專利名稱：神經(jīng)集落形成分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離、鑒定及鑒別神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)祖細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的發(fā)育起始于胎兒發(fā)育的早期并持續(xù)至產(chǎn)后期。在成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要有三種細(xì)胞神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。胚胎中神經(jīng)發(fā)育第一期是細(xì)胞發(fā)生，為具有精確的時(shí)間和空間順序的階段，干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖產(chǎn)生分化為成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的前體。第二期是細(xì)胞分化和移行階段，成神經(jīng)細(xì)胞(產(chǎn)生神經(jīng)元的細(xì)胞)及神經(jīng)膠質(zhì)胚細(xì)胞(產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞)分化及移行至其最終位置。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的第三期在細(xì)胞獲得特定的成熟表型特征如神經(jīng)元表達(dá)特殊的神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)發(fā)生。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的終末期是選擇性細(xì)胞死亡階段，其中特定細(xì)胞、纖維及連接死亡和退化“微調(diào)”神經(jīng)系統(tǒng)通路。
和機(jī)體的許多其它組織不同，哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳統(tǒng)上幾乎不具有為適應(yīng)損傷或疾病產(chǎn)生新細(xì)胞的能力。然而，體外試驗(yàn)成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表現(xiàn)干細(xì)胞特征細(xì)胞的最近發(fā)現(xiàn)(Reynolds和Weiss，1992)以及成體腦內(nèi)小增殖區(qū)(Alvarez-Buylla等，2001)的重新檢測(Altman，1962；Altman和Das，1965)使人們相信成體哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)保留產(chǎn)生新細(xì)胞的能力，而且神經(jīng)干細(xì)胞是增殖前體的來源。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有增殖和分化能力的神經(jīng)干細(xì)胞可以從祖細(xì)胞分化而來。根據(jù)Potten和Loeffler(Potten和Loeffler，1990)的定義，神經(jīng)干細(xì)胞可以從祖細(xì)胞分化而來，具有自穩(wěn)定能力，產(chǎn)生大量子代細(xì)胞并產(chǎn)生神經(jīng)組織三種基本細(xì)胞類型的成熟細(xì)胞。
干細(xì)胞的關(guān)鍵鑒別特征是其表現(xiàn)自我更新或產(chǎn)生更多自身細(xì)胞的能力。在最簡單的定義中，干細(xì)胞為具有自穩(wěn)定性能力的細(xì)胞。然而，由于考慮到大量細(xì)胞可符合這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，此定義是有問題的。干細(xì)胞更為嚴(yán)格和實(shí)用的定義由Potten和Loeffler(1990)提供，他們將干細(xì)胞定義為“具有以下能力的未分化細(xì)胞a)增殖，b)自穩(wěn)定性，c)產(chǎn)生大量分化的功能子代細(xì)胞，d)損傷后再生組織，以及e)這些選項(xiàng)用途的靈活性”。
已證明培養(yǎng)系統(tǒng)在研究和理解生物學(xué)過程和系統(tǒng)的細(xì)胞和分子性質(zhì)的無價(jià)工具。關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞，已經(jīng)開發(fā)了分離、增殖及擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞以及繼后其子代分化為神經(jīng)系統(tǒng)三種基本細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)方法(Reynolds和Weiss，1996)。Reynolds和Weiss根據(jù)功能標(biāo)準(zhǔn)而鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。這些標(biāo)準(zhǔn)包括以下能力1)增殖和產(chǎn)生大量子代細(xì)胞，2)長期培養(yǎng)中長時(shí)間的自我更新，及3)持續(xù)產(chǎn)生來源組織的基本細(xì)胞類型。這種方法被稱為神經(jīng)球分析(NA)，它提供了關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞生存及其潛在治療用途的豐富資料。
簡言之，神經(jīng)球分析涉及穿至成體神經(jīng)系統(tǒng)組織的胚胎顯微解剖，接著破壞細(xì)胞連接及單細(xì)胞懸浮增殖。將細(xì)胞鋪于(典型地以低濃度)組織培養(yǎng)皿的存在至少一種誘導(dǎo)增殖的生長因子(即表皮生長因子[EFG]，堿性成纖維細(xì)胞生長因子[bFGF]，等等)確定的無血清培養(yǎng)基中。在這些條件下，2-5天內(nèi)，多能神經(jīng)干細(xì)胞開始分裂產(chǎn)生被稱作神經(jīng)球的未分化細(xì)胞的同源細(xì)胞衍生群(圖1)。在增殖誘導(dǎo)因子的持續(xù)存在下，神經(jīng)球中的細(xì)胞持續(xù)分裂致組成神經(jīng)球的細(xì)胞數(shù)量增加，從而神經(jīng)球的體積增加?？墒占窠?jīng)球，裂解為單細(xì)胞懸液，再鋪板培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生新的神經(jīng)球。以此方式進(jìn)行的神經(jīng)干細(xì)胞傳代導(dǎo)致有活力的中樞神經(jīng)系統(tǒng)前體細(xì)胞算術(shù)增加(圖3)。
神經(jīng)球分析已成為分離哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且形成用于理解神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞的細(xì)胞和分子生物學(xué)的許多分析方法的核心。例如，此方法已被用于篩選對干細(xì)胞功能有影響的外源性信號因子(Shimazaki等，2001)，并有助于理解神經(jīng)干細(xì)胞的體內(nèi)生物學(xué)(Morshead等，1994；Alvarez-Buylla等，2001)。盡管在推進(jìn)本領(lǐng)域中此分析方法是具有價(jià)值的，但還是受到顯著的限制。
作為細(xì)胞群體，神經(jīng)球可被傳代至少10次，導(dǎo)致產(chǎn)生大量子代細(xì)胞，繼而可被分化為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的三種基本細(xì)胞類型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而滿足對干細(xì)胞的基本需求(Reynolds和Weiss，1996)。另外，各同源細(xì)胞衍生的神經(jīng)球可被裂解為單細(xì)胞，并且在促有絲分裂因子存在下，產(chǎn)生新的神經(jīng)球(自穩(wěn)定性)，子代細(xì)胞可被分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。目前假定神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的每一神經(jīng)球衍生于神經(jīng)干細(xì)胞。發(fā)明者得到意想不到的結(jié)果表明這是不正確的，神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的神經(jīng)球的增殖潛能不同。因此，盡管神經(jīng)球分析鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，但此方法中并非所有產(chǎn)生的神經(jīng)球都衍生于神經(jīng)干細(xì)胞。一些(也許大多數(shù))神經(jīng)球可以是具較有限增殖潛能并也可能是不同分化潛能的神經(jīng)祖細(xì)胞。由神經(jīng)球分析測定的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)是高估的，基于此結(jié)果的隨后解釋可能是不正確的。例如，圖2A和圖2B代表神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的神經(jīng)球群體。作為假設(shè)的例子，圖2A和圖2B之間的不同是圖2B中添加被稱為GF-X的多肽生長因子的結(jié)果。在此情況下，似乎GF-X的的添加導(dǎo)致神經(jīng)球數(shù)減少大約34％。在此特殊實(shí)驗(yàn)中這可解釋為GF-X對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖或存活的負(fù)調(diào)節(jié)影響。如果神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的所有神經(jīng)球都衍生于干細(xì)胞，此解釋是正確的，然而，如果情況并非如此則結(jié)論是不成立的。這樣實(shí)驗(yàn)的一個(gè)例子可見于美國專利US 5,851,832實(shí)施例43。在這些情況下，假定神經(jīng)球數(shù)量的變化反映了對神經(jīng)干細(xì)胞的影響，然而，除非神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的所有神經(jīng)球顯示衍生于干細(xì)胞，否則此假設(shè)是沒有事實(shí)根據(jù)的。因此，目前用于研究神經(jīng)干細(xì)胞的方法存在顯著不足。
因此，由先前的體外研究神經(jīng)干細(xì)胞的技術(shù)方法伴隨的前述不足來看，本領(lǐng)域需要能夠鑒別神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的體外分析方法。
還需要能夠根據(jù)增殖潛能鑒別不同神經(jīng)干細(xì)胞的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種可用于對多種類型神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定、鑒別、分離及定量的方法。
本發(fā)明涉及于三維半固體培養(yǎng)基中(如見圖12所示方法)進(jìn)行體外培養(yǎng)和增殖神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞的方法。一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞并能夠鑒別神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的方法。另一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定具有不同程度增殖潛能的神經(jīng)干細(xì)胞并能夠鑒別高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞和較低或較小增殖潛能的神經(jīng)干細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及一種根據(jù)集落大小、形態(tài)及抗原表達(dá)而鑒別多種類型神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至集落間可看出大小差別；及(d)估計(jì)集落大小，其中較大的集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，較小的集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
作為另一個(gè)實(shí)施方案，鑒定及鑒別多種類型神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)祖細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)可以基于初始集落內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生的集落形態(tài)。
因此，本發(fā)明還提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落形態(tài)，其中波形集落表明集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，具有平滑邊緣的集落表明集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的存在可通過檢測集落上未分化細(xì)胞或分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在而確定。因此，本發(fā)明還提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落的抗原表達(dá)，其中未分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在表明集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在表明集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
未分化細(xì)胞及神經(jīng)譜系相關(guān)抗原表達(dá)例如神經(jīng)巢蛋白(nestin)、sox2、Musashi、ABCG2、LeX、PNA、CD24及其它標(biāo)志物。中樞神經(jīng)系統(tǒng)分化細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)例如β微管蛋白、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)、O4、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、髓鞘堿性蛋白(MBP)及其它標(biāo)志物。
本發(fā)明提供了一種于半固體三維基質(zhì)中分離、增殖和擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞及其子代細(xì)胞的體外方法。本發(fā)明還提供了一種鑒別高增殖潛能(HPP)神經(jīng)干細(xì)胞和低增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞并區(qū)別神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的方法。
從下列詳細(xì)描述本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。然而，應(yīng)該知道由于根據(jù)此詳細(xì)描述本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，表示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和特定實(shí)施例僅通過舉例說明的方式給出。


現(xiàn)根據(jù)附圖描述本發(fā)明圖1第一代和第二代神經(jīng)球。將第14天胚胎皮質(zhì)離解為單細(xì)胞懸液，以500,000個(gè)細(xì)胞/ml的濃度于確定的含表皮生長因子(EGF)的無血清培養(yǎng)基中鋪板培養(yǎng)。鋪板培養(yǎng)三天后，鑒定附于基質(zhì)的小細(xì)胞簇群(A)。四天后可見漂浮于懸液中的同源細(xì)胞衍生神經(jīng)球(B)。收集神經(jīng)球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液并再次鋪板。第二代7天的神經(jīng)球(C)。
圖2神經(jīng)球分析中小鼠第14天胚胎皮質(zhì)產(chǎn)生的神經(jīng)球。表皮生長因子(EGF)存在下產(chǎn)生的7天神經(jīng)球的顯微照片。圖2A是于200ul孔中產(chǎn)生35個(gè)神經(jīng)球培養(yǎng)物的顯微照片，而另一培養(yǎng)物中僅產(chǎn)生23個(gè)神經(jīng)球(圖2B)。
圖3傳代大鼠E18皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的生長曲線。傳代10次后產(chǎn)生的總活性細(xì)胞理論數(shù)。數(shù)據(jù)代表連續(xù)傳代10次后，根據(jù)每一代計(jì)數(shù)的整分部分所產(chǎn)生細(xì)胞的可能總數(shù)。以1×106個(gè)細(xì)胞開始并在每一代保存所有細(xì)胞，通過傳代，產(chǎn)生了10，4.03×1015個(gè)細(xì)胞，這表明10周增加了109倍。
圖4分別對半固體膠原基礎(chǔ)培養(yǎng)基(神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析)或液體懸浮培養(yǎng)(神經(jīng)球分析)中培養(yǎng)的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落和神經(jīng)球的生長進(jìn)行了對照。
(A)在神經(jīng)球分析中，2DIV(體外培養(yǎng)天數(shù))時(shí)，許多附著于基質(zhì)的小神經(jīng)球開始形成。左上角是一個(gè)2DIV神經(jīng)球高倍放大。
(B)4DIV時(shí)同源細(xì)胞簇群已長大，大多數(shù)從基質(zhì)分離并漂浮于懸液中。左上角顯示一個(gè)4DIV神經(jīng)球的高倍放大。
(C)5-7DIV時(shí)大多數(shù)神經(jīng)球漂浮于懸液中，在這個(gè)時(shí)期準(zhǔn)備傳代。
(D)神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析1DIV時(shí)的一個(gè)分裂細(xì)胞。
(E)7DIV時(shí)神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中的集落得以很好地測定，其直徑范圍為40um-500um。
(F)14DIV時(shí)神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中許多集落仍相對較小，而其它細(xì)胞繼續(xù)長大。
圖5神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析及神經(jīng)球分析中的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落/神經(jīng)球數(shù)相似。在神經(jīng)球分析中2.4±0.9％(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤鋪板的神經(jīng)球/總細(xì)胞數(shù))的細(xì)胞形成神經(jīng)球，而神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中2.8±1.2％(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)鋪板細(xì)胞形成集落。
圖6神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的7天及14天集落。鋪板培養(yǎng)后7天(A)及14天(B)集落的顯微照片。14天時(shí)，鑒定三個(gè)不同集落大小(箭頭)。
圖7神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落大小比較。此分析中根據(jù)各集落直徑觀察了大范圍集落大小。為描述起見，發(fā)明者設(shè)立了四個(gè)分組(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
圖8神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落于四個(gè)大小分類中每一分類的相對頻數(shù)(A)如下所述，將2500個(gè)細(xì)胞鋪于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析培養(yǎng)基。21天后，計(jì)數(shù)四個(gè)不同大小分類的集落數(shù)。
(B)當(dāng)圖6A中數(shù)據(jù)以集落大小占總集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)時(shí)，大于70％的集落直徑＜0.5mm，而大的、高增殖集落占總集落數(shù)的大約2％。
(C)細(xì)胞總數(shù)相關(guān)的集落頻數(shù)(％)(如圖7由集落大小再分)顯示少于3％的鋪板細(xì)胞總數(shù)增殖并形成集落。此3％中，大多數(shù)(2.23％)產(chǎn)生小集落(直徑＜0.5mm)，表明較有限的增殖潛能，這些集落繼續(xù)是小集落，鋪板細(xì)胞很小一部分(0.06％)是高增殖潛能并形成大集落(＞2mm)。
圖9神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生集落的鑒定和切除，及從液體培養(yǎng)基中集落分離細(xì)胞的繼后傳代。
(A)于解剖顯微鏡下鑒定有關(guān)集落，并在無菌條件下，使用顯微解剖剪從半固體培養(yǎng)基基質(zhì)中切除集落。
(B)將切除的集落轉(zhuǎn)移至膠原蛋白酶溶液中并于37℃培育30分鐘。
(C)以200ul Gilson移液吸頭分散基質(zhì)來分裂集落，制備單細(xì)胞懸液(D)將細(xì)胞鋪板于24孔培養(yǎng)板的含EGF確定無血清培養(yǎng)基一個(gè)單孔中。
(E)7-10天后產(chǎn)生神經(jīng)球。
圖10小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的高增殖潛能(HPP)集落的第二代和第三代神經(jīng)球(A)切除之前一個(gè)高增殖潛能集落(直徑2.1mm)。
(B)7DIV時(shí)由(A)分離的細(xì)胞形成大量神經(jīng)球(二代集落)。
(C)(B)中一個(gè)區(qū)域的高倍放大。
(D)來自(B)的神經(jīng)球于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代，于7DIV時(shí)產(chǎn)生第三代神經(jīng)球。
(E)(D)中一個(gè)區(qū)域的高倍放大。
圖11產(chǎn)生第二代和第三代神經(jīng)球的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落百分?jǐn)?shù)。100％直徑＞2mm的集落產(chǎn)生第二代集落，直徑為1-2mm、0.5-1mm及＜0.5mm的集落分別有71％、43％及25％產(chǎn)生第二代神經(jīng)球。第三代集落形成僅見于那些直徑＞2mm及1-2mm(分別為100％及50％)，在直徑＜1mm的集落未見第三代神經(jīng)球形成。
圖12是本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。
圖13對于小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的直徑＞2mm集落觀察到的不同集落形態(tài)。直徑＞2mm分類的集落中觀察到許多種集落形態(tài)。
圖14對于小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的直徑1-2mm集落觀察到的不同集落形態(tài)。直徑1-2mm分類的集落中觀察到許多種集落形態(tài)。
圖15對于小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的直徑0.5-1mm集落觀察到的不同集落形態(tài)。直徑0.5-1mm分類的集落中觀察許多種集落形態(tài)。
圖16對于小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的直徑＜0.5mm集落觀察到的不同集落形態(tài)。直徑＜0.5mm分類的集落中觀察許多種集落形態(tài)。
圖17產(chǎn)生第二代及第三代神經(jīng)球的小鼠原始第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落百分?jǐn)?shù)。100％直徑＞2mm的集落產(chǎn)生第二代集落，直徑為1-2mm、0.5-1mm及＜0.5mm的集落分別有50％、36％及17％產(chǎn)生第二代神經(jīng)球。第三代集落形成僅見于直徑＞2mm及1-2mm的集落(分別為100％和8.3％)。在直徑小于1mm的集落未見第三代神經(jīng)球形成。
圖18直徑＞2mm集落產(chǎn)生的第二代神經(jīng)球的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞免疫染色。圖例說明以β微管蛋白抗體染色的神經(jīng)元顯示紅色(A)，以膠質(zhì)纖維性酸性蛋白質(zhì)(GFAP)抗體染色的星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示綠色(B)，以O(shè)4抗體染色的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯示藍(lán)色(C)。
圖19神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生集落的原位免疫染色。
小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的直徑＞2mm(A)、直徑1-2mm(B)、直徑0.5-1mm(C)及直徑＜0.5mm(D)的集落內(nèi)未分化細(xì)胞以神經(jīng)巢蛋白抗體染色顯示紅色。
圖20神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中四個(gè)大小分類每一分類中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落相對頻數(shù)(A)如下述實(shí)施例12中描述，于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析培養(yǎng)基中鋪板7500個(gè)細(xì)胞。21天后，將集落分成四個(gè)大小分類，計(jì)數(shù)四個(gè)不同大小分類中的集落數(shù)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
(B)當(dāng)給定大小分類的集落數(shù)(圖20A)以總集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示時(shí)，50％的集落直徑＜0.5mm，而直徑＞2mm的集落占總集落數(shù)的大約16％(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
(C)每細(xì)胞總數(shù)的集落(給定大小分類)頻數(shù)(％)顯示小于0.6％的總鋪板細(xì)胞增殖并形成集落。這0.6％中，大多數(shù)(0.29％)產(chǎn)生小集落(直徑＜0.5mm)，表明較有限的增殖潛能，這些集落繼續(xù)是小集落。鋪板細(xì)胞總數(shù)的很小一部分(0.08％)為高增殖潛能并形成大集落(直徑＞2mm)(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
圖21神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中分離了產(chǎn)生直徑＞2mm集落的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞，離解并于液體懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代(神經(jīng)球分析)以產(chǎn)生第三代神經(jīng)球。將第三代神經(jīng)球分離成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，2500個(gè)細(xì)胞于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中鋪板培養(yǎng)21天。圖21顯示了起始神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中由直徑＞2mm細(xì)胞產(chǎn)生的第三代神經(jīng)球獲得的2500個(gè)細(xì)胞的集落頻數(shù)(給定大小的分類中)。神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中來自直徑＞2mm集落的細(xì)胞當(dāng)再次鋪板培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生四個(gè)分類的集落。細(xì)胞總數(shù)相關(guān)的集落(指定大小分類)頻數(shù)(％)顯示總鋪板細(xì)胞的2.5％(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)增殖并形成集落。這2.5％中，大多數(shù)(1.8％)產(chǎn)生產(chǎn)生小集落(直徑＜0.5mm)，表明較有限的增殖潛能。這些集落繼續(xù)是小集落。總鋪板細(xì)胞的很小一部分(0.02％)為高增殖，并形成大集落(直徑＞2mm)。
圖22起源自四個(gè)直徑＞2mm的集落(神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中產(chǎn)生)細(xì)胞的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞于液體培養(yǎng)(神經(jīng)球分析)的長期擴(kuò)增。在長期的神經(jīng)球(超過3代)培養(yǎng)物中對來自四個(gè)直徑＞2mm的集落(描述為Large(L)1、L2、L3及L4)的細(xì)胞進(jìn)行傳代，顯示第6次傳代時(shí)高倍擴(kuò)增。
圖23來自大鼠第18天胚胎(E18)皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析集落。神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中大鼠第18天胚胎(E18)皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生直徑1-2mm的兩個(gè)集落。
圖24神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中來自大鼠第18天胚胎(E18)皮質(zhì)細(xì)胞的四個(gè)大小分類每一分類集落的相對頻數(shù)(A)如下述實(shí)施例16中描述，于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析培養(yǎng)基中鋪板7500個(gè)細(xì)胞。21天后，計(jì)數(shù)四個(gè)不同大小分類中的集落數(shù)。
(B)當(dāng)圖24A的數(shù)據(jù)以集落(在給定大小分類中)/集落總數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示時(shí)，大于77％的集落直徑＜0.5mm，而大的、高增殖集落占集落總數(shù)的大約0.2％。
(C)集落/細(xì)胞總數(shù)的(特定大小分類)頻數(shù)(％)圖25神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中成體小鼠室下區(qū)(SVZ)細(xì)胞產(chǎn)生的不同大小集落(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
圖26神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中由人胎兒皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的不同大小集落。與成體及胚胎神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的集落相比，所產(chǎn)生的不同集落細(xì)胞更為分散(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
圖27神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中添加EGF、FGF或EGF+FGF的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的集落頻數(shù)(/鋪板細(xì)胞總數(shù))顯示了集落大小分布。
圖28神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生集落的原位免疫染色。在直徑＞2mm(A，B，顯示集落輪廓)、直徑為1-2mm(C、D)、直徑0.5-1mm(D)及直徑＜0.5mm(E)的集落中，以β微管蛋白抗體染色顯示紅色的β微管蛋白+細(xì)胞，圖29神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中半固體甲基纖維素培養(yǎng)基和小鼠第14天胚胎皮質(zhì)細(xì)胞的使用。使用半固體甲基纖維素培養(yǎng)基的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎皮質(zhì)細(xì)胞形成集落(A-10×、B-10×、C-B的40×放大)。
本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明提供了對來自胚胎干細(xì)胞(ES)、胚胎、出生后或成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞及祖細(xì)胞在三維半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)增殖的方法。本發(fā)明涉及了根據(jù)增殖潛能對多種類型神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別及鑒別不同神經(jīng)干細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及了根據(jù)集落形態(tài)對多種類型神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別及鑒別不同神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)的未分化細(xì)胞的詳細(xì)定義可見US patent 5,750,376。然而，簡要地，本發(fā)明中的細(xì)胞可定義如下神經(jīng)祖細(xì)胞-本身非干細(xì)胞的未分化細(xì)胞。神經(jīng)祖細(xì)胞具有增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的能力。因此，神經(jīng)祖細(xì)胞可為單向、雙能或多能的。神經(jīng)祖細(xì)胞一個(gè)明顯的特征是，與干細(xì)胞不同，它具有有限的增殖能力并無自穩(wěn)定性。
神經(jīng)干細(xì)胞-如本發(fā)明所使用，是指能無限分裂并能產(chǎn)生最終分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的子細(xì)胞的寡能或多能細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞能夠自穩(wěn)定并產(chǎn)生大量子代細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的非干細(xì)胞子代被稱為神經(jīng)祖細(xì)胞。
前體細(xì)胞-如本發(fā)明所使用，是指神經(jīng)干細(xì)胞子代，因此包括神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。
鑒定中樞神經(jīng)系統(tǒng)中未分化細(xì)胞的這些術(shù)語的不恰當(dāng)使用已導(dǎo)致研究神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞的混亂和曲解。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以根據(jù)集落大小鑒別神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)祖細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；
(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至集落間可看出差別；及(d)估計(jì)集落大小，其中較大的集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種鑒定神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至集落間可看出差別；及(d)估計(jì)集落大小，其中較小的集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
神經(jīng)細(xì)胞可來自任何合適的來源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞來自原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或培養(yǎng)的神經(jīng)球。神經(jīng)細(xì)胞可來自任何種類的動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更為優(yōu)選地為嚙齒類動(dòng)物或靈長類動(dòng)物如小鼠、大鼠或人類。神經(jīng)細(xì)胞可來自神經(jīng)軸任何部位包括但不限于紋狀體、中隔、皮質(zhì)、腹側(cè)中腦、中腦、小腦或脊髓的原始胚胎、出生后或成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。
例如，可以使用下列方式而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從小鼠胚胎(如第14天胚胎)切除紋狀體或皮質(zhì)。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用合適的培養(yǎng)基稀釋成約8.0×104個(gè)細(xì)胞/mL-7.0×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度，優(yōu)選地約2×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度，優(yōu)選地添加EGF(如10-50ng/ml，優(yōu)選地20ng/ml)。神經(jīng)干細(xì)胞合適的培養(yǎng)基包括NeuroCultTM培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.)及任何含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基(如MEM、DMEM/F12、Iscove’s、McKoy’s、RPMI)，其中添加有葡萄糖、HEPES及碳酸氫鈉；增殖添加物包括的成分如胰島素、脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、四甲烯二胺、亞硒酸鈉、垂體浸膏(O’Connor等，1996)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
另外，來自培養(yǎng)的神經(jīng)球的細(xì)胞也可以用于分析。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從小鼠胚胎切除紋狀體或皮質(zhì)。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，于合適的培養(yǎng)基如含約20ng/ml EGF的NeuroCultTM完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中鋪板培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞7天以產(chǎn)生用于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析的神經(jīng)球。從培養(yǎng)物收集第7天的神經(jīng)球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用合適的培養(yǎng)基如優(yōu)選地含生長因子(如EGF)的NeuroCult完全培養(yǎng)基稀釋成優(yōu)選的約2.0×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
然后于半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞。任何支持細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基均可使用。優(yōu)選地，半固體培養(yǎng)基是以膠原為基礎(chǔ)或以甲基纖維素為基礎(chǔ)(IMDM、DMEM/F12、McKoy’s、Iscoves)。半固體培養(yǎng)基可以包括其中添加膠原或甲基纖維素的用于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的同樣合適的培養(yǎng)基(如無細(xì)胞因子的Neurocult無血清培養(yǎng)基、NeurocultTM增殖添加物及EGF)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基以使足夠數(shù)量集落以進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的濃度(如1000-25,000個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選地2500-7500個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿)進(jìn)行鋪板培養(yǎng)半固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞。所形成的集落來自單細(xì)胞-神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞。培養(yǎng)集落至集落大小間可觀察到大小和差別(如約10-30天)，于評分板上使用網(wǎng)格進(jìn)行集落計(jì)數(shù)并估計(jì)集落大小。來自單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞的集落將隨時(shí)間繼續(xù)增大，而來自神經(jīng)祖細(xì)胞的集落將具有有限的生長能力，因此不會隨時(shí)間繼續(xù)增大。集落大小將鑒別高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞(HPP-NSC)、低增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞(LPP-NSC)及神經(jīng)祖細(xì)胞。因此，所產(chǎn)生的集落大小可預(yù)見集落來自神經(jīng)干細(xì)胞還是神經(jīng)祖細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞具有高增殖潛能還是低增殖潛能。特別地，較大的集落(與培養(yǎng)皿上其它集落相比)表明是高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞，中等大小集落表明是低增殖潛能神經(jīng)祖細(xì)胞，較小集落表明是神經(jīng)祖細(xì)胞?！拜^大集落”或“較小集落”的實(shí)際直徑取決于許多因素，如集落培養(yǎng)的時(shí)間有多久，等等。例如，2500個(gè)細(xì)胞/板培養(yǎng)14-28天后，將集落歸為根據(jù)直徑劃分的四個(gè)分類之一(1)＞2.0mm，(2)1-2mm，(3)0.5-1mm及(4)＜0.5mm。因此，假定集落培養(yǎng)了至少14天，直徑＞2.0mm指示表明是產(chǎn)生于神經(jīng)干細(xì)胞的集落。
也可以根據(jù)所產(chǎn)生集落的形態(tài)鑒別細(xì)胞類型。因此，本發(fā)明提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括
(a)于支持神經(jīng)干細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落形態(tài)，其中波形集落的存在表明集落是由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種鑒定神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)祖細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落形態(tài)，其中平滑邊緣集落的存在表明集落是由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
在上述根據(jù)集落形態(tài)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法中，神經(jīng)細(xì)胞來源及分析培養(yǎng)基和條件按照上述根據(jù)集落大小的分析方法。
如實(shí)施例6中所述，不同大小的集落表現(xiàn)不同的形態(tài)。關(guān)于直徑＞2mm的集落，某些情況下，集落表面邊緣含有突出，突出下致密細(xì)胞層形成波形。其它直徑＞2mm的集落具有由集落的顏色強(qiáng)度所反映的不同程度細(xì)胞密度。在某些情況下，大集落中心具有深色的細(xì)胞圈。直徑為1-2mm和0.5-1mm集落也可觀察到不同的集落形態(tài)。直徑1-2mm的集落特征包括毛狀邊緣和相差上黑暗的致密中心核。其它直徑1-2mm的集落具有更均一的細(xì)胞簇群。有些直徑0.5-1mm的集落具有密集的中心和平滑的表面，而其它則具有星形外表面。此大小范圍的某些集落顯示相差上非常黑暗及致密。直徑＜0.5mm的某些集落所觀察到的集落形態(tài)不如其它大小分類的集落所觀察到的明顯。某些情況下，在直徑＜0.5mm的小集落觀察到致密中心核。
在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)干細(xì)胞的存在可以通過測定集落的抗原表達(dá)而估計(jì)。因此，本發(fā)明提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)干細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落的抗原表達(dá)，其中未分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在表明集落是由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種鑒定神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)祖細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)測定集落的抗原表達(dá)，其中特定神經(jīng)譜系相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)志物存在表明集落是由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
在上述根據(jù)抗原表達(dá)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法中，神經(jīng)細(xì)胞來源及分析培養(yǎng)基和條件按照上述根據(jù)集落大小的分析方法。
集落的抗原表達(dá)可通過針對未分化細(xì)胞標(biāo)志物的抗體(如抗神經(jīng)巢蛋白、sox、sox2、musashi、LexA、CD24)及針對分化細(xì)胞抗體標(biāo)志物的抗體(抗β微管蛋白、GFAP、O4、MAP2、MBP)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色而測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測定其它合適的標(biāo)志物。在一個(gè)實(shí)施方案中，對集落進(jìn)行了表明神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)巢蛋白表達(dá)檢測。在另一實(shí)施方案中，對集落進(jìn)行了表明神經(jīng)祖細(xì)胞的的β微管蛋白表達(dá)檢測。
為便于介紹，本發(fā)明上述鑒別神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的分析方法(如大小、形態(tài)或抗原表達(dá))可共同稱作神經(jīng)集落形成細(xì)胞(NCFC)測定。
考慮到神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析能夠鑒定不同的神經(jīng)干細(xì)胞并鑒別神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞，此方法可用于篩選潛在治療成分的功效(針對特定神經(jīng)干細(xì)胞亞型的藥物)或毒性(針對除神經(jīng)干細(xì)胞外的組織/細(xì)胞的藥物)?？梢圆煌瑒┝繉⒛康某煞謶?yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞，并監(jiān)測神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的反應(yīng)。例如，可以測定成分對神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞增殖的影響，蛋白質(zhì)如酶、受體、神經(jīng)遞質(zhì)及氨基酸的新表達(dá)或水平增加可以使用本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行分析。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析也可用于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)體內(nèi)處理的效應(yīng)(遺傳或后生)及其對神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞的影響或用于研究治療非中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的成分的非目的效應(yīng)，及此成分可能對神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的次級效應(yīng)或副作用。在此情況下，使用成分處理動(dòng)物，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離細(xì)胞，采用神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法評價(jià)成分對神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、基因表達(dá)和/或蛋白表達(dá)的作用。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析的應(yīng)用可包括藥物篩選、診斷疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)、檢測周圍環(huán)境對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，如由輻射、毒物、刺激或環(huán)境強(qiáng)化引起的影響，以及評估中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法的其它應(yīng)用是篩選衰老、飲食攝入及運(yùn)動(dòng)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法可用于神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)研究及信號、生長因子、激素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及神經(jīng)遞質(zhì)的鑒定。例如，神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析的應(yīng)用可包括在神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物學(xué)(肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化癥、癌癥、腦腫瘤或瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)行性腫瘤、亨延頓氏舞蹈病)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷生物學(xué)(脊髓，手術(shù)修復(fù))、神經(jīng)學(xué)綜合征(精神分裂癥)生物學(xué)及衰老和記憶喪失生物學(xué)方面的研究。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法的其它用途包括評估腦功能的增強(qiáng)、疼痛的感覺、損傷后愈合、成癮、記憶喪失及行為失常。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂如神經(jīng)變性疾病(如多發(fā)性硬化癥、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、亨延頓氏舞蹈病)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)、顱腦損傷、脊髓損傷、腦性麻痹)涉及神經(jīng)細(xì)胞的退化、機(jī)能障礙或神經(jīng)細(xì)胞丟失。預(yù)期神經(jīng)干細(xì)胞移植可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的此類疾病或紊亂。因此，本發(fā)明的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析方法可用于評價(jià)治療用細(xì)胞制品的質(zhì)量。根據(jù)此方法鑒定的神經(jīng)干細(xì)胞也可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的治療。
以下非限制性實(shí)施例說明了本發(fā)明具體實(shí)施方式
實(shí)施例1使用小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析(NCFC)神經(jīng)細(xì)胞可來自鼠類、嚙齒類動(dòng)物及人類神經(jīng)軸任何部位(包括但不限于紋狀體、中隔、皮質(zhì)、腹側(cè)中腦、中腦、小腦或脊髓)的原始胚胎、出生后或成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。神經(jīng)細(xì)胞還可從使用神經(jīng)球分析或神經(jīng)組織培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法而產(chǎn)生的培養(yǎng)細(xì)胞獲得。根據(jù)培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的任何標(biāo)準(zhǔn)程序，神經(jīng)細(xì)胞還可從任何時(shí)期的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物獲得。
例如，使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1 albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除紋狀體和/或皮質(zhì)。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
另外，來自培養(yǎng)的神經(jīng)球的細(xì)胞也可用于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，于添加20ng/ml EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中鋪板。培養(yǎng)細(xì)胞7天以產(chǎn)生用于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析的神經(jīng)球。從培養(yǎng)物收集第7天的神經(jīng)球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過。
使用NeuroCult 完全培養(yǎng)基(StemCell Technologies Inc.)將從上述兩個(gè)例子任一例產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按2500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)并估計(jì)集落大小。
實(shí)施例2半固體培養(yǎng)(神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析)與液體懸浮培養(yǎng)(神經(jīng)球分析)小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)集落的生長按上述實(shí)施例1詳述，從小鼠原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或神經(jīng)球第7天的培養(yǎng)物分離細(xì)胞。簡言之，使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除紋狀體和/或皮質(zhì)。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，于NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)中稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
另外，如前所述，來自培養(yǎng)神經(jīng)球的細(xì)胞也可以用于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，于含20ng/ml EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中鋪板。培養(yǎng)細(xì)胞7天以產(chǎn)生用于神經(jīng)集落形成分析的神經(jīng)球。從培養(yǎng)物收集第7天的神經(jīng)球，機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過。
使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(StemCell Technologies Inc.)將上述兩個(gè)例子產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按2500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。
圖4顯示了如圖例說明所列的培養(yǎng)數(shù)天后神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析及神經(jīng)球分析中形成的神經(jīng)球的形態(tài)。圖5顯示了神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中產(chǎn)生的集落數(shù)與神經(jīng)球分析中產(chǎn)生的集落數(shù)相似?？傊?，在神經(jīng)球分析和神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中分別形成了相似數(shù)量的神經(jīng)球和集落。這表明，神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中使用的培養(yǎng)條件不抑制EGF敏感細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例3在使用小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中集落大小和天數(shù)之間的關(guān)系按上述實(shí)施例1詳述，從小鼠原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或神經(jīng)球第7天的培養(yǎng)物分離細(xì)胞。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)4-7天，神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞開始增殖(圖6A)形成小集落。14天時(shí)，這些小集落已經(jīng)增大，集落間可看到差別(圖6B)。大約10-14天后許多集落停止生長，而其它集落繼續(xù)擴(kuò)增。21-28天時(shí)，集落可分為至少4類1)直徑＞2mm，2)直徑為1-2mm，
3)直徑為0.5-1mm及4)直徑＜0.5mm(圖7)。
實(shí)施例4神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生不同集落類型的大小和不同大小集落的頻數(shù)估計(jì)集落大小及對集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，對這些大小分類每一分類的集落頻數(shù)進(jìn)行繪圖(圖8A)。這可以表示為鋪板細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖8B)或產(chǎn)生總集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖8C)。大多數(shù)(76％)產(chǎn)生的集落＜0.5mm，很小一部分(2.3％)形成直徑＞2mm的大集落。
實(shí)施例5從不同大小集落的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生不同大小集落分離的細(xì)胞的增殖潛能通過以下程序測定不同大小集落細(xì)胞的增殖潛能。從膠原基質(zhì)切除而分離四個(gè)大小分類的集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中37℃培育30分鐘(圖9)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至24孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(神經(jīng)球分析)，于添力EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用新鮮培養(yǎng)基中重新鋪板培養(yǎng)。每10-14天重復(fù)一次這樣的操作。按上面詳述(圖9)從神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中分離高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞(HPP-NSC)集落。在這些培養(yǎng)條件下，從直徑為2mm或更大的集落(HPP-NSC集落)而非直徑＜0.5mm的集落產(chǎn)生生長因子敏感的細(xì)胞系(圖10B-C)。
實(shí)施例6小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生不同的集落形態(tài)按上述實(shí)施例1詳述，從小鼠原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或神經(jīng)球第7天的培養(yǎng)物分離細(xì)胞。
神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)4-7天，神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞開始增殖(圖6A)形成小集落。14天時(shí)，這些小集落已經(jīng)不同程度生長，可觀察到不同大小的集落(圖6B)。大約10-14天后許多集落停止生長，而其它集落繼續(xù)擴(kuò)增。21-28天時(shí)，集落可分為至少4類1)直徑＞2mm，2)直徑1-2mm，3)直徑0.5-1mm及4)直徑＜0.5mm(圖7)。21-28天時(shí)，可觀察到不同集落大小分類的集落形態(tài)差別，通過顯微鏡直接對來自四個(gè)大小分類的集落進(jìn)行拍照，記錄形態(tài)差別(圖13-16)。從膠原基質(zhì)切除而分離四個(gè)大小分類的集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中37℃培育30分鐘(圖9)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至24孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(神經(jīng)球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分散并使用新鮮培養(yǎng)基重新鋪板培養(yǎng)。每14天重復(fù)一次這樣的操作。按上面詳述(圖9)從神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中分離高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞(HPP-NSC)集落。在這些培養(yǎng)條件下，從直徑為2mm或更大的集落(HPP-NSC集落)而非直徑＜0.5mm的集落(圖11)產(chǎn)生生長因子敏感的細(xì)胞系(圖10B-C和圖11)。
直徑＞2mm的集落所觀察的不同集落形態(tài)示于圖13。在某些情況下，集落表面邊緣含有突出，于突出下具有致密細(xì)胞層形成波形(圖13A)。其它直徑＞2mm的集落具有由集落顏色強(qiáng)度反映的不同程度細(xì)胞密度(圖13B和圖13C)。在某些情況下，大集落的中心具有深色的細(xì)胞圈(圖13D)。
直徑1-2mm和0.5-1mm的集落也可觀察到不同的集落形態(tài)(圖14和圖15)。直徑1-2mm集落的特征包括毛狀邊緣(圖14C)，及相差上為黑暗的致密中心核(圖14A和14B)。直徑1-2mm的其它集落具有較均一的細(xì)胞簇(圖14D)。
有些直徑0.5-1mm的集落(圖15)具有致密中心和平滑表面(分別為15A及15B)，而其他的則具有星狀的外表面(圖15C)。此大小范圍的有些集落在相差上非常黑暗及致密。(圖15D)直徑＜0.5mm的集落觀察到的集落形態(tài)不如其它大小分類的集落觀察到的明顯(圖16A-D)。在某些情況下，在直徑＜0.5mm的小集落觀察到致密中心核(圖16D)。
如上所述，在神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的定義中，神經(jīng)干細(xì)胞具有廣泛的增殖潛能而神經(jīng)祖細(xì)胞具有有限的增殖潛能。大集落可被重復(fù)傳代的能力支持其最初來源于神經(jīng)干細(xì)胞的結(jié)論，另外，小集落不能持續(xù)增殖及產(chǎn)生大量的子細(xì)胞支持其非干細(xì)胞衍生而是神經(jīng)祖細(xì)胞的結(jié)論。因此，神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析能夠鑒別具有不同增殖潛能(高及低增殖潛能)的細(xì)胞。
實(shí)施例7神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析-小鼠第14天胚胎紋狀體中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織神經(jīng)細(xì)胞來自小鼠原始胚胎稱作紋狀體的神經(jīng)軸區(qū)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40mm尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(StemCell Technologies Inc.)將從上述例子產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按2500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。
實(shí)施例8神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中使用小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的不同集落類型的大小及不同大小集落的頻數(shù)估計(jì)集落大小及對集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，這些大小分類每一分類的集落頻數(shù)總結(jié)于表1中。此結(jié)果以鋪板細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示(表1)。鋪板細(xì)胞總數(shù)的0.52-1.1％不同程度增殖并形成不同大小的集落。鋪板細(xì)胞總數(shù)的很小一部分(0.09％)形成大集落(＞2mm)。大多數(shù)形成的集落＜1mm(0.5％)表明較有限的增殖潛能。
實(shí)施例9不同大小集落中小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞的增殖潛能通過以下程序判斷不同大小集落的增殖潛能。從膠原基質(zhì)切除而分離四個(gè)大小分類的集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中于37℃培育30分鐘(圖9)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至24孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(神經(jīng)球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用新鮮培養(yǎng)基重新鋪板。每10-14天重復(fù)一次這樣的操作。直徑＞2mm的集落始終產(chǎn)生第二代和第三代神經(jīng)球(圖17)。長期培養(yǎng)中，來自第三代神經(jīng)球的細(xì)胞增殖、擴(kuò)增及保持多譜系潛能，表明最初的神經(jīng)集落形成細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。直徑1-2mm、直徑0.5-1mm及直徑＜0.5mm的集落中的細(xì)胞分別有50％、36％和17％產(chǎn)生第二代神經(jīng)球。直徑1-2mm的集落細(xì)胞有8.3％產(chǎn)生第三代神經(jīng)球，然而這些細(xì)胞不能被傳代。直徑＜1mm的集落細(xì)胞不產(chǎn)生第三代神經(jīng)球，表明最初的神經(jīng)集落形成細(xì)胞無發(fā)明背景中描述的神經(jīng)干細(xì)胞的所有特征，為神經(jīng)祖細(xì)胞。
實(shí)施例10小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞直徑＞2mm集落產(chǎn)生的第二代神經(jīng)球的多譜系分化潛能通過以下程序判斷直徑＞2mm集落的多譜系增殖潛能。從膠原基質(zhì)切除而分離直徑＞2mm的各集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中37℃培育30分鐘(圖9中方法圖示)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至24孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(神經(jīng)球分析)，于使用添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分離，將來自集落的所有細(xì)胞鋪于含0.8mL添加1％血清的NeuroCultTM完全培養(yǎng)基的#35-4688Becton Dickinson BioCoat 8孔小室載玻片(預(yù)先包被多聚-D-賴氨酸層粘連蛋白)上。在這些培養(yǎng)條件下細(xì)胞分化，然后使用以下程序進(jìn)行進(jìn)一步的免疫染色處理。6-8天后使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)物以確定細(xì)胞是否已分化及具有活力。在分化過程中根據(jù)鋪板的細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)基是否變?yōu)樗嵝?變成黃色/橙黃色)而更換培養(yǎng)基。通過去除大約50％的培養(yǎng)基并代以新鮮的添加1％血清的NeuroCult TM完全培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。
培養(yǎng)10天后，從含分化細(xì)胞的每小室去除培養(yǎng)基(小心不要去除所有培養(yǎng)基而將未固定細(xì)胞暴露于空氣)，將1mL 4％的對甲醛溶液直接添加至小室中。于室溫培育細(xì)胞30分鐘。通過連接至真空抽氣機(jī)的吸引系統(tǒng)抽吸對甲醛溶液，于標(biāo)本中添加PBS(pH 7.2)并培育5分鐘。再重復(fù)此清洗過程三個(gè)步驟2次。然后，通過于每孔添加1mL含0.3％Triton X-100的PBS透化細(xì)胞，室溫培育5分鐘。5分鐘后，通過抽吸去除PBS/TritonX-100，用PBS進(jìn)行兩次5分鐘清洗。
標(biāo)本以針對神經(jīng)元的特定譜系標(biāo)志物β微管蛋白、針對星形膠質(zhì)細(xì)胞的特定譜系標(biāo)志物GFAP及針對少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特定譜系標(biāo)志物O4的一抗進(jìn)行標(biāo)記，用含10％山羊血清的稀釋溶液以最佳工作稀釋度(β微管蛋白抗體以1∶1000使用，GFAP抗體以1∶100使用及O 4抗體以1∶50使用)稀釋一抗。將250ul稀釋抗體直接添加至小室中，所有樣本于37℃培育2小時(shí)。培育之后，使用PBS進(jìn)行三次5分鐘的清洗，以去除一抗。然后，以含2％血清(與一抗所用稀釋液相同的血清)的PBS稀釋二抗-德克薩斯紅染料標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)、AMCA標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)及μ鏈特異的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM，并添加至每孔載玻片上，于37℃與250ul二抗培育樣本30分鐘，培育之后，使用PBS進(jìn)行三次5分鐘的清洗，以去除二抗。依照廠家說明書從載玻片去除小室。于每一小室孔添加5ul封固劑，然后蓋上75mm蓋玻片以免產(chǎn)生氣泡。于熒光顯微鏡下使用適于每種熒光基團(tuán)的濾光片觀察免疫熒光。
由直徑＞2mm集落產(chǎn)生的第二代神經(jīng)球所分離的細(xì)胞能夠產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種細(xì)胞表現(xiàn)型-神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖18)，表明原始神經(jīng)集落形成細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。
實(shí)施例11神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生集落的原位免疫染色由于膠原凝膠可被干燥及染色，神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中形成的集落還可進(jìn)行直接原位免疫細(xì)胞化學(xué)染色。神經(jīng)集落的生長、脫水、固定及染色均在35mm培養(yǎng)皿及超大(75mm×50mm)載玻片上進(jìn)行。根據(jù)以下程序進(jìn)行神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中的集落的原位染色。將裝有大約200ml丙酮的容器置于冰上最少15分鐘。從培養(yǎng)箱中取出神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中使用的35mm培養(yǎng)皿，并去除培養(yǎng)皿蓋。含膠原凝膠及包埋集落的每個(gè)培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)至75mm×50mm超大載玻片上。將預(yù)切的聚丙烯隔膜連同一白色厚濾光卡片置于膠原凝膠上以使液體浸透卡片。然后去除白色厚卡片，保留原先的聚丙烯隔膜。將含有膠原凝膠和隔膜的整個(gè)載玻片水平放入一合適的充滿約200ml冷丙酮的塑料容器中。聚丙烯隔膜浮出，留下膠原凝膠在載玻片上。將載玻片置丙酮中5分鐘。從固定劑中取出載玻片，垂直風(fēng)干。將載玻片置于裝有4％對甲醛溶液的塑料容器中，標(biāo)本于室溫培育30分鐘。倒出對甲醛溶液，于標(biāo)本中添加約20ml PBS(pH 7.2)，室溫培育5分鐘。再重復(fù)此清洗過程三個(gè)步驟2次。然后，通過于含載玻片的塑料容器中添加20mL含0.3％Triton X-100的PBS透化細(xì)胞，標(biāo)本于室溫培育5分鐘。5分鐘后，倒出PBS/Triton X-100，用PBS清洗兩次，每次5分鐘。
然后以針對未分化神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物神經(jīng)巢蛋白的一抗標(biāo)記標(biāo)本，以含10％山羊血清的PBS 1∶50稀釋抗神經(jīng)巢抗體，然后向載玻片上的脫水膠原凝膠直接添加約500ul稀釋的抗體，于抗體溶液上鋪一層石蠟?zāi)ぁＫ袠?biāo)本于37℃培育2小時(shí)。培育之后，使用PBS進(jìn)行三次5分鐘的清洗，以去除一抗。然后，以含2％山羊血清的PBS稀釋二抗-得克薩斯紅標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)，直接添加至載玻片上的脫水膠原凝膠上。于抗體溶液上鋪一層石蠟?zāi)?。將?biāo)本與二抗在37℃培育30分鐘。培育之后，使用PBS進(jìn)行三次5分鐘的清洗以去除二抗，在每一脫水的膠原凝膠中心添加5ul封固劑，然后蓋上蓋玻片以免產(chǎn)生氣泡。于熒光顯微鏡下使用適于每種熒光基團(tuán)合的合適濾光片觀察免疫熒光。
直徑＞2mm集落的細(xì)胞神經(jīng)巢蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性，這些集落的大多數(shù)細(xì)胞為神經(jīng)巢蛋白染色(圖9A)。與直徑＞2mm的集落細(xì)胞相比，直徑1-2mm(圖19B)和直徑0.5-1mm(圖19C)的集落含有較少數(shù)量神經(jīng)巢蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞，而直徑＜0.5mm的集落神經(jīng)巢蛋白陽性細(xì)胞數(shù)最少(圖19D)。這表明與直徑＜2mm的集落相比，直徑＞2mm的集落含有包括神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的未分化細(xì)胞數(shù)量較多。
實(shí)施例12使用數(shù)量增加的小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析神經(jīng)細(xì)胞來自小鼠原始胚胎稱作紋狀體神經(jīng)軸區(qū)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀釋成6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。此細(xì)胞濃度是實(shí)施例1中用于第2次2傳代的第14天胚胎紋狀體神經(jīng)球及實(shí)施例7中原始紋狀體細(xì)胞濃度(2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL)的三倍。6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度產(chǎn)生7500個(gè)鋪板細(xì)胞總數(shù)/35mm培養(yǎng)皿，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生合適數(shù)量進(jìn)行評分的集落。
使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(StemCell Technologies Inc.)將從上述例子產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞單細(xì)胞懸液稀釋成6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。
實(shí)施例13神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織產(chǎn)生不同集落類型的大小及不同大小集落的頻數(shù)如實(shí)施例12所述，在神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)來自原始胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的細(xì)胞。估計(jì)集落大小及對集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，對這些大小分類的每一分類的集落頻數(shù)繪圖(圖20)。這可以表示為鋪板細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖20C)或產(chǎn)生總集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖20B)。大多數(shù)(50％)產(chǎn)生的集落＜0.5mm，16％形成直徑＞2mm的大集落，鋪板總細(xì)胞中很小一部分(0.08％)形成的大集落(直徑＞2mm)。所形成集落大多數(shù)＜1mm(0.4％)，表明較有限的增殖潛能。
實(shí)施例14神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中直徑＞2mm的集落細(xì)胞產(chǎn)生不同集落類型的大小及不同大小集落的頻數(shù)-小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織如實(shí)施例12所述，在神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)來自原始胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的細(xì)胞。通過以下程序檢測直徑＞2mm集落細(xì)胞再次鋪板生長神經(jīng)集落形成細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生不同集落類型的能力。從膠原基質(zhì)切除而分離直徑＞2mm集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中37℃培育30分鐘(圖9)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至96孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中(神經(jīng)球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球(第二代神經(jīng)球)的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用新鮮培養(yǎng)基于24孔板重新鋪板培養(yǎng)以產(chǎn)生第三代神經(jīng)球。10-14天后，在形成第三代神經(jīng)球的孔收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用臺盼藍(lán)排除進(jìn)行活力細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中根據(jù)以下程序?qū)⒓?xì)胞鋪板培養(yǎng)。使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)調(diào)整細(xì)胞濃度至2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL，按給定順序添加至神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基中

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按2500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。直徑＞2mm的集落細(xì)胞能夠再生成不同大小分類的集落(圖21)。
實(shí)施例15直徑＞2mm的集落細(xì)胞的長期增殖潛能和擴(kuò)增-小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織如實(shí)施例12所述，在神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)來自原始胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的細(xì)胞。通過以下程序檢測直徑＞2mm集落在長期神經(jīng)球培養(yǎng)(超過第三代神經(jīng)球)中自我更新和生成大量子代細(xì)胞的能力。從膠原基質(zhì)切除而分離直徑＞2mm集落，各自于0.25％膠原蛋白酶溶液中37℃培育30分鐘(圖9)。然后使用Gilson移液吸頭機(jī)械分散切離的集落，碎開基質(zhì)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將來自單集落的所有細(xì)胞鋪板至96孔培養(yǎng)板的一個(gè)孔中，于添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(神經(jīng)球分析)。10-14天后，在形成新神經(jīng)球(第二代神經(jīng)球)的孔中收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用新鮮培養(yǎng)基于24孔板重新鋪板培養(yǎng)以產(chǎn)生第三代神經(jīng)球。10-14天后，在形成第三代神經(jīng)球的孔收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并于含有添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中鋪板培養(yǎng)。10-14天后，在形成神經(jīng)球的孔收集神經(jīng)球，機(jī)械分離并使用臺盼藍(lán)排除進(jìn)行活力細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后使用含添加EGF的NeuroCult完全培養(yǎng)基T-25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)所有細(xì)胞(第四代)。每10-14天重復(fù)此再次鋪板培養(yǎng)過程以產(chǎn)生長期培養(yǎng)物。在每一培養(yǎng)代次，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，通過每代接種活力細(xì)胞總數(shù)除此代活力細(xì)胞總數(shù)計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。然后從第6代的起始細(xì)胞數(shù)開始計(jì)算活力細(xì)胞總數(shù)的累積擴(kuò)增倍數(shù)(6-10代)(圖22)。四個(gè)直徑＞2mm的單獨(dú)集落的細(xì)胞顯示不管細(xì)胞生長速率如何變化，活力細(xì)胞總數(shù)的擴(kuò)增倍數(shù)均增加。直徑＞2mm集落的細(xì)胞在8代以上能夠自我更新并且產(chǎn)生子代數(shù)量增加，此為神經(jīng)干細(xì)胞的兩個(gè)重要特征。
實(shí)施例16使用大鼠第18天原始胚胎(E18)皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析神經(jīng)細(xì)胞可來自鼠類、嚙齒類動(dòng)物及人類神經(jīng)軸任何部位(包括但不限于紋狀體、中隔、皮質(zhì)、腹側(cè)中腦、中腦、小腦或脊髓)的原始胚胎、出生后或成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。
使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從Sprague-Fischer 344大鼠第18天胚胎(BrainBits，Illinois，USA)切除皮質(zhì)。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用帶一次性塑料移液吸頭的p200Gilson吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過，使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM NS-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長因子-bFGF及2ng/μl肝素)稀釋成6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小(圖23)。
實(shí)施例17大鼠第18天原始胚胎皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析集落大小和天數(shù)之間的關(guān)系如上述實(shí)施例16所詳述，從大鼠第18天原始胚胎皮質(zhì)中樞神經(jīng)細(xì)胞組織分離細(xì)胞并于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)。21-28天時(shí)，集落可分為至少4類1)直徑＞2mm，2)直徑1-2mm，3)直徑0.5-1mm及4)直徑＜0.5mm(圖7)。圖23顯示在神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中觀察到的兩個(gè)直徑1-2mm的大鼠第18天胚胎細(xì)胞集落。
實(shí)施例18使用大鼠第18天原始胚胎皮質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析所產(chǎn)生不同集落類型的大小和不同大小集落的頻數(shù)估計(jì)集落大小及對集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，對這些大小分類每一分類的集落頻數(shù)繪圖(圖24A-C)。這也可以表示為鋪板細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖24C)或產(chǎn)生總集落數(shù)的百分?jǐn)?shù)(圖24B)。大多數(shù)(77％)產(chǎn)生的集落＜0.5mm，很小一部分(0.2％)形成直徑＞2mm的大集落。
實(shí)施例19使用小鼠原始的成體室下區(qū)(SVZ)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析可從成體小鼠稱為室下區(qū)(包含增殖的神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞)的神經(jīng)軸區(qū)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織獲得神經(jīng)細(xì)胞。例如，使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從6只CD1albion小鼠(Charles River)切除室下區(qū)，將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，用解剖刀切碎，然后使用胰蛋白酶和DNA酶溶液于37℃酶解處理15分鐘。培育15分鐘后，向細(xì)胞添加類卵粘蛋白胰蛋白酶抑制劑并輕輕混合。細(xì)胞懸液于8000rpm離心5分鐘，棄去上清液，使用150ul NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTMNS-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長因子-bFGF及2μg/ml肝素)重懸細(xì)胞沉淀，使用帶一次性使用塑料移液吸頭的p200Gilson吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗細(xì)胞懸液兩次(離心)，使用1ml NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTMNS-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長因子-bFGF及2μg/ml肝素)重懸細(xì)胞終沉淀，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過。由于污染有細(xì)胞碎片、髓磷脂及其它細(xì)胞類型計(jì)數(shù)成體小鼠細(xì)胞是非常困難的，因此細(xì)胞計(jì)數(shù)不可靠。神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中從最終的1ml細(xì)胞懸液使用了150ul。按給定順序添加以下組分以獲得神經(jīng)干細(xì)胞分析的半固體培養(yǎng)基

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小(圖25)。
實(shí)施例20使用小鼠原始的成體室下區(qū)(SVZ)細(xì)胞的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析如上述實(shí)施例19所述，從小鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞組織的室下區(qū)細(xì)胞分離細(xì)胞并于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)。21-28天時(shí)，集落可分為至少4類1)直徑＞2mm，2)直徑1-2mm，3)直徑0.5-1mm及4)直徑＜0.5mm(圖25)。
實(shí)施例21人胎兒皮質(zhì)細(xì)胞的第4代神經(jīng)球的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析神經(jīng)細(xì)胞可來自鼠類、嚙齒類動(dòng)物及人類神經(jīng)軸任何區(qū)域(包括但不限于紋狀體、中隔、皮質(zhì)、腹側(cè)中腦、中腦、小腦或脊髓)的初生胚胎、生后或成體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織。
來自人第4代神經(jīng)球的細(xì)胞用于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析(參照方法)。簡言之，第4代神經(jīng)球于400rpm離心5分鐘并棄去上清液。于200ulNeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTMNS-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長因子-bFGF及2μg/ml肝素)中重懸細(xì)胞沉淀，然后使用一次性塑料移液吸頭機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過。使用臺盼藍(lán)排除進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTMNS-A基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纖維細(xì)胞生長因子-bFGF及2μg/ml肝素)將細(xì)胞稀釋成2.17×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。
按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小(圖26)。
實(shí)施例22人胎兒皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的不同的神經(jīng)集落形成細(xì)胞集落大小如上述實(shí)施例21詳述，于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)人胎兒神經(jīng)球單細(xì)胞懸液。21-28天時(shí)，集落可分為至少4類1)直徑＞2mm(圖26A)，2)直徑1-2mm(圖26B)，3)直徑0.5-1mm(圖26C)及4)，直徑＜0.5mm(圖26D)。圖26顯示了神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中人胎兒皮質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞懸液衍生的不同集落大小。神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中人胎兒皮質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生集落的形態(tài)不同于小鼠細(xì)胞(圖7)及大鼠細(xì)胞(圖23)產(chǎn)生的集落。不同大小集落的細(xì)胞較分散，在直徑＞2mm及直徑1-2mm的集落中可見較少的細(xì)胞。
實(shí)施例23使用不同生長因子的神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析使用神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析檢測認(rèn)為存在于胚胎及成體小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的EGF、FGF及EGF+FGF敏感的干細(xì)胞和祖細(xì)胞亞群。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，清洗一次，通過40um尼龍細(xì)胞濾過器(Falcon)濾過。使用NeuroCult 完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀釋成6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。使用下列成分配制3.3ml的神經(jīng)干細(xì)胞分析半固體培養(yǎng)基溶液，各生長因子單獨(dú)或聯(lián)合添加

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行EGF、FGF及EGF+FGF集落的計(jì)數(shù)并估計(jì)其大小。
實(shí)施例24小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞于使用不同生長因子神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中產(chǎn)生不同大小集落的頻數(shù)根據(jù)實(shí)施例23描述的程序使用小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞添加EGF、bFGF及EGF+bFGF進(jìn)行神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析。對生長因子敏感細(xì)胞形成的集落估計(jì)大小并進(jìn)行集落計(jì)數(shù)，對這些大小分類每一分類每鋪板細(xì)胞總數(shù)的集落頻數(shù)繪圖(圖27)。在EGF、FGF及EGF+FGF存在下，直徑＜0.5mm的集落頻數(shù)最高，很小一部分(0.2％)形成直徑＞2mm的大集落。結(jié)果表明在EGF和FGF存在下，獲得較多集落，而大多數(shù)集落＜0.5mm，并按照對這些集落細(xì)胞進(jìn)行的功能性分析確定其來自神經(jīng)祖細(xì)胞。
實(shí)施例25神經(jīng)集落形成細(xì)胞集落以帶有小鼠第14天原始胚胎紋狀體分化細(xì)胞特異標(biāo)志物的血清覆蓋進(jìn)行的原位免疫染色神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中形成的集落也可用血清覆蓋以誘導(dǎo)不同集落的細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)譜系，然后進(jìn)行直接原位免疫細(xì)胞化學(xué)染色。根據(jù)實(shí)施例12描述的程序于神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中培養(yǎng)小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞21天。在培養(yǎng)期末，于每一神經(jīng)集落形成細(xì)胞培養(yǎng)皿上覆蓋1ml含1％胎牛血清的NeuroCultTM完全培養(yǎng)基(StemCellTechnologies Inc.)，培育10天。然后根據(jù)實(shí)施例11描述的程序進(jìn)行神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中膠原及嵌入集落的原位脫水、固定及透化。然后以針對幼稚及成熟神經(jīng)元特異的標(biāo)志物-β微管蛋白的一抗標(biāo)記標(biāo)本。使用含10％山羊血清的PBS以1∶1000稀釋抗β微管蛋白抗體。然后將約500ul稀釋抗體直接添加至載玻片的脫水膠原凝膠上，于抗體溶液之上置一層石蠟?zāi)?。所有樣本?7℃培育2小時(shí)。培育之后，以PBS進(jìn)行三次5分鐘清洗去除一抗，然后，以含2％山羊血清的PBS稀釋二抗-德克薩斯紅染料標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)，直接添加至載玻片的脫水膠原凝膠上。于抗體溶液之上置一層石蠟?zāi)?。?biāo)本與二抗于37℃培育30分鐘。培育之后，以PBS進(jìn)行三次5分鐘清洗以去除二抗，于每一脫水的膠原凝膠中心添加5ul封固劑，然后蓋上蓋玻片以免產(chǎn)生氣泡。于熒光顯微鏡下使用適于每種熒光基團(tuán)的濾光片觀察免疫熒光。
直徑＞2mm集落中很少細(xì)胞表達(dá)β微管蛋白(圖28A和圖28B)。與直徑＞2mm的集落相比，直徑1-2mm(圖28C及圖28D)、直徑0.5-1mm(圖28D)及直徑＜0.5mm(圖28E)的集落含有較多β微管蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞。此操作程序可以進(jìn)行神經(jīng)集落形成細(xì)胞集落分化細(xì)胞暴露于血清后的檢測。
實(shí)施例26神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中甲基纖維素和小鼠第14天原始胚胎紋狀體細(xì)胞的使用上述神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中使用的半固體培養(yǎng)基為膠原培養(yǎng)基。其它類型半固體培養(yǎng)基如甲基纖維素也可用于從單細(xì)胞懸液產(chǎn)生神經(jīng)集落。對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織分離的神經(jīng)細(xì)胞在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中形成集落的能力與在膠原培養(yǎng)基中形成集落的能力進(jìn)行了比較(實(shí)施例1)使用標(biāo)準(zhǔn)顯微解剖技術(shù)從CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除紋狀體。將組織收集于含2％葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，清洗一次，然后使用火拋光的玻璃吸管機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，使用NeuroCult完全培養(yǎng)基(NeuroCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀釋成6.51×105個(gè)細(xì)胞/mL濃度。按給定順序添加以下組分以制備3.3ml的半固體膠原培養(yǎng)基溶液

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。
同時(shí)，按給定順序添加以下組分生成1％終濃度的甲基纖維素來制備甲基纖維素培養(yǎng)基

充分混合生成的溶液以于整個(gè)培養(yǎng)基均勻分配細(xì)胞。使用按7500個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿的終濃度將1.5ml懸液鋪入各35mm組織培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)物置于設(shè)定37℃、100％濕度及5％CO2的組織培養(yǎng)箱中。于14-28天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)及估計(jì)集落大小。圖29顯示小鼠第14天胚胎紋狀體細(xì)胞產(chǎn)生的三個(gè)直徑＜0.5mm的集落盡管根據(jù)目前認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，應(yīng)該知道本發(fā)明不限于已公開的實(shí)施例。相反，本發(fā)明旨在涵蓋包括在附加權(quán)利要求書精神及范圍內(nèi)的各種修改及等同處置。
所有出版物、專利及專利申請書全部以參考文獻(xiàn)形式完整合并在本文中，如同每一單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾垥惶貏e單獨(dú)指明通過參考文獻(xiàn)完整合并。
表1神經(jīng)集落形成細(xì)胞分析中4個(gè)大小分類每一分類集落的相對頻數(shù)

來自小鼠原始胚胎紋狀體的單細(xì)胞懸液在低濃度下于含EGF的無血清半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行鋪板培養(yǎng)。培養(yǎng)21天后將同源細(xì)胞衍生的集落歸為4個(gè)大小分類，相對于鋪板細(xì)胞總數(shù)相關(guān)的神經(jīng)集落形成細(xì)胞頻數(shù)(％)通過神經(jīng)集落形成細(xì)胞頻數(shù)(％)＝(集落數(shù)/鋪板細(xì)胞總數(shù))×100進(jìn)行計(jì)算。0.52-1.1％的鋪板細(xì)胞總數(shù)不同程度增殖并形成集落。鋪板細(xì)胞總數(shù)很小一部分(0.09％)形成大集落(＞2mm)，大多數(shù)形成的集落＜1mm(0.5％)，表明較有限的增殖潛能。
參考文獻(xiàn)Altman，J.(1962).Are new neurons formed in the brains of adult mammals？Sciennce135，1127-1129.
Altman，J.& Das，G.D.Autoradiographic and histological studies of postnatalneurogenesis.I.A longitudinal investigation of the kinetics，migration andtransformation of cells incorporating tritiated thymidine in neonate rats，with specialreference to postnatal neurogenesis in some brain regions.J.Comp.Neurol.126，337-390(1966).
Alvarez-Buylla A，Garcia-Verdugo JM，Tramontin AD(2001)A unified hypothesison the lineage of neural stem cells.Nat Rev Neurosci 2287-293.
Morshead CM，Reynolds BA，Craig CG，McBurney MW，Staines WA，Morassutti D，Weiss S，van der Kooy D(1994)Neural stem cells in the adult mammalian forebrain；a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.Neuron 131071-1082.
Potten，C.S.，and Loeffler，M.(1990).Stem cellsAttributes，cycles，spirals，pitfallsand uncertainties.Lessons for and from the Crypt.Development 110，1001-1020.Reynolds BA，Weiss S(1992)Generation of neurons and astrocytes from isolatedcells of the adult mammalian central nervous system.Science 2251707-1710.
Reynolds BA，Weiss S(1996)Clonal and population analyses demonstrate that anEGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.Dev Biol1751-13.
Shimazaki T，Shingo T，Weiss S(2001)The ciliary neurotrophic factor/leukemiainhibitory factor/gp130receptor complex operates in the maintenance of mammalianforebrain neural stem cells.J Neurosci 217642-7653.
權(quán)利要求
1.一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至集落間可看出差別；及(d)估計(jì)集落大小，其中較大的集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，較小的集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
2.一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)確定集落形態(tài)，其中波形集落表明集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，具有平滑邊緣的集落表明集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
3.一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至形成集落；及(d)確定集落的抗原表達(dá)，其中未分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在表明集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，分化細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的存在表明集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述的神經(jīng)細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的神經(jīng)細(xì)胞來自人類、大鼠或小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述的神經(jīng)細(xì)胞來自原始中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織或培養(yǎng)的神經(jīng)球。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中對高增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞與低增殖潛能神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了鑒別。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述的半固體培養(yǎng)基為膠原培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述的半固體培養(yǎng)基為甲基纖維素培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(a)之前神經(jīng)細(xì)胞以培養(yǎng)基稀釋。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中向培養(yǎng)基添加促進(jìn)特定類型神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞生長的細(xì)胞因子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中向培養(yǎng)基添加促進(jìn)特定類型神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)祖細(xì)胞生長的激素。
13.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法，其中所述的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(b)細(xì)胞以約1000-25,000個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿的濃度鋪板。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(c)培養(yǎng)細(xì)胞大約10-28天。
16.根據(jù)權(quán)利要求1及4-15任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(d)中直徑＞2.0mm的集落表明是神經(jīng)干細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求1及4-15任一項(xiàng)的方法，其中在步驟(d)中直徑＜2.0mm或直徑＝2.0mm的集落表明是神經(jīng)祖細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求3-15任一項(xiàng)的方法，其中使用原位免疫染色方法測定集落的抗原表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求3-15任一項(xiàng)的方法，其中使用摘除或離體的神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞集落免疫染色方法測定集落的抗原表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述的免疫染色使用針對未分化細(xì)胞的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述的抗體結(jié)合神經(jīng)巢蛋白、sox1、sox2、musashi或LexA/SSEA-1。
22.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述的免疫染色使用針對神經(jīng)細(xì)胞譜系特異細(xì)胞標(biāo)志物的抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述的抗體結(jié)合β微管蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、O4或髓磷脂堿蛋白(MBP)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的分析方法在檢測潛在治療成分中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的分析方法在診斷中的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的分析方法在評價(jià)環(huán)境介質(zhì)影響中的用途。
全文摘要
描述了一種神經(jīng)集落形成細(xì)胞(NCFC)分析方法，此方法可以鑒別神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)與神經(jīng)祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞的方法，包括(a)于支持神經(jīng)細(xì)胞生長的半固體培養(yǎng)基中懸浮神經(jīng)細(xì)胞；(b)于半固體培養(yǎng)基中以可產(chǎn)生集落的濃度鋪板細(xì)胞；(c)培養(yǎng)鋪板細(xì)胞至集落間可看出差別；及(d)估計(jì)集落大小，其中較大的集落可能由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生，小集落可能由神經(jīng)祖細(xì)胞產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，通過測定集落的形態(tài)或抗原表達(dá)可鑒別神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)祖細(xì)胞。
文檔編號G01N33/50GK1867678SQ200480030526
公開日2006年11月22日 申請日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者布倫特·A·雷諾, 莎朗·A·路易斯 申請人:干細(xì)胞技術(shù)公司