xué)和臨床上HF明顯出現(xiàn)之前3個(gè)基質(zhì)相關(guān)基因在心肌中的表達(dá)狀態(tài)，我們開(kāi)發(fā)出了一種技術(shù)以獲得在自發(fā)博動(dòng)的大鼠心臟中獲得活檢物。在活檢后，使大鼠恢復(fù)以檢查它對(duì)心力衰竭是否具有抵抗性或者易感性。這個(gè)新的方法使我們?cè)谒ソ咦兊妹黠@之前確定了基因表達(dá)的水平。TSP2的表達(dá)只在那些在12-14周內(nèi)發(fā)生心臟迅速失代償?shù)拇笫笾性谠缙诘姆屎耠A段(10周)明顯增加(圖2a)，而在接下來(lái)保持代償狀態(tài)的大鼠中，在該早期肥厚階段沒(méi)有上調(diào)，在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫笮呐K中也沒(méi)有。其他HF相關(guān)候選基因例如骨活化素(圖2b)和膠原VI(圖2c)的表達(dá)水平，在隨后出現(xiàn)衰竭和與對(duì)照相比保持代償?shù)拇笫笾性谠缙诜屎耠A段都有升高。重要的是，廣泛使用的心臟肥厚和衰竭的標(biāo)記在所有大鼠的10周活檢中都上調(diào)，而不論隨后是代償或者衰竭，因此不能區(qū)別有衰竭傾向和對(duì)衰竭有抗性的大鼠(圖2d)。與我們最初的微陣列研究一致，在出現(xiàn)心力衰竭之后這三個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)一步提高到它們?cè)?0周表達(dá)水平的2倍以上。代償?shù)拇笫螅M管在10周時(shí)有高的骨活化素、膠原VI和BNP，在17周處死時(shí)這些基因的表達(dá)水平?jīng)]有進(jìn)一步顯著提高(數(shù)據(jù)未顯示)。
TSP-2敲除(TSP-/-)小鼠不能存活于急性心肌梗死與多種大鼠心力衰竭模型相反，對(duì)響應(yīng)壓力超負(fù)荷一向產(chǎn)生心力衰竭的小鼠模型沒(méi)有仔細(xì)的文獻(xiàn)證明。因此，我們對(duì)22只野生型和16只TSP2-/-小鼠進(jìn)行前心肌梗死，以研究TSP2在急性心肌結(jié)構(gòu)性損傷中的作用以及接下來(lái)在快速心肌重塑中的作用。因?yàn)樗械男∈笤贛I之后前72小時(shí)內(nèi)由于心臟破裂而死亡，所以TSP2缺失的小鼠不能夠承受梗死。另一方面，100％的沒(méi)有死于手術(shù)后立即并發(fā)癥的野生型小鼠存活(圖3)。
MI后48小時(shí)的計(jì)算機(jī)形態(tài)學(xué)測(cè)定顯示與野生型小鼠相比，在TSP2缺失的小鼠中，心肌膠原明顯的完全缺乏反應(yīng)性的增加(分別是0.38±0.05％和0.70±0.04％；p＜0.05)(圖4)。光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡顯示在TSP2缺失的小鼠中有廣泛的心肌基質(zhì)破損。野生型小鼠中沒(méi)有一只顯示了這樣的表型(圖5)。
討論在這一研究中證明TSP2在心臟中表達(dá)的提高鑒定了那些傾向于向顯著心力衰竭發(fā)展的肥厚心臟。進(jìn)一步顯示在對(duì)急性心臟負(fù)荷產(chǎn)生有效應(yīng)答時(shí)需要TSP2。相反，已知的肥厚標(biāo)記例如BNP在所有形式的心臟肥厚中總是表達(dá)增加，因此不能夠區(qū)別有衰竭傾向和抵抗衰竭的肥厚形式。
盡管在血管和血栓形成疾病中對(duì)血小板反應(yīng)蛋白家族進(jìn)行了廣泛研究，還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)證實(shí)血小板反應(yīng)蛋白在心力衰竭中的重要作用。我們的發(fā)現(xiàn)提示TSP2在心臟基質(zhì)生物學(xué)中可能具有直接或者間接的關(guān)鍵功能。
TSP2是一種分泌的基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，其功能多樣，并沒(méi)有被完全認(rèn)識(shí)。由于在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)或者果蠅基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TSP2的相近直向同源物，看起來(lái)這個(gè)蛋白是為了應(yīng)對(duì)在脊椎動(dòng)物中細(xì)胞基質(zhì)相互作用復(fù)雜性的增加而進(jìn)化。以前在TSP2缺失小鼠中的研究已經(jīng)表明TSP2表達(dá)的缺失導(dǎo)致具有不規(guī)則外形的異常大的膠原纖絲，這是TSP2組織細(xì)胞外基質(zhì)作用的證據(jù)。而且，TSP2缺失的小鼠的皮膚脆弱，抗張強(qiáng)度下降。TSP2缺失的皮膚成纖維細(xì)胞的基質(zhì)附著缺陷，在它們的培養(yǎng)物中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的水平增加。本研究發(fā)現(xiàn)了TSP2在心肌中的兩個(gè)表面上相互矛盾的功能。在Ren-2大鼠中的慢性高血壓中，TSP2在心臟中表達(dá)的增加鑒定了那些傾向出現(xiàn)心力衰竭的動(dòng)物。盡管這種應(yīng)答看起來(lái)表明TSP2的表達(dá)是有害的，但是與在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)仍然保持代償?shù)拇笫笾械膽?yīng)答相比，有可能這種應(yīng)答反映出隨后向顯著衰竭發(fā)展的大鼠中的一種升高的、已經(jīng)被激活的損傷應(yīng)答。很明確TSP2的表達(dá)是成年動(dòng)物中對(duì)損傷的應(yīng)答所特有的。另一方面在小鼠的實(shí)驗(yàn)性心肌梗死中，TSP2的存在明顯地保護(hù)了心臟不破裂。盡管由于涉及了不同的物種，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)很難比較，而且就TSP2缺失小鼠而言，可能存在復(fù)雜的代償性改變，但是兩組結(jié)果都證明了TSP2在損傷之后產(chǎn)生完整的功能性細(xì)胞外基質(zhì)中起到的重要作用。就TSP2缺失的小鼠中切割皮膚傷口的愈合而言，TSP 2的缺失看起來(lái)是有益的，因?yàn)樵谶@種特殊的傷口愈合形式中，所產(chǎn)生的血管生成的增加和MMP2的增加加速了愈合，盡管已知在該組織中存在在膠原纖維已經(jīng)存在的結(jié)構(gòu)的改變。但是提示由于心肌基質(zhì)中類(lèi)似的異常情況導(dǎo)致心臟組織事先具有固有的薄弱狀況，使心臟在梗死之后易出現(xiàn)破裂。
這里的數(shù)據(jù)提示TSP2在心臟中表達(dá)的增加在向衰竭發(fā)展之前發(fā)生。因?yàn)橐呀?jīng)知道血小板反應(yīng)蛋白可以與整聯(lián)蛋白結(jié)合，所以TSP2可能通過(guò)整聯(lián)蛋白信號(hào)介導(dǎo)了促纖維變性(pro-fibrotic)的效果。最近Zhang等(J Clin Invest 111833-841，2003)報(bào)導(dǎo)了具有適配子蛋白基因Grb2單倍體機(jī)能不全(haploinsufficiency)的小鼠，對(duì)于壓力超負(fù)荷產(chǎn)生的心臟纖維化有抵御作用。在能夠由于機(jī)械壓力導(dǎo)致的整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的粘著斑激酶的激活中有Grb2的參與。在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn)β1整聯(lián)蛋白是在高血壓的Ren2大鼠的心臟中表達(dá)顯著升高并且在衰竭的心臟中表達(dá)進(jìn)一步升高的基因之一。我們最近的觀察結(jié)果--心臟成纖維細(xì)胞的體外伸展提高了β1整聯(lián)蛋白的蛋白水平，證明了這一發(fā)現(xiàn)(S.Pokharel和Y.M.Pinto，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。
應(yīng)當(dāng)注意用于膠原定量的苦味酸天狼猩紅染色技術(shù)依賴(lài)于膠原纖維的大小、排列和裝配，才能顯示可見(jiàn)的橙紅色偏振。由于TSP2缺失小鼠具有異常的膠原纖絲和纖維結(jié)構(gòu)，特別組織較差的纖維和無(wú)規(guī)更大的纖絲，測(cè)量的雙折射可能會(huì)受到這些改變的影響。
總之，根據(jù)本發(fā)明提出TSP2發(fā)揮心臟基質(zhì)完整性的至關(guān)重要的調(diào)節(jié)物的功能。由于在實(shí)驗(yàn)和臨床形式的壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭中都具有細(xì)胞外基質(zhì)形成的特征，TSP2的早期表達(dá)可能反映出了在代償性肥厚向心力衰竭的轉(zhuǎn)變中重要的基質(zhì)應(yīng)答。這些觀察結(jié)果表明TSP2心臟中過(guò)表達(dá)的早期檢測(cè)可以鑒定那些易于出現(xiàn)心力衰竭的肥厚的心臟，可以促進(jìn)易于發(fā)展為心力衰竭的病人的早期發(fā)現(xiàn)和可能的治療。
實(shí)施例2半乳糖苷凝集素-3標(biāo)志了傾向于出現(xiàn)衰竭的肥厚的心臟中活化的巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞趨化蛋白和多種不同的細(xì)胞因子心肌表達(dá)的升高提示在心力衰竭(HF)中有巨噬細(xì)胞的參與。但是還不清楚巨噬細(xì)胞是否僅僅對(duì)已經(jīng)出現(xiàn)的損傷產(chǎn)生應(yīng)答還是積極地參與HF的早期階段。為了研究高血壓性HF中的這些機(jī)制，發(fā)明人使用了純合的高血壓性TGR(mRen2)27(Ren-2)大鼠。這些大鼠在10周齡時(shí)一律出現(xiàn)心臟肥厚，此后一些大鼠保持代償性直至17周，而其他的大鼠在12到14周齡時(shí)出現(xiàn)衰竭和死亡。該研究表明心臟中半乳糖苷凝集素-3的表達(dá)特異地標(biāo)志出傾向出現(xiàn)衰竭的肥厚的心臟。在有衰竭傾向的肥厚的心臟中巨噬細(xì)胞看起來(lái)被早期和特異地激活，并且來(lái)源于巨噬細(xì)胞的介體如半乳糖苷凝集素-3可能導(dǎo)致心臟纖維化的發(fā)展和向HF的發(fā)展。
材料和方法轉(zhuǎn)基因大鼠和血液動(dòng)力學(xué)研究純合Ren-2大鼠獲自Max-Delbrück-Zentrum für MolekulareMedizin，Berlin，Germany。我們研究了16只雄性Ren-2大鼠和作為對(duì)照的8只年齡相當(dāng)?shù)膩?lái)自非轉(zhuǎn)基因背景的Sprague Dawley(SD)大鼠。在16只Ren-2大鼠中，8只Ren-2大鼠在7-13周齡使用0.05mg/kg/天的坎地沙坦進(jìn)行處理，坎地沙坦是一種血管緊張素II受體類(lèi)型I阻斷劑(ARB)。在8只未處理的Ren-2大鼠中，4只在13周發(fā)生HF時(shí)處死。對(duì)剩下的4只Ren-2大鼠進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)，在17周時(shí)處死，這時(shí)它們?nèi)匀粵](méi)有出現(xiàn)衰竭的臨床癥狀。在處死前和在10周時(shí)進(jìn)行血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量。在處死之后測(cè)量心臟、肺臟重量和體重。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行管理和處理的步驟經(jīng)過(guò)學(xué)院的動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。
10周大的Ren-2大鼠的心肌活檢對(duì)另外一組12只Ren-2大鼠和4只SD大鼠進(jìn)行麻醉，將一個(gè)鈍的20號(hào)針頭插入氣管中作為氣管套管。套管與一個(gè)使用室內(nèi)空氣的容積循環(huán)式嚙齒動(dòng)物呼吸機(jī)(model 683，Harvard Apparatus，SouthNatick，MA)相連，潮氣量是2.5到3毫升，呼吸速率是80次呼吸/min。在顯微解剖鏡的視覺(jué)幫助下在左側(cè)第四個(gè)肋間隙切一個(gè)5mm的切口，以通到胸部。使用0.35mm的定制針頭取活檢。
cDNA微陣列選擇從標(biāo)準(zhǔn)化的大鼠cDNA文庫(kù)(總共12336個(gè)基因)中分離cDNA克隆，用于微陣列分析(Incyte Genomics，CA，USA，大鼠GEM-2/3)。將PCR擴(kuò)增的每一個(gè)cDNA插入物印制在玻璃表面上成為高密度陣列。在這些玻璃芯片上用3個(gè)不同時(shí)刻的兩個(gè)SD和六個(gè)Ren-2大鼠心肌mRNA進(jìn)行一式兩份雜交。將表達(dá)顯示出統(tǒng)計(jì)顯著(P＜0.001)改變的靶基因(在HF-S組中至少有2倍過(guò)表達(dá))再次印制在亞陣列上進(jìn)一步進(jìn)行分析，這樣使每個(gè)基因都獨(dú)立地分析了四次，提高了可靠性水平。采用的數(shù)據(jù)采集(Tan FL等，Proc Natl Acad Sci.9911387-11392，2002)和驗(yàn)證方案在以前有詳細(xì)描述(Bandman O等，Ann NY AcadSci.，97577-90，2002)。
引物和探針根據(jù)GenBankTM中的序列，使用Primer Express Software(PEApplied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)設(shè)計(jì)半乳糖苷凝集素-3特異的引物(正向5′-CCCGACTGGACCACTGACA-3′，反向，5′-CAGCATGCGAGGCATGACT-3′以及探針，5′-TGCCCTACGATATGCCCTTGCCTG-3′)。
RNA分離和實(shí)時(shí)PCR使用RNeasy Mini Kit根據(jù)RNeasy Mini實(shí)驗(yàn)步驟(QIAGEN，Hilden，Germany)，從大鼠左心室分離RNA，儲(chǔ)存于-80℃。使用PicoPure RNA Isolation Kit(Arcturus，CA，USA)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，從大鼠心臟活檢物中分離RNA。發(fā)現(xiàn)對(duì)于TaqmanTM檢測(cè)最佳的PCR條件是12.5μm 2×PCR Master Mix，終濃度為5mM MgCl2，300nM每個(gè)引物，200nM探針以及10ng cDNA模板，總體積是25μl。
測(cè)序、膜點(diǎn)樣和宏陣列的cDNA雜交從Incyte Genomics獲得通過(guò)微陣列鑒定的差異表達(dá)的基因的克隆，并使用5′-GGTGACACTATAGAAGAGC-3′引物(Eurogentec，Seraing，Belgium)測(cè)序。在確證身份以后，使用5′-ACCATGATTACGCCAAGCTC-3′和3′-ACGACGGCCAGTGAATTGAA-5′引物通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)質(zhì)粒插入物進(jìn)行擴(kuò)增。然后將每個(gè)克隆一式兩份點(diǎn)樣與尼龍膜上(宏陣列)。使用個(gè)人fx-phospho imager(Cyclone System Packard，Meriden，CO，USA)對(duì)斑點(diǎn)印跡進(jìn)行掃描。
蛋白質(zhì)分離和Western印跡根據(jù)以前的描述進(jìn)行蛋白質(zhì)分離和Western印跡。用含有Tween20的Tris緩沖鹽水(TBS-T)將一抗(半乳糖苷凝集素-3，Bioreagents；ED-1和OX-6由Dr.M.de Winther，Department of MolecularGenetics，University of Maastricht，The Nether lands惠贈(zèng))稀釋為1/1000。二抗(辣根過(guò)氧化物酶體綴合的IgG，Cell SignalingTechnology)用TBS-T稀釋為1/2000。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL，Amersham，Arlington Heights，IL，USA)呈現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。
免疫組化、半乳糖苷凝集素細(xì)胞化學(xué)和共聚焦顯微鏡術(shù)如以前的描述(Gabius等，Anal Biochem.18991-94，1990)通過(guò)特異的抗半乳糖苷凝集素-3單克隆抗體以及生物素化的半乳糖苷凝集素-3呈現(xiàn)半乳糖苷凝集素-3的表達(dá)和可接近的結(jié)合位點(diǎn)。如其他文獻(xiàn)的詳細(xì)描述(Andre等，Chembiochem.2822-830，2001)，在保持活性的條件下使半乳糖苷凝集素-3生物素化。在激光共聚焦掃描顯微鏡術(shù)中，使用FITC標(biāo)記的親和素檢測(cè)半乳糖苷凝集素結(jié)合位點(diǎn)。使用德克薩斯紅標(biāo)記的二抗以免疫細(xì)胞化學(xué)的方式呈現(xiàn)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)。關(guān)于該步驟在其他文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的詳細(xì)描述(Broers等，J Cell Sci.112(Pt 20)3463-3475，1999)。
心臟成纖維細(xì)胞增殖和脯氨酸摻入檢測(cè)如以前的描述(Pokharel等，Hypertension，40155-161，2002)，從2日齡的新生Sprague-Dawley大鼠中分離大鼠心臟成纖維細(xì)胞。細(xì)胞在添加10％胎牛血清(FBS)、1％L-谷氨酸、50U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中，在37℃下在濕潤(rùn)的含有5％CO2的空氣中培養(yǎng)。接種后24小時(shí)將細(xì)胞用含有0.5％FBS的培養(yǎng)基孵育24小時(shí)使其休眠。然后使用鼠的重組半乳糖苷凝集素-3(對(duì)照、10μg/ml和30μg/ml)處理細(xì)胞24小時(shí)。使用放射性標(biāo)記的甲基[3H]胸苷摻入(0.5μCi每孔)檢測(cè)測(cè)定分裂細(xì)胞的數(shù)目。使用LKB-Wallace beta計(jì)數(shù)儀(FSA Laboratory Supplies，Loughborough，UK)檢測(cè)成纖維細(xì)胞和閃爍液體混合物中的放射性。
使用[3H]脯氨酸摻入檢測(cè)測(cè)定分泌的膠原。簡(jiǎn)而言之，心臟成纖維細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中至90-100％匯合。在孵育的最后24小時(shí)中，加入15μCi/ml的L-[3H]脯氨酸。使用10％三氯乙酸(TCA)沉淀?xiàng)l件培養(yǎng)基中摻入的[3H]脯氨酸，用液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。
統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。使用單因素方差分析(ANOVA)與用于對(duì)多重比較進(jìn)行校正的Dunnett事后分析相組合，對(duì)每個(gè)研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，使用SD大鼠作為內(nèi)部對(duì)照組。使用統(tǒng)計(jì)包SPSS10.0(Chicago，IL，USA)進(jìn)行分析。P值小于0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)顯著的。
結(jié)果HF-S大鼠中惡化的心臟功能以及心臟纖維化在8只安慰劑處理的大鼠中觀察到肥厚的左右心室。相反，在坎地沙坦處理和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫笾袥](méi)有出現(xiàn)LV增加。8只沒(méi)有處理的大鼠中4只在12-14周齡期間發(fā)生顯著的臨床HF，伴隨出現(xiàn)下降的心臟功能指標(biāo)。剩余4只大鼠在17周的研究階段中保持代償化。在HF-S大鼠中明顯出現(xiàn)伴隨著胸膜積液(肺臟重量/體重％HF-S，10.61±0.7對(duì)HF-R，4.97±0.2，P＜0.001)和左心室舒張末期壓力(LVEDP)升高的顯著HF，這些在HF-R大鼠和或ARB處理的大鼠中不存在(圖6a，b和c)。在10周時(shí)所有安慰劑處理的Ren-2大鼠均出現(xiàn)LVH但是沒(méi)有失代償?shù)难簞?dòng)力學(xué)的證據(jù)(LV重量/體重％Ren-2，HF-S，3.88±0.08；非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?.15±0.2，以及dP/dtmaxRen-2，8556±296對(duì)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?780±373)。由計(jì)算機(jī)輔助的光密度測(cè)量測(cè)定的心肌膠原含量顯示與HF-R大鼠相比，HF-S大鼠中具有更高程度的心臟纖維化。ARB使LVH和心肌膠原含量標(biāo)準(zhǔn)化，這樣它仍然可以與具有正常血壓背景的品系的相當(dāng)(圖7)。
微陣列顯示了HF易感大鼠中免疫相關(guān)基因的豐度首先，我們檢查了HF-S和HF-R組之間基因表達(dá)的生物變異性。來(lái)自?xún)蓚€(gè)組的樣品對(duì)之間大部分基因的表達(dá)水平高度相關(guān)。我們重點(diǎn)關(guān)注衰竭和未衰竭的肥厚心臟之間差異表達(dá)的基因。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Log轉(zhuǎn)化，只有超過(guò)2倍閾值的表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)顯著的差異(P＜0.05)才認(rèn)為是差異表達(dá)。半乳糖苷凝集素-3是最突出過(guò)表達(dá)的基因，在HF大鼠中表達(dá)升高5倍以上(表3)。有趣的是，主要組織相容性復(fù)合體抗原II(MHC-II)和免疫球蛋白受體基因也在這些過(guò)表達(dá)的基因中。
宏陣列顯示HF易感性基因被血管緊張素II阻滯的標(biāo)準(zhǔn)化為了驗(yàn)證在HF中差異表達(dá)的基因，我們首先測(cè)序然后將這些基因重新點(diǎn)樣在尼龍膜上(宏陣列)，在不同的生物樣品中重復(fù)雜交，這樣對(duì)克隆的身份進(jìn)行確證。開(kāi)始由微陣列確定的7個(gè)主要指標(biāo)基因在這里也有過(guò)量表達(dá)。為了確證在這個(gè)由血管緊張素驅(qū)動(dòng)的HF模型中腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活的作用，在使用亞增壓劑量的坎地沙坦對(duì)Ren-2大鼠的亞組從7周到13周進(jìn)行處理之后，我們對(duì)微陣列確定的靶基因的表達(dá)進(jìn)行了重新分析。血管緊張素II阻滯完全阻止了心臟肥厚和衰竭的發(fā)生。在基因表達(dá)水平上，它阻止了所有HF-相關(guān)的候選基因的過(guò)表達(dá)。引起注意的是半乳糖苷凝集素-3的表達(dá)也被阻止了。
Western印跡顯示在正在衰竭的心肌中半乳糖苷凝集素-3具有高表達(dá)考慮到半乳糖苷凝集素-3轉(zhuǎn)錄水平的強(qiáng)烈增加，我們重點(diǎn)關(guān)注了它在心肌中的蛋白質(zhì)水平。與在微陣列/宏陣列中得到的結(jié)果相當(dāng)，在相同的動(dòng)物組(具有最大程度的心臟纖維化，在13周時(shí)迅速發(fā)生心臟失代償)中觀察到了最高水平的半乳糖苷凝集素-3表達(dá)(HF-S，94.6±8.9；HF-R，35±5.6，P＜0.01)(圖8a和b)。
CD68陽(yáng)性、MHC-II抗原和半乳糖苷凝集素-3的共定位我們通過(guò)免疫組化對(duì)半乳糖苷凝集素-3在大鼠心肌中的分布進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。從組織學(xué)上看，HF易感的大鼠顯示了成片的纖維化區(qū)域。在沒(méi)有受到影響的區(qū)域中組織的結(jié)構(gòu)保持完好。相反在ARB處理的和SD大鼠中，以及在肥厚的未衰竭的HF-R大鼠中都沒(méi)有看到這些高度纖維化的區(qū)域。重要的是，半乳糖苷凝集素-3陽(yáng)性區(qū)域顯示了顯著的組織損傷和高度的纖維化。從形態(tài)學(xué)上看，半乳糖苷凝集素-3陽(yáng)性細(xì)胞相當(dāng)大。為了確證這些細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的假設(shè)，我們使用巨噬細(xì)胞特異的抗體(ED-1)進(jìn)行了連續(xù)切片分析。半乳糖苷凝集素-3陽(yáng)性的區(qū)域與巨噬細(xì)胞特異染色共定位(Co-localized)。這些巨噬細(xì)胞也強(qiáng)烈表達(dá)MHC-II抗原，表明這些細(xì)胞在抗原呈遞中的積極作用。這些特征在HF-R大鼠和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩胁⒉伙@著。
在心臟成纖維細(xì)胞中的半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點(diǎn)在確定半乳糖苷凝集素-3在巨噬細(xì)胞中有強(qiáng)烈表達(dá)之后，我們確定半乳糖苷凝集素-3是否結(jié)合心臟成纖維細(xì)胞。我們使用生物素化的半乳糖苷凝集素-3呈現(xiàn)心臟成纖維細(xì)胞上的半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點(diǎn)。在0.1％Triton透化的細(xì)胞中，半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點(diǎn)的存在導(dǎo)致靜止細(xì)胞中的彌散細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核外染色(圖10a)。相反，增殖的成纖維細(xì)胞在細(xì)胞核周?chē)性鰪?qiáng)的染色，顯示了與有絲分裂相關(guān)的染色特征的改變(圖10b)。這個(gè)型式由共聚焦顯微鏡術(shù)獨(dú)立監(jiān)測(cè)。實(shí)際上，這些實(shí)驗(yàn)確證了在增殖的(即PCNA陽(yáng)性)心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核周?chē)山咏陌肴樘擒漳?3配基緊密存在(圖10c、d和e)，反映了半乳糖苷凝集素-3過(guò)表達(dá)狀態(tài)中細(xì)胞周期的激活。
半乳糖苷凝集素-3誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生在提供了心臟成纖維細(xì)胞中存在可接近位點(diǎn)的證據(jù)之后，我們確定了半乳糖苷凝集素-3是否促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。使用重組的半乳糖苷凝集素-3，我們進(jìn)行了增殖試驗(yàn)。加入不同濃度的半乳糖苷凝集素-3(0，10和30μg/ml)，使用或者不使用血清富集。我們觀察到使用10和30μg/ml外源半乳糖苷凝集素-324小時(shí)后心臟成纖維細(xì)胞增殖顯著增加(30μg/ml半乳糖苷凝集素-3，347±17.5計(jì)數(shù)每分鐘(cpm)；10μg/ml半乳糖苷凝集素-3，309±4.8cpm；對(duì)照，145±4.8；p＜0.01)。然后我們通過(guò)加入外源半乳糖苷凝集素-3，使用放射性脯氨酸摻入測(cè)定，監(jiān)測(cè)了心臟成纖維細(xì)胞膠原的產(chǎn)生。在培養(yǎng)基中含有30μg/ml半乳糖苷凝集素-3時(shí)，脯氨酸摻入提高了大約66％(30μg/ml半乳糖苷凝集素-3，1066±56cpm；對(duì)照，707±52.8cpm；p＜0.05)。更低濃度的半乳糖苷凝集素-3不能產(chǎn)生顯著的作用(10μg/ml半乳糖苷凝集素-3 992±72cpm，p＝0.13)。
10周時(shí)的心肌活檢顯示在后來(lái)快速發(fā)展為HF的大鼠中高半乳糖苷凝集素-3表達(dá)為了評(píng)估在HF成為血液動(dòng)力學(xué)和臨床上明顯之前在心肌中的半乳糖苷凝集素-3的表達(dá)狀態(tài)(即10周齡)，我們開(kāi)發(fā)了獲得自主搏動(dòng)的大鼠心臟中心臟活檢物的技術(shù)。活檢后，使大鼠恢復(fù)以確定其是否抵抗或易感HF。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)量，只在后來(lái)發(fā)展為HF的大鼠中半乳糖苷凝集素-3的心肌表達(dá)增加(任意單位5.8±0.17)，而其在隨后仍保持代償?shù)拇笫笾?3.4±0.2)以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫蟮男呐K中(2.5±0.033)以相對(duì)較低的水平表達(dá)(圖12)。
討論本研究的目的是確定在肥厚的心室向衰竭轉(zhuǎn)化的過(guò)程中的特異機(jī)制。我們證明半乳糖苷凝集素-3，一種巨噬細(xì)胞表達(dá)的蛋白，在衰竭傾向的肥厚心臟中早期和特異地表達(dá)。而且，我們確定半乳糖苷凝集素-3與心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，激活心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原產(chǎn)生，提示這一過(guò)程可能導(dǎo)致了心肌硬化并且很可能導(dǎo)致向HF的發(fā)展。
以前的研究已經(jīng)提示了巨噬細(xì)胞和炎性應(yīng)答在HF中的作用。但是這些研究留下了未解答的問(wèn)題，即巨噬細(xì)胞的激活是在HF之前出現(xiàn)還是僅僅伴隨HF出現(xiàn)。而且，也沒(méi)有對(duì)巨噬細(xì)胞與心臟纖維化關(guān)聯(lián)的特異機(jī)制進(jìn)行解釋。
作為首先在腹膜巨噬細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的抗原，半乳糖苷凝集素-3是半乳糖苷凝集素家族中唯一的嵌合類(lèi)型成員。它具有凝集素基團(tuán)，其與β半乳糖苷以及蛋白質(zhì)共同具有不依賴(lài)于鈣的特異性，它位于巨噬細(xì)胞的吞噬細(xì)胞杯和吞噬體內(nèi)。除了其抗凋亡和生長(zhǎng)促進(jìn)作用以外，半乳糖苷凝集素-3還調(diào)控單核細(xì)胞趨化性、化動(dòng)性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的可獲得性。而且，最近的研究還提示在通過(guò)Fcγ受體(FcγR)交聯(lián)之后，半乳糖苷凝集素-3在巨噬細(xì)胞的吞噬作用中起重要的作用。
有趣的是，我們還觀察到FcγR在我們的HF模型中的過(guò)表達(dá)(表3)。
從10周齡的大鼠得到的活檢顯示只有在向迅速衰竭轉(zhuǎn)化的大鼠中才出現(xiàn)半乳糖苷凝集素-3表達(dá)的增加。考慮到半乳糖苷凝集素-3的促炎和成纖維生長(zhǎng)促進(jìn)作用，這個(gè)階段表達(dá)的增加可能促進(jìn)了有利于衰竭的環(huán)境。與我們的發(fā)現(xiàn)一致，巨噬細(xì)胞的肝臟類(lèi)似物(即枯否細(xì)胞)表達(dá)的半乳糖苷凝集素-3也參與在肝臟中誘導(dǎo)合成過(guò)量的纖絲形成膠原。這提示半乳糖苷凝集素-3是一個(gè)巨噬細(xì)胞相關(guān)的促纖維化介體，也是另外一種炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞因子，它在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的特征條件下具有影響心臟重塑的能力。半乳糖苷凝集素-3如何加快向HF發(fā)展的另一個(gè)假說(shuō)來(lái)自對(duì)半乳糖苷凝集素-3是晚期糖基化終產(chǎn)物的第三個(gè)受體(RAGE-3)的發(fā)現(xiàn)，該受體在膠原交聯(lián)和心肌硬化方面起關(guān)鍵的作用。
我們還證明了半乳糖苷凝集素-3與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合并且誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞增殖，增加膠原產(chǎn)生。盡管半乳糖苷凝集素-3開(kāi)始是作為糖結(jié)合蛋白被發(fā)現(xiàn)的，但是已知半乳糖苷凝集素-3與細(xì)胞內(nèi)除了糖綴合物以外的靶也發(fā)生特異相互作用。以前的研究提出了幾個(gè)作為半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點(diǎn)的分子，包括Mac-2結(jié)合蛋白和層粘連蛋白。但是，仍然不知道是什么誘導(dǎo)增殖細(xì)胞中半乳糖苷凝集素-3結(jié)合元件迅速地向核周?chē)w移。它是半乳糖苷凝集素-3結(jié)合位點(diǎn)從正在分裂的細(xì)胞核向外運(yùn)輸(離心遷移)還是這些受體在指導(dǎo)下從胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移(向心遷移)，這還需要進(jìn)一步的探究。
本研究提示免疫系統(tǒng)激活以及半乳糖苷凝集素-3的產(chǎn)生在從左心室肥厚向HF發(fā)展過(guò)程中的重要作用，并表明在促免疫和促纖維化的因子之間的聯(lián)系。在HF之前半乳糖苷凝集素-3表達(dá)的增加可能反映了在肥厚的正在衰竭的心室中巨噬細(xì)胞早期和異常的激活。反過(guò)來(lái)，半乳糖苷凝集素-3可能釋放由活化的巨噬細(xì)胞向心臟纖維化的信號(hào)。對(duì)半乳糖苷凝集素-3的外周檢測(cè)可以作為HF的指示，在治療上，對(duì)半乳糖苷凝集素-3的作用進(jìn)行抑制可能成為新的治療靶標(biāo)，以抵消過(guò)度心臟纖維化。
實(shí)施例3人血清中半乳糖苷凝集素-3的分析在患有心血管疾病的患者的血清中檢測(cè)半乳糖苷凝集素-3水平。使用商品化的通過(guò)ELISA測(cè)量半乳糖苷凝集素-3的試劑盒。結(jié)果總結(jié)在表4-6中。顯示半乳糖苷凝集素-3在患有心血管疾病如心力衰竭、LVH的患者的血清中顯著升高。而且，也找到了健康對(duì)照受試者中半乳糖苷凝集素-3水平的上限，這個(gè)上限在大多數(shù)CHF患者中都被超過(guò)了。
根據(jù)本發(fā)明，第一次證明在人受試者的血清中對(duì)半乳糖苷凝集素-3水平的測(cè)定，將患病與非患病的受試者可靠地區(qū)分開(kāi)，這樣，與已知的肌細(xì)胞標(biāo)記(BNP)相結(jié)合，為非肌細(xì)胞的疾病過(guò)程提供了額外的信息。
數(shù)據(jù)表格LVH＝高血壓，肥厚CHF＝心力衰竭Infl＝炎性血管疾病Poscon＝疾病的混和組Infarct＝梗死的患者Healthy＝健康對(duì)照表1.候選基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物和探針的序列
探針的5′和3′位置分別標(biāo)記了6-羧基熒光素報(bào)告因子和6-羧基四甲基羅達(dá)明淬滅劑。根據(jù)來(lái)自GenBank的序列(登錄號(hào)在括號(hào)中給出)注釋引物和探針的位置。Fwd，正向；Rev，反向。
表2.10周(肥厚，無(wú)HF)、12到14周(發(fā)展為HF)以及17周(代償性肥厚)大鼠的血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較
LVW/BW，按照體重校正的左心室重量；dP/dtmax(mmHg/s)，LV壓力升高的最大速率；-dP/dtmin，LV壓力降低的最大速率；*，P＜0.05對(duì)年齡匹配的SD大鼠；#，P＜0.01對(duì)10周和17周Ren-2大鼠。
表3.候選基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物半定量PCR和實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物和探針的序列
探針的5′和3′位置分別標(biāo)記了6-羧基熒光素報(bào)告因子和6-羧基四甲基羅達(dá)明淬滅劑。根據(jù)來(lái)自GenBank的序列(登錄號(hào)在括號(hào)中給出)注釋引物和探針的位置。Fwd，正向；Rev，反向。
表4.半乳糖苷凝集素-3，描述
表5.ANOVA
表6.多重比較。因變量半乳糖苷凝集素-3Bonferroni
*平均差異在.05水平顯著。
權(quán)利要求
1.確定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法，包括(a)得到所述受試者的生物樣品；(b)確定所述樣品中至少一種非肌細(xì)胞標(biāo)記的水平；(c)將所述標(biāo)記的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；以及(d)確定標(biāo)記的水平是否指示了發(fā)生高血壓性終末器官損害的風(fēng)險(xiǎn)。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中的生物樣品是來(lái)自外周血的血漿樣品。
3.權(quán)利要求1或者2中的方法，其中的非肌細(xì)胞標(biāo)記是蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3中的方法，其中的非肌細(xì)胞標(biāo)記是半乳糖苷凝集素-3。
5.權(quán)利要求3中的方法，其中的非肌細(xì)胞標(biāo)記是血小板反應(yīng)蛋白-2。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)中的方法，其中通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量標(biāo)記的水平。
7.一種或者多種非肌細(xì)胞標(biāo)記用于確定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風(fēng)險(xiǎn)的受試者的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中的標(biāo)記是蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的用途，其中的蛋白質(zhì)是半乳糖苷凝集素-3。
10.權(quán)利要求8的用途，其中的蛋白質(zhì)是血小板反應(yīng)蛋白-2。
11.半乳糖苷凝集素-3或者其調(diào)節(jié)劑在制備預(yù)防和/或治療高血壓性終末器官損害的藥物中的用途。
12.血小板反應(yīng)蛋白-2或者其調(diào)節(jié)劑在制備預(yù)防和/或治療高血壓性終末器官損害的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定具有發(fā)生高血壓性終末器官損害風(fēng)險(xiǎn)(例如，特別是心力衰竭)的受試者的方法，包括(a)得到所述受試者的生物樣品；(b)確定所述樣品中至少一種非肌細(xì)胞標(biāo)記的水平；(c)將所述標(biāo)記的水平與標(biāo)準(zhǔn)水平進(jìn)行比較；以及(d)確定標(biāo)記的水平是否指示了發(fā)生高血壓性終末器官損害的風(fēng)險(xiǎn)。非肌細(xì)胞標(biāo)記優(yōu)選是半乳糖苷凝集素－3或者血小板反應(yīng)蛋白2。
文檔編號(hào)G01N33/94GK1879022SQ200480033263
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月9日
發(fā)明者Y·M·品托 申請(qǐng)人:馬斯特里赫特大學(xué)